MEDIDA DE LA REACCION DE HILLS EN CLOROPLASTOS AISLADOS

APONTE, Anglica. Cdigo: 1039461736; GUEVARA, Anglica. Cdigo:

1144161439. Practica Laboratorio Biologa Celular y Molecular PROFESOR:
Ivn Gonzales.
Programa de Ciencias Bsicas, Microbiologa, Universidad Santiago de Cali.

RESUMEN
Los cloroplastos son los orgnulos de las clulas vegetales donde se realiza la
fotosntesis, al convertir la energa lumnica en energa qumica (ATP) y generar
poder reductor (NADPH).1 En la prctica se realizo un protocolo para el
aislamiento de cloroplastos de hojas de espinaca, En l se resumen los principales
reactivos, soluciones, materiales biolgicos, equipos, y condiciones necesarias
para reproducirlo en condiciones de laboratorio, se probo la reaccin de Hills
donde en la suspensin de cloroplastos se desprendi O2 en presencia de luz,
Finalmente, se sugieren diversas aplicaciones para aislar otro tipo de organelas y
sus aplicaciones en el medio cientfico.
PALABRAS CLAVE: cloroplastos, organelas, ATP, NADPH

ABSTRACT
Chloroplasts are organelles of plant cells where photosynthesis takes place ,
converting light energy into chemical energy (ATP ) and generate reducing power
(NADPH )1 In practice a protocol for the isolation of chloroplasts of leaves was
performed spinach, it summarizes the main reagents , solutions, biological
materials , equipment, and conditions necessary to reproduce in laboratory
conditions , the reaction Hills where the suspension of chloroplasts came off O2 in
the presence of light was tested , Finally, suggest several applications for isolating
other organelles and their applications in scientific circles .
KEYWORDS: chloroplasts, organelles, ATP, NADPH
INTRODUCCIN
En 1939, Robn Hill y col. encontraron
que una suspensin de cloroplastos

aislados puede desprender O2 en

presencia de luz, si se suministra un
compuesto oxidado capaz de aceptar
electrones procedentes de la fotolisis

del agua. De esta forma, el proceso

de desprendimiento de O2 en la
fotosntesis pudo ser separado del de
la fijacin de CO2. En la hoja intacta,
los principales aceptores naturales de
electrones son la ferredoxina y el
NADP, pero se inactivan durante el
proceso de aislamiento de los
cloroplastos.
in
vitro,
estos
aceptores
naturales
pueden
sustituirse
por
el
2,6
diclorofenolindofenol (DCPIP). Este
compuesto es azul en forma oxidada
(quinona)
pero
se
decolora
lentamente cuando se reduce (fenol).
La reaccin que tiene lugar es la
siguiente2:

Los cloroplastos son orgnulos

exclusivos de las clulas vegetales.
En ellos tiene lugar la fotosntesis,
esta funcin consiste en utilizar la
energa de la luz solar para activar la
sntesis de molculas de carbono
pequeas y ricas en energa, y va
acompaado
de
liberacin
de
3
oxgeno. Los cloroplastos producen
tanto las molculas nutritivas como el
oxgeno que utilizan las mitocondrias.
Los procesos que se realizan en la
fotosntesis son estudiados por la
bioenergtica que se encarga del
estudio de los procesos de absorcin,
transformacin
y
entrega
de energa en
los
sistemas
biolgicos.

En esta prctica se identificaron las

caractersticas del aislamiento de los
cloroplastos, las funciones de los
reactivos empleados en la prctica y
se
entendi
la
medicin
de
fotosntesis
a
travs
de
la
decoloracin del DCPIP mediante un
espectrofotmetro.

MATERIALES Y METODOS
Aislamiento de cloroplastos:
Mortero y mano, Papel filtro,
Centrfuga, tubos, Gradilla, Probeta
de 50 ml, Erlenmeyer, beaker,
Embudo, Varilla de vidrio, Pipetas de
2 ml y de 1 ml, Vaso de precipitados
de 50 ml, Balanza, Hojas frescas de
espinaca, Solucin de sacarosa 0.5
M, Propilenglicol al 10%, Agua
destilada.
Se pesaron 6 g de hojas de espinaca
previamente desnerviadas y lavadas
dos veces con agua destilada fra. Se
cortaron las hojas en pequeos
trozos y se maceraron en un mortero
como se ve en la figura 1 y se le
agrego 2 ml de sacarosa 0.5 M
paulatinamente hasta 10ml con la
misma solucin.

Se desecho el sobrenadante y se
suspende el precipitado que contiene
los cloroplastos aislados en 6 ml de
propilenglicol al 10% agitando con
una varilla.
Medida de la reaccin de Hill en los
cloroplastos aislados

Figura 1. Espinaca con 2 mL de sacarosa

Luego se filtro la mezcla obtenida a

travs de papel de filtro y se recogi
en un tubo centrifuga.
Se centrifuga durante 10 min a 2500
r.p.m. como se ve en la figura 2.

Con los cloroplastos aislados se

preparo 3 tubos de ensayo, en el
primer tubo se agregaron 9 mL de la
solucin tampn y 0.5 mL de
cloroplastos hervidos, en el segundo
tubo de ensayo se agregaron 9 mL de
la solucin tampn y 0.5 mL de
cloroplastos frescos este tubo de
ensayo se cubre con papel aluminio
para evitar que le caiga luz a la
muestra y en el tercer tubo de ensayo
se agregaron 9 mL de la solucin
tampn y 0.5 mL de cloroplastos
frescos.
En
la
prctica
se
uso
el
espectrofotmetro con la longitud de
onda de 590 nm la cual absorbe el
DCPIP.
A cada tubo de ensayo se le agrega
0.1 mL de la solucin de DCPIP se
pone
una
parte
en
el
espectrofotmetro y se mide la
absorbancia en el tiempo 0.

Figura 2. Centrifugacin de los cloroplastos

Se sitan los tubos al frente de la

lmpara como se ve en la figura 3. y
se mide la absorbancia para los
tiempos 3,6 y 9.

Grafica
1.
Comportamiento
de
absorbancia en cada una de las muestras
0.45
0.4
0.35
0.3
Figura 3. Cloroplastos con la solucin tampn
frente a la lmpara

Resultados de la absorbancia:
Tubo 1
0 minutos
3 minutos
6 minutos
9 minutos

Absorbancia
0.224
0.386
0.357
0.425

Resultados de la absorbancia:
Tubo 2
0 minutos
3 minutos
6 minutos
9 minutos

Absorbancia
0.274
0.261
0.253
0.247

Resultados de la absorbancia:
Tubo 3
0 minutos
3 minutos
6 minutos
9 minutos

Absorbancia
0.291
0.243
0.248
0.274

Se realizo una grafica para comparar

las absorbencias obtenidas en cada
uno de los tubos el resultado fue el
siguiente:
.

0.25

Tubo 1

0.2

Tubo 2

0.15

Tubo 3

0.1
0.05
0
0 Min.

3 Min.

6 Min.

9 Min.

Se logra ver una gran diferencia en el

aumento de la absorbancia cuando la
muestra de cloroplastos esta a una
elevada temperatura.
Se ve un comportamiento similar en
los tubos 2 y 3 ya que en los dos
casos los cloroplastos estn frescos,
pero en el tubo 2 se ve una
disminucin constante en cuanto a la
absorbancia ya que no la cantidad de
luz que absorba el tubo era mnima.
Los resultados se compararon con los
obtenidos en el Protocolo para el
aislamiento de cloroplastos intactos
de hojas de plantas de Musa spp.
Obtenidas por cultivo in vitro y
evaluacin
de
la
actividad
fotosinttica Michel Leiva-Mora* ,
Yelenys
Alvarado-Cap,
Mayra
Acosta-Surez, Mileidy Cruz-Martn,
Cynthia
Snchez-Garca,
Berkis
Roque. * Instituto de Biotecnologa de

las Plantas (IBP), Universidad Central

Marta Abreu de Las Villas en Cuba 4,
se pudo observar la reduccin de la
absorbancia la cual se debi a la
reduccin del DCPIP y esto a su vez
estar directamente relacionado con
la tasa fotosinttica de la suspensin
de cloroplastos. El transporte de
electrones
y
los
equivalentes
reductivos en los fotosistemas de los
cloroplastos, provocan que el DCPIP
oxidado (azul intenso) al aceptar
electrones procedentes de la fotlisis
del agua, se convierta en DCPIP
reducido (azul claro). A menudo el
DCPIP, se utiliza en las mediciones
de la cadena de transporte de
electrones en los cloroplastos debido
a su mayor afinidad por los electrones
que la ferredoxina. Mediante la
medicin de la absorbancia a 595 nm
se puede calcular la tasa de
transporte electrnico en trminos de
umol DCPIP reducido/mg clorofila/ h y
utilizarse como un ndice de vitalidad
cloroplstica.

CONCLUSIONES
Se logro determinar el efecto de la
intensidad luminosa sobre la actividad
fotosinttica de los cloroplastos.
Se identificaron las caractersticas del
aislamiento de los cloroplastos.
Se determinaron las funciones de los
reactivos empleados en la prctica y
se
entendi
la
medicin
de
fotosntesis
a
travs
de
la

decoloracin del DCPIP mediante un

espectrofotmetro.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. http://revista.ibp.co.cu/compon
ent/docman/doc_view/1138vol10-n1-2010149-52.html
2. http://idmsdos.es.tl/-.Introducci%F3n.htm
3. biologaygeologia.blogspot.com
/2013_02_01_archive.html
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6. https://books.google.com.co/b
ooks?
id=UZcaLMfWXdkC&pg=PA13
9&lpg=PA139&dq=QUE+SUC
EDE+EN+LA+MEMBRANA+Y
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ource=bl&ots=iB_xzbGR68&si
g=UzeMCPUFjaVJHYKDD_yv
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ed=0CDIQ6AEwBA#v=onepag
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%20MEMBRANA%20Y
%20LOS
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%20LA%20REACCION
%20DE%20HILL&f=false

ANEXOS
AISLAMIENTO
CLOROPLASTOS

DE

Consulte si es posible aislar en

laboratorio otras organelas celulares
(Mitocondrias,
ribosomas, etc.) y detalle cada uno de
los procesos?
La centrifugacin diferencial es un
procedimiento
comn
en microbiologa y citologa,
usado
para separar ciertos orgnulos de su
respectiva clula para un anlisis
posterior de partes especficas de las
clulas. En el proceso, primero
se homogeniza una
muestra
de tejido para romper las membranas
celulares y mezclar los contenidos de
las clulas. Luego, esta mezcla
homognea
es
sometida
a
repetidas centrifugaciones, cada vez
removiendo
el precipitado,
e
incrementando la fuerza centrfuga.
Finalmente, la purificacin debe ser
hecha por la sedimentacin de
equilibrio, y la capa deseada es
extrada para un futuro anlisis.
La separacin est basada en el
tamao y la densidad, donde las
partculas ms grandes y densas son
precipitadas en centrifugaciones de
poca fuerza. Por ejemplo, las clulas

completas no homogenizadas sern

precipitadas en centrifugaciones con
poca fuerza y en cortos intervalos
como 1,000g por 5 minutos. Los
fragmentos ms pequeos de las
clulas y los orgnulos permanecen
en
el lquido
sobrenadante y
requieren ms fuerza centrfuga y
ms tiempo para precipitarse. En
general, uno puede enriquecer
(separar o concentrar) los siguientes
componentes de la clula, en orden
de separacin, con la presente
aplicacin:
Clulas completas y ncleos;
Mitocondria,
peroxisomas;

lisosomas

Microsomas (vesculas del retculo

endoplasmtico); y
Ribosomas y citosoles.
Centrifugacin
equilibrio

por

gradiente

de

Separar molculas basado en su

punto isopcnico. El mtodo consiste
en
centrifugar
preparaciones
biolgicas (u otras preparaciones) a
altas fuerzas y por largos periodos de
tiempo en soluciones que contienen
cantidades variadas de una molcula
viscosa.
Sedimentacin
densidades

de

equilibrio

de

La sedimentacin isopcnica usa un

gradiente de solucin como cloruro
de cesio o sacarosa para separar
partculas,
basndose
en
sus

diferentes
densidades
(masa/volumen. Una solucin es
preparada con la porcin de gradiente
con densidad ms alta en el fondo.
Despus, las partculas a separar son
aadidas al gradiente y luego
centrifugadas. Cada partcula es
procesada (igualmente arriba o abajo)
hasta que alcance un ambiente de
densidad comparable. Este gradiente
de densidad puede ser continuo o
preparado paso a paso.
2. Identifique las posibles funciones
de aislar organelas en el laboratorio.
Anexe
3
artculos que describan el uso de
estas tcnicas
2.1
http://www.medigraphic.com/pdfs/
neumo/nt-2010/nt103d.pdf
Aislamiento
de
organelos
en
macrfagos humanos infectados con
Mycobacterium tuberculosis
2.2
https://ibcmunq.files.wordpress.co
m/2010/03/tp2.pdfhttps://ibcmunq.fi
les.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf
Extraccin
y
cuantificacin
de
protenas
2.3
http://www.arareko.net/biology/bac
terial_endosymbionts_of_amoebae
/index.pdf
Identificacin
y
aislamiento de posibles legionella sp.
Como bacterias endosimbiontes de
amebas de vida libre

ANEXOS
MEDIDA
DE
REACCION
DE
HILL
CLOROPLASTOS AISLADOS

LA
EN

1. Identifique la importancia de
este experimento desde el
punto de vista de las
aplicaciones que pueda tener
Aplicaciones:
Determinacin del efecto de la
intensidad luminosa, calidad de la luz,
el pH, la temperatura, sobre la
actividad fotosinttica de cloroplastos
en condiciones in vitro y ex vitro.
Determinar, en condiciones de
laboratorio, el efecto de herbicidas
inhibidores del transporte electrnico
en cloroplastos, as como en la
bsqueda
de
candidatos
ms
eficientes.
Evaluacin y seleccin de lneas
modificadas
genticamente
con
resistencia a herbicidas cuyo sitio de
accin se localice a nivel de
cloroplastos.
Determinar la actividad fitotxica de
algunos compuestos alelopticos
desacoplantes de la cadena de
transporte electrnico en cloroplastos.
Clculo de la tasa de transporte
electrnico en trminos de umol
DCPIP reducido/mg clorofila/h y su
utilizacin como un ndice de vitalidad
cloroplstica.
Determinar la actividad fisiolgica de
toxinas cloroplastos-especficas de
diversos agentes fitopatgenos, as

como diferenciar la agresividad entre

diferentes cepas en base a la
produccin de toxinas.
2. Que sucede en la membrana
y en los cloroplastos durante
este proceso?
Mediante la reaccion de Hill es
posible
demostrar
y
caracterizar la relacion del
transporte de electrones con la
reaccion
luminica
de
la
fotosintesis
el
NADPH+,
receptor natural final, de la
cadena de transporte de
electrones,
toma
dos
electrones y dos protones y es
reducido a NADPH + H. En la

reaccion de Hill el receptor

final es sustituido por los
denominados reactivos de Hill;
entre los cuales se encuentra
la quinona, el DCPIP, el
hexacianato ferrico de potasio
III y el cianuro ferrico de
potasio. La reaccion de Hill se
lleva
a
cabo
utilizando
cloroplastos rotos, ya que la
membrana es impermeable
para
algunos
de
estos
6
reactivos.