Procesos Downstream:

Fundamentos De La Recuperacin,
Purificacin Y Terminado De Productos

Nicole M. Rodrguez Torres

Gamalier Rivera Ortiz
4 de noviembre de 2016
Biol 4433/Microbiologa Industrial
Prof. ngel R. Nez Marrero

Objetivos

Explicar el objetivo principal de las operaciones downstream.

Identificar los aspectos principales que estn relacionados a la

recuperacin y a la purificacin de productos.

Describir las etapas que forman parte de la operacin downstream.

Explicar cundo es que se aplican tcnicas de recuperacin que

involucran destruccin celular y cundo no.

Explicar la utilidad de la filtracin en las operaciones downstream.

Explicar la utilidad de la cromatografa en las operaciones

downstream.

Mencionar los proceso involucrados en las etapas de terminacin.

Upstream

Downstream

Introduccin
En el proceso de produccin industrial, luego de la
fermentacin o del cultivo de las clulas en el tanque, se
requiere recuperar y procesar el material para obtener el
producto deseado.
Esto es el inicio de las etapas o procesos downstream.
Dependiendo del tipo de producto es que van a ser estas
etapas finales de produccin.

Componentes De Un Proceso
Industrial

Etapas
Iniciales
Etapas
Finales

Cepa Microbiana
Sustratos
Fermentacin

Recuperacin
Purificacin
Etapa de terminacin
Distribucin

Objetivo De Etapas De
Recuperacin Y De Purificacin
Obtencin de la sustancia de inters y la pureza de la misma,
de modo que sea apta para el consumo.
Depende el producto y su objetivo, es que ser el nivel de
pureza.
A mayor pureza requerida, mayores tecnologas deben ser
aplicadas en el proceso downstream y mayor el costo final
del producto.

Recuperacin Y Purificacin
De Metabolitos Industriales
Recuperacin de metabolitos: Los procesos dirigidos a separar los
metabolitos de inters de la clula o del medio donde ocurri la
fermentacin, de manera que puedan ser extrados.
En ese proceso se extraen por lo general mezclas de materiales que
son parecidos en propiedades fsicas y qumicas al metabolito de
inters.

Purificacin de metabolitos: serie de mtodos especficamente diseados

para eliminar casi en su totalidad las impurezas, y permitir que resulte un
producto mucho ms puro.
Etapas de terminacin: Incluye la preparacin del producto segn ser
distribuido al mercado.

Procesos Downstream
Dependen del tipo de industria:
De industria a industria, el proceso de purificacin sigue una
dinmica parecida, aunque no existe ningn protocolo estndar
para aplicarse de forma consistente (rutinaria) en la purificacin de
productos en operaciones "downstream".
Es decir, cada compaa va a establecer su propia operacin
downstream.

Algunos De Los Componentes

De Las Etapas Downstream

Recuperacin de metabolitos de inters

Clarificacin
Etapas de Purificacin
Generacin del Bulk (producto en su forma bruta-no finalizada)
Formulacin
Llenado/Terminacin
Empaque
Aprobacin final
Distribucin al mercado

Complejidad de los procesos depende del tipo de producto

Conceptos Importantes Relacionados

A Etapas Downstream

Pureza: El producto o sustancia de inters est libre de otras sustancias o molculas

que no son deseadas (y que son consideradas contaminantes).

Identidad: Que al final de la purificacin la protena o la molcula de inters que es

obtenida conserve sus caractersticas y su naturaleza esperada. (Que no tenga
modificaciones no deseadas)

Rendimiento: Cunta cantidad hay presente del producto o sustancia de inters, luego
de cada etapa de procesamiento.

Actividad: Se relaciona con la capacidad que tiene una molcula de actuar de una
forma especfica. En el caso de productos teraputicos, es la habilidad del mismo para
llevar a cabo el efecto deseado o esperado (efecto teraputico).

Estabilidad: cun susceptible puede ser una molcula a diferentes condiciones (y

cmo eso le afecta). Mientras ms estable menos su vulnerabilidad a factores
externos.

Recuperacin de Productos
Qu se recupera?:
Clulas completas

Metabolitos Celulares

Intracelulares

En organelos, en cuerpos de inclusin, otros

Extracelulares van directo al medio de fermentacin

Ejemplo De Localizacin De Metabolitos

Importantes

Recuperacin de Productos
Factores a considerar para la seleccin del mtodo:

El valor del producto final

El grado de pureza requerido por el tipo de producto final

Propiedades fsicas y qumicas del producto

Localizacin del producto

Clula entera
Metabolito celular intracelular o extracelular

El grado de impurezas presentes

Costo-efectividad de las tecnologas disponibles

Recuperacin
Tecnologa depende de si son clulas completas, productos
intracelulares o extracelulares
Clulas completas

Puede incluir:
Etapa inicial de filtracin
Congelacin
Otros

Destruccin De La Clula

Ocurre por lisis de la clula

Proceso muy sensitivo que tiene que considerar la presencia de los siguientes elementos:
Pared celular
Contaminacin con desechos celulares
Desnaturalizacin de productos

Puede ser logrado por mtodos mecnicos:

Homogenizadores

Uso de Ball Mills (esferas abrasivas)

Cambios en presin que hacen explotar la clula

Clulas son agitadas en suspensin con pequeas molculas abrasivas, se fomenta que
se den colisiones que luego ayudan a romper la clula

Ultrasonido

Involucra el uso de alta frecuencia que es producida electrnicamente

Es costoso y por lo general se usa en etapa de laboratorio (no es costo-efectivo con
volmenes amplios)

Homogenizadores,
Desestabilizadores ultrasnicos,
bead mills

Problemas Con Los Mtodos

Mecnicos

Requiere mucho re-procesamiento del caldo con los productos y desechos

Altos desechos celulares

Mezclas de constituyentes celulares

Necesidad de realizar procesos de clarificacin

Puede afectar el rendimiento final (disminuye cantidad de materiales deseados)

Riesgos de desnaturalizacin a metabolitos delicados (por ejemplo: protenas)

Destruccin De La Clula
Por mtodos no mecnicos:

Se afecta la clula por permeabilizacin:

Permeabilizacin qumica

Permeabilizacin por cambios osmticos

Usando solventes para crear aperturas en la membrana celular

Tolueno, ter, benceno
Antibiticos
Surfactantes
Agente quelante EDTA- til en Gram negativos

Choque osmtico-cambios drsticos en las presiones osmticas

Permeabilizacin enzimtica

Limitado a liberar enzimas periplsmicas o superficiales

Se usa EDTA, proteasas, entre otras

Purificacin
Hacer el producto apto para su uso. Garantiza que solo hay lo deseado
en el producto.

Se desea remover progresivamente desechos y contaminantes:

Desechos celulares
cidos nucleicos, protenas
Microorganismos, virus
Depende el producto requiere varias etapas:
Clarificacin
Purificacin intermedia
Purificacin final

En general mientras ms procesos incluyen un sistema de bioprocesos "downstream", es

altamente probable que se logre un aumento en la pureza de los metabolitos, sin embargo, el
rendimiento final tiende a disminuir.

Purificacin
Incluye procesos como:
Filtracin
Filtracin por membrana (microfiltracin / ultrafiltracin)
Centrifugacin
Concentracin
Cristalizacin
Cromatografas

Intercambio inico, de afinidad, de fase inversa, hidrofbicas, HPLC

(nivel de anlisis en el laboratorio)

Etapas de inactivacin viral

Filtracin
Es uno de los mtodos de mayor aplicacin en las operaciones
downstream.
Es una tecnologa de separacin, que utiliza un material con orificios
(poroso) y llamado el elemento filtrante, para remover partculas que se
encuentran en mezclas lquidas o gaseosas.
Por lo general, el modo de accin es:

Partculas no deseadas: se quedan atrapadas en el filtro y se le conoce

como el material retenido (retentate).

El material de inters, pasa a travs del filtro ( se le conoce como el

material filtrado o permeado [en ingls filtrate, permeate])

Aunque, hay tcnicas de filtracin donde el material retenido es el

que se interesa, mientras que el filtrado no lo es.

Filtracin-Mecanismos
Flujo normal
Flujo tangencial
Video: https://www.youtube.com/watch?v=LkoQX7U4eeo

Tipos de filtros
Son variados y se aplican dependiendo de la etapa en el
proceso downstream
Filtros gruesos (depth filters) - 8-100m
Filtros de superficie - 0.5- 30m
Filtros de membrana - 0.05 10m

Filtros

Cromatografa

Es una de las aplicaciones con mayor uso en la purificacin.

Sistemas de columna

Existen diversos tipos de modos de operacin dependiendo de la

columna.

Ejemplos:
Afinidad
Intercambio inico
Hidrofbicas
peso

En el nivel industrial son columnas muy grandes con las que se procesa
el material que contiene el producto.

Tipos de Cromatografas:
Intercambio Inico

se basa en la afinidad de los iones en solucin por los sitios

de polaridad opuesta que se encuentran en la fase
estacionaria.

Tipos de Cromatografas:
Exclusin por Tamao

Se basa en la habilidad de materiales de porosidad

controlada para separar los componentes de una mezcla de
acuerdo al tamao y forma de las molculas.

Tipos de Cromatografas:
Afinidad

se fundamenta en la especificidad de algunas macromolculas

biolgicas. stas se unen especficamente a la fase estacionaria y para
separar dicha macromolcula, bastar con variar el pH una vez que la
columna este limpia y slo se encuentre de inters.

Tipos de Cromatografas:
Absorcin

se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de los

compuestos por el slido utilizado como fase estacionaria. Las
separaciones obtenidas se determinan casi exclusivamente por
interacciones polares, siendo la fase estacionaria ms polar que la
fase mvil.

Centrfugas Industriales

Etapas De Terminado
Varan segn el producto
Se llevan a la concentracin/ dosis comercial
Se llenan, empacan y distribuyen
Productos teraputicos y alimentos requieren procesos
ms rigurosos

Formulacin
Esto se realiza luego que los investigadores verifican el
aislamiento y la purificacin del producto por medio de
protocolos de anlisis confirmados.
La formulacin del producto sigue unas especificaciones de
R&D y se condiciona para su uso por parte de mdicos y
pacientes.
Propiedades de uso
Propiedades fisicoqumicos macroscpicas
Estructuras microscpicas
Composicin qumica

TORRES P., Norma S., TORRES V., Sergio, FERRO V., Diana C., OLAYA E., Erika S., GARCA C., Rafael G., CARACTERIZACIN
DEL PROCESO PRODUCTIVO, LOGSTICO Y REGULATORIO DE LOS MEDICAMENTOSVitae [en linea] 2006, 13 (Sin mes) :
[Fecha de consulta: 1 de noviembre de 2016] Disponible en:<http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=169813258009>
ISSN 0121-4004

Mejoramiento y Preservacin
de la cepa microbiana
GAMALIER RIVERA ORTIZ
PROF. NGEL R. NEZ MARRERO
BIOL 4433

Objetivos
Explicar por qu es importante que las compaas

busquen el mejoramiento de sus lneas productoras.

Describir estrategias que son aplicadas para el
mejoramiento de las cepas.
Describir los principales mtodos para la
preservacin de lneas celulares.

Mejoramiento de la cepa

El objetivo principal es lograr modificaciones a las

cepas microbianas de manera que el proceso de

produccin de metabolitos sea ms efectivo.
Es algo muy necesario para que las compaas se

mantengan competitivas

Mejoramiento de la cepa
Es un proceso complejo y lleno de retos:

Porque puede promover:

Necesidades ms estrictas para el crecimiento de los microorganismos

(aireacin, nutrientes, espumas)

Procesos de recuperacin ms complejos

Controles de ingeniera ms rigurosos

Riesgo de aumento en los costos operacionales

Por eso se evala la costo-efectividad

Mejoramiento de la cepa microbiana

Puede involucrar los siguientes aspectos:

Regulacin ms estricta de enzimas

Aumentar la permeabilidad de la clula (para mejorar etapas

dowsntream)

Manipulacin gentica del aparato existente

Aadir propiedades genticas nuevas (DNA

recombinante, ingeniera gentica)

Mecanismos de modificacin gentica

Dos tipos de mtodos:

No involucran DNA externo:

Mutaciones convencionales

Involucran DNA externo (inducidas)

Transduccin
Conjugacin
Transformacin
Electroporacin
Fusin de protoplastos
Ingeniera gentica (DNA recombinante)
Bioinformtica
Genmica

Mutaciones convencionales
Luego de exponer a

microorganismos a factores
mutagnicos, se seleccionan mutantes con posibilidades y
se prueba su habilidad para la produccin.

Mutantes auxotrficos: aquellos que carecen de una

enzima que le permita manufacturar cierto tipo de

nutriente. De esa forma ese nutriente tiene que ser
aadido al medio de fermentacin.

Ejemplos: mutantes deficientes de biotina, mutantes deficientes de

lisina, entre otros.

Tcnicas de modificaciones genticas a la cepa

Transduccin= Proceso por el que se introduce material gentico exgeno a la bacteria

utilizando un virus como vector.

Conjugacin= Proceso de transferencia de material gentico entre una clula procariota

(bacteria o arquea) donadora y una receptora mediante el contacto directo o una
conexin que las una.

Transformacin= Es uno de los procesos naturales de transferencia de material

gentico de una bacteria a otra, junto con la conjugacin y la transduccin, que es una
integracin directa del ADN.

Electroporacin= Tcnica que consiste en inducir la competencia mediante la

aplicacin de un pulso elctrico muy breve e intenso.
Bioinformtica
Genmica

Tcnicas de modificaciones genticas a la cepa

Fusin de protoplastos= Es una tcnica de biotecnologa en la cual se produce la

fusin de las membranas de dos o ms clulas dando lugar a un hbrido somtico. La
tcnica es ampliamente empleada para introducir variabilidad en las cepas de inters
biotecnolgico.

Bioinformtica= Estudio a nivel molecular que se encarga en descifrar los codones de

las bases nitrogenadas de la secuencia gentica.

Genmica= Conjunto de disciplinas relacionadas con el estudio de los genomas y su

aplicaciones en terapia gnica, biotecnologa, etc.

Otras tcnicas con DNA externo

Ingeniera gentica: o la tcnica del DNA

recombinante

Formacin de nuevas combinaciones de material hereditario

por la insercin de molculas de cidos nucleicos producidas
fuera de la clula.

El material gentico puede provenir de clulas eucariotas,

procariotas o sintetizado qumicamente.

Preservacin o Mantenimiento de las cepas microbianas

Objetivos:
Mantener la coleccin existente
Coleccionar nuevas cepas
Proveer cultivos puros con caractersticas deseadas
Se quiere preservar :

Pureza gentica
Niveles de productividad

Facilidad de transporte y de manejo

Mantenimiento (preservacin) de microorganismos de inters industrial

Los microorganismos pueden ser obtenidos de:

Fuentes naturales

a. Suelo y agua
b. Fermentaciones naturales (obtener Saccharomyces de la fermentacin del vino, o Lactobacillus
del queso)
c. Animales y plantas, en el caso de las vacunas

Coleccin de cultivos

Cada firma posee su propia coleccin de cultivos

Esto va a depender de cada industria

Coleccin de cultivos
Se mantienen las cepas con un estricto control en su nivel

metablico (se mantiene bajo)

Evita que pierdan la habilidad de sobreproduccin
La coleccin de cultivos tiene una importancia a nivel

cientfico general, y existen grandes colecciones de cultivo

alrededor del mundo.
En el nivel de la industria se puede coleccionar la cepa en

las instalaciones, bajo unas condiciones especializadas.

Colecciones de cultivo
Tipos de colecciones de cultivos ms importantes:

ATTC (American Type Culture Collection)

Instituto Pasteur (Francia)
National Collection of Type Cultures (Londres)
National Collection of Industrial Bacteria (Escocia)
Asian Network on Microbial Research (ANMR)
European Culture Collection Organization
Japanese Federation of Culture Collections

World Federation of Culture Collections (WFCC)

Red que une las colecciones de cultivo a nivel mundial

Preservacin de cepas
Objetivos:
Preservar pureza gentica
Preservar niveles de productividad inicial
Lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con
facilidad

Para emplear mtodos de conservacin es requerido

Conocer las caractersticas asociadas a ese cultivo

Mtodos de conservacin
Subcultivos

Es un mtodo comn, poco costoso y necesario.

Consiste en el cultivo peridico en un medio nutritivo fresco

El cultivo desarrollado se mantiene entre 2 a 8C de 15 a 60 das

Se brindan condiciones para microorganismos aerbicos y

anaerbicos

Anaerobios: se le aade una capa de aceite o de vaselina, estriles

Mtodos de conservacin
Desecacin: consiste en eliminar el agua evaporndola; es un mtodo vlido para
microorganismos esporulados que aguantan las altas temperaturas. Puede ser desecacin
en:
-En suelo, arena, slica gel
-En papel de filtro
-Lquida (D-Drying), aplicando vaco, en desuso
-En bolitas de alginato
-En sal

Mtodos de conservacin
Congelacin en refrigeradores a temperaturas entre -20 y -

80 C.

-20 C : temperatura del refrigerador comn

-60 a -80C: son refrigeradores especiales

Se utilizan agentes crioprotectores: sustancias que evitan

que las bajas temperaturas maten a los microorganismos.

Ejemplo: glicerol, rafinosa, lactosa, trihalosa

Ventajas incluyen:
ocupa menos espacio, no requiere muchos equipos.

Mtodos de conservacin
Nitrgeno lquido
Suspensin del microorganismo
en un agente crioprotector en
ampolletas y es sellada antes de
colocarla

Se llega a temperaturas hasta de

196 C (puede fluctuar entre 1560C (gaseoso) a -196 C
(lquido).

Requiere constante suplido del

nitrgeno lquido y es costoso.

Mtodos de conservacin
Liofilizacin

Mtodo ms adecuado para la preservacin microbiana

Involucra el congelado, seguido de un secado al vaco

El agua se remueve del medio, por sublimacin, en presencia de

un agente crioprotector

Luego se sella al vaco

El cultivo puede mantenerse estable hasta por 30 aos