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DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA HUMANA

MATERIA QUMICA BIOLGICA - CICLO LECTIVO 2016

TRABAJO PRCTICO 7
Trabajo Prctico de Laboratorio N 1

PRINCIPIOS DE COLORIMETRA
Toda medicin fotocolorimtrica consiste en la determinacin de la
concentracin de una sustancia por la cantidad de color que posee
naturalmente o que puede producir luego de una reaccin cromtica,
convenientemente elegida. Este procedimiento est basado en el hecho que
toda sustancia coloreada absorbe luz de una determinada longitud de onda ().
Cuando un tomo, ion o molcula absorbe un fotn, la energa agregada
produce una alteracin del estado, y se dice que las especies estn excitadas.
La excitacin puede involucrar alguno de los siguientes procesos:
1. transicin de un electrn a un nivel mayor de energa.
2. cambio en el modo de vibracin de las molculas con enlaces covalentes.
3. alteracin de su modo de rotacin alrededor de los enlaces covalentes.
La absorcin de la energa radiante por una solucin puede describirse por
medio de una grfica de absorbancia en funcin de la longitud de onda. Esta
grfica se denomina espectro de absorcin.
Por ejemplo, para el caso de la oxihemoglobina:

El espectro de absorcin frecuentemente se utiliza para propsitos de


identificacin cualitativa.

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Espectroscopa de absorcin
Considrese un haz de energa radiante con una intensidad inicial, Io, que
incide
sobre una celda cuadrada y pasa a travs de ella (cuyos lados son
perpendiculares al haz). La celda contiene una solucin de un compuesto que
absorbe energa radiante de una cierta longitud de onda (). La intensidad de la
energa radiante transmitida, Is, ser menor que Io. Parte de la energa radiante
ser reflejada por la superficie de la celda o absorbida por la pared de la celda
o el solvente. Por lo tanto, estos factores deben ser eliminados si se desea
considerar slo la absorcin del compuesto de inters. Esto se hace usando un
blanco que contiene todo menos el compuesto a ser determinado.
La transmitancia de un compuesto en solucin se define como la proporcin
de luz incidente que es transmitida:
Transmitancia = T = Is /Io
Usualmente esta razn se describe como un porcentaje (%T).
El concepto de transmitancia es importante porque slo puede medirse la luz
transmitida.
Cuando la concentracin de un compuesto en solucin aumenta, ms luz es
absorbida por la solucin y menos es transmitida. El porcentaje de T vara
inversamente y logartmicamente con la concentracin.
Sin embargo, es ms conveniente usar la absorbancia, A, la cual es
directamente proporcional a la concentracin.
Por lo tanto:
A = log Is/Io = log T = log (1/T)
Grficamente, si se grafica A o %T en funcin de la concentracin de la
solucin con el compuesto que absorbe energa, se obtienen los siguientes
grficos:

Ley de Lambert-Beer
La ley de Lambert-Beer o comnmente conocida como ley de Beer, establecida
en 1852 por Beer, quien postul que la reduccin de la energa radiante de un
haz de radiacin monocromtica es proporcional a la intensidad del haz y a la
cantidad de sustancia absorbente situada en su trayectoria. O sea que
establece que la concentracin de una sustancia es directamente proporcional
a la cantidad de energa radiante absorbida o inversamente proporcional al
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logaritmo de la energa radiante transmitida. Si la concentracin de una


solucin es constante y la longitud del paso de luz que atraviesa una solucin
se duplica, el efecto sobre la absorbancia es igual duplicar la concentracin, ya
que habr dos veces ms molculas absorbentes presentes en el paso de
energa radiante. De este modo la absorbancia tambin es directamente
proporcional a la longitud de la trayectoria que atraviesa la energa radiante a
travs de la celda. La relacin matemtica entre la absorcin de energa
radiante, la concentracin de la solucin, y la longitud del paso ptico se
demuestra por la ley de Beer:

A = a.b.c
donde A es la absorbancia o densidad ptica; a, absortividad; b, paso de luz de
la solucin en centmetros; y c, concentracin de la sustancia de inters.
Esta ecuacin forma las bases del anlisis cuantitativo por fotometra de
absorcin o espectroscopa de absorcin. Los valores de absorbancia no tienen
unidades.
La absortividad es una constante de proporcionalidad relacionada con la
naturaleza qumica del soluto y tiene unidades que son recprocas con las de b
y c.
Cuando c se expresa en moles por litro y b en centmetros, el smbolo e,
llamado absortividad molar (o coeficiente de extincin molar), se usa en lugar
de a y es una constante para un compuesto dado a una determinada longitud
de onda, bajo condiciones especficas de solvente, pH, temperatura, etc. Tiene
unidades de L/mol.cm (o sea: M-1.cm-1). Mientras mayor es la absortividad
molar, mayor es la absorbancia para la misma concentracin en trminos de
masa de dos compuestos.
Una vez probado que la sustancia sigue la ley de Beer a una longitud de onda
especfica (es decir, una grfica lineal de A contra c conteniendo el punto 0;0),
la concentracin de una solucin desconocida puede ser determinada midiendo
su absorbancia e interpolando su concentracin en la grfica de calibracin.
Por el contrario, cuando el %T se grafica frente a la concentracin (en un papel
milimetrado), se obtiene una relacin curva (similares a las mostradas
previamente).
La ley de Beer es una relacin matemtica ideal que contiene varias
limitaciones.
Por lo tanto, existen desviaciones de la ley de Beer, que implican variaciones
en la linealidad de la absorbancia contra la concentracin, y una de estas
causas es cuando se miden concentraciones muy elevadas de una sustancia.
Entonces la ley de Beer es aplicable slo a soluciones diluidas.
Tambin es sabido que, si dos o ms compuestos absorben a la longitud de
onda de la energa radiante incidente, cada uno con diferente absortividad, no
se cumplir la ley de Beer.
Los instrumentos que miden la absorbancia de soluciones contienen siete
componentes bsicos:
(1) una fuente estable de energa radiante;
(2) una hendidura de entrada para el enfoque de la luz;
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(3) un selector de longitud de onda;


(4) una hendidura de salida para el enfoque de la luz;
(5) un dispositivo para mantener el recipiente transparente (cubeta) que
contiene la solucin a ser medida;
(6) un detector de energa radiante;
(7) un dispositivo para leer la seal elctrica generada por el detector.

Si se utiliza un filtro como selector de longitud de onda, se dispone solo de luz


monocromtica a longitudes de onda discretas y el instrumento es llamado
fotmetro.
Si se usa un monocromador (esto es, un prisma o una red de difraccin) como
selector de longitud de onda, el equipo puede proporcionar luz monocromtica
sobre un intervalo continuo de longitudes de onda y es llamado espectrmetro
o espectrofotmetro.
En la fotocolorimetra se determina la cantidad de luz absorbida en un
determinado intervalo espectral por una determinada concentracin de
sustancia. En otras palabras, en los mtodos fotocolorimtricos, se comparan
intensidades luminosas para un determinado intervalo de longitud de onda.
Resumiendo, para el clculo de la concentracin de la sustancia que se
determina en una muestra, se realiza una curva de calibracin previa,
leyendo en el espectrofotmetro la absorbancia correspondiente a
distintas concentraciones conocidas de esa misma sustancia (conocida
como solucin testigo) y graficando A en funcin de la concentracin.
Interpolando en la regin lineal (donde se cumple la ley de Beer) el valor de
absorbancia medido, se puede conocer la concentracin de la sustancia
analizada en la muestra. En el caso que la absorbancia de la muestra sea
mayor que la absorbancia del ltimo punto de la recta, se deber realizar
nuevamente el ensayo con una cantidad de muestra menor (diluir la muestra)
para poder calcular la concentracin de la sustancia en estudio.

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TRABAJO PRCTICO N 1 CICLO LECTIVO 2016


CINTICA ENZIMTICA
ESTE TRABAJO PRCTICO TIENE COMO OBJETIVOS QUE EL ALUMNO
- ADQUIERA HABILIDADES EN EL MANEJO DE MATERIAL DE
LABORATORIO
- ANALICE EL DISEO DE UN PROTOCOLO DE TRABAJO
- DESARROLLE EL INSTRUCTIVO PARA LLEVAR A CABO EL
PROTOCOLO
- TRACE GRFICOS
- CALCULE PARMETROS A PARTIR DE UN GRFICO
- CALCULE EL KM Y VMAX DE UNA ENZIMA
- MANEJE UNIDADES DE CONCENTRACIN (DE SUSTRATO Y DE
PRODUCTO) Y
VELOCIDAD DE REACCIN,
- INTERPRETE LOS RESULTADOS

INTRODUCCIN
En el trabajo prctico se determinarn los parmetros cinticos de la enzima
ureasa. Esta enzima interviene en el metabolismo de la urea en
microorganismos, invertebrados y plantas. NO se encuentra en ninguna clula
humana.
La ureasa se utiliza en los laboratorios de anlisis clnicos como herramienta
para determinar la concentracin de urea en muestras de sangre (uremia) y
orina.
La concentracin de urea circulante est determinada por la produccin de
urea a nivel heptico y por la eliminacin de este metabolito a nivel renal. Si la
funcin heptica no est alterada, la uremia es uno de los parmetros utilizados
para evaluar la funcin renal, entre otros - creatininemia, clearance de
creatinina, etc.
PROCEDIMIENTOS
Todos los equipos trabajarn para analizar Productovs. Tiempo.
Cada lado de mesada trabajar con una Sustratoy calcular una velocidad
inicial (Vo) que informar al resto de la comisin.
Todos los alumnos harn el grfico de Vo vs. Sustratoy 1/Vo vs. 1/
Sustratocon los datos de toda la comisin para finalmente informar los
parmetros cinticos Vm y Km de una enzima.

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FUNDAMENTO DEL MTODO


Se usar la enzima UREASA, que hidroliza la urea produciendo CO 2 y NH3.

ureasa
UREA + H2O

CO2 + 2 NH3

El reactivo 1 contiene la ureasa y el buffer adecuado para la reaccin


enzimtica.
El reactivo 2 tiene pH alto -frena la reaccin- y contiene los reactivos para
cuantificar el NH3 producido, desarrollando un color entre amarillo y verde
esmeralda.
PRESTAR MUCHA ATENCIN AL PROTOCOLO, AL FRASCO DE UREA
QUE CORRESPONDEN A CADA MESADA Y AL N DE GRUPO DE
TRABAJO
Cada equipo hace una curva de Producto= f (t), con tubos conteniendo
idntica cantidad de enzima, sustrato, reactivos y variando el tiempo de
incubacin con el reactivo.
Cada equipo procesa 5 tubos con CANTIDAD DE UREA IGUAL EN TODOS
LOS TUBOS E INCUBACIONES DE 0, 5, 10, 20 y 30 MINUTOS

Mesada 1: urea = solucin stock en frasco rotulado: 0,6 mM


Mesada 2: urea = solucin stock en frasco rotulado: 0,9 mM
Mesada 3: urea = solucin stock en frasco rotulado: 1,5 mM
Mesada 4: urea = solucin stock en frasco rotulado: 2,0 mM
Mesada 5: urea = solucin stock en frasco rotulado: 3,0 mM
Mesada 6: urea = solucin stock en frasco rotulado: 6,0 mM
Mesada 7: urea = solucin stock en frasco rotulado: 9,0 mM
a) Cargar urea 0,5 ml / tubo de la concentracin que corresponda en todos los
tubos.
b) Agregar 1 ml de reactivo 1 al tubo 5 = tiempo de incubacin 30 minutos a 37
C. Anotar tiempo.
c) Pasados 10 minutos del anterior, agregar 1 ml de reactivo 1 al tubo 4 =
tiempo de incubacin 20 minutos a 37 C. Anotar tiempo.
d) Pasados 10 minutos del anterior, agregar 1 ml de reactivo 1 al tubo 3 =
tiempo de incubacin 10 minutos a 37 C. Anotar tiempo.
e) Pasados 5 minutos del anterior, agregar 1 ml de reactivo 1 al tubo 2 = tiempo
de incubacin 5 minutos a 37 C. Anotar tiempo.
f) Pasados 5 minutos del anterior, agregar 1 ml de reactivo 1 al tubo 1 = tiempo
de incubacin 0 minutos.
g) Inmediatamente, agregar 1 ml de reactivo 2 a todos los tubos, empezando
por el tubo 1 y siguiendo hasta el 5. Anotar tiempo.
h) Incubar 15 minutos a temperatura ambiente para el desarrollo de color.
i) Leer absorbancia de todos los tubos en el fotmetro con el filtro de 530 nm
contra tubo 1 = tiempo 0 minutos.
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j) Calcular la cantidad de producto (en mM) en cada tubo, utilizando el factor de


conversin F=2.12
k) Graficar productoen funcin del tiempo de incubacin. Atencin en las
unidades.
l) Calcular la velocidad inicial (Vo). Atencin en las unidades.
m) Armar la tabla de velocidad inicial (Vo) con cada una de las concentraciones
de sustrato, con los datos obtenidos por cada lado de mesadas centrales.
Atencin en las unidades.
n) Graficar velocidad inicial en funcin de sustrato. Atencin en las unidades.
o) Graficar dobles recprocas. Atencin en las unidades.
p) Calcular Km y Vmx. Atencin en las unidades.
PROTOCOLO
TUBO
N

UREA
(ml)

5
4
3
2
1

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

REACTIVO
1
(ml)
1
1
1
1
1

Tiempo
Incubacin
(Min)
30
20
10
5
0

REACTIVO Desarrollo
2
de color
(ml)
(Min)
1
10
1
10
1
10
1
10
1
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INFORME
GRUPO DE TRABAJO (ANOTE N DE GRUPO Y LOS APELLIDOS Y
NOMBRES DE LOSPARTICIPANTES DEL ENSAYO)
RESULTADOS PROPIOS: GRFICO producto= f (t)
CONCENTRACIN
(COMPLETAR)
TUBO N
1
2
3
4
5

DE

SUSTRATO

UTILIZADO

Tiempo de Incubacin
(Min)
0
5
10
20
30

SUSTRATO=

Absorbancia
530 nm

Calcular la cantidad de producto en cada tubo, utilizando el coeficiente de


extincin que le proveern los docentes. Completar la siguiente tabla (indicar
las unidades).
Absorbancia
530 nm

Eje Y
(NH3)
(mM)

Eje X
Tiempo de Incubacin
(minutos)
0
5
10
20
30

Realice Ud. el grfico producto en funcin de tiempo en papel milimetrado


y adjntelo.
- Segn el grfico que realiz, calcule la velocidad inicial (Vo) de la reaccin en
las condiciones de trabajo.
COMPLETAR (indicar las unidades)
UREA=
Vo =

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RESULTADOS DE LA COMISIN:
GRFICOS Vo en funcin de (sustrato)
1 / Vo en funcin de
(1/ sustrato)
Completar la siguiente tabla (indicar las unidades).
Eje Y
Vo

Eje X
UREA

Eje Y
1/Vo

Eje X
UREA

- Realice Ud. el grfico Vo en funcin de (sustrato) en papel milimetrado y


adjntelo.
- Realice Ud. el grfico 1 / Vo en funcin de (1 / sustrato) en papel
milimetrado y adjntelo.
- Calcular Km y Vm (indicar las unidades)
COMPLETAR (indicar las unidades)

Km =
Vmx =

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ELECTROFORESIS
Se dispondrn de geles de poliacrilamida-SDS 10% ya preparados para realizar una
corrida electrofortica en condiciones desnaturalizantes.

Sembrar muestras de protenas previamente preparadas con Sample Buffer


(Glicerol, SDS, -Mercaptoetanol en H2O. Qu funcin cumple cada componente?) y
calentadas por 15 minutos a 95C.
Largar la corrida electrofortica. Con el paso del tiempo, se puede observar
como avanza el frente de corrida. Mediante este mtodo, las protenas se separan por
sus diferencias en el peso molecular, ya que todas estn cargadas negativamente en
forma proporcional a su tamao mediante el uso de SDS.
En el laboratorio, se dispondr de geles teidos, membranas teidas y placas
de revelado; para observar los distintos pasos del Western Blot.
Ms informacin: http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish-wb-webinar.pdf

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