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CAPTULO 2

TCNICA ANALTICA

DESENVOLVIMENTO E VALIDAO DE UMA TCNICA ANALTICA


PARA A QUANTIFICAO DE LAMOTRIGINA EM PLASMA HUMANO

_______________________________________________
2.1. INTRODUO
A crescente dependncia criada entre pases nos ltimos anos est na origem da vigente
necessidade dos resultados dos mtodos analticos serem internacionalmente aceites.
Consequentemente, a validao das metodologias analticas cada vez mais importante,
procurando assegurar um nvel comum (mnimo) de qualidade. A determinao de frmacos em
matrizes biolgicas uma das reas que depende da validao dos mtodos, pois, por exemplo,
um ensaio de bioequivalncia s ser oficialmente reconhecido pelas autoridades competentes
se demonstrar que foi realizado com base numa metodologia validada (Hartmann et al., 1998).
Por este motivo, a validao dos mtodos analticos tem sido alvo de crescente interesse por
parte das agncias reguladoras, o que se tornou particularmente evidente, a partir da dcada de
90.
A primeira conferncia sobre o tema Analytical Methods Validation: Bioavailability,
Bioequilvalence and Pharmacokinetic Studies foi realizada em Washington em 1990. Esta
conferncia, que reuniu pela primeira vez cerca de 500 cientistas de todo o mundo (provenientes
de vrias reas, nomeadamente, personalidades do ramo da indstria, das agncias reguladoras
e do meio acadmico) resultou na elaborao de um relatrio onde se sistematizaram os
princpios orientadores e recomendaes a aplicar na validao dos mtodos analticos (Shah et
al., 1991; 1992a; 1992b). A publicao deste relatrio foi feita em vrios jornais (Pharmaceutical
Research; Journal of Pharmaceutical Sciences; International Journal of Pharmaceutics;
European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics; Journal Association of Official
Analytical Chemists), com o objectivo de obter uma vasta disseminao da informao pela
comunidade cientfica. Esta conferncia foi ainda considerada como a pedra basilar para o
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Captulo 2 Tcnica Analtica

posterior desenvolvimento de orientaes formais nesta matria pelas agncias reguladoras.


Aps essa data, foi constatada uma melhoria na qualidade dos dados submetidos s agncias
reguladoras (Shah e Midha, 1995). Porm, subsistiu alguma controvrsia nas concluses
retiradas da Conferncia de Washington de 1990, que foram posteriormente analisadas por
alguns autores (Hartmann et al., 1994) e apontadas numa conferncia realizada em Munich, em
1994 (Hartmann et al., 1995). Algumas das concluses resultantes desta conferncia so a
confirmao do trabalho realizado por Kringle (1994). Por outro lado, Hooper (1995) chamou a
ateno para a necessidade de se fundamentar os critrios de aceitao em consideraes
estatsticas, pois s assim possvel retirar concluses fiveis quanto conformidade ou no
conformidade dos mtodos. Dez anos passados sobre a Conferncia de Washington de 1990, o
tema foi novamente discutido em reunio (Shah et al., 2000). A este propsito, interessa referir
que as orientaes dadas actualmente pela FDA (Guidance for Industry, 2001) so baseadas
nas deliberaes proferidas nestas duas conferncias (Shah et al., 1992b; Shah et al., 2000).
Actualmente o registo de novos medicamentos exige a validao da metodologia analtica,
e por isso, algumas entidades reguladoras estabeleceram documentos oficiais que funcionam
como directrizes a adoptar no processo de validao (EMEA, 1995a; EMEA, 1995b; EMEA,
1998; Guidance for Industry, 2001). S um processo de validao bem definido e documentado
fornecer evidncias objectivas de que o mtodo est adequado ao objectivo a que se prope.

2.1.1. Conceitos gerais, terminologia e legislao


Para garantir que um mtodo analtico gera informao fivel sobre uma amostra, este
deve sofrer uma avaliao que se designa por validao. A validao um processo contnuo
que tem incio no planeamento da estratgia analtica, e continua ao longo do desenvolvimento
do mtodo. Na verdade, muitas vezes impossvel determinar exactamente onde que acaba o
desenvolvimento do mtodo e comea sua validao, pois os dois andam intimamente ligados
(Eurachem Guide, 1998).
A validao pode ser definida como a avaliao sistemtica de um procedimento analtico
para demonstrar que est sob as condies nas quais deve ser aplicado (WHO, 1992). Trata-se
pois de definir requisitos do mtodo e confirmar que este possui capacidade de desempenho
consistente com o que se pretende da sua aplicao (Eurachem Guide, 1998).
Dentro do mbito geral, possvel distinguir dois tipos de validao: (1) a validao
laboratorial (in house validation) e (2) a validao total ou completa (full validation). A primeira

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Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

consiste em validar um novo mtodo que est a ser desenvolvido, ou verificar se um mtodo
adoptado de outras fontes est a ser bem aplicado. Nesta abordagem so avaliadas todas as
caractersticas de desempenho, porm sem analisar a reprodutibilidade. A segunda avalia a
reprodutibilidade da metodologia atravs de um estudo inter-laboratorial, utilizado para averiguar
como se comporta a metodologia com determinada matriz em diferentes laboratrios. Interessa
referir a este propsito, que uma metodologia s ser aceite como oficial para determinada
aplicao se tiver sido sujeita a um processo de validao total ou completa. Por vezes
estabelece-se alguma confuso na terminologia, no entanto, o termo robustez (robustness ou
ruggedness) refere-se avaliao da capacidade que um mtodo possui de resistir a pequenas
variaes nas condies do mtodo (ex: pH ou composio da fase mvel), enquanto que o
termo reprodutibilidade est normalmente reservado para os estudos entre laboratrios
(Hartmann et al., 1998).
Por outro lado, podemos definir diferentes nveis de validao; o termo validao parcial
pode ser utilizado quando est em causa um estudo parcial motivado por modificaes
introduzidas numa tcnica j validada (ex: alteraes no intervalo de concentraes; mudana no
sistema de deteco; diminuio do volume de amostra - amostras peditricas; alterao da
matriz biolgica, ou simplesmente a alterao do anticoagulante utilizado na recolha da amostra)
(Guidance for Industry, 2001). No entanto, alguns autores preferem falar em revalidao e
validao cruzada (Dadgar et al., 1995; Bressolle et al., 1996). A primeira refere-se
necessidade de uma nova avaliao face a alteraes significativas ao mtodo validado (ex.
diferenas significativas na extraco da amostra ou nas condies cromatogrficas). A
alterao da coluna cromatogrfica ou da fase mvel poder alterar a linearidade e a
selectividade do mtodo, porm, no produz qualquer efeito sobre a eficcia da extraco da
amostra. A este respeito, podemos encontrar algumas orientaes sobre a revalidao de
mtodos analticos no trabalho de Daghar et al. (1995). A preciso, a exactido e o limite de
quantificao so considerados como os testes mnimos requeridos durante um processo de
revalidao (Jenke, 1996c). A expresso validao cruzada est relacionada com a aplicao de
um mtodo validado a outras condies, nomeadamente, a matrizes biolgicas diferentes (ex:
homogeneizado de crebro vs. soro vs. plasma), provenientes de diferentes espcies (ex:
plasma de rato vs. plasma humano) (Dadgar et al., 1995; Bressolle et al., 1996), ou quando se
pretende comparar dois ou mais mtodos analticos (ex: o mtodo validado serve de referncia
ao novo mtodo, que, por sua vez, pode funcionar como alternativa ao primeiro) (Lang e Bolton,
1991a; Guidance for Industry, 2001).
Existem razes legais, tcnicas e comerciais que justificam a implementao da validao
dos mtodos. Os dados analticos pouco fiveis podem conduzir a decises desastrosas e
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Captulo 2 Tcnica Analtica

prejuzos financeiros irreparveis. Actualmente, para provar a sua competncia tcnica, os


laboratrios sujeitam-se avaliao de vrios parmetros por parte de rgos de mbito
nacional ou internacional, nos chamados processos de acreditao.
Nos ltimos anos, principalmente na dcada de 90, assistimos publicao de vrios
artigos e revises a respeito da validao dos mtodos analticos (Mehta, 1989; Cardone et al.,
1990; Lang e Bolton, 1991a; 1991b; Jenke, 1996a; 1996b; 1996c), e especificamente sobre
mtodos bioanalticos (Buick et al., 1990; Karnes e March, 1991; Karnes et al., 1991; Shah et al.,
1991; 1992a; 1992b; Hartmann et al., 1994; Dadgar et al., 1995; Shah e Midha, 1995; Braggio et
al., 1996; Bressolle et al., 1996; Wieling et al., 1996; Hartmann et al., 1998; Shah et al., 2000),
nos quais podemos encontrar definies, procedimentos, parmetros e estratgias de validao.
Infelizmente, as estratgias e definies nem sempre so coincidentes. Uma tentativa para
harmonizar estas diferenas foi feita atravs da ICH (International Conference on
Harmonization) (EMEA, 1995a; EMEA, 1995b) para os produtos farmacuticos, na qual os
representantes das indstrias e as agncias reguladoras dos EUA, Unio Europeia e Japo
definiram os parmetros, requisitos, e em alguns casos, tambm as metodologias para a
validao dos mtodos analticos. A FDA (Guidance for Industry, 2001) e o grupo EURACHEM
(1998; 2000) publicaram tambm os seus documentos.
No obstante o facto de importantes organismos internacionais, como a IUPAC
(International Union of Pure and Applied Chemistry), a ISO (International Organization for
Standardization) e a AOAC (Association of Official Analytical Chemists) terem redigido
documentos tcnicos que definem guias de orientao para a validao de mtodos analticos,
tambm nestes se verificam diferenas (Hartmann et al., 1998), o que origina certamente alguma
confuso no que respeita a nomenclatura e conceitos. A maioria das definies sugeridas pela
ICH corrobora as de outras organizaes internacionais, tais como, IUPAC, ILAC (International
Laboratory Accreditation Conference) e WELAC (Western European Laboratory Accreditation
Cooperation). Contudo, as definies de selectividade e especificidade sugeridas pela ICH
foram criticadas por Vessman (1996).

2.1.2. Validao da tcnica analtica cromatogrfica


Os mtodos analticos para a quantificao de frmacos e seus metabolitos em amostras
biolgicas desempenham um papel fundamental na avaliao e interpretao de resultados

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Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

provenientes de estudos de biodisponibilidade (BD) e bioequivalncia (BE), e de estudos


farmacocinticos

(Shah

et

al.,

1992a).

Geralmente,

para

realizao

de

estudos

farmacocinticos no exigida a validao completa da metodologia analtica, porm, a


validao do mtodo deve incluir o estudo da sua aplicao s amostras que motivaram o seu
desenvolvimento, por exemplo, s amostras dos doentes (Shah et al., 1992a).
A validao de um mtodo define-se como o conjunto de todos os procedimentos
necessrios para demonstrar que determinado mtodo, concebido para quantificar um analito
(ou uma srie de analitos), numa dada matriz biolgica, suficientemente fivel para originar
resultados com elevado grau de confiana. Assim, essencial que determinado mtodo se
encontre bem caracterizado e validado de forma a originar resultados que possam ser
satisfatoriamente interpretados (Shah et al., 1992a).
Na validao de um mtodo analtico mltiplas variveis devem ser consideradas, desde o
processo de colheita da amostra, ou o tipo de matiz biolgica, ao procedimento utilizado na
preparao da amostra, separao cromatogrfica, deteco, e finalmente anlise dos
dados obtidos (Bressolle et al., 1996). Durante o desenvolvimento da tcnica analtica a
validao deve incluir o protocolo escrito, o plano operacional previamente elaborado e que inclui
a definio do sistema a validar, a descrio detalhada do procedimento experimental, a
identificao dos parmetros de validao e a definio dos critrios de aceitao. Por fim, deve
proceder-se elaborao de relatrios tcnicos - onde devem constar todos os resultados dos
ensaios em que se baseiam quaisquer concluses da validao (Shah et al., 1992b).
Os parmetros essenciais para assegurar a fiabilidade de um mtodo analtico de
quantificao de substncias em matrizes biolgicas so os seguintes: linearidade, preciso,
exactido, sensibilidade, limite de quantificao (LQ) e limite de deteco (LD), selectividade,
especificidade, eficcia da extraco, estabilidade do analito na matriz biolgica e a robustez do
mtodo (quando aplicvel). Assim, o processo de validao de um mtodo cromatogrfico
desenvolvido para quantificar substncias em matrizes biolgicas pode ser esquematicamente
representado pela Figura 2.1.
A disperso de informao e a quase inexistncia de orientaes oficiais, data do
desenvolvimento da metodologia analtica, levou-nos a uma procura exaustiva na bibliografia de
princpios orientadores para a validao dos mtodos analticos no sentido de se pr-definirem
critrios de aceitao adequados para o fim em causa.

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Captulo 2 Tcnica Analtica

Desenvolvimento e

Estudos preliminares

optimizao do mtodo
NO

Resultados
Promissores?

NO
SIM
SIM

LINEARIDADE
Modelo de calibrao

NO

Reduzir gama de
concentraes/
alterar modelo?

OK?

NO

Alterar
volume de
amostra?

SIM
SIM

PRECISO

EXACTIDO

SIM

NO

ESPECIFICIDADE/SELECTIVIDADE

Reduzir gama de
concentraes/
Aumentar pontos
da curva?

SIM

NO

LQ

OK?

NO

Amplitude de
concentraes

OK?
SIM
SIM
Limites?

LD

NO

ESTABILIDADE (MATRIZ)

SIM

ROBUSTEZ

Uso a longo
prazo?

NO

Descrio final do procedimento analtico

Figura 2.1. Representao esquemtica da validao de uma tcnica analtica para quantificao de um
analito numa matriz biolgica.
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Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

2.1.3. Parmetros analticos


2.1.3.1. Curva de calibrao e linearidade

A relao entre o sinal medido (rea ou altura do pico) e a massa ou concentrao do


analito expressa por uma equao matemtica, designada por curva de calibrao. Para definir
adequadamente a relao entre a concentrao e a resposta necessrio recorrer a um nmero
suficiente de padres (5 a 8 padres, sem incluir o branco ou seja, o ponto zero), devendo
abranger toda a gama de concentraes esperadas (Shah et al., 1992a). As directrizes da ICH
especificam um mnimo de 5 pontos para o estudo da recta de calibrao (EMEA, 1995b).
Embora alguns procedimentos analticos necessitem de recorrer ao modelo de calibrao
no-linear (o que, normalmente, se traduz num maior nmero de padres necessrios para
definir a relao resposta-concentrao), o mais comum utilizar o modelo linear, atravs do
Mtodo dos Mnimos Quadrados. Nesta abordagem, a varivel independente (x) a
concentrao e a varivel dependente (y) a resposta cromatogrfica, assumindo que a medida
do erro igual e normalmente distribuda para cada amostra (Bressolle et al., 1996).
No entanto, o modelo de regresso linear s poder ser correctamente aplicado se as
suas assunes forem cumpridas, o que nem sempre acontece quando se est perante
intervalos de concentrao amplos e dinmicos, como acontece, frequentemente, nos estudos
farmacocinticos. Por vezes, pode ser necessrio recorrer ao modelo de regresso linear
ponderada, se a condio de homoscedasticidade no cumprida, ou seja, quando a varincia
no igual para todos os pontos da recta de calibrao.
A este propsito remetemos o assunto para o Captulo 3, onde se faz o estudo do modelo
de regresso que melhor ajusta os dados das curvas de calibrao obtidas durante a validao
da tcnica analtica.

2.1.3.1.1. Linearidade (e intervalo ou amplitude de concentraes)

A capacidade de obter resultados linearmente proporcionais concentrao de analito na


amostra dentro de um intervalo determinado, designa-se por linearidade (Jenke, 1996a). Em
qualquer tcnica instrumental, a relao linear s vlida para uma gama de concentraes,
designada aqui, por intervalo de concentraes. Este intervalo estabelecido quando se
confirma que o mtodo apresenta um grau aceitvel de linearidade, exactido e preciso, para

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Captulo 2 Tcnica Analtica

as concentraes compreendidas entre os valores especificados (EMEA, 1995b). O uso de


extrapolao para alm dos extremos da recta de calibrao no est recomendado, quer acima
do padro de concentrao mais elevado, quer abaixo do padro de concentrao mais baixa,
ou seja, abaixo do limite de quantificao (LQ) (Hartmann et al., 1998).
A linearidade do mtodo pode ser demonstrada atravs do estudo estatstico dos
parmetros da recta (y=a+bx): o declive (b), a ordenada na origem (a) e o coeficiente de
correlao (r). O declive deve ter um valor estatisticamente diferente de zero, a ordenada na
origem no dever ser estatisticamente diferente de zero e o coeficiente de correlao da recta
de calibrao no deve ser significativamente diferente de 1 (Bressolle et al., 1996).
A linearidade frequentemente testada apenas utilizando o coeficiente de correlao, r.
Quando r=1, este parmetro indica-nos que todos os pontos se encontram exactamente sobre
uma linha de declive positivo; quando r=0 indica-nos a falta de correlao entre a varivel
dependente (y) e a varivel independente (x). No entanto, a magnitude de r, s por si, constitui
um mau indicador de linearidade (Miller, 1991). De facto, o valor de r indica-nos apenas o grau
de dependncia entre duas variveis (Analytical Methods Committee, 1988). Para alm disso, foi
j demonstrado que uma percentagem considervel de erros no extremo inferior da recta de
calibrao pode coexistir com coeficientes de correlao aceitveis, erros esses que so
subestimados na anlise das medidas de disperso dos parmetros da regresso, a e b
(Mulholland e Hibbert, 1997).
O estudo da homogeneidade de varincias faz parte da avaliao da curva de calibrao
(Captulo 3). Este estudo pode colocar em questo a aceitabilidade do intervalo assumido pela
varivel x. Na prtica, uma diferena significativa de varincias implica ou a diminuio do leque
de concentraes considerado, ou a ponderao da regresso linear.

2.1.3.2. Sensibilidade, limite de deteco e limite de quantificao

A sensibilidade de um mtodo relaciona-se com a variao mnima que preciso impor


grandeza a medir (concentrao) para se obter uma variao significativa do resultado da
medio (sinal). Um mtodo ser considerado sensvel se pequenas variaes na concentrao
(x) originarem grandes alteraes na resposta medida (y). A sensibilidade , por conseguinte,
definida pelo declive da recta de calibrao (Mehta, 1989), e portanto, se o modelo de regresso
o linear, pode ser medida em qualquer ponto da recta de calibrao. Embora relacionados
entre si, a sensibilidade no deve ser confundida com o limite de deteco (LD), nem com o

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Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

limite de quantificao (LQ), que esto relacionados com a capacidade do mtodo em detectar
concentraes baixas.

2.1.3.2.1. Limite de deteco

O limite de deteco (LD) define-se como a quantidade mais baixa de analito numa
amostra que pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada (Buick et al., 1990).
Esta tambm a definio utilizada pela ICH (EMEA, 1995a). Uma das definies mais comuns
de LD, aceite internacionalmente, assume que o mais pequeno sinal que possvel distinguir do
sinal do branco relaciona-se com este e com o seu desvio-padro (Miller, 1991).
O limite de deteco de uma tcnica analtica pode ser determinado por 3 processos: (A)
avaliao visual (EMEA, 1995b), (B) relao sinal/rudo (EMEA, 1995b) e o (C) mtodo baseado
em parmetros da curva de calibrao (Miller, 1991; EMEA, 1995b).
O primeiro mtodo (processo A), baseia-se na adio de quantidades conhecidas de
analito a uma matriz, de forma a que seja possvel distinguir o sinal analtico e o rudo da linha de
base, estabelecendo-se assim o LD atravs da menor quantidade que possvel visualizar, ou
seja detectar. Este procedimento tambm pode ser realizado introduzindo parmetros no
processo de integrao do instrumento analtico.
A relao sinal/rudo (processo B) s pode ser aplicada nos casos em o instrumento exibe
uma linha de base. Esta relao obtida por comparao dos sinais apresentados por amostras
com baixas concentraes conhecidas, com o sinal apresentado pela matriz isenta do composto
de interesse. A concentrao mnima para a qual a substncia pode ser detectada assim
estabelecida, sendo geralmente aceite uma proporo de 3:1 ou 2:1 (EMEA, 1995b). Nos
mtodos cromatogrficos, o LD , frequentemente, calculado com base na relao obtida para a
altura do pico e a mxima flutuao do rudo da linha de base (geralmente 3:1) medida para uma
dada distncia (20 vezes a largura do pico medido a meia altura). Porm, para os mtodos
bioanalticos, os brancos da matriz so frequentemente caracterizados por picos interferentes,
capazes de alterar a avaliao da linha de base, pelo que este tipo de determinao do LD no
, geralmente, o mais apropriado. Para alm disso, esta avaliao baseada na altura do pico, e
muitas vezes, o sinal recomendado para a quantificao do analito a rea do pico (Hartmann et
al., 1998).

O limite de deteco pode ainda ser determinado com base na curva de calibrao e as
respectivas medidas de disperso.
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Captulo 2 Tcnica Analtica

Assim, o LD pode ser expresso em unidades de resposta (Miller, 1991):

LD = Br + K Br

(Equao 2.1)

onde br representa a resposta do branco, estimada como a mdia de ybr, e br o desvio-padro


da medida do sinal do branco, estimado por SBr.
O correspondente LD, expresso em unidades de concentrao, XLD, pode ser obtido por:

X LD =

K S Br
b

(Equao 2.2)

onde K uma constante qual foi atribudo o valor de 3, segundo recomendao da IUPAC, b
o declive da recta de calibrao.
SB uma estimativa do desvio-padro da medida do branco, que pode ser determinada
B

pela ordenada na origem (Miller, 1991). Por vezes, esta medida de desvio-padro pode ser
obtida a partir do desvio-padro residual obtido para a recta de calibrao ou da estimada do
desvio-padro da ordenada na origem (Hartmann et al., 1998). Esta recomendao dada pela
ICH (EMEA, 1995b).
Segundo a definio da IUPAC, para um K=3, o CV no limite de deteco ser de 33,3%
(Miller, 1991). O factor de multiplicao K=3, geralmente considerado como mnimo (Hartmann
et al., 1998).
O clculo do LD atravs dos parmetros da curva de calibrao e sua disperso (processo
C) certamente um processo menos subjectivo j que se apoia em consideraes estatsticas.

2.1.3.2.2. Limite de quantificao

O limite de quantificao (LQ), define-se, por sua vez, como a quantidade mais baixa de
analito numa amostra que pode ser quantificada com preciso e exactido aceitveis (Buick et
al., 1990). O LQ equivale concentrao mais baixa da curva de calibrao e deve ser
determinado atravs do clculo do coeficiente de variao e medidas de exactido apropriadas,
utilizando pelo menos 5 padres independentes (Shah et al., 1992b). Os valores mdios devem
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Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

estar compreendidos entre limites fixos, normalmente devem representar 20% do valor nominal
e apresentar um coeficiente de variao que no exceda os 20% (Shah et al., 1992b).
Para alm do exposto, alguns autores utilizam uma abordagem semelhante que foi
referida para o clculo do LD (EMEA, 1995b). comum a definio do LQ atravs de uma
equao semelhante equao 2.2, donde,

X LQ =

K S Br
b

(Equao 2.3)

em que o K assume um valor de 10 ou 20; para um coeficiente de variao de 10% ou 5%,


respectivamente (Karnes et al., 1991; Miller, 1991).
Uma vez estabelecido o LQ, este deve ser usado como limite operacional (Karnes et al.,
1991), ou seja extrapolaes para valores alm da curva de calibrao no esto
recomendadas, a menos que se demonstre boa exactido e preciso nos procedimentos de
diluio ou concentrao das amostras.

2.1.3.3. Especificidade e selectividade

A especificidade de um mtodo pode ser definida como a capacidade de avaliar, de forma


inequvoca, o analito, na presena de componentes que podem interferir com a sua
determinao, ou seja, sem interferncias de nenhum outro composto presente na amostra
(compostos endgenos) (Bressolle et al., 1996). A selectividade define-se, por sua vez, como a
capacidade de um mtodo em detectar simultaneamente substncias qumicas diferentes,
presentes numa mesma amostra, nomeadamente produtos de degradao, metabolitos ou
frmacos administrados concomitantemente (Bressolle et al., 1996).
Por vezes, os termos selectividade e especificidade so utilizados indistintamente,
podendo originar alguma confuso desnecessria. Um mtodo instrumental que produz uma
resposta para uma nica substncia de interesse pode ser chamado especfico (o analito o
nico responsvel pelo sinal medido); um mtodo que produz resposta para vrias entidades
qumicas, pode ser chamado selectivo, caracterizando-se pela existncia de uma resposta
preferencial para a substncia de interesse; portanto, podemos falar em grau de selectividade,
enquanto que a especificidade uma caracterstica de natureza absoluta (Vessman, 1996).

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Captulo 2 Tcnica Analtica

Dado que nos mtodos cromatogrficos comum a resposta a vrias substncias


simultaneamente, o termo selectividade foi sugerido como o mais apropriado (Karnes et al.,
1991). Esta terminologia utilizada pela FDA (Guidance for Industry, 2001).
A especificidade/selectividade pode ser avaliada de vrias formas. Karnes et al. (1991)
sugerem que uma forma simples de avaliar a especificidade demonstrar a ausncia de
resposta no branco da matriz biolgica. Esta avaliao consiste no exame minucioso de
diferentes amostras de brancos de matriz biolgica, provenientes de diferentes fontes, ao longo
do intervalo de tempo esperado para obter os picos de interesse (Karnes et al., 1991). Portanto,
esta prova faz-se por comparao da matriz isenta da substncia de interesse, com a matriz
adicionada com a substncia (padro), e deve demonstrar que no existe interferncia no tempo
de reteno do composto em anlise, nem do padro interno, caso se utilize. A Conferencia de
Washington recomenda a utilizao de pelo menos 6 amostras independentes da mesma matriz
biolgica (Shah et al., 1992a).
A especificidade pode tambm ser avaliada atravs do estudo da ordenada na origem (a),
com o objectivo de averiguar se este parmetro da recta de calibrao ou no
significativamente diferente de zero (teste F) (Karnes et al., 1991).
No entanto, os maiores problemas relacionados com a especificidade/selectividade
devem-se presena de metabolitos ou produtos de degradao. Para avaliar a selectividade da
metodologia analtica podemos recorrer (Mehta, 1989; Karnes et al., 1991; Bressolle et al., 1996;
Jenke, 1996b):
I) a outros mtodos ou estratgias de deteco do analito, por exemplo, fazer a deteco a
diferentes comprimentos de onda para avaliar a pureza do pico, ou utilizando detectores dotados
de maior especificidade para a substncia (ex: espectrometria de massa);
II) a outras tcnicas, ou mesma tcnica cromatogrfica em condies diferentes (ex:
outra coluna cromatogrfica com diferente selectividade);
III) colheita de amostras biolgicas nos doentes, preferencialmente em diferentes
tempos, o que especialmente importante nos estudos farmacocinticos, onde previsvel a
presena de metabolitos e/ou outros frmacos que estejam a ser administrados ao doente fora
do mbito do estudo;
IV) ao mtodo de adio de padro, em que quantidades conhecidas de analito so
adicionadas a uma amostra real (ex: ensaio clnico), a qual pode conter metabolitos. Neste caso,
deve verificar-se uma relao linear entre a concentrao de analito adicionado e a resposta
obtida. Este mtodo particularmente til quando no possvel obter matriz isenta da
substncia de interesse.

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Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

Numa determinao analtica em que a concentrao (x) medida em funo de uma


resposta (y) desejvel que a matriz no influencie essa resposta. Em caso de haver alguma
contribuio da matriz, esse facto pode levar a um erro sistemtico constante ou proporcional,
que se traduzir em falta de especificidade (Figura 2.2) (Karnes et al., 1991). Alguns autores
defendem que a avaliao da especificidade/selectividade deve ser includa no estudo do Bias
ou Vis (Hartmann et al., 1998).

b)

Resposta

Resposta

a)

Concentrao

Concentrao

Figura 2.2. Efeito da matriz biolgica (-----) nas curvas de calibrao.

A determinao de frmacos em amostras biolgicas decorrentes de estudos


farmacocinticos em doentes est sujeita a um maior nmero de potenciais interferentes (devido
aos frmacos que so administrados concomitantemente, fora do mbito do estudo),
comparativamente com o que sucede, por exemplo, quando se analisam amostras provenientes
de voluntrios sos, nos ensaios clnicos. Nestas circunstncias e dado que seria impossvel
testar todas as possibilidades de interferncia, est recomendado que se faa o estudo dos
frmacos que previsivelmente iro ser administrados simultaneamente (Mehta, 1989).

2.1.3.4. Preciso e exactido

A preciso e a exactido so dois dos parmetros principais na validao dos mtodos,


pois determinam a sua aceitao.
77

Captulo 2 Tcnica Analtica

2.1.3.4.1. Preciso

A preciso de um mtodo uma medida de disperso que caracteriza os valores


analticos em redor da sua mdia. Define-se como sendo o grau de concordncia entre os
valores de uma srie repetida de ensaios analticos (EMEA, 1995a).
A preciso pode ser avaliada a trs nveis: o estudo da repetibilidade ou estudo intra-dia, a
preciso intermdia e a reprodutibilidade (Hartmann et al., 1998).
O estudo da preciso intra-dia ou repetibilidade do mtodo considerado como a medida
da preciso do mtodo sob condies ptimas, isto , nas mesmas condies instrumentais,
sobre a mesma amostra, pelo mesmo tcnico, no mesmo laboratrio, e no decurso de uma
mesma srie de ensaios efectuados num curto intervalo de tempo, geralmente durante um dia.
Este estudo feito em vrias preparaes da mesma amostra, e no deve ser confundido com a
preciso instrumental, que avaliada por uma sequncia de injeces repetidas da mesma
preparao.
A preciso avaliada pelo desvio-padro e coeficiente de variao (CV) das respostas
obtidas para uma mesma concentrao. Este parmetro tambm conhecido por desvio-padro
relativo - RSD (Relative Standard Deviation) e pode ser dado pela equao:

CV (%) =

100

(Equao 2.4)

onde o desvio-padro absoluto e a mdia aritmtica das respostas (determinaes).

A preciso intermediria avalia a influncia de variaes dentro do mesmo laboratrio:


diferentes dias, diferentes analistas ou diferentes equipamentos (EMEA, 1995a). O estudo da
preciso, entre vrios lotes de determinaes, durante vrios dias, comummente designado por
ensaio inter-dia, est geralmente sujeito a maior variabilidade, e por isso considerado como
uma medida mais representativa dos resultados a serem observados durante a utilizao do
mtodo na rotina (Bressolle et al., 1996).
Por fim, segundo a ISO, reprodutibilidade o grau de concordncia entre os valores
obtidos pelo mesmo mtodo, para a mesma amostra, sob condies diferentes (operador, local,
equipamentos) (Hartmann et al., 1994). Por norma, o termo reprodutibilidade expressa a
preciso entre laboratrios. A sua avaliao s se faz (se necessrio) aps completa validao

78

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

por um laboratrio, ou seja, depois do estudo da robustez do mtodo (Hartmann et al., 1998). O
estudo da reprodutibilidade exigido em metodologias oficiais, por exemplo, em caso de
padronizao de procedimentos para posterior incluso em farmacopeias (EMEA, 1995a; EMEA,
1995b).
Normalmente, em estudos farmacocinticos, a avaliao da preciso feita com base no
estudo da repetibilidade ou ensaio intra-dia e no estudo da preciso a diferentes tempos ou seja,
o ensaio inter-dia.

2.1.3.4.2. Exactido

A exactido de um mtodo define-se como sendo a capacidade de um mtodo analtico


em dar resultados o mais prximo possvel do valor real ou verdadeiro. A ICH, define exactido
como o grau de concordncia entre o valor obtido num ensaio e um valor de referncia aceite
como verdadeiro (EMEA, 1995a).
Segundo a AOAC e a ISO, o termo exactido traduz a combinao do erro sistemtico e
do erro aleatrio, enquanto a avaliao do erro sistemtico deve ser indicada apenas como Bias
ou Vis (Hartmann et al., 1994; Hartmann et al., 1998).
O ensaio de avaliao da exactido do mtodo pode ser realizado conjuntamente com o
ensaio da preciso (Hartmann et al., 1998). comum realizar esta avaliao recorrendo adio
de quantidades conhecidas de substncia de referncia matriz, a diferentes nveis de
concentrao. A exactido dada pela diferena entre a quantidade de analito adicionada, que
conhecida, e a concentrao de analito obtida pelo mtodo (Jenke, 1996b). Estatisticamente, o
erro sistemtico ou seja, o Bias ou Vis pode ser determinado por anlise de regresso, e por
anlise comparativa (teste t) (Hartmann et al., 1998).
Assim, para cada nvel de concentrao, o Bias ou Vis obtido atravs da comparao
entre a concentrao observada (Cobs) e a concentrao terica ou nominal (Cnom); sendo que,
Cobs representa a mdia aritmtica das determinaes efectuadas (x), obtida atravs da
introduo das respostas (y) na equao do modelo de regresso da curva de calibrao.
O clculo deste erro obtido pela seguinte equao (Braggio et al., 1996; Wieling et al.,
1996):

Bias (%) =

C nom C obs
100
C nom

(Equao 2.5)

79

Captulo 2 Tcnica Analtica

Para alm desta abordagem, a exactido pode ainda ser avaliada por (1) comparao de
mtodos e pelo (2) mtodo de adio de padro (Hartmann et al., 1998).
O mtodo de adio de padro particularmente til quando impossvel obter a matriz
isenta de analito (ex: compostos endgenos). Neste caso, procede-se adio de quantidades
conhecidas da substncia de interesse a uma matriz que contem j essa substncia. No entanto,
este mtodo no permite detectar um erro sistemtico constante.
A comparao de mtodos um recurso til quando no possvel obter preparaes
homogneas por adio de analito ao branco de matriz, e quando no possvel obter o branco
de matriz (matriz isenta de analito). o processo utilizado sempre que se pretende avaliar o
comportamento de um mtodo que foi transferido de outro laboratrio ou quando se pretende
estabelecer um mtodo alternativo (Hartmann et al., 1998). A anlise de regresso pode ser
utilizada para realizar este estudo comparativo (Hartmann et al., 1997).

2.1.3.4.3. Critrios de aceitao

A Conferncia de Washington estabeleceu um mnimo de 5 determinaes por cada


concentrao e um mnimo de 3 nveis de concentrao para avaliar a exactido e a preciso:
um nvel perto do LQ, um nvel mediano (ou simplesmente o centro da amplitude de
concentraes), e um nvel prximo do extremo superior da curva de calibrao (Shah et al.,
1992b).
A ICH estabelece um mnimo de 9 determinaes para a avaliao da repetibilidade (3
concentraes/3 determinaes cada) (1995b) e a ISO sugeriu 8 dias x 2 determinaes para os
3 nveis de concentrao (Hartmann et al., 1998).
Segundo a Conferncia de Washington, os valores mdios obtidos devem representar 15
% do valor nominal considerado como verdadeiro, excepto no LQ em que este valor pode
assumir 20%. A preciso em redor do valor mdio no dever exceder os 15%, excepto para o
LQ, em que o coeficiente de variao pode assumir um valor menor ou igual a 20% (Shah et al.,
1992b). O significado destes limites foi discutido por Hartmann et al. (1994).

80

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

2.1.3.5. Ensaio de recuperao ou eficcia da extraco

Por norma, as amostras biolgicas so submetidas a um tratamento prvio (ex: extraco


com solvente orgnico) antes de serem sujeitas aos mtodos instrumentais de anlise. Essa
preparao pode ser mais ou menos complexa, mas sempre causa de erro e de diminuio do
rendimento da tcnica. A maioria dos processos leva a perda de analito por partio incompleta,
ou adsoro. Torna-se, por isso, imprescindvel avaliar a capacidade de recuperao do
procedimento analtico ou seja, a sua eficcia durante a extraco.
A recuperao absoluta a medida da resposta de uma matriz adicionada de analito,
expressa em percentagem do padro puro, no sujeito a qualquer pr-tratamento (Bressolle et
al., 1996). Nos mtodos cromatogrficos (HPLC), a recuperao pode ser determinada por
comparao da rea/altura do pico da amostra sujeita a extraco, com o pico produzido por
idntica quantidade de analito reconstitudo no fludo (preferencialmente na fase mvel), para
cada nvel de concentrao (Mehta, 1989). Este tipo de avaliao que compara a matriz com o
solvente puro designado por recuperao relativa, expressa em percentagem da medida obtida
no solvente puro (Karnes et al., 1991). Considerando que o rendimento do ensaio pode variar
com a concentrao, a eficincia da extraco deve ser avaliada a, pelo menos, trs nveis de
concentrao, ou seja, dois nveis perto dos extremos da curva de calibrao (um nvel de
concentrao baixa e outro nvel de concentrao alta) e um nvel intermdio (Mehta, 1989).
Nos mtodos de padro interno (Pi), esta substncia deve igualmente ser submetida ao
estudo de recuperao, na concentrao utilizada no ensaio (Bressolle et al., 1996). Afinal, a
correco da extraco uma das razes que justificam o uso do padro interno (Hooper, 1995).
Logo, este estudo consistir na comparao dos valores obtidos pela anlise dos extractos de
matriz adicionada de analito (com e sem Pi) e de padro interno (sem analito), com os valores
obtidos a partir da anlise das respectivas solues-padro do analito (com e sem Pi) e do Pi
(sem analito).
Assim, a recuperao, em percentagem, pode ser descrita pela seguinte equao
(Ramachandran et al., 1994):

Re cuperao (%) =

AExtr .
100
ASol .

(Equao 2.6)

81

Captulo 2 Tcnica Analtica

sendo que, para um dado nvel de concentrao de LTG e/ou Pi, AExtr a rea do pico
obtido a partir da amostra de plasma submetida a extraco, ou seja, o extracto; enquanto que
ASol a rea do pico obtido a partir da correspondente soluo aquosa. Na avaliao da eficcia
da extraco da LTG juntamente com o Pi, A ser substitudo pela correspondente razo
ALTG/APi.
No que respeita aos critrios de aceitao definidos para estes ensaios, os valores obtidos
devem ser reprodutveis e preferencialmente com valores acima de 75% (Mehta, 1989). Alguns
autores estabeleceram um valor mnimo de 70% (Braggio et al., 1996), mas valores de 50, 80 e
90% foram j descritos (Karnes et al., 1991).
Em geral, prefervel obter resultados precisos mesmo que a percentagem de
recuperao seja baixa (Hooper, 1995). Por vezes, a recuperao do mtodo sacrificada em
prol de uma maior selectividade; no obstante, o mtodo aceitvel desde que demonstre ter
sensibilidade, preciso e exactido adequadas (Dadgar et al., 1995).
A recuperao do mtodo reflecte-se no Bias (e especificidade/selectividade), pelo que a
avaliao deste erro poder ser considerada como suficiente (Hartmann et al., 1998).

2.1.3.6. Estabilidade

A avaliao da estabilidade uma parte fundamental da validao de mtodos


desenvolvidos para a quantificao de substncias em matrizes biolgicas, pois sem esta
garantia, os subsequentes dados farmacocinticos so questionveis. Existem vrios factores
que podem alterar a estabilidade, nomeadamente a temperatura, o tempo de conservao, a
concentrao de analito, o tipo de fluido biolgico e at a espcie animal (Timm et al., 1985).
Segundo a Conferncia de Washington, a estabilidade do analito na matriz biolgica deve ser
avaliada durante o processo de armazenamento da amostra (Shah et al., 1992b). O objectivo
deste estudo averiguar se as amostras do estudo se encontram adequadamente conservadas
no momento da anlise (Bressolle et al., 1996).
A avaliao da estabilidade do analito na matriz biolgica dever incluir o (1) estudo da
estabilidade a curto prazo - nas condies normais de processamento (temperatura ambiente), e
de armazenamento (4C, -20C) da amostra no laboratrio; o (2) estudo da conservao das
amostras por longos perodos de tempo (ex: congelao a -20C, durante 12 meses) e eventuais
ciclos de congelao/descongelao. Para alm disso, a estabilidade do extracto seco e/ou
extracto reconstitudo pode ser tambm importante, sobretudo quando as amostras so
processadas por meio de injectores automticos. Neste caso, as amostras reconstitudas podem
82

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

a permanecer por perodos de tempo, muitas vezes, superiores a 48 horas, designadamente,


quando necessrio repetir a anlise (Dadgar et al., 1995; Bressolle et al., 1996; Hartmann et
al., 1998).
Normalmente, a avaliao da estabilidade na matriz biolgica feita por comparao das
respostas das amostras (obtidas por adio de analito matriz), sujeitas a condies definidas
de temperatura e de tempo, com as respostas das amostras preparadas no momento da anlise
(amostras de referncia). Uma outra estratgia de estudo da estabilidade passa pela preparao
de todas as amostras no mesmo dia, sujeitando as amostras de referncia a nitrognio lquido ou
a temperaturas inferiores a -130C durante o seu armazenamento (Dadgar et al., 1995). Com
estas condies, a degradao praticamente nula (Dadgar et al., 1995), no entanto, esta
tcnica est limitada pela necessidade de equipamento especializado.
Os ensaios de estabilidade das amostras devem decorrer nas mesmas condies a que
estas so sujeitas durante a rotina laboratorial, de forma a averiguar se o analito sofre
degradao temperatura de conservao (ex. -20C ou -80C) ou se, porventura, se verificam
fenmenos de adsoro do analito s paredes do recipiente seleccionado para a recolha e/ou
armazenamento da amostra (ex: tubos de vidro, eppenddorfs).
A Conferncia de Washington recomenda o estudo de 2 nveis de concentrao (baixa e
alta) em duplicado (Shah et al., 1992b). Hooper (1995) recomenda o uso de aproximadamente
10 amostras para que a comparao seja estatisticamente significativa. A comparao feita
atravs de uma razo entre as mdias das amostras de estabilidade e das amostras de
referncia, a qual dever estar compreendida entre 90-110%; os intervalos de confiana das
razes devero estar compreendidos entre 80-120% (Hooper, 1995). O estudo da estabilidade
com base em consideraes estatsticas foi desde cedo abordado por Timm et al. (1985).

2.1.3.7. Robustez

Apesar da robustez do mtodo no ter sido considerada na Conferncia de Washington


(Shah et al., 1992b), o seu estudo adquire, certamente, maior importncia quando se pretende
aplicar o mtodo por longos perodos de tempo e/ou aplic-lo em diferentes laboratrios. um
dos parmetros abordados nas recomendaes da ICH (EMEA, 1995a; EMEA, 1995b) e
normalmente avaliado na fase final do desenvolvimento/validao de um mtodo, com o
objectivo de investigar de forma sistemtica os procedimentos/condies que necessitam de um
rigoroso controlo durante a sua aplicao na rotina (Dadgar et al., 1995; Hartmann et al., 1998).

83

Captulo 2 Tcnica Analtica

Alguns autores incluem a avaliao da robustez no estudo da preciso (Hartmann et al.,


1998). A robustez avalia-se atravs do efeito que pequenas alteraes nas condies
operacionais da anlise produzem sobre a fiabilidade do mtodo. So exemplo destas pequenas
alteraes, a mudana de operador, a existncia de grandes intervalos de tempo entre os
perodos operacionais, pequenas modificaes instrumentais ou alteraes das condies
cromatogrficas (alteraes de pH, de composio da fase mvel, de temperatura) (Bressolle et
al., 1996). Durante o processo de extraco da amostra, importante estudar a influncia de
pequenas variaes de pH, da fora inica, ou dos volumes de solvente orgnico/aquoso
utilizados; relativamente ao mtodo cromatogrfico propriamente dito, deve-se estudar o efeito
de pequenas variaes na composio da fase mvel, no pH do tampo, na temperatura
ambiente e o impacto da utilizao de diferentes colunas cromatogrficas do mesmo tipo (o
mesmo material de enchimento, mas com fases estacionrias de lotes diferentes, ou diferentes
processos de fabrico) (Dadgar et al., 1995; Hartmann et al., 1998). Em HPLC, diferentes colunas
cromatogrficas do mesmo fabricante, so uma fonte comum de variabilidade (Bressolle et al.,
1996). Para avaliar a robustez das colunas, alguns autores recomendam a utilizao de, pelo
menos duas colunas de diferentes lotes (Dadgar et al., 1995), enquanto outros sugerem a
utilizao de trs colunas, duas de diferentes lotes do mesmo fabricante e pelo menos uma
coluna de um fabricante diferente (Jenke, 1996c).

84

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

2.2. MATERIAIS E MTODOS


2.2.1. Desenvolvimento da tcnica analtica
Os materiais de referncia, lamotrigina (LTG) BW430C78 [3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)1,2,4-triazina] e o seu padro interno (Pi) BW725C78 [3,5-diamino-6-(2-metoxifenil)-1,2,4triazina] (anlogo estrutural), foram cedidos pela Glaxo Wellcome (Cardiff, Reino Unido) (Figura
2.3); o branco de plasma humano foi cedido pelo Instituto Portugus de Oncologia (Coimbra,
Portugal); o acetato de etilo, o metanol, o cloreto de sdio, o hidrxido de sdio, o
hidrogenofosfato de potssio e a trietilamina foram adquiridos Merck (Merck KGaA, Darmstadt,
Alemanha).
A tcnica utilizou um cromatgrafo BAS-480 equipado com uma bomba PM-80, um
injector manual Rheodyne com um bucle de 50 L e um detector de UV/Vis BAS UV-116
(Bioanalytical Systems Inc., Lafayette Indiana Ocidental, EUA.).
A separao cromatogrfica processou-se numa coluna LiChrospher 100 RP-18 (5 m)
LiChroCART 125-4 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha), temperatura ambiente, com uma
fase mvel constituda por 35,0% metanol, 64,7% hidrogenofosfato de potssio 0,1 M e 0,3%
trietilamina, a um fluxo de 1,0 mL/min. A deteco foi realizada a 306 nm.
Os padres de lamotrigina, com concentraes finais de 0,1; 0,5; 2,5; 5,0; 10,0 e 15,0
mg/L, foram obtidos por adio de alquotas de soluo-me de LTG e das solues intermdias
a branco de plasma.

Figura 2.3. Lamotrigina (LTG) BW430C78 [3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-triazina]a) e padro


interno (Pi) BW725C78 [3,5-diamino-6-(2-metoxifenil)-1,2,4-triazina]b).
85

Captulo 2 Tcnica Analtica

2.2.1.1. Preparao da amostra

A extraco da LTG e do Pi a partir da matriz biolgica foi baseada no mtodo


apresentado por Fraser et al. (Fraser et al., 1995) e Sallustio & Morris (Sallustio e Morris, 1997).
Aps a adio de 100 l da soluo de Pi (40 mg/L) a 1 mL de amostra, procedeu-se sua
basificao com NaOH 2M. Posteriormente, adicionou-se acetato de etilo, seguido de agitao e
centrifugao a 1585 g. Finalmente, a camada orgnica foi transferida para um tubo de vidro
cnico e evaporada secura a 45C. O resduo foi reconstitudo com fase mvel imediatamente
antes de ser injectado no sistema cromatogrfico (Figura 2.4).

1 mL amostra
(plasma/soro)
+ 100 L Padro Interno 40 mg/L
+ 1 mL NaOH 2M
VRTEX (10 seg.)

+ 5 mL Acetato de Etilo
VRTEX (10 seg.)

AGITAO HORIZONTAL
(400 oscil./min.)

CENTRIFUGAO
(1585 g; 10 min.; 15C)

Fase aquosa

Fase orgnica

EVAPORAO
(N2 ; 45C)

Resduo seco

H.P.L.C

Figura 2.4. Esquema representativo da preparao da amostra.

86

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

2.2.2. Validao da tcnica analtica


A validao do mtodo consistiu no estudo dos parmetros analticos de fiabilidade:
linearidade, especificidade, selectividade, sensibilidade, preciso, exactido, recuperao e
estabilidade.

2.2.2.1. Curva de calibrao e linearidade

A linearidade foi testada para as concentraes compreendidas entre 0,1 mg/L e 15,0
mg/L. Para a realizao do ensaio intra-dia, cada nvel de concentrao foi analisado 5 vezes,
enquanto que o ensaio inter-dia decorreu ao longo de 5 dias. Os dados obtidos foram
representados graficamente para obteno da razo entre a rea da LTG e a rea do Pi
(ALTG/APi) vs. concentrao de LTG. Aps a anlise dos dados obtidos, optou-se pelo mtodo de
regresso linear ponderada, utilizando o inverso do quadrado da concentrao como factor de
ponderao (ver Captulo 3). Estes dados foram usados para o estudo subsequente dos
parmetros de fiabilidade da validao.

2.2.2.2. Sensibilidade, limite de deteco e limite de quantificao

O limite de deteco (LD) da tcnica analtica foi determinado atravs da equao, XLD=K
SBr/b (equao 2.2.), onde XLD o LD expresso em concentrao, o K uma constante qual foi
atribudo o valor de 3, segundo recomendao da IUPAC, b o declive da recta de calibrao e
SBr uma estimativa da disperso do branco, determinada pelo desvio-padro da ordenada na
origem (Sa) (Miller, 1991). O limite de quantificao (LQ) foi avaliado de acordo com as medidas
de preciso e exactido, tal como foi discutido anteriormente.

2.2.2.3. Especificidade e selectividade

Para estudar a especificidade do presente mtodo foram analisadas seis amostras


independentes de branco de plasma humano, isto , desprovido de frmaco (Karnes et al., 1991;
Shah et al., 1992b).

87

Captulo 2 Tcnica Analtica

Uma vez que a LTG normalmente usada em associao com outros frmacos, para a
avaliao da selectividade do mtodo foram estudadas vrias substncias activas consideradas
como potenciais interferentes: carbamazepina, fenitona, cido valprico, fenobarbital, primidona,
vigabatrina, gabapentina, clobazam, clonazepam, midazolam e paracetamol. O estudo consistiu
na comparao dos cromatogramas obtidos para cada frmaco com o cromatograma tpico da
LTG e do Pi. Para alm disso, foram tambm analisadas amostras de doentes a diferentes
tempos de colheita para avaliar a presena de eventuais metabolitos interferentes.

2.2.2.4. Preciso e exactido

A preciso e a exactido foram avaliadas com o mesmo conjunto de dados (5


determinaes para cada concentrao), utilizando as equaes 2.4 e 2.5, respectivamente.
Esta avaliao foi feita no conjunto total de dados (6 nveis de concentrao) obtidos no ensaio
intra-dia e no ensaio inter-dia.

2.2.2.5. Recuperao

Este estudo consistiu na comparao dos valores obtidos pela anlise dos padres do
analito (com e sem Pi) e do Pi (sem analito) na matriz biolgica, com os valores obtidos a partir
da anlise das respectivas solues-padro do analito (com e sem Pi) e do Pi (sem analito).
As amostras utilizadas para o estudo da recuperao do mtodo foram preparadas por
adio de alquotas de concentrao conhecida de LTG e/ou Pi ao branco de plasma. As reas
dos picos de LTG e/ou Pi, depois de submetidas a extraco, foram comparadas com as reas
obtidas aps injeco directa dos correspondentes padres preparados em metanol. O estudo
da recuperao de LTG na presena do padro interno implicou a utilizao da razo das
respectivas reas (ALTG/APi).
Nesta anlise, as reas dos picos de LTG/Pi obtidas aps injeco directa so
consideradas como o 100%. O Pi foi adicionado s solues imediatamente antes da injeco no
sistema cromatogrfico.
Este procedimento permitiu avaliar a recuperao de amostras que contm LTG na
presena do Pi, do analito isoladamente ou do Pi isoladamente, por anlise de cinco rplicas
para cada concentrao (para 3 nveis de concentrao) no mesmo dia (Wieling et al., 1996).

88

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

2.2.2.6. Estabilidade

A avaliao da estabilidade foi conduzida de acordo com as recomendaes de Hooper


(1995). Esta avaliao incluiu: (1) estudo do analito na matriz a 4C (conservao no frigorfico) e
o (2) estudo do analito na matriz a -25C (congelao).
As amostras utilizadas para o estudo da estabilidade do frmaco na matriz biolgica foram
preparadas por adio de uma alquota de concentrao conhecida de LTG (2,5 e 10 mg/L) a um
branco de plasma, e posteriormente armazenadas a 4C e a -25C.
A avaliao foi efectuada por anlise de dez rplicas em cada dia, de acordo com a Figura
2.5. A anlise dos dados foi feita por comparao das respostas (rea do pico) obtidos no dia da
anlise (dia N), com as respostas obtidas no primeiro dia do estudo (dia 0) - data a partir da qual
as amostras so submetidas s condies que se pretendem testar.
A data de validade dada pelo nmero de dias (N) que passaram desde o dia 0, at que
se verifique uma diferena significativa entre as amostras do estudo e as amostras de referncia.
Para isso, as razes das respostas foram avaliadas, calculando a sua mdia e o seu intervalo de
confiana a 90%; a razo da mdia das respostas obtidas tambm foi avaliada.
Os ciclos de congelao/descongelao no foram investigados durante este processo de
validao porque as amostras dos doentes que participaram no estudo farmacocintico foram,
desde logo, armazenadas em recipientes individuais de 1 mL, aps a sua colheita e
centrifugao. Da mesma forma, a estabilidade temperatura ambiente tambm no foi testada,
pois este requerimento s seria imprescindvel no caso de aplicao de sistemas de injeco
automtica, o que no se verificou.

89

Captulo 2 Tcnica Analtica

SOLUO DE TRABALHO

Amostras do estudo
Condies de estudo: +4C; -25C

Dia 0
Processamento e anlise de amostras
REFERNCIA (n=10)

Dia N
Processamento e anlise de amostras
ESTUDO (n=10)

N+1

ESTVEL
Diferena

COMPARAO
[Critrios: Hooper, 1995]

Estabilidade=N-1
Diferena
Significativa

No Significativa

Figura 2.5. Esquema de execuo do estudo de estabilidade na matriz biolgica. O Dia 0 corresponde ao
primeiro dia do estudo (a partir do qual as amostras so submetidas s condies especficas de
armazenamento - +4 C ou -25C); o Dia N corresponde ao dia em que se averigua se o analito permanece
estvel nessas condies; N+1 correspondente ao ensaio imediatamente a seguir; e N-1 correspondente ao
ensaio imediatamente anterior.

90

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

2.3. RESULTADOS
2.3.1. Validao da tcnica analtica
Tabela 2.1. Dados obtidos no ensaio intra-dia.
Conc. (mg/L)

Api

Razo A/Api

0,1

75381

3373583

0,0223

0,1

62834

2744443

0,0229

0,1

68050

2863618

0,0238

0,1

73212

3190782

0,0229

0,1

75930

3144582

0,0241

0,5

257216

2014039

0,1277

0,5

405062

3171034

0,1277

0,5

288208

2030940

0,1419

0,5

241389

1784224

0,1353

0,5

170464

1336876

0,1275

2,5

1821207

2519066

0,7230

2,5

1313376

1854051

0,7084

2,5

1455983

1988923

0,7320

2,5

1571247

2257804

0,6959

2,5

1891859

2639658

0,7167

5,0

2920147

1953823

1,4946

5,0

3625661

2558610

1,4170

5,0

3470936

2411890

1,4391

5,0

3255545

2293479

1,4195

5,0

3348493

2296357

1,4582

10,0

7548655

2788875

2,7067

10,0

7461482

2621568

2,8462

10,0

8558588

2994875

2,8577

10,0

7417735

2879871

2,5757

10,0

6983170

2374008

2,9415

15,0

12209191

3244845

3,7626

15,0

12953689

2911392

4,4493

15,0

11682576

2903904

4,0231

15,0

10940196

2852877

3,8348

15,0

11147470

2672128

4,1718

Conc.=Concentrao de LTG; A=rea do pico de LTG; Api=rea do pico de padro interno.

91

Captulo 2 Tcnica Analtica

Tabela 2.2. Dados obtidos no ensaio inter-dia.


Conc. (mg/L)

Api

Razo A/Api

0,1

89732

2780180

0,0323

0,1

83003

2460993

0,0337

0,1

123588

3535188

0,0350

0,1

118272

3117456

0,0379

0,1

64864

2497706

0,0260

0,5

399103

2986622

0,1336

0,5

309584

2179106

0,1421

0,5

393720

2825141

0,1394

0,5

431599

2959311

0,1458

0,5

279882

1984052

0,1411

2,5

2111016

3253657

0,6488

2,5

1393606

2004521

0,6952

2,5

1574631

2444087

0,6443

2,5

2379968

3407448

0,6985

2,5

2157593

3074835

0,7017

5,0

4240341

3337117

1,2707

5,0

3595902

2485049

1,4470

5,0

3581481

3080708

1,1626

5,0

4469835

3314859

1,3484

5,0

4545205

3048304

1,4911

10,0

7427676

3044278

2,4399

10,0

8594665

2962489

2,9012

10,0

9385589

3818931

2,4576

10,0

9109442

3402017

2,6777

10,0

8155147

3055876

2,6687

15,0

12700467

3414331

3,7198

15,0

10505641

2661383

3,9474

15,0

12581530

3482997

3,6123

15,0

14246163

3731211

3,8181

15,0

13158717

3326533

3,9557

Conc.=Concentrao de LTG; A=rea do pico de LTG; Api=rea do pico de padro interno.

92

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

2.3.1.1. Curva de calibrao e sensibilidade

As curvas de calibrao dos ensaios intra- e inter-dia (durante os 5 dias) foram obtidas por
regresso linear ponderada, de acordo com o procedimento descrito no Captulo 3. O factor de
ponderao, aplicado ao modelo de regresso dos dados provenientes dos dois ensaios, foi
igual ao inverso da concentrao (1/x2). Os resultados esto representados na Tabela 2.3.

Tabela 2.3. Equao da recta.


Ensaio

Equao da recta

Coeficiente de correlao

Inter-dia

y=0,2636 x +0,0067

r=0,995

Intra-dia

y=0,2804 x -0,0049

r=0,999

y representa a relao ALTG/APi e x representa a concentrao expressa em mg/L.

O LQ igual ao menor padro da recta estudado que apresenta valores de exactido e


preciso aceitveis, de acordo com os critrios estabelecidos a priori (LQ = 0,1 mg/L). O LD
calculado apresentou um valor de 0,008 mg/L.

2.3.1.2. Especificidade e selectividade

Os cromatogramas tpicos de LTG extrada a partir de uma matriz de plasma humano


encontram-se representados na Figura 2.6; os tempos de reteno obtidos para a LTG e seu Pi
foram de 6,7 e 2,3 minutos, respectivamente. A ausncia de resposta nas amostras de branco de
plasma foi demonstrada (Figura 2.6a). Os frmacos avaliados (carbamazepina, fenitona, cido
valprico, fenobarbital, primidona, vigabatrina, gabapentina, clobazam, clonazepam, midazolam
e paracetamol), normalmente usados em co-administrao com a lamotrigina, no interferiram
com a tcnica.
Nesta fase de validao do mtodo procedeu-se tambm colheita de algumas amostras
nos doentes, em diferentes tempos (antes e aps a administrao do frmaco) com o objectivo
de avaliar a eventual presena de metabolitos da LTG, ou de outros frmacos AEs administrados
ao doente, capazes de interferir com o mtodo. A Figura 2.7 mostra-nos um cromatograma
obtido a partir de uma amostra de um doente, simultaneamente medicado com lamotrigina e
cido valprico. Este doente encontrava-se submetido a 200 mg de lamotrigina por dia. A

93

Captulo 2 Tcnica Analtica

colheita da amostra foi realizada 2 horas aps a administrao de LTG. Posteriormente, a sua
concentrao srica foi avaliada em 10,6 mg/L de LTG.

a)
a)

b)

b)

Figura 2.6. Cromatogramas representativos de um branco de plasma humanoa) e um padro de 2,5


mg/L de lamotrigina (tr=6,7 min.), ao qual foi adicionado 4,0 mg/L de padro interno (tr=2,3 min.)b).

94

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

Figura 2.7. Cromatograma tpico de uma amostra de um doente medicado com lamotrigina (200 mg/dia); a
colheita foi realizada 2 horas aps administrao do frmaco; este doente epilptico estava medicado com
lamotrigina e cido valprico (Conc. LTG=10,6 mg/L; tr=6,7 min.).

2.3.1.3. Preciso e exactido

O resumo da preciso e exactido do mtodo est representado na Tabela 2.4. Os


coeficientes de variao mdios foram 4,02% para o ensaio intra-dia e 6,67% para as anlises
realizadas nos 5 dias.
No que respeita exactido, o valor de Bias variou entre -3,63% e 3,46% para o ensaio
intra-dia e -3,79% e 1,82% para o ensaio inter-dia. A comparao emparelhada entre
concentraes nominais e experimentais tambm no revelou diferena estatstica (p>0,05), o
que confirmou a exactido do mtodo.
Todos os valores estavam de acordo com os critrios de Washington (Shah et al., 1992b).

95

Captulo 2 Tcnica Analtica

Tabela 2.4. Resumo dos resultados da preciso (%CV) e da exactido (%Bias) do mtodo
analtico desenvolvido para a determinao de lamotrigina em plasma humano (n=30).
Ensaio
Intra-dia

Inter-dia

CTerica

CExperimental*

CV

Bias

CExperimantal*

CV

BIAS

(mg/L)

(mg/L)

(%)

(%)

(mg/L)

(%)

(%)

0,1

0,100,003

3,12

+0,28

0,100,017

13,45

-0,33

0,5

0,490,023

4,88

-2,33

0,510,017

3,18

+1,44

2,5

2,570,049

1,93

+2,73

2,550,108

4,22

+1,82

5,0

5,170,114

2,21

+3,46

5,070,504

9,88

+1,46

10,0

9,950,515

5,19

-0,48

9,950,718

7,20

-0,52

15,0

14,460,983

6,81

-3,63

14,430,561

3,88

-3,79

Mdia

4,02

+0,004

6,97

+0,013

CTerica=Concentrao terica; CExperimental=Concentrao experimental; CV=Coeficiente de variao; *mdiadesviopadro.

2.3.1.4. Recuperao

A recuperao mdia da lamotrigina a partir da matriz foi consistente na gama de


concentraes avaliadas, revelando um valor mdio de 82,057,46% (mdiadesvio-padro)
(Tabela 2.5). de salientar a medida de disperso dos valores obtidos, j que alguns autores
consideram ser este ponto fulcral na avaliao da eficcia da extraco (Hooper, 1995). A
recuperao mdia do padro interno foi de 86,149,26%.

Tabela 2.5. Recuperao absoluta (%) da lamotrigina em plasma humano na presena de


padro interno (Pi=4,0 mg/L).
Concentrao Terica

Recuperao (%)

(mg/L)

MDP

CV (%)

2,5

83,674,49

5,37

5,0

79,706,51

8,17

15,0

82,7811,02

13,31

Mdia

82,057,46

9,09

MDP=Mdiadesvio-padro; CV=Coeficiente de variao; n=nmero de amostras.

96

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

2.3.1.5. Estabilidade

A estabilidade do analito na matriz a 4C foi avaliada a dois nveis de concentrao, com


dez determinaes em cada dia de estudo, em 7 dias diferentes. As amostras foram preparadas
por adio de alquotas de soluo-me para obter concentraes finais de 2,5 e 10,0 mg/L de
LTG.
O estudo foi feito atravs da razo entre a resposta obtida no dia do ensaio (dia N) e a
resposta obtida no Dia 0. Esta comparao realizada atravs da razo das mdias das
respostas e atravs da mdia e intervalo de confiana (90%) da razo entre respostas. Os
resultados para cada nvel de concentrao encontram-se na Tabela 2.6. A evoluo das razes
(os dois nveis em conjunto; n=20), durante os 11 dias, pode ser observada na Figura 2.8.
A lamotrigina revelou ser estvel em plasma quando armazenada a 4C, durante onze dias
(Tabela 2.6 e Figura 2.8).

1,3

Razo Dia N /Dia 0

1,2

1,1

1,0

,9

,8

,7
Dia 1

Dia 3

Dia 5

Dia 7

Dia 9

Dia 11

Tempo (dias)
Figura 2.8. Estudo de estabilidade da lamotrigina em plasma a 4C, durante 11 dias: evoluo da razo
(mdia) entre as respostas obtidas no dia do ensaio (Dia 1, Dia 2, Dia 3, Dia 4, Dia 7, Dia 8 e Dia 11) e as
respostas obtidas no primeiro dia de estudo (Dia 0); as barras representam o intervalo de confiana a 90%,
n=20.

97

Captulo 2 Tcnica Analtica

Tabela 2.6. Estudo de estabilidade da lamotrigina em plasma a 4C, durante 11 dias, para 2
nveis de concentrao.
Padro

2,5 mg/L

10,0 mg/L

Dia*

Resposta

Razo das mdias

Razo

A/Api

Dia N /Dia 0

Dia N /Dia 0

MDP

CV (%)

(%)

IC 90%

0,8770,066

7,56

0,8180,035

4,26

93,3

0,89 - 0,98

0,8590,108

12,54

98,0

0,90 - 1,07

0,8760,098

11,14

99,9

0,94 - 1,07

0,8190,048

5,81

93,4

0,88 - 0,99

0,8330,034

4,06

95,0

0,90 - 1,01

0,8190,032

3,91

93,4

0,90 - 0,98

11

0,8500,047

5,54

96,9

0,92 - 1,02

3,5900,201

5,60

3,2460,223

6,87

90,5

0,86 - 0,96

3,3670,461

13,70

93,9

0,86 - 1,01

3,2870,343

10,43

91,6

0,85 - 0,99

3,2420,151

4,65

90,4

0,87 - 0,94

3,2970,195

5,92

91,9

0,88 - 0,96

3,2530,364

11,19

90,7

0,86 - 0,95

11

3,2670,212

6,50

91,1

0,87 - 0,96

Conc.=Concentrao de LTG; A=rea do pico de LTG; Api=rea do pico de padro interno; MDP=Mdiadesviopadro; CV=Coeficiente de variao; *Dia 0=Primeiro dia de estudo; Dia N=Nmero de dias que decorreram aps o
primeiro dia de estudo.

A estabilidade do analito na matriz biolgica temperatura de -25C foi igualmente


avaliada por anlise de dez rplicas em cada dia para os dois nveis de concentrao (2,5 e 10,0
mg/L). Este estudo pretende avaliar a estabilidade a longo prazo, ou seja, saber quanto tempo
podem ficar as amostras armazenadas no congelador at serem analisadas. Este estudo foi
realizado no 10, 46, 63, 107 e no 151 dia aps congelao das amostras.
A lamotrigina revelou ser estvel em plasma quando armazenada a -25C durante
aproximadamente 5 meses (Figura 2.9).

98

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

1,30

Razo Dia N / Dia 0

1,20

1,10

1,00

,90

,80

,70
Ms I

Ms II

Ms III

Ms IV

Ms V

Tempo (meses)

Figura 2.9. Estudo de estabilidade da lamotrigina em plasma a -25C: evoluo da razo (mdia) entre as
respostas obtidas no dia do ensaio (Dia N, do Ms Y) e as respostas obtidas no primeiro dia de estudo (Dia
0). O Ms I, II, III, IV e V corresponde, respectivamente, ao 10, 46, 63, 107 e 151 dia de estudo a partir
do Dia 0; as barras representam o intervalo de confiana a 90%, n=20.

99

Captulo 2 Tcnica Analtica

2.4. DISCUSSO
O desenvolvimento de uma tcnica de cromatografia lquida de elevada resoluo (HPLC)
capaz de quantificar adequadamente as concentraes de lamotrigina existentes no soro
humano representa um avano cientfico importante, na medida em que abre perspectivas de
estudo, nomeadamente a nvel farmacocintico e farmacodinmico, para um melhor
conhecimento da relao existente entre a dose administrada e a concentrao plasmtica e
entre esta e a resposta farmacolgica induzida pela LTG.
O mtodo para a determinao de LTG por cromatografia lquida foi desenvolvido pela
primeira vez, em 1987, por Cohen e colaboradores (Cohen et al., 1987). A LTG foi quantificada
atravs de uma coluna de fase normal, aps extraco da amostra com acetato de etilo. Mais
tarde, Fazio et al. foram responsveis pelo desenvolvimento de um mtodo de HPLC capaz de
quantificar a LTG e o seu Pi em menos de 3 minutos, utilizando uma coluna de fase normal de
pequenas dimenses (75 mm) e com um tamanho de partcula de 3 m (Fazio et al., 1992). Este
tipo de cromatografia em fase normal foi mais tarde utilizado por Bartoli et al. (Bartoli et al.,
1997), e por Vidal et al. (1999) porm, a sua principal limitao a natureza dos solventes
(hidrofbicos) utilizados na fase mvel.
A lamotrigina foi, igualmente, quantificada

atravs

de

ensaio

radioimunolgico

(Biddlecombe et al., 1990), ensaio imunofluorimtrico (Sailstad e Findlay, 1991) e por


electroforese capilar (EC) (Shihabi e Oles, 1996). Quando comparados com a anlise
cromatogrfica (HPLC), estes mtodos revelaram valores de r=0,980 (Biddlecombe et al., 1990),
r=0,989 (Sailstad e Findlay, 1991), e r=0,970 (Shihabi e Oles, 1996), respectivamente. Apesar de
no se ter assistido comercializao de ensaios imunolgicos para a quantificao de
lamotrigina, semelhana do que se verificou com os outros AEs convencionais (geralmente
quantificados por ensaio imunolgico de polarizao de fluorescncia - FPIA), a EC ganhou
alguns adeptos e foi aplicada rotina laboratorial (Thormann et al., 2001; Theurillat et al., 2002).
A LTG foi ainda quantificada por cromatografia gasosa (Hallbach et al., 1997; Queiroz et al.,
2002) e por cromatografia em camada fina (TLC) de elevada resoluo (Patil e Bodhankar,
2005a). Contudo, a cromatografia lquida de elevada resoluo a tcnica eleita na maior parte
dos mtodos desenvolvidos para determinar a LTG em matrizes biolgicas. Recentemente foram
desenvolvidos novos ensaios para a avaliao da LTG na presena de impurezas (cido 2,3diclobenzico), por espectrofotometria, TLC e HPLC (Youssef e Taha, 2007).
A cromatografia em fase reversa foi claramente a tcnica de HPLC mais utilizada para a
quantificao de LTG em fluidos biolgicos. Em 1991, com o intuito de determinar a LTG e o seu

100

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

metabolito 2-N-glucuronido, composto altamente polar, foi desenvolvida uma nova tcnica
recorrendo a HPLC em fase reversa (Sinz e Remmel, 1991). Esta tcnica apesar de permitir a
determinao simultnea da LTG e do seu metabolito no plasma e na urina, apresentou, no
entanto, alguns pontos desfavorveis, como sejam os tempos de reteno elevados (cerca de 30
minutos), o recurso a gradiente de fase mvel e o aquecimento da coluna a 40C, que podem
constituir limitaes importantes, nomeadamente porque exigem equipamento especializado.
Ainda no mesmo ano, foi publicada outra tcnica de determinao de LTG recorrendo a uma
coluna com ciano-partculas (Cociglio et al., 1991). Desde ento, a determinao de LTG por
HPLC em fase reversa tem sido apontada em vrios trabalhos (Ramachandran et al., 1994;
Fraser et al., 1995; Papadoyannis et al., 1995; Hart et al., 1997; Lensmeyer et al., 1997; Sallustio
e Morris, 1997; Ren et al., 1998; Angelis-Stoforidis et al., 1999; Matar et al., 1999; Vidal et al.,
1999; Barbosa e Mdio, 2000; Torra et al., 2000). O nmero elevado de trabalhos publicados at
2000, traduz, certamente, o interesse suscitado sobre o tema.
No que diz respeito preparao da amostra, a maioria dos mtodos analticos de
determinao de LTG publicados utiliza a tcnica extraco lquido-lquido com solvente
orgnico (Cohen et al., 1987; Fazio et al., 1992; Fraser et al., 1995; Forssblad et al., 1996; Hart
et al., 1997; Sallustio e Morris, 1997; Matar et al., 1999; Barbosa e Mdio, 2000). Ainda que
alguns autores tenham referido o clorofrmio (Hart et al., 1997) ou o ter dietlico (Matar et al.,
1999), a maioria dos autores utilizou o acetato de etilo como solvente orgnico. Apesar de mais
dispendiosa, alguns autores preferem a extraco em fase slida (Sinz e Remmel, 1991;
Papadoyannis et al., 1995; Yamashita et al., 1995; Lensmeyer et al., 1997; Torra et al., 2000).
Alguns dos procedimentos publicados so baseados na injeco directa aps precipitao de
protenas com acetonitrilo (Ramachandran et al., 1994; Ren et al., 1998; Angelis-Stoforidis et al.,
1999) ou na injeco da amostra em diclorometano aps basificao (Bartoli et al., 1997; Vidal et
al., 1999). No entanto, estes mtodos necessitam de recorrer a deteco a dois comprimentos
de onda (220 nm e 310 nm) (Ramachandran et al., 1994), originam tempos de anlise longos
(Ren et al., 1998) ou possuem limites de deteco relativamente altos (Angelis-Stoforidis et al.,
1999). Alguns dos mtodos referidos utilizaram uma razo de amostra/acetonitrilo de 1:1
(vol./vol.) (Ramachandran et al., 1994; Ren et al., 1998), no entanto, este facto pode levar a
precipitao e bloqueio da coluna (Jrgens et al., 1984). Para alm disso, este tipo de tratamento
da amostra pode originar a diminuio do tempo de vida da coluna devido a eventual remoo
incompleta das protenas da matriz biolgica. Em 1997, foi desenvolvido um mtodo capaz de
analisar a LTG e os seus dois metabolitos, o glucuronido e o metabolito metilado, que utiliza um
sistema automtico de preparao de amostra includo no prprio sistema cromatogrfico
(Cooper et al., 1997). Este mtodo consegue determinar estes trs compostos simultaneamente,
101

Captulo 2 Tcnica Analtica

apesar das suas diferenas de polaridade e de intervalos de concentrao, porm, requer o


estabelecimento prvio de um sistema complexo de preparao de amostras, para alm de
recorrer a gradiente de fase mvel e dois comprimentos de onda durante os 18 minutos de
anlise.
Neste tipo de anlise que exige um pr-tratamento da amostra com passos mais ou
menos complexos, essencial o recurso utilizao de um padro interno (Pi). Atravs de uma
reviso feita aos mtodos de quantificao de lamotrigina publicados at data, o Pi mais
utilizado foi o anlogo estrutural da lamotrigina (3,5-diamino-6-(2-metoxifenil)-1,2,4-triazina)
(Cohen et al., 1987; Cociglio et al., 1991; Sinz e Remmel, 1991; Fazio et al., 1992; Fraser et al.,
1995; Papadoyannis et al., 1995; Sallustio e Morris, 1997; Angelis-Stoforidis et al., 1999; Barbosa
e Mdio, 2000). Em determinadas circunstncias, foram usadas outras substncias, tais como, o
hexobarbital (Ramachandran et al., 1994), o tiopental (Hart et al., 1997), o butalbital (Torra et al.,
2000), a acetanilida (Yamashita et al., 1995), a nortriptilina (Bartoli et al., 1997), a protriptilina
(Vidal et al., 1999), o felbamato (Ren et al., 1998) ou a pipamperona (Dumortier et al., 2001). Foi
tambm publicada uma tcnica de quantificao da LTG que no recorre ao uso de Pi,
justificando o facto com a elevada eficcia de extraco da tcnica (Forssblad et al., 1996).
Alguns destes mtodos apresentam capacidade para determinar vrios frmacos AEs
simultaneamente. Em 1994, Ramachandran et al. (1994) desenvolveram um mtodo analtico em
fase reversa capaz de quantificar a lamotrigina na presena de fenitona, fenobarbital e
carbamazepina recorrendo a deteco a dois comprimentos de onda (220 nm e 310 nm). Em
1997, foi proposto um mtodo de quantificao da LTG, na presena de fenitona,
carbamazepina e seu epxido, aps uma extraco em fase slida e separao numa coluna (de
grupos cianopropil) sujeita a uma temperatura constante de 50C, seguida de deteco a 214 nm
(Lensmeyer et al., 1997). Porm, este mtodo para alm de ser dispendioso devido ao tipo de
preparao de amostra que utiliza, encontra-se igualmente, limitado pela necessidade de
equipamento especializado para aquecimento da coluna, o que se verifica tambm no mtodo
proposto por Sinz e Remmel, (1991), tal como j foi referido atrs. Um outro mtodo foi
desenvolvido

para

quantificar

LTG,

oxcarbazepina

seu

metabolito

activo,

10-

hidroxicarbazepina, simultaneamente a 210 nm (Torra et al., 2000), porm, no possvel


quantificar o metabolito activo na presena de etossuccimida, pois os dois compostos
apresentam tempos de reteno muito semelhantes na referida tcnica. Foi tambm publicado
um mtodo capaz de quantificar simultaneamente seis AEs (lamotrigina, carbamazepina,
fenitona, fenobarbital, primidona e etossuccimida) e dois metabolitos da carbamazepina
(carbamazepina-epxido e carbamazepina-diol) a 220 nm (Matar et al., 1999).

102

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

O presente mtodo de cromatografia lquida de elevada resoluo foi desenvolvido e


validado utilizando um sistema em fase reversa em condies cromatogrficas muito simples:
separao cromatogrfica rpida (10 minutos) e deteco UV. A LTG apresenta dois mximos
de absoro UV, um sinal mais forte a 220 nm, e um sinal mais fraco a 310 nm. No entanto,
frmacos AEs (fenobarbital, primidona, etossuccimida, fenitona, oxcarbazepina, carbamazepina
e seus metabolitos), bem como, compostos endgenos absorvem a 200 nm, pelo que podem
constituir fontes de interferncia da tcnica (Ramachandran et al., 1994; Lensmeyer et al., 1997;
Matar et al., 1999; Torra et al., 2000). Por exemplo, o epxido da carbamazepina, pode eluir ao
mesmo tempo que a lamotrigina, no entanto este metabolito no absorve para valores de
comprimento de onda superiores a 300 nm (Ramachandran et al., 1994; Fraser et al., 1995).
Assim, a deteco a 310 nm permite eliminar a maior parte das interferncias presentes no
plasma (Ren et al., 1998). Consequentemente, nesta tcnica a leitura foi processada a 306 nm,
tal como a tcnica desenvolvida por Cohen et al. (Cohen et al., 1987) e outras tcnicas
publicadas posteriormente (Fraser et al., 1995; Papadoyannis et al., 1995; Hart et al., 1997;
Angelis-Stoforidis et al., 1999; Barbosa e Mdio, 2000). A extraco com acetato de etilo como
solvente orgnico, para alm das vantagens que apresenta em termos de durabilidade da coluna
cromatogrfica comparativamente com o mtodo de precipitao de protenas, permite excluir
todas as impurezas hidroflicas existentes no soro, que so removidas juntamente com fase
aquosa. Para alm disso, tentou-se diminuir o volume de solvente orgnico, com o objectivo de
diminuir o tempo necessrio para a evaporao da fase orgnica, verificando-se um aumento da
razo entre amostra/acetato de etilo (vol.:vol.), comparativamente com outros mtodos (Cohen et
al., 1987; Fazio et al., 1992; Forssblad et al., 1996; Sallustio e Morris, 1997; Barbosa e Mdio,
2000). Nesta tcnica, a adio de trietilamina fase mvel justifica-se pelo facto de a LTG ser
um composto bsico relativamente polar, capaz de reagir com alguns grupos residuais (silanol)
da coluna cromatogrfica num sistema em fase reversa, o que pode traduzir-se em deformaes
dos picos dos cromatogramas (Juergens, 1988). Estas bases orgnicas de cadeia alqulica curta,
como a trietilamina e a n-butilamina, foram utilizadas para a separao da LTG em condies
bsicas (pH=8,5) por Juergens (1988) e mais tarde, por outros autores (Hart et al., 1997;
Lensmeyer et al., 1997; Barbosa e Mdio, 2000).
A selectividade foi averiguada atravs do estudo de AEs frequentemente utilizados em
associao com a lamotrigina na teraputica de ambulatrio (carbamazepina, fenitona, cido
valprico, fenobarbital, primidona, vigabatrina, gabapentina, clobazam), bem como outros
frmacos utilizados na teraputica de interveno durante a hospitalizao dos doentes
(clonazepam, midazolam e paracetamol). No se verificou interferncia por parte destes
frmacos.
103

Captulo 2 Tcnica Analtica

O estudo da estabilidade da substncia na matriz biolgica assume tambm alguma


relevncia j que permite assegurar que a amostra se mantm inalterada desde a sua colheita
no internamento hospitalar at ser analisada no laboratrio, desde que devidamente
acondicionada e refrigerada. Neste estudo foi demonstrado que a LTG permanece estvel
durante 11 dias a 4C e por 5 meses quando as amostras so congeladas a -25C.
O mtodo desenvolvido por Barbosa e Mdio (2000) porventura o que mais se
assemelha tcnica em questo, ainda assim, apresenta uma amplitude de concentraes mais
restrita e um limite de quantificao e de deteco superiores, para alm da preparao da
amostra ser potencialmente mais demorada devido ao maior volume de acetato de etilo que
utiliza no processo de extraco.
luz dos critrios de validao referidos inicialmente neste captulo, os valores
apresentados provam que o mtodo exacto e preciso, sensvel e selectivo. A exactido nos
extremos da curva de calibrao, especialmente no limite de quantificao, foi excelente. Este
facto deve-se aplicao do modelo de regresso linear ponderada (Captulo 3). Esta
abordagem repercutiu-se tambm no limite de deteco calculado (0,008 mg/L), que se
apresentou como o mais baixo de todos os outros mtodos referidos atrs (Cohen et al., 1987;
Cociglio et al., 1991; Sinz e Remmel, 1991; Fazio et al., 1992; Ramachandran et al., 1994;
Papadoyannis et al., 1995; Forssblad et al., 1996; Bartoli et al., 1997; Hart et al., 1997;
Lensmeyer et al., 1997; Sallustio e Morris, 1997; Ren et al., 1998; Angelis-Stoforidis et al., 1999;
Matar et al., 1999; Barbosa e Mdio, 2000; Torra et al., 2000).
Por conseguinte, a tcnica validada neste trabalho configura-se como a mais adequada ao
propsito que inicialmente motivou o seu desenvolvimento, pois permite quantificar a LTG numa
gama de concentraes suficientemente abrangente, permitindo, por um lado, a determinao de
concentraes elevadas, referentes s amostras colhidas no tmax (~2 horas aps administrao),
ou seja, os mximos ou picos de concentrao, e por outro lado, simultaneamente, possibilita o
estudo do perfil de concentraes ao longo de dias consecutivos de descontinuao teraputica,
o que leva as concentraes sricas dos doentes at valores muito baixos (ver Captulo 4). Esta
estratgia de descontinuao da dose de AE uma tcnica de precipitao de crises utilizada
nos doentes epilpticos com o objectivo de caracterizar o seu tipo de crise e/ou localizar o foco
epilptico em candidatos a tratamento cirrgico. Este estudo baseia-se na monitorizao vdeoelectroencefalogrfica (VEEG) do doente durante um perodo de tempo definido (ver Captulo 1 e
5). Assim, a tcnica analtica em causa permite quantificar concentraes at 0,1 mg/L, j que
esse o valor do limite de quantificao.
Em resumo, o mtodo analtico aqui apresentado pode ser classificado como sendo
simples e reprodutvel, tendo demonstrado a sua utilidade e adequao para a determinao de
104

Estudo da LTG em doentes epilpticos submetidos a monitorizao VEEG

LTG em soro humano. Por conseguinte, este mtodo encontra-se apto a ser aplicado, no s
investigao clnica facilitando a realizao de estudos de farmacocinticos/ farmacodinmicos,
mas tambm monitorizao teraputica dos doentes na rotina clnica atravs da determinao
dos seus nveis sricos (Castel-Branco et al., 2001). Importa no entanto referir que, fruto do
interesse gerado nos ltimos anos por todo o mundo em torno da utilizao clnica da LTG,
continuamos a assistir ao desenvolvimento de tcnicas de HPLC para a sua determinao,
isoladamente (Croci et al., 2001; Cheng et al., 2005) ou simultaneamente com outros AEs
convencionais e de nova gerao (Bugamelli et al., 2002; Contin et al., 2005; Patil e Bodhankar,
2005b; Greiner-Sosanko et al., 2007). O estudo da variabilidade inter-laboratorial da tcnica de
HPLC realizado em 70 laboratrios (13 pases europeus) revelou valores semelhantes aos
referidos para os AEs convencionais (Williams et al., 2003). Recentemente foi publicada uma
tcnica especfica para a anlise de LTG em comprimidos (Emami et al., 2006).

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