La cadena respiratoria

Los compuestos NADH y FADH2, originados fundamentalmente en el ciclo de Krebs,

pero tambin en otros procesos catablicos, albergan el poder reductor que les confieren
los electrones "energticos" que transportan. Esa energa ser liberada, poco a poco, a lo
largo de la cadena respiratoria ubicada en la membrana interna de las mitocondrias o en
la membrana celular de los procariotas. Tanto el NADH como el FADH 2 ceden los
electrones a la cadena formada de transportadores y, a medida que pasan de uno a otro,
los electrones van liberando energa. Esa energa permite el bombeo de protones, lo que
genera un gradiente electroqumico, entre la matriz mitocondrial y el espacio
intermembrana (mitocondria) o entre el citoplasma y el espacio periplsmico
(procariotas). La fuerza protn-motriz generada, impulsa los protones a travs de las
ATP sintasas, permitiendo la unin del ADP a un grupo fosfato, con la consiguiente
formacin de ATP. El conjunto de estos procesos, que culminan con la formacin de
ATP, constituyen la fosforilacin oxidativa. Los electrones que han sido impulsados a
lo largo de la cadena respiratoria, deben unirse a un aceptor final. En la respiracin
aerobia el aceptor ltimo de electrones es el O2, que al unirse con H+ del medio, forma
H2O como producto final.
La cadena respiratoria en Escherichia coli

E. coli es un microorganismo procariota por lo tanto carece de organelas internas y los

componentes enzimticos de la cadena respiratoria estn ubicados en la membrana
citoplasmtica. La cadena respiratoria est integrada por dos grupos diferentes de
enzimas:
a) las deshidrogenasas: son flavoprotenas o metaloflavoprotenas que oxidan sustratos
especficos (NADH, succinato, D-lactato, glicerol-3-fosfato, etc.) y reducen quinonas

(siendo la ubiquinona-8 o la menaquinona-8 la especie predominante en clulas crecidas

en aerobiosis o anaerobiosis, respectivamente), b) las oxidasas terminales: oxidan a las
quinonas reducidas y entregan los electrones al aceptor final (oxgeno, fumarato o
nitrato). Estos sistemas de oxidasas terminales estn constituidos por citocromos; el
complejo del citocromo bo y el complejo del citocromo bd. El predominio de uno u otro
sistema depende de la presin de oxgeno: alta presin, citocromo bo; baja presin,
citocromo bd.
En la Figura 1 se esquematiza un modelo de la cadena respiratoria aerbica en E. coli.
Complejo citocromo
nH+

bo/bd

2H+

2H+

QH2

Periplasma

QH2
Membrana

A
Q

Q
2e-

SH2

O2+2H+
Deshidrogenasas

Citoplasma
O2+2H+

H2O
SH2

interna
2eH2O

Esquema de la cadena respiratoria aerbica de E. coli. Distintos sustratros (SH2, SH2) interactan con
sus respectivas deshidrogenasas (A, B) reducindolas, stas a su vez reducen ubiquinona-8 (Q) a
ubiquinol-8 (QH2), el cual transfiere los equivalentes de reduccin a cualquiera de las oxidasas terminales
(complejo del citocromo bd, complejo del citocromo bo). Finalmente, las oxidasas transfieren los
electrones al oxgeno para formar agua. A y B representan, respectivamente, a deshidrogenasas que
generan o no gradiente electroqumico de protones. Ejemplos: A, NDH-1; B, NDH-2, D-LDH, SDH.
Adaptado de Cronan y col., 1987. Cytoplasmic membrane, vol 1 pp. 31-55. Esherichia coli and
Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, American Society for Microbiology,
Washington, DC.

 La cadena respiratoria en plantas

Las plantas, al ser organismos pluricelulares, presentan organelas internas en su
estructura, de manera que los componentes de la cadena respiratoria se ubican en la
membrana de las mitocondrias. En plantas superiores y algunas algas, hongos y
protistas, la cadena respiratoria se bifurca a nivel de la ubiquinona, por lo que existen
dos vas de transporte de electrones hacia el oxgeno: la va clsica de la Citocromo
oxidasa (que comparte con animales) y la va de la oxidasa alternativa (AOX), que no
est presente en animales y es insensible al KCN pero se inhibe por el agregado de
derivados hidroximatos como el SHAM (cido salicilhidroxmico). Esta va alternativa
no est acoplada a la generacin de ATP pero si lleva a la produccin de calor. En la
siguiente figura se esquematiza los componentes de la cadena respiratoria de plantas
superiores.
ESPACIO INTERMEMBRANA
H+

H+

III
II

UQ

H+
Cit.

IV

AOX

MI
Cox

NADH

O2

Succinato
+

NAD

SHAM

Fumarato

KCN
H2O

MATRIZ
Esquema de la cadena respiratoria mitocondrial de plantas. Se indica la bifurcacin de la cadena de
transporte a partir de UQ. Complejo I, NADH deshidrogenasa; Complejo II, succinato deshidrogenasa;
Complejo III, citocromo bc1; Complejo IV, citocromo oxidasa (COX); AOX, oxidsasa alternativa; UQ,
ubiquinona. SHAM, cido salicilhidroxmico, inhibidor de AOX; KCN, cianuro de potasio, inibidor de
COX. Adaptado de Vanlerberghe y McIntoch, 1997. Ann. Rev Plant Physiol. Plant Molecular Biol., vol.
48 pp.703-734.

Los perxidos y los metales de transicin (Fe/Cu) en relacin con el estrs oxidativo
Una consecuencia del metabolismo aerbico es la produccin de especies reactivas del
oxgeno, que pueden interaccionar con las biomolculas (DNA, lpidos, protenas, etc.)
provocando su alteracin y degradacin, con el consecuente dao celular. Toda
situacin de desbalance, ya sea por un aumento en la generacin de esas especies
reactivas o por una disminucin en los sistemas defensivos, provoca lo que se denomina
"estrs oxidativo".
Especies reactivas del oxgeno (ERO)
El oxgeno es una especie triplete capaz de aceptar un electrn por vez, pero su
potencial redox es bajo (Em=-0,16V), por lo que existen pocas biomolculas capaces de
transferirle un electrn. Es decir, no puede directamente oxidar aminocidos o cidos
nucleicos. Sin embargo, si es capaz de oxidar lentamente las flavinas reducidas de la
mayora de las enzimas redox, presentes en la cadena respiratoria (NDH-2, succinato
deshidrogenasa, sulfito reductasa y fumarato reductasa). Esta oxidacin da lugar a la
generacin de especies ms reactivas que el oxgeno, capaces de daar las biomolculas.
Entre las especies derivadas del oxgeno, algunas son radicales libres tales como: radical
hidroxilo (HO), superxido (O2-), peroxilo (RO2), xido ntrico (NO) y otras, que sin
ser radicales libres, son tambin muy reactivas y son la fuente de muchos radicales
libres, entre ellos se encuentran: perxido de hidrgeno (H2O2), perxidos orgnicos
(RHO2), cido hipocloroso (HClO), oxgeno singlete ('O2) y ozono (O3).
Cmo y porqu se originan las ERO?

El O2- y H2O2 son muy reactivos y pueden reaccionar con los clusters hierro-azufre de
grupos tioles de las protenas, los cuales no pueden reaccionar directamente con el
oxgeno (Reaccin 1).

O2

-0,33V

+0,94V

O2-

H2O2

+0,38V

OH-+ HO

+2,33V

H2O

Sin embargo, no son lo suficientemente potentes como para oxidar los cidos nucleicos.
El dao oxidativo sobre el DNA es debido a otra especie reactiva derivada del oxgeno,
HO (Reaccin 3).
Men++ reductor oxidado

Me(n+1)++ reductor?

Me(n+1)++ OH-+ HO

Men++ H2O2
HO + DNA

(2)
(3)

(4)

H2O + lesin

Los mecanismos propuestos para la formacin de las ERO involucran una reaccin de
Fenton sitio-especfica donde participa un metal reducido (Me(n-1)+) que reacciona con el
perxido de hidrgeno (HO-OH) o con un hidroperxido orgnico (RO-OH)
produciendo la ruptura del enlace peroxilo (-O-O-) (Reaccin 3). Los perxidos pueden
tambin reaccionar con el radical superxido y generar radicales libres ms reactivos
mediante la reaccin de Haber-Weiss, tambin catalizada por metales de transicin
(Reaccin 5 y 6):
Fe/Cu
-

O2 + HO + OH-

HO-OH + O2

Fe/Cu
RO-OH + O2-

O2 + RO + OH-

(5)

(6)

Molculas como el H2O2 o radicales poco reactivos, pueden generarse en un lugar de la

clula y trasladarse a otro lugar de sta o an migrar a clulas vecinas y ejercer all su
accin. Otros radicales, como el HO, son tan reactivos que al originarse reaccionan

(1)

inmediatamente con molculas prximas ya sean cidos grasos, hidratos de carbono,

protenas o DNA. El radical HO al atacar al DNA, puede hacerlo tanto sobre la
desoxirribosa como sobre las bases pricas y pirimdicas. Por esto las ERO estn
implicadas en el desarrollo de enfermedades como el cncer o el sndrome de la
inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y de varias enfermedades degenerativas como ser
aterosclerosis, injuria por reperfusin posisqumica, enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Parkinson, artritis reumatoidea y esclerosis lateral amiotrfica.

Protocolo de trabajo
Practico n 1
Cadena Respiratoria y Consumo de oxgeno
Estudio de la cadena respiratoria en plantas
Se determinar el consumo de oxgeno en muestras de flavedo de limones. Las muestras
se tomarn de la parte coloreada de la cscara del limn (flavedo) cuidando de no retirar
nuestras de albedo (porcin blanca de la cscara), hasta alcanzar el peso requerido
(50 mg) y se picar finamente. El consumo de O 2 de las muestras se determinar en
suspensiones de 2 ml en buffer fosfato de sodio 50 mM pH 7,5 en ausencia y presencia
de diferentes inhibidores: KCN 10 mM como inhibidor de la va de los citocromos y
SHAM 5mM como inhibidor de la va alternativa de la cadena respiratoria. Se evaluar
el grado de inhibicin obtenido con cada uno de los compuestos, respecto al consumo
de oxgeno en ausencia de los mismos.

Estudio de la cadena respiratoria en suspensiones bacterianas

Se prepararn suspensiones celulares (Abs560nm=0,4) conteniendo 0,5% de glicerol
como sustrato respirable a partir de cultivos de clulas crecidas hasta fase exponencial
en medio LB. En dichas suspensiones se determinar comparativamente el consumo de
oxgeno en presencia o ausencia de t-BOOH 5mM y Cu 1mM. De esta forma se
analizar la participacin del metal en este proceso.
Tambin se estudiar la respuesta frente a los mismos inhibidores probados para las
muestras de flavedo de limones.

 Practico n 2
Cadena Respiratoria y Produccin de Especies reactivas del oxgeno (ERO)
Determinacin de niveles intracelulares de ERO
La formacin de ERO se determinar mediante el uso de la sonda 2,7dichlorofluorescein diacetato (H2DCFDA). Este compuesto como tal no fluoresce pero
tiene caractersticas lipoflicas que le permiten difundir libremente al interior de la
clula. En la membrana este compuesto es atacado por esterasas que hidrolizan y liberan
el diacetado de la molcula convirtindola en una sustancia hidroflica (H2DCF), que es
incapaz de salir del compartimiento citoslico. Cuando esta sonda es oxidada por las
ERO, se transforma en DCF, que si fluoresce. Hay una gran cantidad de sustancias que
pueden oxidar a esta molcula pero especialmente el H2O2 es una de las ejerce un mayor
efecto. La determinacin de EROs se llevar a cabo midiendo la intensidad de
fluorescencia en un espectrofluormetro (ISS-PCI (Champaign, IL, USA)) o mediante
el uso de un microscopa de fluorescencia Olympus BX51TF (Tokio, Japn).

490 nm

519 nm

490 nm

Protocolos de trabajo
Determinacin de la formacin de ERO por espectroscopa de fluorescencia
1) Preparar 10 ml de una suspensin de Abs 560nm=0,5 en buffer fosfato de sodio 50 mM
(pH=7,0) a partir de clulas de E. coli crecidas aerbicamente en medio LB hasta
Abs560nm=2,0.
2) Incubar 30 min a 37C en bao agitado en oscuridad en presencia de 10 M de la
sonda fluorescente.
3) Transferir a 4 tubos eppendorf (2 ml) y centrifugar (10000 rpm 5 min) para eliminar
la sonda que no haya ingresado a la clula. Resuspender en el mismo volumen con
buffer fosfato.
4) Transferir a tubos de vidrio los 2 ml de clulas, las cuales sern sometidas a
diferentes tratamientos con: Control (sin sustancia), CuSO4 50 M, t-BOOH 1 mM o
una combinacin de ambos compuestos.
5) Incubar las muestras 10 min a 37C en bao agitado.
6) Finalizado el tiempo de incubacin transferir 1,5 ml a tubos eppendorf y lavar dos
veces con buffer fosfato de sodio 50 mM (pH=7,0).
7) Sonicar las muestras durante 2 min en frio para liberar la sonda oxidada.
8) Para medir la intensidad de fluorescencia se realizar una dilucin con el buffer de
trabajo y a la muestra se la excitar a una longitud de onda de 490 nm y se medir la
emisin a 519 nm.
Determinacin de la formacin de ERO por microscopa de fluorescencia
1) Preparar 10 ml de una suspensin de Abs 560nm=1 en buffer fosfato de sodio 50 mM
(pH=7,0) a partir de clulas de E. coli crecidas aerbicamente en medio LB hasta
Abs560nm=2,0.

2) Tranferir a tubos de vidrio 2 ml de clulas, las cuales sern sometidas a diferentes

tratamientos con: Control (sin sustancia), CuSO4 50 M y una combinacin de t-BOOH
1 mM y Cu2+ 50 M.
3) Incubar 10 min a 37C en bao agitado
4) Transferir a 3 tubos eppendorf (2 ml) y centrifugar (10000 rpm 5 min). Lavar 3 veces
con buffer fosfato.
5) Transferir a tubos de vidrio los 2 ml de clulas e Incubar 30 min a 37C en bao
agitado en oscuridad en presencia de 10 M de la sonda fluorescente.
6) Finalizado el tiempo de incubacin transferir 1,5 ml a tubos eppendorf y lavar 1 vez
con buffer fosfato de sodio 50 mM (pH=7,0).
7) Colocar 15 o 20 l entre porta y cubre y mirar al microscopio.

Determinacin de la formacin de ERO en extractos celulares. Medicin directa

1) Para observar la formacin de ERO, se partir de la misma suspensin inicial de
Abs560nm=0,5 la cual se sonicar por 5 min.
2) En la cubeta de medicin se adicionar secuencialmente, el fluorescente y una fuente
de carbono (Glucosa) para mantener la cadena respiratoria funcionando, y diferentes
especies generadores de ERO como 50 M de CuSO4, 1 mM de t-BOOH o 5 mM KCN
(inhibidor de citocromos).
3) La intensidad de la fluorescencia ser registrada durante 5 min despus de adicionar
cada uno de dichos compuestos o de una mezcla de ellos.