Glucocerebrosidasa(GCR;EC3.2.1.

45)esunamembranaasociadaaunaenzimalisosomal
[1,2]quecatalizalahidrlisisdeglucocerebrosidasaaglucosayceramida[35].Msde
300seidentificaronmutacionesenelgenGCR[6,7],quedancomoresultadoactividad
GCRinsuficiente,loqueconducealaenfermedaddeGaucher,elmsfrecuentetrastorno
dealmacenamientolisosomalhumana[6,810].Estaenfermedadsecaracterizaporuna
acumulacindeglicolpidosenlosmacrfagos,principalmenteenelhgado,elbazoyla
mdulasea,causandoanomalasfuncionalesenestosrganos.Laenfermedadpuedeser
clasificadoentresformasdeacuerdoconlaausencia(TipoI)olapresenciaylagravedad
delaslesionesenelsistemanerviosocentral(tiposIIyIII)[9,11a13].Eltratamientoms
comnysegurodelaenfermedaddeGaucherconsisteenlaterapiadereemplazode
enzimas(ERT)enlosquesedaunaenzimaactivaalospacientesconlostiposIyIII
enfermedadesporinfusionesintravenosas[5,8,14].ERThademostradosereficazdurante
unperiodode15aos,deteneryrevertirmuchosdelossntomasdelaenfermedad[7,15].
Laterapiafueintroducidaporprimeravezen1991porelusodeunproductoderivadode
placentaquefuesustituidoadicionalmenteen1994porunaformarecombinante,producido
enclulasovricasdehmsterchino(CHO)[7].Enlaactualidad,lasnuevaspreparaciones
enzimticasestnsiendoinvestigadoseincluyenGCRusandofibroblastoshumanosde
genesactivados[16,17]yGCRhumanarecombinantederivadadelasplantas[18,19].Los
anticuerposantiGCRsonherramientasimportantesytilesparacaracterizarGCR
producidaenunnmerodesistemasdeexpresin,incluyendoclulasdeinsectos[9,20],
clulasdeplantas[18]yclulasdemamfero[2123].LosanticuerposantiGCRtambin
sepuedenutilizarparadiscriminarentreloscasosnoneuropticosyneuropticosdeeste
trastorno,comosedemuestraporGinnsycolaboradores[24,25],yparacaracterizarlas
formasmolecularesdelaenzimaenindividuosnormalesyenpacientesconTiposI,IIyIII
formasdelaenfermedad[3,11,2629].Hastaahora,losanticuerposantiGCR(tanto
monoclonalesypoliclonales)hansidoproducidocontraGCRpurificadoapartirde
placentahumana[24,30,31].Sinembargo,estaesunafuentelimitadaquerequiere
muchospasoscomplejosparalapurificacinGCR[32].Aqu,sedescribelaproduccinde
anticuerpospoliclonalesantiGCRhumanosmurinoscontraunGCRrecombinante
expresadaenEscherichiacoliysepurificmedianteunacromatografacargadaconnquel
columna.ElusopotencialdelosanticuerposparacaracterizarGCRsedemostrmediante
anlisisdeinmunotransferenciadelosextractoscelularesysobrenadantesdecultivode
clulasCOS7transfectadastransitoriamenteconlosmamferosplsmidosdeexpresin
quecontienenelGCRADNchumanobajoelcontroldelpromotortardoprincipalde
adenovirus(AdMLP).Adems,losanticuerposerancapacesdereconocerGCRendgeno
enECV304ylneascelulareshumanasHeLa.Losresultadosdemostraronlafactibilidad
deproducirpoliclonalanticuerposcontraGCRrecombinanteobtenidoenE.coli.La
especificidadylacalidaddelantisueroproducidofuerondescritos,ascomola
funcionalidaddelosmamferosplsmidosdeexpresin,loqueconfirmaquesepueden
usarparalatransfeccinestabledeclulasCHOenelfuturo.
Materialesymtodos
GCRdeamplificacindeADNcyclonacinProcedimientosElGCRdeADNchumanose
obtuvoporpurificacindelARNtotaldeclulasECV304(ATCCCRL1998),seguidode
lasntesisdeADNcatravsdeRTPCR(resultadosnomostrados).LosADNcde1519pb

quecodificanGCRhumanaquecarecedelpptidosealseamplificporPCRusandoel
cebadordirecto(50GGATCCGCCCGCCCCTGCATCCCTAAAA30)quecontiene
unsitioderestriccinBamHI,yelcebadorinverso(50GAATTCGTGCCTCCTTGA
GTATCT30)quecontieneunsitioderestriccinEcoRI.PCRserealizutilizandoADN
polimerasaPfx(Invitrogen,Carisbad,CA,EE.UU.),0,2mMdecadatrifosfatode
desoxinuclesidoy20pmoldecadacebador.laamplificacinporPCRcondicionesfueron
lassiguientes:94C,5min;30ciclosde94C,1min;47C,45s;68C,3min;yunsolopaso
de68C,7minparalaextensinfinal.LosproductosdePCRseclonaronenelvector
pGEMT(Promega,Madison,WI,EE.UU.).DH5adeE.coliclulascompetentesse
transformaronconelproductodeligacinparalapropagacinyamplificacindelaADN
recombinante.LosclonespositivosseconfirmaronporsecuenciacindeADNusandoun
secuenciadordeADNautomatizado(ABI3100)basadoenelmtododideoxytermination
[33].LosplsmidoresultadopGEMTGCRsedigiriyelinsertosesubclonenlossitios
BamHIyEcoRIdelpAE,unvectordeexpresindeE.colibasadoenelpromotorT7,que
permitelaexpresindeprotenasrecombinantesenfusinconunaetiquetadeseishistidina
(his96tag)enelextremoNterminal[34].ParalaexpresinGCRenclulasdemamfero,
elGCRdeADNchumanoseamplificysesubclonenelvectordeexpresinpED,
proporcionadoamablementeporelDr.RJKaufman(HowardHughesMedicalInstitute,
UniversidaddeMichigan),queproporcionaaltosnivelesdeexpresindeprotenas
heterlogasenbaseaunasistemadeexpresindicistrnico[35].Seobtuvierontres
construccionesdeplsmidosparalaexpresinenclulasdemamfero(1)UncDNAGCR
clonadoconsupropiasealdepptido;(2)UncDNAGCRfusionadoaunpptidosealde
lacadenakappadeIg(IGJ);(3)UncDNAGCRfusionadoaIGJyparaunhis96etiqueta
enelGCRNterminalparafacilitarlapurificacindeprotenasporelnquelcargado
cromatografa.Exp
ExpresinenE.coli
LasclulascompetentesdeEscherichiacoliBL21SI(Gibco/BRL)fueron
transformadaconelplsmidopAEGCRysecultivaronenplacasdurantelanochea30C
enmedioLBsinNaClyquecontiene100lg/mldeampicilina(LBONamperios).Una
solacoloniaseinoculen20mldemedioysehicieroncrecerdurantelanochea30C.
Despusde16h,elcultivosediluy100vecesen1LdemediodeLBONamp.cuando
DO600alcanzado0,6,NaClseaadialmedioaunaconcentracinfinalde300mMpara
lainduccindelaexpresinGCRrecombinante.Despusde3h,lasclulasserecogieron
porcentrifugacin,seresuspendieronen100mldetampndelisis(NaCl300mM,100
mMTrisHCl)pH8,8yselisaronenpresinfrancesa(ThermoElectronCorporation,San
Jose,CA,EE.UU.).Loslisados celularessecentrifugarona26,0009gpara15min.Los
cuerposdeinclusininsolublesselavaroncon20mldetampndeunin(NaCl500mM,
50mMTrisHClpH8,8)quecontiene1Mdeurea.Despusdelacentrifugacin,los
cuerpos de inclusin se disolvieron en 20 ml de tampn que contiene 5 mM de b
mercaptoetanoly8Mureadeunin.
Discusin
LosanticuerposantiGCRsonherramientasimportantesparalacaracterizacin

deGCR,laenzimalisosomalquecausalaenfermedaddeGauchercuandosealterasu
actividadenzimtica.anticuerposmonoclonalesypoliclonalesespecficostienen
yasehaproducidoelusoderatonesoconejosinmunizadosconderivadadeplacentaGCR
[24,30,31],despusdecomplejolosprocedimientosdepurificacindelaenzima[32].
Aunquepoliclonalanticuerposnoproporcionanunsuministrocontinuocomo
anticuerposmonoclonales,noexisterestriccinparaproducir
Higo.5 Anlisis detransferencia de Western de GCRendgeno en HeLa y ECV 304
clulas humanas, utilizando el murino antiGCR producida antisuero policlonal. Los
carriles 1,2extractocelular delas clulas COS7transfectadas conel plsmido pED
IgjGCRyCOSnotransfectadas7clulas,respectivamente(muestrasdecontrol),carril3
humanarecombinanteGCRde56kDapurificadaapartirdeE.coli(controlpositivo),carril
4 masa molecular estndar, carriles 5, 6 no transfectadas HeLa y ECV 304 lisados
celulares,respectivamente.LosGCRendgenosglicosiladadeHeLayclulasECV304se
indicanmediantelaflecha
elantgenoparafinesdeinmunizacindelosanimales.Adems,anticuerpospoliclonales
tienenlaventajadeserobtenidoenuntiemporelativamentecorto,conpocainversin
financieraencomparacinconanticuerposmonoclonales[37,38],ypuedeserutilizado
con xito en las tcnicas inmunolgicas. La habilidad de los reactivos policlonales de
reconocerunamultiplicidaddeeptoposesinteresanteenalgunosensayosinmunolgicos,
donde
ladeteccindeunamolculapodraversecomprometidaporlausodeunnicoeptopo
[37].Adems,elusodeE.colirecombinantesderivadosdeGCRtambinfacilitarala
produccindeanticuerposmonoclonalesusandoinmunizadoLosratonesconesteantgeno.
AdemsdesuaplicabilidadadiscriminarlasdiferentesmasasmolecularesdeGCR,tanto
en individuos sanos y pacientes de Gaucher [11, 2629], los anticuerpos antiGCR se
puedenutilizarparaanalizarnuevoformulacionesdeenzimasrecombinantes,propuestos
para teraputico utilizar. Desde GCR es una protena glicosilada, su expresin ha sido
investigado en los sistemas eucariotas complejos, tales como la planta y clulas de
mamfero[17,18,22].Sinembargo,sistemasbacteriaspuedenrepresentarunaalternativa
interesante
obtenerlaenzimaparalaproduccindeanticuerpos.MI.coliconstituyelaplataformade
expresinmsbienestablecidaquepromuevelaaltaproduccindeprotenasconbajo
costo.
ApesardequeenlossistemasdebacteriasdelGCRestinactiva[36],antisueroespecfico
GCRpuedeserproducidousandounnoglicosiladaGCR.Porlotanto,enestetrabajo
describimoslaexpresinGCRenE.coliymostrlaproduccindeantiGCRanticuerpos
policlonalesenratonesBALB/cinmunizadosconlaprotenapurificada
ElADNcnoeraGCRcodonesoptimizadosperolaprotenafueproducidaconxito
enE.coliBL21SI.Adems,elusodepAEvector[34]paraclonarelADNcGCRenel
marcoconunaetiquetaenhis6xNterminalpermitilapurificacinGCRporunsolo
cromatogrficopasoatravsdenquelcargadoderesina.LosGCRpurificadaseutiliz
parainmunizarratones,conduciendoaaltaLosttulosdeanticuerpos,comoseevalupor
ELISAysemuestraenHigo.2.Puestoqueesteenfoqueeramuyeficiente,lainmunizacin
especiesdeanimalesdemayortamaotambinsepuedenadaptaraampliarlaproduccin
deantisueroantiGCRengrandecantidades.Porotraparte,conelfindeevaluarlaeficacia

delanticuerpoparadetectardetiposalvajeGCRglicosilada,tenemosclonadoelADNc
GCR en la expresin de mamfero pED vector [35]. Tres diferentes construcciones se
utilizaronparatransfeccintransitoriadeclulasCOS7.EnelPEDGCRconstruir,se
mantuvoelpptidosealGCRnativo,mientrasqueenelplsmidoPEDIgjGCR,elIGC
maduro
secuenciasefusionaalpptidosealsecretoraIGJelobjetivoparaobteneraltosnivelesde
laGCRenelmediodecultivo.Adems,elplsmidopEDIgj69hisGCRexpresauna
GCRconunhis96tagenelextremoNterminalparafacilitarla
lapurificacindeprotenas.EnelanlisisdetransferenciaWestern,utilizando
losanticuerposproducidos,bandasdeprotenasde56kDay
6466kDasedetectcomolanoglicosiladay
formasglicosiladasdeGCR,respectivamente
Deacuerdoconlaliteratura,laGCRhumanaesunmonmerode
497aminocidosquecontienecincoputativoNglicosilacin
sitios,cuatrodeloscualesestnnormalmenteocupados[9].sumolecular
tamaovarade59aalrededorde69kDa[27],deacuerdoconla
complejidaddelascadenasdecarbohidratos.Talcomofuerevisadopor
Fabregaetal.[22],sehanreportadotresbandaspararepresentar
GCRglicosilada.Inicialmente,laescisindelaGCR
pptidolderseobtieneunpolipptidonoglicosiladade56kDa
queseconvierteenelncleodelasreaccionesdeglicosilacin.
Unaformaprecursoradeaproximadamente63kDasesintetiza
concadenasdeoligosacridosdetipomanosaalta,y
posteriorprocesamientodeloshidratosdecarbonomitadesresultados
enlasestructurasdetipocomplejosialiladosintermediosde
6669kDa.Estasformasdelaenzimasetransportanala
lisosomasymodificadoporexoglicosidasaslisosomales,
dandocomoresultadola59kDaGCRformamadura[22,29,39].
SereconocieronbandasdeGCRconaproximadamente64kDa
porelanticuerpoenlisadosdeclulastransfectadasconlostres
plsmidos:PEDGCR,PEDIgjGCRyPEDIgj69
hisGCR.Adems,unabandadeprotenade56kDa,quecorresponde
aunGCRnoglicosilada,sedetectsloenpEDGCR
(Fig.3,carril2).Enestecaso,lapresenciadela
pptidoldernativoGCRposiblementeresultenelmayor
losnivelesdelaexpresinGCR,causandoacumulacinde
protenasparaserdirigidasaprocesodeglicosilacin.Sobreel
Porotrolado,elGCRsecretadaobservaenlacultura
sobrenadantedeclulastransfectadasconelPEDIgjGCR
plsmidomuestra66kDaylaformanoglicosilada
noseobserv(Fig.4,carril3).Laprotenade56kDa
sedetectbandaslodespusdelareaccindedesglicosilacin
conPNGasaF,unaglucosidasaqueeliminatodoslosNligado
hidratos de carbono (Fig. 4, carril 4). la secrecin de GCR es un dependiente de
glicosilacin

proceso[21].Adems,esunGCR
enzimalisosomalasociadaalamembranaque,encondicionesnaturales
condiciones,sesecretadelasclulasanivelesmuybajos
oinclusonosecretada.Sinembargo,elusodeunafuerteexpresin
LossistemaspuedenllevaralagrancantidaddeGCRenel
mediodecultivo,segnloinformadoporLeonovayGrabowski
[21].Estosautoresdetectaronunamasamoleculardeaproximadamente
69kDadeGCRsecretadadeCHOyhumano
clulasdefibroblastos,mientrasqueun64kDaseobservparaintracelular
GCR.Porlotanto,lasformasmolecularesdeGCRdetectaron
poranlisisdeexpresintransitoriaaquseajustana
losdescritosenlaliteratura.
AdemsdelanlisisdetransfeccintransitoriadeclulasCOS7
clulas,elensayodeinmunotransferenciadeloslinajesdeclulashumanas
demostradoelpotencialdelosanticuerpospoliclonalesantiGCR
anticuerposparareconocermuestrashumanas.elmolecular
masade59kDadetectadaenHeLayECVlisadosdeclulas304
(Fig.5,carriles5y6)seajustanalaespera
GCRformamadura[22,29,39].
Enconclusin,hemosdemostradoqueelIGCexpresenE.coli,aunqueinactivos,fue
capaz de inducir la produccin de anticuerpos policlonales antiGCR especficos, til
herramientasparacaracterizarGCRenmuestrasclnicasoparamonitorearexpresinGCR
recombinante.Adems,elxitodelaexpresintransitoriadeGCRenclulasdemamfero
indica que los plsmidos de expresin caracterizado aqu pueden ser utilizado para la
transfeccinestableenclulasCHOparaGCRproduccin.