Você está na página 1de 66

Introduo anlise

laboratorial laboratrio II
Nesta unidade...
Introduo
Laboratrio e trabalhos microbiolgicos
Mtodos bsicos de trabalho
Meios de cultura utilizados em cervejaria
Microscopia
Classificao e identificao de microrganismos
Exerccios
Chave de respostas
Referncias bibliogrficas

Introduo anlise laboratorial laboratrio II


Srie: Cursos de Cervejaria
2004
SENAIRio de Janeiro
Diretoria de Educao
Ficha Tcnica
Gerncia de Educao Profissional

Luis Roberto Arruda

Gerncia de Produto

Maria Lcia Telles Siqueira Farias

Produo Editorial

Vera Regina Costa Abreu


Alda Maria da Glria Lessa Bastos

Pesquisa de Contedo e Redao

Denise Rosa Perdomo Azeredo

Reviso Tcnica

Srgio Laux

Reviso Pedaggica

Neise Freitas da Silva

Reviso Gramatical e Editorial

Raquel Soares Correa

Projeto Grfico

Artae Design & Criao

Editorao

Projeto Visual Comunicao Ltda.

Edio revista da apostila Operaes Bsicas de Laboratrio II. Vassouras, 2001. (Srie
Cursos de Cervejaria). SENAI. RJ. CETEC de Produtos Alimentares. Coordenadoria de Informao
Tecnolgica.

Direitos autorais de propriedade do SENAI-DR/RJ. Proibida a reproduo parcial ou total fora do


sistema SENAI.

SENAI
SENAIRio de Janeiro
GEP Gerncia de Educao Profissional
Rua Mariz e Barros, 678 Tijuca
20270-903 Rio de Janeiro RJ
Tel.: (21) 2587-1116
Fax: (21) 2254-2884
GEP@rj.senai.br
http://www.rj.senai.br

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Introduo
No Centro de Tecnologia de Produtos Alimentares do SENAI-RJ, as atividades de apoio Indstria
de Alimentos e Bebidas esto centradas em diversos nveis. A Educao Tecnolgica ocupa um lugar
de destaque, seguindo as novas exigncias de qualidade impostas pelo mercado. Dentro desta
perspectiva que apresentamos a presente publicao, que focaliza aquelas atividades e operaes
fundamentais executadas em Microbiologia e Microscopia para a rea de Cervejaria.
O objetivo principal do material aqui apresentado dar suporte ao profissional que atua ou atuar
em laboratrios de microbiologia e microscopia, alicerando-o naquelas operaes fundamentais para
que as atividades sejam executadas dentro dos nveis adequados de segurana, eficcia e confiabilidade
necessrias.
Esperamos que o material cumpra os objetivos para o qual foi idealizado e que seja til aos que o
utilizarem. O CETEC de Produtos Alimentares agradece antecipadamente qualquer crtica ou sugesto
que venha contribuir para a melhoria do material aqui apresentado.

Laboratrio e trabalhos
microbiolgicos
Aspectos gerais
O laboratrio microbiolgico dever estar isolado de outros ambientes, como, por exemplo, do
laboratrio fsico-qumico e dos escritrios.
O piso, as paredes da sala e as reas das mesas de trabalho devero ser fceis de limpar e
desinfetar (cobertura de ladrilhos ou material plstico), pois obrigatrio uma limpeza sistemtica
e sanitizao dos pisos, paredes, balces e mesas de operao.
O ambiente devera ser mantido isento de poeira.

SENAI-RJ 101

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Importante!
Para isso, necessrio:
manter fechadas as portas e janelas das salas de trabalhos microbiolgicos; e
ar renovado ou refrigerado, somente atravs de instalaes de ar-condicionado
com filtros apropriados. Os aparelhos de ar-condicionado devero ser mantidos
rigorosamente limpos.

Jamais trazer para o interior do laboratrio microbiolgico, ou manter nele depositados, caixas
para garrafas, garrafas vazias, embalagens de materiais, etc.
Para a guarda e a limpeza de material usado e sujo (pipetas, bastes de vidro, lminas, lamnulas,
esptulas, placas de Petri, etc.), devero existir locais em separado e isolados.
A microscopia e a protocolagem de material no devero ser procedidas na sala de microbiologia
propriamente dita, porm em sala pequena e separada. No caso de uma contaminao (impureza
microbiolgica involuntria), os microscpios e equipamentos de escrita seriam dificilmente limpos
ou desinfectados.
Ao pessoal no autorizado e estranho ao servio dever ser impedido o acesso ao laboratrio
microbiolgico. Um arraste de microrganismos pode trazer conseqncias irreparveis.
Auxiliares inexperientes devero ser orientados sobre possveis perigos de contaminao, instrudos
e supervisionados.
A localizao dos produtos de neutralizao, dos extintores, das caixas dos primeiros socorros e
das instrues de uso dever ser de pleno conhecimento de todos os auxiliares de laboratrio.
Uma lista ou cartaz contendo todas as substncias txicas existentes e dos microrganismos perigosos
deve ser afixado em lugar visvel.
O vesturio de trabalho dever ser confeccionado com material consistente e resistente fervura.
necessria uma troca peridica e no somente em casos de impurezas visveis.
Materiais de anlises e cultura de microrganismos devero ser sempre tratados como se
contivessem m.o. patognicos.

m.o.
Todas as vezes, durante a leitura, que aparecer a abreviatura "m.o."
leia microrganismo.
Manter a ordem e higiene.
Nas salas de trabalho no se deve comer, beber ou fumar.
Evitar, na medida do possvel, um exagerado falatrio, acessos de tosses e espirros.
Evitar caminhadas desnecessrias e movimentao excessiva. Perigo de inalaes.

SENAI-RJ 102

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Evitar o uso de adornos ou jias nos dedos.


Proceder limpeza das reas dos balces de trabalho com um pano embebido em lcool a 70%,
antes e aps as operaes.
A identificao dos recipientes e vidrarias em geral dever ser procedida com lpis-tinta
impermevel ou com etiquetas autocolantes.
Todos os trabalhos microbiolgicos devem ser executados nas proximidades da chama de um
Bico de Bunsen, considerando que o ar quente ascendente atua contra a sedimentao dos
microrganismos.
Antes e aps o trabalho, assim como antes de sair do laboratrio, sempre lavar as mos
criteriosamente.
A contaminao do ambiente de trabalho resulta de germens provenientes do ar e que sedimentam
em conjunto com partculas de p, assim como dos m.o. trazidos pelos humanos.

Observao
1. O teor de m.o. do ar ambiente laboratorial em conseqncia da quantidade de
pessoas que trabalham na sala de 500 a 2.000 germens/m3.
2. O teor de m.o. do ar externo conforme local e estao do ano de 100 a 500
germens/m3.
3. Transmisso de m.o. atravs das pessoas:
polpa dos dedos: 20 a 100 m.o./cm3.
palma das mos: 1.000 a 6.000 m.o.
espirro: 104 a 106 m.o.
1ml de escarro/saliva:106 a 108 m.o.
1ml de secreo nasal: 106 a 107 m.o.

SENAI-RJ 103

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Etapas de uma limpeza e desinfeco criteriosa e regular das mos


a) umidificar as mos com gua;
b) saponificar as mos com sabo lquido ou loo de lavagem;
c) esfregar o produto por 30 segundos, espumando bem;
d) enxaguar criteriosamente com gua;
e) secar bem as mos com uma toalha limpa descartvel, secando bem, inclusive, as partes entre
os dedos;
f) manter as mos abaixo das instalaes fornecedora do produto desinfetante;
g) com o antebrao, movimentar a alavanca do dosador de desinfetante; e
h) esfregar as mos com o produto desinfetante durante 30 segundos, no mnimo.

Primeiros socorros num laboratrio microbiolgico

Mos em contato com m.o., de forma inadvertida

lavar bem as mos e, logo aps, usar


um produto desinfetante (mistura de
lcool a 70% e 1% de glicerina), ou
outra soluo desinfetante.

Suspenso de m.o. atingiu a boca

enxaguar com bastante gua e


gargarejar com uma soluo de
permanganato de potssio a 0,1%.

Suspenso de m.o. atingiu o olho

enxaguar o olho em gua corrente


ou utilizar a "ducha especial para
olhos". Procurar orientao mdica
oftlmica.

m.o. foram engolidos

provocar vmito beber forte


soluo de NaCI. Procurar
orientao mdica.

m.o. atingiram uma ferida na pele

feridas de pequena dimenso, deixar


sangrar preliminarmente e, aps,
cobrir com material esterilizado.
Procurar orientao mdica.

SENAI-RJ 104

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Equipamentos para um laboratrio microbiolgico


Com base na produo anual em hl e conforme os tipos de bebidas a elaborar, o tamanho e os
equipamentos necessrios podem ser bastante diferenciados.

Aparelhos, equipamentos, instrumentos, instalaes e material tcnico


auxiliar

Microscpio biocular para campos claro e escuro, contraste de fase, com os seguintes dispositivos
ticos:
Objetivas:
63 x, para campo escuro
40 x, para contraste de fase 10 x
Ocular:
10 x (ou 12,5 x)

Autoclave para 121C a 2 bar de presso.

SENAI-RJ 105

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Dessecador e botija de CO2 com vlvula redutora e bomba de vcuo

Conjunto de filtrao por membrana

Estao de filtrao por membrana para diversas unidades de filtro ou frasco anaerbico

SENAI-RJ 106

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Estufa de incubao para 27 a 28C e outra para 37C


Estufa de secagem para 160 a 180C
Centrfuga
Agitador magntico com sistema de
aquecimento
Aparelho banho-maria para 45 a 50C
Geladeira com congelador
Balana analtica
Capela de fluxo laminar

Bicos diversos de Bunsen (a)


Suportes para tubos de ensaio (b)
Alas e fios de platina e suportes correspondentes (c)

Diversos maaricos portteis de gs propano

SENAI-RJ 107

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Lupa amplificadora, ou melhor, um contador de colnias

Estereomicroscopia
Grande armrio e/ou sala apropriada, temperados por lminas e iluminao indireta
Aparelho agitador

Macrossuporte pipetador com balo de suco

SENAI-RJ 108

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Potencimetro ou medidor de pH
Armrios de guarda ou depsito de instrumentos, vidraria, materiais diversos, como, por exemplo,
meios nutritivos, pipetas, placas de Petri, etc.
Instalao de desmineralizao de gua
Cestos de arame
Aparelho coletor de amostras de ar
Aparelho automtico de envases de solues

Materiais reutilizveis
Frascos para meios nutritivos com tampa rosquevel.

Pinas

a) ala de platina;

b
c

b) fio de platina;
c) esptula de Drigalski;

SENAI-RJ 109

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

d) tubo para cultura com vedao tipo "Kapsenberg";


d

e) tubo para cultura com rolha de material celulsico;

f) tubo de Durham;
f

g) tubo de guerra;
g

h) garrafa com vedao tipo "engate", de 120ml;


i) garrafa com vedao tipo "engate", de 180ml;

i
h

SENAI-RJ 110

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

j) frasco Erlenmeyer;
k) frasco de "Steilbrust";
l) frasco de cultura seg. Fernbach;

m) lmina de vidro;
n) lmina com depresso convexa; e
o) lamnula (essas no so mais lavadas e sim jogadas fora).

E, ainda:
Garrafas de esguicho em polietileno de 500 ml, para lcool e gua.
Pipetas.
Tubos de ensaio de paredes grossas, sem borda.

SENAI-RJ 111

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Materiais no-aproveitveis
Lamnula para microscpio.
Placas de Petri de material sinttico.
Tubos com bastonete para SWAB.

Materiais para coleta de provas em fbrica


lcool etlico a 70%, em frascos de esguicho.
Produto desinfetante em spray.
Algodo hidrfilo.
Caixa trmica ou armao para transporte de provas.
Luvas descartveis em ltex.
Maarico de gs propano.
Instrumental para coleta de provas (colher, esptula, pinas).
Material esterilizado: garrafas, placas de Petri, latas, pipetas.
Termmetro.
Material de escrita: lpis, marcador de feltro com tinta permanente (pincel atmico), protocolo de
registros.

Mtodos bsicos de trabalho


Tcnicas de esterilizao
Em um trabalho microbiolgico fundamental que os meios de cultura, instrumentos e recipientes
de cultura estejam esterilizados.

Por "esterilizao" entendemos a exterminao de todos os


microrganismos vivos ou seus estados latentes (esporos), atravs do
calor.

Como referncia para a esterilizao, vale a conseqente perda irreversvel da capacidade de


propagao.

SENAI-RJ 112

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Os procedimentos mais importantes para uma esterilizao se baseiam na aplicao do calor.


O diagrama a seguir indica as formas mais relevantes de esterilizao pelo calor.
Calor

Calor seco

Ar quente

Calor mido (V
apor)
(Vapor)

ao Rubro

Flambagem

Vapor direto

Vapor sob presso

Em cada forma de esterilizao por ar quente e vapor o produto submetido esterilizao nos
equipamentos atinentes (esterilizados) leva algum tempo para atingir a temperatura de esterilizao. O
andamento de uma esterilizao, com relao ao perodo de durao, divide-se em quatro segmentos:
a) tempo de preaquecimento: tempo necessrio para o aquecimento do prprio esterilizador;
b) tempo de equilbrio: tempo necessrio para que o produto atinja a temperatura de esterilizao;
c) tempo de exterminao: tempo temperatura definida para a extino dos m.o.; e
d) tempo de esfriamento: tempo necessrio para o esfriamento do produto estril.

Grfico dos tempos no desenvolvimento de uma esterilizao, em funo


da temperatura
Preaquecimento

Equilbrio

Extino

Resfriamento

[C]
120
100
Temperatura
do vapor

80
60

Temperatura no produto a
esterilizar

40
20
0
10

20

30

40

50

60

70

80

90

min

SENAI-RJ 113

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Esterilizao por calor seco


Tratamento com ar quente seco
Recipientes, frascos e instrumentos em vidro, via de regra, so esterilizados com ar quente.
Interligaes entre aparelhos so afrouxadas quando estas so constitudas por materiais diversos
(diferentes coeficientes de dilatao). Todos os instrumentos e/ou peas, antes de sua esterilizao,
devero ser embalados em recipientes metlicos (por exemplo, pipetas) ou em folhas de alumnio (por
exemplo, placas de Petri de vidro), para proteg-los de uma recontaminao.
As garrafas com vedamentos por engate utilizam juntas de silicone. Juntas de vedao em borracha
ficam duras e quebradias pelo calor. Tubos de ensaio, frascos e garrafas so vedados com chumao
de algodo ou com casquete tipo Kapsenberg.
Valores de referncia para esterilizao com ar quente

Temperatura

Durao

160C

180 minutos

170C

120 minutos

180C

30 minutos

Tempos de equilbrio ou de compensao longos devero ser programados. Assim, uma pilha de
placas de Petri, numa estufa de ar quente a 180C, apenas atinge uma temperatura de 160C, nas
posies mais desfavorveis, aps 3,5 horas. Quando o algodo, inserido entre o produto a esterilizar,
ficar levemente amarronzado aps o tratamento pelo calor, um sinal de que havia a temperatura
determinada para a esterilizao.

Tratamento por aquecimento ao rubro


Os instrumentos metlicos de inoculao (ala e fio de platina, esptula, etc.) so levados ao rubro
na chama de um bico de Bunsen. Tambm as partes do dispositivo de fixao, que normalmente so
introduzidas no frasco de cultura, devero ser aquecidas pela chama. Segura-se o dispositivo de fixao
e manuseio quase verticalmente e movimenta-se a ala na zona externa da chama (zona de oxidao),
compassadamente de cima para baixo e vice-versa. O calor tambm dever atingir o espao abaixo
da rosca de fixao da platina onde pode haver acmulo de germens. Da mesma forma, devero ser
flambadas as partes do dispositivo de fixao que so introduzidas no frasco por ocasio da inoculao
da cultura.

Importante!
No superaquecer o punho de fixao!

SENAI-RJ 114

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Grande cuidado deve-se ter quando, logo aps a inoculao, ainda se agregam grandes quantidades
de m.o. na ala. Nesse caso, a ala dever ser preliminarmente mergulhada numa soluo de lcool a
70%. Evita-se, dessa forma, um salpicar do material de inoculao ainda ativo e uma formao de
aerosol impregnado de germens.

Zonas de temperatura de uma


chama do bico de Bunsen

Calcinao da
ala de platina

Tratamento por flambagem


Aparelhos metlicos, como filtros a membrana, tesouras, pinas, etc., assim como vidraria, pipeta
e bastes de vidro, so comumente flambados para uma rpida esterilizao. As partes de vidro
devem ser mergulhadas em soluo de lcool a 70% antes da flambagem. Tambm as bordas e as
vedaes dos frascos de cultura devero ser flambadas de imediato aps a abertura e antes do
fechamento.

Esse mtodo considerado pouco seguro e confivel, uma vez que sua eficcia dificilmente pode
ser comprovada e ainda porque esporos de bactrias ambientais sedimentveis podem sobreviver s
breves temperaturas atuantes de 290C.
Uma flambagem nada mais do que uma esterilizao parcial.

SENAI-RJ 115

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Esterilizao por calor mido (vapor)

Tratamento com vapor direto


Vapor vivo de fluxo corrente produzido nos chamados "vasos de vapor".
A aplicao de vapor diminui a resistncia trmica dos
esporos das bactrias, pois seus envoltrios de umectao
incham e, com isso, tornam-se mais sensveis ao calor. Em se
tratando de esporos de bactrias, uma ao de vapor a 100C
estar aliada a uma durao de extino de algumas horas,
enquanto que clulas vegetativas estariam mortas aps curto
espao de tempo.

umectao
Ao de umedecer,
molhar, umectar.

O mosto cervejeiro, para sua esterilizao, submetido, em trs dias consecutivos, a um aquecimento
de 100C, durante 30 minutos em cada dia. Com isso, os esporos sobreviventes do primeiro aquecimento
se liberam e as clulas vegetativas morreriam durante o segundo e terceiro aquecimento.
Esse mtodo, caracterizado como uma esterilizao fracionada ou "tindalizao", somente
apropriado para a esterilizao de mosto ou meios de cultura termolveis.
Composio de um vaso a vapor para uma esterilizao fracionada (tindalizao)

1 . Termmetro
2 . Tampa
3 . Cmara de esterilizao
e carga dos produtos
4 . Direo do fluxo de vapor
5 . Peneiras
6 . Produtos a esterilizar
7 . Indicador do nvel de gua
8 . gua
9 . Fonte de calor

SENAI-RJ 116

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Composio de uma autoclave de paredes duplas

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Manmetro
Tampa
Direo do fluxo de vapor
Cmara de esterilizao
e carga dos produtos
Peneiras
Termmetro
Indicador do nvel de gua
Vlvula
gua
Fonte de Calor

Tratamento com vapor sob presso


O mtodo mais importante e confivel para a exterminao de m.o. a esterilizao por vapor em
autoclaves. Nesse recipiente presso pode-se atingir temperaturas acima de 100C. Para tanto, a
gua levada fervura.
Atravs da vlvula aberta, o ar contido expulso do recipiente pelo vapor gerado. Aps o fechamento
da vlvula de escape h um aumento da temperatura do vapor de gua paralelamente com o aumento
da presso, at valor programado atravs de um termostato ou vlvula com contrapeso.
Temperaturas em autoclaves
em relao a presses de vapor reinantes

Presso de Vapor em bar

Temperatura em C

121

134

144

A durao do andamento da esterilizao j foi tratada anteriormente.


Enquanto o tempo de preaquecimento depende do tipo da autoclave, ateno especial dedicada
aos tempos de equilbrio e de extermnio.
Para o tempo de equilbrio foram determinados os seguintes "valores referenciais".

SENAI-RJ 117

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Valores de referncia para os "tempos de equilbrio"


no processo de autoclavagem

Recipiente

Ampolas de paredes finas

Frascos medicinais de paredes espessas

Contedo

Tempo de equilbrio

(em ml)

(em minutos)

At 10

100

10

250

15

500

20

1.000

22

O tempo de extermnio dos m.o. dever ser de 20 minutos a 121C (2 bar) e de 5 minutos a 134C
(3 bar). Aps o trmino do tempo de extermnio, a presso no dever ser evacuada. Deixa-se,
preferencialmente, aps desligamento, resfriar o equipamento para ca. De 80C antes da retirada da
carga de produtos.

Importante!
Durante a esterilizao a vapor, os materiais devero ser protegidos de
uma posterior contaminao.

As placas de Petri e pipetas, antes da esterilizao, so colocadas em recipientes metlicos cilndricos


especiais ou embrulhadas com folhas de alumnio. Os frascos vedados com chumao de algodo ou
material celulsico so cobertos, na autoclave ou vaso gerador de vapor, com uma folha aluminizada
para proteo contra o gotejamento da gua condensada.
Para uma autoclavagem, as garrafas vazias tamponadas devero conter alguns ml de gua para
tambm haver uma formao de vapor no interior das mesmas.

Importante!
Somente retirar garrafas resfriadas. Perigo de exploso!

Outros mtodos de esterilizao


Solues de substncias sensveis ao calor so descontaminadas por "filtrao estril".
Nesse processo so utilizados filtros de fina porosidade. Os poros tm um tamanho definido (por
exemplo, dimetro de 0,2 m). Os m.o. contidos no lquido so retirados pelo filtro. O filtrado captado
num frasco esterilizado estar isento de m.o. (com exceo do vrus!).
SENAI-RJ 118

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Os filtros especiais para bactrias esto disposio no mercado especializado.

Filtraes etreis tambm podero ser processadas atravs do uso de "filtros a membrana". Produtos
qumicos tambm so empregados para a esterilizao e/ou desinfeco. Os mais utilizados so o
lcool a 70% (por exemplo, etanol, isopropanol) e formalina a 10%. Esses componentes provocam a
precipitao das protenas.
Para a eliminao dos m.o. do ar ambiente das salas de trabalho e dos localizados sobre superfcies
so geralmente utilizadas as "radiaes da luz ultravioleta". Os raios U.V. atuam somente sobre as
faixas focalizadas. Danificam o DNA e matam os m.o. A radiao U.V. mais ativa na faixa de
comprimento de onda de 260mm.

Meios de cultura
Os meios de cultura so necessrios para:
a) comprovao da presena de m.o.;
b) cultivo de m.o.; e
c) preservao de m.o.
Todos os meios de cultura tm em comum o fato de, atravs de sua composio apropriada,
possibilitarem o crescimento de m.o.
As substncias componentes dos meios de cultura devero estar balanceadas em funo dos m.o.
a culturas, ou seja, em relao s caractersticas de seus metabolismos. A composio dos meios de
cultura resulta de uma mistura de substncias orgnicas e inorgnicas, como, por exemplo, protenas
hidrolisadas, carboidratos, sais minerais, elemento trao e vitaminas.
Todos os m.o. possuem em comum o poder de assimilar, apenas para sua nutrio e multiplicao,
substncias nutritivas solveis. Alm da gua e dos componentes nutritivos, tambm de grande
importncia o valor de pH do meio de cultura. Com isso estar assegurada uma propagao otimizada
dos m.o.
Conforme o caso exigido, os meios de cultura devero ser solidificados por um produto gelificante.
O produto gelificante Agar-Agar um polisarcardeo obtido a partir de algas. Por uma adio de 1%
ao meio de cultura, pode ser aquecido at 121C. A capacidade de gelificao no fica reduzida e,
alm disso, o Agar-Agar tem a vantagem de no ser degradado pelos m.o. O Agar-Agar fluidifica
acima de 96C e gelifica abaixo de 43C, assumindo novamente a forma consistente, ou seja, solidificada.
O agar dever estar integrado aos meios de cultura slidos nas concentraes de 1% a 2%.
Outro produto gelificante a gelatina, uma protena obtida de ossos e tecido conjuntivo.
Atualmente a gelatina no mais empregada, pois pode ser hidrolisada por m.o. proteolticos.

SENAI-RJ 119

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Concentrao do produto gelificante adicionado


Conforme a concetrao do produto gelificante adicionado, diferenciamos:

Meios de cultura slidos


Os referidos meios devem conter, pelo menos, uma adio de 1% de Agar-Agar. Possibilitam uma
separao e avaliao morfolgica de colnias individuais. Meios de cultura solidificados so prprios
para o teste qualitativo e quantitativo do coeficiente numrico e tipo de m.o.

Meios de cultura meio slidos


A adio de Agar-Agar mantm-se abaixo de 1%. Os referidos meios servem para a comprovao
de m.o. mveis e so utilizados em tubos de cultura de alta camada. Atravs de uma pontada vertical,
o meio de cultura inoculado. Germens mveis crescem em formato de tufos ou feixes na profundeza
do meio. Uma determinao do coeficiente numrico em meios de cultura semi-slidos e lquidos no
possvel.

Meios de cultura lquidos


So bem apropriados para uma rpida ativao e multiplicao de m.o.

SENAI-RJ 120

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Vantagens e desvantagens dos meios de cultura slidos e lquidos


Slidos

Lquidos

Vantagens:

Vantagens:

1. Contagem de m.o. possvel, tambm para


mistura de m.o. (de cada clula uma colnia).

1. Provisionamento otimizado de nutrientes,


com as clulas circundadas completamente
da soluo nutritiva.

2. Clulas so distintas, sem nenhuma


influncia recproca por diferentes tipos de
m.o.

2. Desassimilao de substncias metablicas


interferentes.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

3. Imediata extrao do inoculado e testes


possveis.

3. Morfologia otimizadas por livre propagao,


sem impedimentos por parte de clulas
vizinhas.

x 4. Curto tempo de desenvolvimento, mesmo


com traos de m.o.

4. Menores custos.

Desvantagens:

Desvantagens:

1. Abastecimento deficiente de nutrientes para


as colnias.

1. Impossvel comprovao do coeficiente


inicial numrico de m.o.

2. Nenhuma desassimilao de produtos


metablicos.

2. Opresso de um grupo de m.o. por outro


na mistura de m.o.

3. Clulas morfologicamente no desenvolvidas


otimamente.

3. Impossvel o teste de identificao.

4. Maiores custos.

4. Maior durao de desenvolvimento quando


em traos.

Composio e forma de aplicao


Conforme a composio e forma de aplicao, os meios de cultura diferenciam-se em:

Meios de cultura no seletivos


A oferta de nutrientes de tal forma definida que permite um crescimento otimizado de um grande
nmero de tipos de m.o., sem inibir nenhum grupo. So meios de cultura para a determinao da
contagem total de m.o.
Exemplo:
Standard-I-Agar um meio de cultura universal para bactrias, enquanto Agar-mosto um meio
de cultura coletivo para fungos, filamentososos e leveduras.

SENAI-RJ 121

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Meios de cultura seletivos


A oferta em nutrientes e os agentes seletivos permitem apenas o crescimento de um determinado
tipo de m.o. Outros grupos de m.o. so impedidos de desenvolver ou so totalmente suprimidos por
substncias inibidoras, como, por exemplo, lpulo, valor de pH ou falta de determinados estimulantes.
Exemplo:
NBB-Agar um meio de cultura para m.o. danosos cerveja, segundo Back.
MRS-Agar so iniciais segundo seus descobridores Man, Ragosa e Sharpe para bactrias
danosas cerveja.

Meios de cultura diferenciais


Possibilitam uma diferenciao com base num determinado comportamento das colnias.
Exemplo:
Colnias de bactrias Escherichia-coli evidenciam, sobre o meio de cultura "Endo-Agar", um
brilho metlico dourado-esverdeado. Colnias de outro grupo de bactrias so coloridas de vermelho
claro.
Quando se conhece as respectivas receitas ou instrues de trabalho, pode-se preparar os prprios
meios de cultura em laboratrio. Quase todos os produtos comerciais para os meios de cultura
encontram-se em forma pulverizada ou granulada. Aps dissoluo em gua destilada ou
desmineralizada, com posterior esterilizao em autoclave, esto prontos para uso.
Dos produtos secos em p podem ser preparados meios de cultura slidos, meio slidos ou lquidos.
Pode-se tambm comprar meios nutritivos elaborados em garrafas, que podem ser fluidificados em
gua fervente e, posteriormente, fluir para placas de Petri ou tubos de cultura.
Uma alternativa para meio de cultura slido a aquisio de "discos de material celulsico com
nutrientes". Um disco de cartolina estril, com propriedades de absoro, contm os componentes
nutritivos em forma seca. Por adio de gua esterilizada, as referidas substncias so dissolvidas e o
disco est pronto para uso.
Todos os meios de cultura, aps inoculados com m.o., devero estar sob determinadas condies e
colocados numa estufa de incubao.
As condies mencionadas so:
temperatura
tempo/durao
com ar = aerobiose
sem ar = anaerobiose

SENAI-RJ 122

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Meios de cultura mais importantes e suas condies de incubao

Agar-mosto

Fungos

28C

2 a 3 dias

aerobiose

Agar Standard I

Bactrias aerbias

28C

1 a 2 dias

aerobiose

NBB-Agar ou

Bactrias danosas

25 a 28C

Ca. 5 dias

anaerobiose

28C

2 a 5 dias

Agar-MRS

cerveja

Agar soro laranja

m.o. danosos
aos refrigerantes

Endo-Agar

Escherichia-coli

37C

2 dias =

aerobiose

5 dias =

anaerobiose

1 dia (20 horas)

aerobiose

Meios de cultura utilizados em


cervejaria
Para bactrias danosas cervejaria
Meio de cultura NBB
Segundo Back, NBB o meio de cultura para bactrias nocivas cerveja com indicador "Vermelho
de Clorofenol" (vermelho/amarelo), inibidor de leveduras por adio de actidiona.
Utilizam-se trs formas de aplicao do referido meio de cultura:
NBB-A = NBB-Agar (n 4709/525) Dhler
NBB-B = NBB-Bouillon ou caldo (n 4710/526) Dhler
NBB-C = NBB-Concentrado (n 4711/527) Dhler
Estes meios de cultura contm os nutrientes essenciais para detectar tambm os m.o. de crescimento
lento.
O NBB-Agar evidencia uma seletividade algo maior do que os dois outros, abrangendo,
exclusivamente, por incubao anaerbica, os m.o. rigorosamente danosos cerveja e os mais
importantes tipos de m.o. potencialmente danosos cerveja.
Para a incubao a 25-28C, durante 5 dias, usam-se "recipientes anaerbicos" ou "dessecadores
com atmosfera de CO2". As concentraes de Actidiona nesse Agar inibem efetivamente o crescimento

SENAI-RJ 123

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

de leveduras de cultivo, entretanto, podero se desenvolver leveduras selvagens, como, por exemplo,
Saccharomyces pastorianus ou Sacch. diastaticus, no provocando, porm, uma viragem do indicador.
O meio nutritivo contm o "Indicador Vermelho de Clorofenol".
O cultivo sobre NBB-Agar, alm de permitir a avaliao morfolgica das colnias, tambm possibilita
a determinao da contagem de m.o. e a execuo de testes complementares, como o comportamento
segundo Gram e teste da catalase.
O NBB-Bouillon ou Caldo destaca-se como sendo um meio de deteco com a mais alta sensibilidade.
So utilizados como frascos de cultura, de preferncia, tubos de ensaio com vedantes gs-permeveis
(por exemplo, rolhas de substncia esponjosa).
O NBB-Concentrado tem durao de incubao de apenas 8 dias.
Resultados j podem ser obtidos aps 4 dias, porm a avaliao final se processar aps 10 a 12
dias.
As vantagens adicionais do NBB-Concentrado so o crescimento macio dos m.o. prejudiciais
cerveja e a alta segurana na identificao. Nessas provas, uma contaminao tambm poder ser
avaliada macroscopicamente atravs de formao de uma turvao e sedimentao.
O NBB-Concentrado um meio nutritivo empregado, principalmente, para a detectao de traos
de m.o. nocivos cerveja em provas de cerveja nova, de m filtrabilidade e com suspenso de leveduras.

MRS, Agar ou Caldo


Segundo Man, Rogosa e Sharp (= MRS) obtido na forma granulada.
Esse meio de cultura dissolvido em gua destilada e seletivo para bactrias contaminantes da
cerveja.
Existem duas formas de aplicao:
1. MRS-Agar (Merck 10660)
2. MRS-Bouillon (Merck 10661)
O perodo de incubao de 5 a 7 dias.

Agar VLB-S7
Foi desenvolvido pela VLB Berlin. um meio seletivo para lactobacilos.
Geralmente, o meio nutritivo S-7 empregado para a comprovao de m.o. nocivos cerveja. O
referido meio contm Verde Bromocresol como indicador e descolora quando da produo de cidos.
Sua incubao de 7 dias.

SENAI-RJ 124

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

LMDA = "Lee's Multi Differential Agar"


DAS = "Schwartz Differential Agar"
Foram desenvolvidos pelos laboratrios Schwartz, dos Estados Unidos. Contm Verde Bromocresol
como indicador de acidez.

RAKA RAY-Agar = RR3


um meio nutritivo para identificao de bactrias nocivas cerveja.
No contm indicador. Durao de incubao de ca. 5 dias.

BSNB
Meio nutritivo especfico lquido para m.o. nocivo cerveja, segundo Kretschmer, no qual tambm
se desenvolvem leveduras e bactrias gram-negativas.
A incubao demora acima de 7 dias. O meio nutritivo pode ser preparado em laboratrio.
Preparao:
1.500ml de cerveja Pilsener;
100ml de leite peptonado;
4.500ml de gua nobre cervejeira;
200ml de levedura cervejeira autolisada;
140g de suco de tomate; e
60g de glicose.

Para a determinao de leveduras


Agar-Acetato
O Agar-acetato um meio "deficiente" e contm acetato, que ativa e acelera a formao de
ascsporos.
Composio:
0,2g de rafinose;
4,0g de Acetato de Sdio p.a. ou 5,6g de Acetato de Sdio 3H2O; e
20,0g de Agar.
Esses componentes so dissolvidos em 1 litro de H2O destilada e autoclavados.

SENAI-RJ 125

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Agar-Violeta Cristal
Usado para anlise de leveduras "selvagens" do gnero Saccharomyces. O referido meio de cultura
inibe as leveduras de cultivo e leveduras "selvagens" do gnero no Saccharomyces.
Preparao:
fluidificar o Agar-mosto preparado;
dissolver 20mg de Violeta Cristal em 1 litro do Agar-mosto liquefeito e dosar essa quantidade em
frascos Erlenmeyer esterilizados; e
durante 2 dias esterilizar por 15 minutos a 100C. O Agar-Violeta Cristal no dever ser preparado
antecipadamente.

Agar-Lisina
Para anlise de leveduras no pertencentes ao gnero Saccharomyces. O referido meio de cultura
contm o aminocido lisina como nica fonte nutritiva assimilvel. Esse componente somente pode ser
decomposto pelas leveduras do gnero no Saccharomyces. As leveduras do gnero Saccharomyces
no se desenvolvem.
Pelos meios de cultura ou testes indicados, as leveduras permitem uma classificao conforme o
seguinte esquema:

Crescimento sobre Levedura de cultivo Levedura selvagem Levedura selvagem


gnero

gnero no

Saccharomyces

Saccharomyces

Agar-mosto

Agar-Acetato

ou (+)

Agar-Violeta Cristal

Agar-Lisina

Importante!
Esterilizar significa, para o processo de elaborao dos meios nutritivos
de cultura, que esses meios so autoclavados, geralmente, durante 20
minutos, a 121C (= 2 bar).

SENAI-RJ 126

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Moldagem das placas de Agar


Aps a esterilizao do Agar num Erlenmeyer vedado por uma rolha, dever ser o mesmo resfriado
gradativamente, em banho-maria, para uma temperatura entre 45 a 50C. Caso fluirmos o Agar
quente diretamente nas placas de Petri, haver formao de gua condensada na tampa. Nesse caso,
no haver uma formao ntida de colnias individualizadas aps a inoculao. A gua condensada
absorve bactrias e banha a superfcie do meio e, com isso, as bactrias se espalham e se desenvolvem
desordenadamente.
As placas de Petri, como sabemos, so compostas de placas duplas embutidas, a de fundo e a da
tampa em vidro reutilizveis. Ultimamente, esto sendo aceitas as placas de Petri de material sinttico
descartvel. Para a filtrao por membrana usam-se placas menores, com 60mm de dimetro. Para
inoculao de superfcie, utilizam-se placas com 90mm de dimetro.

As tampas devem conter ressaltos para desaerao, permitindo assim


a troca de gases.

As placas de Petri plsticas esto contidas em sacos de polietileno fundidos. O referido conjunto foi
esterilizado pelo fabricante por raios gama ou xido de etileno.
As placas de Petri de vidro devero ser, aps cada uso, rigorosamente limpas e, como j observado
anteriormente, esterilizadas em autoclaves.
Como as placas de Petri devem ser dosadas com 15 a 20ml de Agar fluidificado e, como essa
quantidade torna-se difcil de ser estimada a partir de um Erlenmeyer, evidenciou-se como oportuno, a
princpio, despejar o Agar em tubos de ensaio. Pode-se ento armazenar, na geladeira, uma grande
quantidade de tubos contendo pores do meio de cultura previamente esterilizados. Para sua
reutilizao, conforme a necessidade, procede-se fluidificao por aquecimento em banho-maria,
vertendo-se o Agar lquido nas placas estreis. Essas so as chamadas "placas de cultura".
Quando, durante a moldagem das placas, aparecerem pequenas bolhas na superfcie do Agar, as
mesmas podero ser removidas, antes da completa solidificao do meio, atravs de uma rpida
flambagem.
Antes de verter o Agar fluidificado em placas ou tubos de ensaio esterilizados, imprescindvel
flambar a borda da boca do frasco Erlenmeyer.
Todas estas operaes devero ser processadas no interior da capela fluxo-laminar, junto chama
de um bico de Bunsen (ar ascendente), quando ento a tampa da placa dever ser levantada somente
a uma altura estritamente necessria.

SENAI-RJ 127

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

a) Meio de cultura fluidificado, esterilizado, em frasco Erlenmeyer resfriar em banho-maria


(com termostato), para 50 ou 45C.
b) Sob condies estreis, verter diretamente na placa de Petri esterilizada 15 a 20ml de Agar ou
verter em tubos de ensaio de cultura esterilizado esterilizar em autoclave, deixar resfriar para
50 ou 45C e verter o meio de cultura numa placa de Petri ou deixar resfriar longamente os
tubos e armazen-los na geladeira.
c) O meio de cultura nos tubos de ensaio dever ser fluidificado em gua quente a ca. de 100C e,
ento, esfriado em banho-maria, para 50C ou at 45C, sendo ento vertido numa placa
esterilizada.
Os meios de cultura recm-dosados no so adequados para trabalhos microbiolgicos. O Agar,
por exemplo, quando desentumesce, espreme gua. Por isso, as placas com Agar, antes da inoculao,
devem ser secas numa estufa de secagem a 37-40C, durante 30 a 60 minutos.
Nessa ocasio, o fundo e a tampa so separados e empilhados inclinados com as aberturas para
baixo, conforme demonstrando a seguir. Uma segurana contra o gotejamento de gua condensada.

d) Placas fechadas, com o fundo normal para cima, so armazenadas embaladas at o uso para
inoculao. Devem ser preparadas placas para um abastecimento semanal, considerando que
meios nutritivos velhos ressecam e fissuram.

Meios de cultura fissurados no devero ser mais usados, pois, com


um teor de gua mnimo, haver inibio no crescimento de
microrganismos.

Para a maioria dos meios de cultura, comprovou-se como positivo guardar em geladeira a 4-6C.
Muito importante resguardar os meios da ao da luz. Poucas horas antes de seu uso, os meios de
SENAI-RJ 128

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

cultura devero ser retirados da geladeira e aquecidos numa estufa de incubao. Por esse procedimento
evitado um retardamento do crescimento dos m.o. por um eventual meio nutritivo muito frio.

O emprego de tubos de cultura


Tubos de cultura possuem, ao contrrio dos tubos de ensaio usuais, uma maior espessura de parede
permevel ao ar (1) (chumao de algodo, material celulsico) ou com tampas de metal leve (2)
(tampa tipo Kapsenberg), que se ajustam no local de forma elstica.
Entre a parede do tubo e borda do tampo no deve acumular
qualquer lquido, pois impediria uma troca gasosa e induziria a uma fonte
de contaminao para o contedo do tubo estril.
Preparao dos vedantes de algodo e material celulsico para tubos
de cultura:
1

6
5

1. Manto celulsico, com 2mm de


espessura
2. Linha da dobra
3. Enrolar firmemente o manto
celulsico
4. Papel de filtro sobre o manto de
algodo
5. Manto de algodo, com 2mm de
espessura
6. Enrolar firmemente o manto de
algodo

Os tubos de cultura podem receber meios nutritivos slidos, semi-slidos ou lquidos. Os tubos a
seguir so guardados em copos Becher, com o fundo almofadado com algodo, ou em suportes de
armao metlica gradeada. Para um posicionamento seguro, tambm
servem tacos de madeira com perfuraes de 6cm de profundidade e ca.
de 18mm de dimetro.
Os tubos de cultura so subdivididos em:
tubos de cultura com camada profunda vertical; e
tubos de cultura com meio de Agar inclinado.
Antes de explicar suas aplicaes, vamos descrever o que vem a ser
"Tcnicas de culturas".
SENAI-RJ 129

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Tcnicas de culturas
A cultura de m.o. engloba duas etapas:
1 Etapa
inoculao dos meios de cultura esterilizados com uma pequena poro microrgnica denominada
"inculo" ou "semeadura".
2 Etapa
reparao dos requisitos necessrios ao crescimento. Junto com a temperatura, o abastecimento
do oxignio fundamental. Os processos de culturas podem ser diferenciados como sendo:
culturas aerbias e anaerbias.
As culturas aerbias servem para o cultivo de m.o. estritamente aerbicos ou facultativamente
anaerbicos, assim como para os m.o. que crescem na superfcie dos meios nutritivos onde h oxignio
suficiente disponvel.
As chamadas culturas de superfcie so procedidas sobre meios de cultura slidos (placas, Agar
inclinado) e as chamadas culturas suspensas, sobre a superfcie de solues nutritivas, que servem,
especialmente, para o crescimento de fungos ou bolores.
Enquanto o oxignio nas culturas de superfcie pode atingir facilmente o interior das clulas, a
difuso fica fortemente entravada quando as clulas crescem numa soluo nutritiva. Nessas culturas,
ditas submersas, em conseqncia do empobrecimento em oxignio abaixo da superfcie lquida, resultam
imediatamente condies anaerbicas. Micrbios aerbicos, conseqentemente, deixam-se cultivar
em meios submersos somente quando for providenciado um suprimento suficiente e constante de
oxignio.
Para tanto, pode-se empregar as seguintes tcnicas:
a) cultura em camada fina (figura A);
b) cultura por agitao, o que provoca uma constante renovao da superfcie limtrofe (figura
D); e
c) insuflao de ar estril na soluo nutritiva, ou seja, aerao submersa (figura E).

SENAI-RJ 130

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Chumao de algodo
Suspenso de bactrias
Rolha de borracha
Suspenso de bactrias
Tampa frouxa
Fixadores de frascos
Mesa agitadora

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Nos procedimentos de culturas anaerbicas ocorre o cultivo de m.o. numa atmosfera quase isenta
de oxignio. Nestas condies, em que se tratando dos rigorosos e facultativamente anaerbicos, a
energia necessria ganha no transcorrer da fermentao.
Microrganismos facultativamente anaerbicos so geralmente cultivados em tubos cheios com
soluo nutritiva at 2/3 de seu volume. Acima do pequeno limite de fase, entre o meio e o ar, somente
pode penetrar um mnimo de oxignio. Dessa maneira, existem condies anaerbicas no fundo do
tubo.
A

1. Grampo de tubo de
borracha
2. Entrada para a bomba
de aqurio
3. Tubo de borracha do
aqurio
4. Chumao de algodo
5. Tubo de silicone
(dimetro interno 6mm
e dimetro externo
8mm)
6. Tubo de vidro com
ponta estirada,
(dimetro 6mm)
7. Cultura

Tubos de cmara profunda


Os tubos com camada nutritiva ampla vertical servem para estoque de quantidades pr-definidas
de meios de cultura estreis ou para o preparo de "culturas por picada central em coluna vertical".

1. Canal de picada
2. Crescimento bacteriano
3. Agar ou leo de parafina
estril

As culturas de picada so freqentemente preparadas para testar como os m.o. se comportam em


relao ao oxignio, ou seja, identificar se um m.o. :
a) aerbico (os m.o. somente se desenvolvem na presena do ar);
b) facultativamente anaerbico (os m.o. tambm se desenvolvem com a entrada de ar); e
c) estritamente anaerbicos (os m.o. se desenvolvem apenas quando no existe presena de
ar).

SENAI-RJ 131

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Um tubo de cultura com Agar inoculado pode ainda receber uma sobrecarga de Agar ou leo de
parafina estril, como barreira adicional contra o oxignio (figura d).
Aps a solidificao do Agar o inculo transferido para o meio nutritivo, atravs da picada de
uma agulha ou fio de platina. O m.o. correspondente se desenvolve na parede da coluna vertical, onde
predominarem as condies mais favorveis de oxignio (figuras a-d). Isto reconhecvel pelo
distanciamento da zona de turvao (zona de crescimento) da superfcie do substrato (figuras a-d).
Os tubos de cultura de picadas so mais vantajosos do que os tubos de cultura com meio Agar
inclinados, porque o meio de cultura no resseca to rapidamente e o desenvolvimento mais fraco.
Conseqentemente, so consumidos menos nutrientes e formadas menores quantidades de produtos
metablicos prejudiciais.
Os m.o. podem ser mantidos disponveis na forma de "culturas de base".
Garantia das "culturas de base" e preparao de culturas de uso.

1 Etapa: da cultura-base (3) assentada, primeiramente, uma nova "cultura-base" (4).


2 Etapa: da cultura-base (3) so preparadas culturas de uso ou servio (5).

Importante!
Culturas-base podem ser guardadas por vrias semanas em geladeira, a
4-6C. Entretanto, as mesmas devero ser renovadas, seguindo um rgido
plano de execuo, aps cada 4 semanas, com reinoculao sobre meios
nutritivos recm-preparados. Vez por outra, por estriamento, devero ser
testadas as culturas quanto presena de m.o. estranhos.

Tubos de cultura Agar inclinados


Os tubos de cultura Agar inclinados so utilizados para guardar "culturas puras". Especialmente,
cepas de cultura de levedura so preservadas dessa forma, mas tambm outros tipos de m.o. para fins
de testes.
Atravs da guarda em forma inclinada, obtm-se uma maior superfcie ativa aps solidificao do
meio nutritivo (fig. B-E) A = tubo de cultura de camada ampla.

SENAI-RJ 132

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Um tubo esterilizado cheio com 5 a 7ml do


meio nutritivo correspondente (B), vedado e
mantido inclinado at solidificao (C e D).
Caso, aps alguns dias de guarda, no houver
crescimento de m.o. estranhos, sinal seguro
de que o meio de cultura est estril.
Com uma ala de platina, a superfcie do
Agar inoculada em forma de "ziguezague" (E).
Aps ter iniciado o crescimento na estufa
incubadora, o tubo guardado na geladeira numa
temperatura de ca. 4C. Atravs da guarda refrigerada, devero ser mantidos, ao mnimo, o
desenvolvimento de outras atividades metablicas, para que no haja danos aos m.o. atravs do acmulo
muito forte de produtos secundrios.
Como a vedao por chumao de algodo favorece ao ressecamento do meio de cultura, dever
ser a mesma, externamente, selada por uma folha de papel aluminizada. Todos os outros vedantes
hermticos so tambm apropriados. Nessas condies, as culturas puras armazenadas devem ser
reinoculadas para novos tubos, aps ca. de trs meses. Nessa ocasio, devero ser sempre preservados,
na geladeira, duas a trs "geraes", para que em caso de falhas se possa recorrer para um tubo mais
antigo.

Diferentes tipos de frascos de cultura

100-2.000ml

50-200ml

1.800ml

Culturas lquidas de m.o. aerbios devem ser preparadas, preferencialmente, em frascos Erlenmeyer
(1), em frascos verticais de peito escarpado com bocal esmerilado (= Freudenreich, antigo (2)) e
frasco de cultura Fernbach (3) de fundo largo.
Uma grande superfcie divisria entre o meio de cultura e o ar facilita o intercmbio gasoso e
favorece o desenvolvimento da cultura.
Esses frascos de cultura podem ser vedados com buchas de algodo e de material celulsico, ou
com cpsulas metlicas apropriadas.

SENAI-RJ 133

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Tcnicas de inoculao
Em microbiologia, entende-se por "inocular" a transferncia de m.o.vivos sobre ou em um
determinado meio de cultura. Para isso, utilizam-se diferentes instrumentos de inoculao, conforme
figura abaixo.
1.
2.
3.
4.
5.

Ala de platina
Fio de platina
Esptula
Ala, olhal
Comprimento da ala de
platina
6. Rosca de fixao da ala de
platina
7. Cabo metlico de
manipulao
8. Comprimento total da haste
coletora
9. Punho metlico com
cobertura de borracha
10. Fio de platina
11. Articulao da esptula

A ala de platina compe-se de um fio de platina Iridium, com um comprimento de 5 a 6cm, ou


de um fio de uma liga de ao resistente ao calor. O fio arqueado na ponta em forma de anel, que
poder coletar diferentes quantidades de lquido conforme dimetro e espessura do fio.

Capacidade de coleta de uma ala de platina

Dimetro da ala (em mm)

Quantidade de lquido (em mm3)

7,5

Com ala de platina so inoculados, principalmente, meios de cultura de Agar e pequenas quantidades
de meios nutritivos. A ala de platina dever ser, antes ou aps seu uso, levada ao rubro na chama de
um bico de Bunsen (procedimento j referido anteriormente).

SENAI-RJ 134

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

O fio de platina tem aplicao no preparo das culturas por "picada".

A esptula (denominada Ala de Drigalski) serve para a distribuio homognea de inculo (por
exemplo, suspenso de bactrias), sobre a superfcie de um meio de cultura slido.

Importante!
O instrumento de inoculao no dever ser largado sobre as mesas de trabalho,
e sim guardado verticalmente nas perfuraes de um suporte de madeira.

Quantidades definidas de suspenses de m.o. e meios de cultura diludas


devem ser extradas com pipetas esterilizadas e, ento, transferidas como
inculo.
As pipetas, antes do procedimento da esterilizao (por calor seco ou
vapor pressurizado), so vedadas na parte superior (bocal), com um
chumao de algodo frouxo de 2cm de comprimento, para que no
penetrem germens no interior da pipeta pelo fluxo de ar que se forma no
ato do escoamento dos lquidos.
Quando do pipetamento de culturas lquidas e materiais perigosos,
utiliza-se a "pra de pipetas" (bola de Pleus). Pipetas aps uso so lavadas
com gua e mergulhadas numa proveta contendo lcool a 70% ou soluo
desinfetante.

SENAI-RJ 135

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Transferncia de microrganismo de um tubo de cultura para uma placa


com Agar, com o uso de uma ala de platina

Material: tubos de cultura, placas de Agar, bico de Bunsen, ala de platina, suporte de tubos de
ensaio e suporte do instrumental de inoculao.

Procedimento na capela fluxo-laminar:


Segurar o tubo na mo esquerda e pegar a ala de platina entre o polegar, o indicador e o dedo
mdio na mo direita (posio de escrita).
A ala de platina dever ser aquecida ao rubro, e o cabo metlico de manipulao flambado.
A tampa do tubo, com a palma da mo direita para baixo, dever ser removida entre os dedos
mdios e anular, sem, contudo, solt-la.
Flambar a boca do tubo seguro na horizontal.
Introduzir a ala de platina sem tocar nas bordas, deixar resfriar e retirar o material microrgnico.
Aps a flambagem da boca e da tampa, fechar o tubo e deposit-lo no suporte.
Com a mo esquerda, levantar a tampa da placa de um dos lados e estriar o inculo sobre a
superfcie do meio de cultura, em forma de linhas sinuosas.
Mergulhar rapidamente a ala de platina na gua, secar e flambar, guardando-a no suporte.
Depositar a placa de Petri com o fundo para cima e proceder s anotaes correspondentes,
como, por exemplo, identificao dos m.o., data, hora, numerao, e, eventualmente, os requisitos
para a cultura e o nome do analista que executou o reinculo.

SENAI-RJ 136

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Reinoculao de microrganismo de um tubo de cultura em outra, com


uso da ala de platina

Material: tubos de cultura, por exemplo, tubos de cultura Agar inclinados, bico de Bunsen, ala de
platina, suporte para tubos de ensaio, suporte para instrumentos de inoculao.

Procedimentos em capela fluxo-laminar:


Pegar os dois tubos na mo esquerda.
Com a ala de platina na mo direita, proceder ao aquecimento da ala ao rubro e flambar o cabo
metlico.
Remover as duas tampas dos tubos com o terceiro e o quarto dedos, e com o quarto e o quinto
dedos, respectivamente, uma aps a outra e mant-las presas.
Flambar os bocais dos dois tubos.
Com a ala resfriada, remover o material microrgnico de um dos tubos e reinocul-lo sobre a
superfcie do meio nutritivo do outro tubo, por estriamento em formato sinuoso.
Flambar os bocais de ambos os tubos e tampas respectivas, e proceder vedao.
Lavar a ala rapidamente na gua, secar, aquecer ao rubro e colocar no suporte.
Proceder s anotaes devidas no tubo inoculado.

SENAI-RJ 137

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Microscopia
Composio do microscpio

1
.
2
3
4
5

15
.

6
7
8
9

10
11
14

12
13

1. Ocular (do latim culos = olho): a lente direcional superior para o


olho
2. Tubo que sustenta a lente ocular
3. Canho: tubo que sustenta uma lente ocular ou 2 lentes oculares
(binocular), na parte superior e o revolver na parte inferior. O
canho rotativo a 3600 e removvel
4. Revolver: sistema rotativo que sustenta as lentes objetivas
aparafusadas
5. Grampo de reteno da lmina sobre a platina, com mola
6. Platina, mesa para exame da lmina descolvel
7. Alavanca para a ajustagem da abertura do diafragma-ris
(contraste)
8. Apoio do acionamento da mesa coaxial, dispositivo "charriot" que
permite a movimentao da lmina sobre a platina, em cruz
9. Condensador e comutador do condensador para duas posies de
acionamento
10.
10.Parafusos macro e micromtricos para ajuste do foco
11.
11.Reostato para a ajustagem da luminosidade da lmpada halgena
de 6V/10W
12.
12.Foco de luz = sada do campo luminoso (com suporte)
13.
13.Base de apoio
14.
14.Cabo eltrico
15.
15.Brao: parte que sustenta a platina e o canho

SENAI-RJ 138

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Importante!
As objetivas so lentes de vidro encaixadas em suportes metlicos.
Chamam-se objetivas porque objetivam a observao do objeto sobre
a platina do microscpio. As objetivas constituem as partes mais sensveis
do microscpio.

Dever ser observado para que as objetivas no batam jamais sobre o preparado ou lmina, quando
da ajustagem do foco.

Importante!
As lentes de vidro devero ser regularmente limpas, com esmero e cautela.

Aspectos gerais da microscopia


Para o aumento de um objeto, adotam-se duas tcnicas:
1. Observao do objeto atravs de uma lupa.
2. Projeo de uma ilustrao do objeto (por exemplo, projeo de um diapositivo).
As duas modalidades de aumento esto combinadas na estrutura do microscpio. A objetiva (4)
atua como lente convergente e produz, no tubo (2) do microscpio, uma miragem projetada e aumentada,
a chamada imagem intermediria", que, atravs da lente ocular (1) (correspondente a uma lupa),
novamente aumentada. O aumento total AT resulta do produto dos aumentos da objetiva A e da
ocular A".
Uma objetiva :
determinante para a capacidade de um microscpio;
importante para o aumento individualizado dos objetos microscpicos observados; e
importante para a nitidez do objeto microscpico observado.
Atravs das objetivas so projetadas figuras reais e invertidas dos objetos, que so observadas pelo
globo ocular atravs das lentes oculares, como se fosse atravs de uma lupa.

SENAI-RJ 139

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

A disperso dos raios de luz no microscpio est configurada na figura a seguir.

a. Olho
b. Ocular
c. Objetiva
d. Lmpada

AB.

Objeto entre distncia


focal simples e dupla da
objetiva
A'B'. Figura reaumentada do
objeto AB, em posio
invertida
A"B". Figura vertical aumentada
de A'B', em posio normal

A capacidade de resoluo de uma objetiva do microscpio depende de suas caractersticas fsicoticas e, particularmente, de uma maneira decisiva, de sua abertura numrica, identificada atravs da
seguinte frmula:

An = n x sem.
Onde:
An = abertura numrica (est gravada na guarnio da objetiva).
n = ndice de refrao (do meio entre o objeto e a objetiva do ar, quando da utilizao do sistema
"seco", ou do leo de imerso, quando da observao atravs de uma objetiva de imerso).
Sem . = metade do ngulo de divergncia ou de abertura, da lente frontal da objetiva.
Observao
A abertura numrica em sistema seco pode atingir, no mximo, o valor
1 (= ar). Na prtica, entretanto, alcana-se apenas um valor
equivalente a 0,95.

Nos sistemas de imerso, para eliminar a reflexo total, intercalado um meio lquido que possua o
mesmo ndice de refrao que o do vidro.

SENAI-RJ 140

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Somente aps a introduo da "tcnica de imerso", na qual o espao entre a lente e o objeto
preenchido com um "leo de imerso" (n = 1,5), pode ser melhorada a abertura numrica.
A finalidade do "leo de imerso" reduzir a refrao dos raios luminosos, permitindo que sejam
dirigidos diretamente para a objetiva. Quando no se usa o leo de imerso, parte dos raios luminosos
desviada ou refratada ao atravessarem a lmina de vidro onde se encontra a preparao a ser
visualizada. Esse desvio ocorre devido ao ndice de refrao do vidro. Por isso os raios sofrem um
desvio menor, permitindo uma imagem mais clara e ntida.

Lente

Lente
leo de
imerso

Lmina
de vidro

Raios
perdidos

Fonte
de luz

A abertura numrica determina, essencialmente, a capacidade mais importante de uma objetiva, a


denominada "capacidade de resoluo".
Por "capacidade resolutiva", ou simplesmente resoluo de um sistema tico, entende-se a aptido
de reproduzir numa imagem, as particularidades do objeto observado.

Observao
Quanto menor a distncia entre os pormenores do objeto, que propicia o
discernimento pela objetiva, maior a sua capacidade de resoluo.

A frmula da "resoluo" a seguinte:

d =
A
Onde:
d = distncia entre duas particularidades ainda distintas do objeto.

= o comprimento de onda da luz incidente.


A = abertura numrica.

SENAI-RJ 141

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Como se depreende da frmula para a resoluo, tambm o comprimento de onda possui um


grande significado, ou seja, quanto menor o valor do comprimento de onda e maior for abertura
numrica, maior a capacidade de resoluo.
Como o comprimento de onda da fonte luminosa geralmente permanece constante a 550mm, a
abertura numrica (A) decisiva para o valor da resoluo (d). Assim, para um microscpio, o limite da
capacidade de resoluo de 0,2 a 0,15 m. Estando dois pontos do objeto mais prximos um do outro,
eles no so mais identificados separadamente num microscpio simples.
Pela utilizao de um microscpio UV, atinge-se uma resoluo de 0,1 m, enquanto num microscpio
eletrnico consegue-se at 0,001 m.
Como j vimos, o aumento total do objeto focalizado igual ao aumento da ocular vezes o da
objetiva. Quanto maior for o aumento da objetiva, mais prxima mesma dever ficar do objeto a ser
focalizado. A distncia entre a lente e o objeto chamada de "distncia focal" ou "comprimento focal".
Deste modo, a distncia focal da objetiva de 10x de 16mm, da objetiva de 40x de 4mm, e da
objetiva de imerso de 1,8mm, como mostrado na figura abaixo.

10X

40X

16mm

100X

4mm

1,8mm

As lentes objetivas geralmente so em nmero de 4, com aumentos de 10x, 40x, 60x a 63x e 100x.
A objetiva de 100x denominada "lente de imerso", porque para ser usada necessrio que fique
imersa em um leo mineral (leo de imerso).
Na parte externa da guarnio das objetivas esto gravadas a marca de fbrica e nmero de
fabricao, assim como diversos valores que caracterizam as propriedades da objetiva.
As gravaes, por exemplo, representam o seguinte:
40 = unidade numrica da imagem intermediria.
0,65 = abertura numrica.
160 = comprimento mecnico do tubo, em mm.
0,17 = espessura da lmina necessria, em mm.

SENAI-RJ 142

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Observao
O comprimento do tubo dever ser mantido para assegurar a correo da
objetiva.

fundamental que se evite uma combinao de acessrios de diferentes fabricantes, pois existem
microscpios e objetivas com diferentes comprimentos de tubos (160, 170, 250, etc.).
Tambm devero ser utilizadas lamnulas com especificaes adequadas no interesse de obteno
de uma boa qualidade de imagem.
Objetivas que so sensveis s oscilaes na espessura das lamnulas esto identificadas pela
indicao "-".
Objetivas com a indicao para lamnulas "0" so destinadas, exclusivamente, para preparados sem
uso de lamnulas. Ao lado das unidades gravadas nas objetivas ainda h indicao do "tipo da objetiva",
o qual se refere ao modo ou grau de correo em funo do erro de imagem.

Ocular
Sua funo aumentar a imagem real aumentada e projetada pela objetiva, como a de uma lupa.
Sua composio tem, no mnimo, duas lentes ou grupo de lentes: lente de campo, lente ocular e,
intermediariamente, o diafragma visual.

Unidade de iluminao
Uma boa imagem microbiolgica necessita de uma boa iluminao.
A iluminao direta composta de:
Fonte luminosa geralmente uma lmpada, localizada na base do microscpio.
Diafragma-ris dispositivo que permite regular a intensidade da luz que passa atravs do objeto
focalizado. Quanto maior for o aumento da objetiva, mais aberto deve estar o diafragma-ris.
Condensador localizado abaixo da platina. Atua convergindo os raios luminosos para o objetivo
focalizado.

Importante!
de suma importncia a boa qualidade de um "condensador".

SENAI-RJ 143

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Os condensadores se subdividem em:


condensador para campo claro;
condensador para campo escuro;
condensador para contraste de fase.
Na microscopia de campo claro so observados objetos maiores, assim como coloridos.
As membranas celulares dos m.o. ficam pretas quando visualizadas em fundo claro.
Em campo escuro observam-se membranas celulares brancas em fundo preto. Com ajuda de um
condensador especial, os raios luminosos no so dirigidos diretamente para o objeto. Somente luz
refletida ou dispersa que alcana o objeto. bastante apropriado para observao de objetos muito
pequenos, como bactrias e leveduras. Cores no so identificveis.
O campo escuro apropriado para exames de rotina nas cervejarias e indstrias de refrigerantes.
No microscpio com contraste de fase so formadas estruturas finas visveis sem colorao.
Objetos transparentes, que possuem um ndice maior de refrao em relao ao meio circunvizinho,
provocam um desaceleramento dos raios luminosos disseminantes. Esses so retardados por uma
frao de um comprimento de onda em relao aos raios luminosos passantes pelo meio. Essa diferena
de fase transforma o contraste de fase em contraste de campo claro. Por toda a parte onde h um
deslocamento de fase do objeto sero reconhecidas particularidades na imagem.
A microscopia de contraste de fase especialmente vantajosa para a observao das condies de
vida dos m.o. Enquanto as leveduras se caracterizam claras, bactrias geralmente se destacam aqui
pretas. A alterao da refrao do protoplasma das clulas de leveduras mortas tambm identificvel
atravs de uma colorao cinza.

Adaptao do microscpio para campo claro

Condensador Zeiss AS 0,9, com


comutador.
O condensador est ajustado na platina e
solidamente instalado. Contm o diafragma
que regula o contraste da imagem.

SENAI-RJ 144

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Abaixo do condensador encontra-se o comutador seguro por meio de um parafuso. Ele permite um
acionamento em duas posies:
alavanca em posio para a direita significa: passagem livre; a ser utilizado para objetiva 10x; e
alavanca em posio para a esquerda significa: comutada a lente adicional; a ser utilizado para
objetiva < 10x.
O diafragma-ris tambm acionado por alavanca para dois posicionamentos:
girando para a direita significa: o diafragma est sendo aberto; e
girando para a esquerda significa: o diafragma est sendo fechado.
Esse comutador de condensador pode ser substitudo por um comutador com diafragma anular Ph2
ou comutador de condensador com diafragma de campo escuro D 0,7. Para tanto:
desaparafusar a porca serrilhada, puxar para baixo o comutador a ser substitudo, encaixar o
outro comutador para a posio de descanso e fixar com a porca serrilhada;
colocar a lmina com o preparado e a lamnula sobre a platina e fix-la sobre a mesa-coaxial com
o grampo de reteno com mola;

Observao
Como preparar a lmina ser descrito posteriormente.

girar o revlver e posicionar a objetiva escala 10 no encaixe do descanso, exatamente sobre a


lmina com o preparado; o ajuste do microscpio dever ser sempre iniciado com a objetiva com
o menor valor de aumento;
posicionar o comutador do condensador para livre passagem da iluminao, acionando a alavanca
para a direita at encaixe de descanso;
no tubo binocular, primeiramente, olhar atravs da ocular e com o parafuso macro e micromtrico
proceder nitidez da imagem; em seguida, proceder correo da nitidez da imagem para a vista
esquerda, girando o tubo regulvel de fora para dentro; utilizando-se um tubo binocular sem tubo
ajustvel, colocar no tubo direita uma ocular normal e no da esquerda uma ocular de mesmo
aumento ajustvel; a nitidez da imagem ser ajustada, para a vista esquerda, girando a lente;
ento proceder ao ajuste da distncia do tubo at observar um campo ntido com ambas as vistas;
ajustar o contraste da imagem e a capacidade de resoluo com o diafragma do condensador;
para controle, remover uma ocular do tubo; olhar atravs do tubo vazio; a abertura ou ngulo de
divergncia perceptvel da objetiva deveria estar iluminada, atravs do diafragma do condensador,
em ca. de sua rea; com a troca da objetiva, ajustar o ngulo de divergncia da objetiva;
conciliar a luminosidade da imagem com o reostato de regulagem da lmpada ou com o filtro
sobre suporte;

SENAI-RJ 145

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

com o revlver das objetivas, escolher a objetiva com a escala desejada, girando-a at encaixe de
descanso; com o parafuso micromtrico, ajustar a nitidez da imagem;
com o revlver das objetivas, escolher a objetiva seguinte com a escala desejada final, girando-a
at encaixe de descanso; e

Importante!
Nesse momento, deve-se observar, no nvel da viso, se a objetiva, durante
o giro, eventualmente, j est golpeando o preparado.

ajustar a nitidez da imagem com o parafuso micromtrico.

Adaptao do microscpio para campo escuro

Condensador AS 0,9.
Diafragma para campo escuro D 0,7
para objetivas de 10x a 40x.
Alavanca do comutador do
condensador.

Ajustagem:
ajustar o objeto, primeiramente, em campo claro, com a objetiva de menor aumento; para isso,
comandar por giro a alavanca para a posio esquerda (= passagem livre);
para a focagem, escolher uma rea do objeto que apresenta a menor estrutura (em caso excepcional,
numa rea perimetral do preparado);
encaixar o diafragma de campo escuro sobre o comutador do condensador, acionando a alavanca
para a posio direita, e abrir o diafragma-ris do condensador;
durante a observao, deslocar o diafragma de campo escuro numa determinada altura, at que o
preparado se apresente o mais claro e o fundo o mais escuro possvel; e
regular o reostato da lmpada (AM) para o mximo de luminosidade.

SENAI-RJ 146

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Preparao de uma amostragem ou de um objeto (por exemplo, com levedura)


para microscopia

a) Limpar uma lmina com um pano seco isento


de fiapos
b) Flambar por diversas vezes a lmina,
movimentado-a sobre a chama de um bico de
Bunsen para conseguir sua esterilizao
c) Sobre o lado esterilizado da lmina, pingar
apenas uma gota de uma soluo de KOH
a 5%
d) Flambar e esterilizar ao rubro a ala de platina
e) Resfriar a ala de platina com rpido mergulho
da ponta no meio de cultura e retirar o
material (levedura ou outras m.o. de uma
colnia)
f e g) Misturar bem o material recolhido na gota
de KOH a 5%
h) Cobrir com cuidado o material, com uma
lamnula flambada de um lado para o outro,
no colocando-a diretamente de cima, na
posio vertical. Tal procedimento evita a
formao de bolhas de ar no preparado e que
prejudicariam a microscopia

Importante!
A soluo KOH a 5% dissolve as protenas coloidais dispersas no
meio e que poderiam ser, eventualmente, confundidas por operadores
inexperientes como sendo Pediococcus.

SENAI-RJ 147

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Classificao e identificao de
microrganismos
Aspectos gerais
Na prtica fabril, o questionamento bsico para a avaliao microbiolgica consiste de duas perguntas:
1. O m.o. evidenciado ou no um contaminante tpico de cervejas?
2. Sendo um contaminante de cervejas, obrigatoriamente ou potencialmente danoso cerveja?
Entende-se por microrganismos danosos aqueles que, atravs da produo de produtos
metablicos, alteram as propriedades organolpticas da cerveja quanto ao paladar e aroma, ou, atravs
da formao de turvao e sedimentos, alteram as propriedades visuais do produto.
Contaminantes obrigatoriamente danosos cerveja so microrganismos que, penetrando em
qualquer cerveja, tornam-se rigorosamente prejudiciais.
Os principais contaminantes obrigatoriamente danosos so os Lactobacillus e Pediococcus.
Contaminantes potencialmente danosos cerveja so microrganismos que se tornam
prejudiciais cerveja somente sob determinadas condies.
Microrganismos potencialmente danosos apenas se desenvolvero quando os fatores inibidores da
cerveja estiverem reduzidos.
Os m.o. obrigatoriamente danosos toleram as propriedades seletivas da cerveja em especial, o
valor do pH baixo, a atmosfera anaerbica, as substncias amargas do lpulo, o teor alcolico, a
deficincia de determinados elementos nutritivos e de crescimento (em decorrncia da fermentao
principal anterior), assim como as baixas temperaturas, podendo se desenvolver sem necessitarem de
longos perodos de adaptao na cerveja.
A contaminao por esses m.o. dever ser evitada por todos os meios.
Menos perigosos so os m.o. potencialmente danosos cerveja. Os mesmos, como j foi visto,
apenas se desenvolvem na cerveja sob determinadas circunstncias. O risco prevalece apenas em
cervejas com um valor de pH muito alto, concentraes de substncias amargas do lpulo extremamente
baixas, insuficiente grau de fermentao, altos teores em oxignio ou baixo teor alcolico.
Contaminantes danosos indiretos para a cerveja so m.o. que no provocam especificamente
qualquer alterao nas caractersticas da cerveja, porm podem se desenvolver nas fases iniciais do
processo de produo afetando indiretamente as qualidades do produto final.
Exemplo: contaminao do mosto j resfriado.
Microrganismos indicadores so m.o. que no constituem perigo quanto estabilidade biolgica
da cerveja, mas que podem aparecer em razo de medidas insuficientes de limpeza e sanitizao ou
SENAI-RJ 148

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

quando da ocorrncia de falhas operacionais. A comprovao desses m.o. fornece uma importante
informao ao setor de controle fabril, que, de imediato, dever providenciar as medidas corretivas
necessrias.
Como estes m.o. podem ser mais prematuramente e mais facilmente detectados, constituem um
alerta para se evitar posteriores problemas microbiolgicos.
Devemos diferenciar os termos classificao e identificao.
Pela identificao determinada tanto a espcie como tambm o tipo de microrganismo.
Na prtica, normalmente suficiente uma classificao para avaliar as propriedades danosas ao
produto.
Para uma anlise de gua potvel torna-se imprescindvel, pela legislao pertinente, a identificao
da Escherichia coli, assim como de grupo de coliformes.
Tambm para os contaminantes danosos ao produto desejvel uma identificao quando se tratar
de um m.o. com caractersticas especiais, como, por exemplo, indicando uma resistncia contra
determinado produto desinfetante.
Para a identificao de m.o., so utilizados inmeros parmetros:

macroscpicos:

forma, colorao, aspectos da colnia.

produo de cido (em meios de cultura com indicador).

microscpicos:

morfologia (forma, tamanho e aparncia da clula).

disposio celular.
mobilidade.

testes:

formao de esporos.

os chamados testes fsico-biolgicos, que diferem para cada grupo de


organismos.

SENAI-RJ 149

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Disposio das etapas de trabalho para a identificao de microrganismos

Cultura por
membrana
filtrante

Enriquecimento
em meio nutritivo
lquido

Suspenso diluda
microrgnica

Estriamento
em Agar

Lminas com
preparados

Provas
Comprobatrias

Estriamento
fracionado para
obteno de
cultura pura
(meio coletivo)

Preparado de GRAM
ou
Teste de KOH
Teste da Catalase

Teste da Oxidase

Prova de verificao
de cultura pura
(meio coletivo)
Cepa-Matriz
Teste adicional

Set de Testes
Manual de cdigo
e identificao,
informaes
sobre ordenao
estatstica

Incubao
Avaliao
Elaborao
do n de
cdigo

Identificao
atravs de um
set de testes,
ou seja,
espectro

Tabelas
de
Determinaes

Espectro de Acar

Classificao e identificao de bactrias


Para a diferenciao de bactrias existem diversos testes, conforme descritos a seguir.

Colorao de Gram
Esse mtodo de colorao, introduzido por GRAM em 1884, divide as bactrias em dois grupos.

SENAI-RJ 150

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Bactrias gram-positivas, que possuem uma parede celular de multicamadas de Murena, e as


gram-negativas, que possuem uma parede celular formada mais intensamente por lipdeos.
O teste de colorao de GRAM tem os seguintes procedimentos:
a) esterilizao ao rubro da ala de platina;
b) remoo de uma colnia do meio de cultura ou introduzir a ala no meio nutritivo lquido do tubo
de cultura;
c) tendo sido a colnia removida da placa de Agar, dever ser a mesma espalhada sobre gota de
gua estril ou sobre soluo fisiolgica salina. A lmina dever ser, preliminarmente,
desengordurada com lcool;
d) preparao de uma fina camada por extenso superficial;
e) preparado seco ao ar;
f) fixao do preparado pelo calor; para tanto, o preparado seco ao ar, com o lado da camada para
cima, passado sobre a chama do bico de Bunsen por 3x; os m.o. fixam-se sobre a lmina;
g) colocao da lmina com o preparado fixado
sobre o banco de colorao;
h) colorao com a soluo Violeta Cristal (1 a
2 minutos);
i) enxge com gua;
j) cobertura com soluo de Lugol (tem a
funo de mordente);
k) enxge com gua;
l) descoramento com lcool a 95%, at trmino
das nuvens do corante; esta a fase
diferenciadora;
m) enxge com gua;
n) contracolorao com Fucsina (20 seg.) ou
Safrina vermelha (1 min.);
o) secagem do preparado; e
p) umedecimento com leo de imerso e, sem lamnula de cobertura, procedimento microscopia.

Resultados:
Bactrias gram-positivas ficam coloridas em violeta.
Bactrias gram-negativas ficam coloridas em vermelho.

SENAI-RJ 151

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Fatores de erro:
1. Bactrias envelhecidas no mais reagem de forma inequvoca (gram-variveis).
2. "Supercolorao" ou "descoramento total" so possveis de acontecer por falta de prtica.
Auxlio: colorao, em paralelo, de bactrias gram-positivas e negativas conhecidas.

Teste de KOH
O referido teste no substitui o mtodo da "colorao de GRAM", entretanto, poder servir de teste
de apoio para os casos de dvida operacional desse ltimo.

a) Sobre uma lmina, aplicar uma poro suficiente de


soluo de KOH a 5%, com auxlio de uma ala de
platina;
b) Misturar bem com o KOH o inculo de uma colnia do
material; e
c) Aps a ao de homogeneizao por 5 a 10 segundos,
levanta-se cuidadosamente a ala. Formando-se um
"muco viscoso" ou um "puxar fio", fica comprovada uma
reao positiva. As bactrias testadas so, KOHpositivas e, como tal, "Gram-negativas". No se
evidenciando qualquer reao, sero as bactrias KOHnegativas e Gram-positivas.

Teste da catalase
Este teste utilizado para diferenciar bactrias aerbias
de anaerbias.
As bactrias aerbias possuem a enzima catalase, a qual
desdobra o H2O2, produzido pelo metabolismo, em H2O e
oxignio.
Bactrias anaerbias no possuem a enzima catalase.
Princpio de trabalho:
Com uma ala de platina, espalhar uma colnia sobre uma lmina, a seco, sobre a qual se goteja
uma soluo H2O2 a 3-5% (em frascos marrons, armazenados em geladeira). Com produo de gases
e espuma, a bactria catalase-positiva e, com isso, aerbica (ou, tambm, facultativa). No havendo
qualquer reao, a bactria catalase-negativa e anaerbica.
Um falso resultado aparece quando h mistura de colnias ou presena de leveduras.

SENAI-RJ 152

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

As leveduras reagem fortemente, sendo catalase-positivas, e poucas clulas presentes j so


suficientes para falsear os resultados.

Teste da oxidase
Esse teste serve para diferenciar bactrias gram-negativas.
As Pseudomonas (Pseudomonadaceae) possuem a enzima citocromoxidase. Conseqentemente,
so oxidase-positivas.
As Enterobactrias (Enterobacteriaceae) no possuem essa enzima e so, portanto, oxidasenegativas.
Utilizam-se tiras ou solues prontas para a realizao do teste. Uma colnia colocada sobre a
tira e espera-se a reao de cor.
Quando a colorao se torna azul, os m.o. so oxidase-positivos. Ausncia de colorao indicam
m.o. oxidase-negativos.

Erros podem acontecer com meio de cultura com pH abaixo de 5,5, e com colnias mais velhas.

SENAI-RJ 153

SENAI-RJ 154

Micrococcus
Sarcina

Bacillus

sem
esporos

formam
esporos

aerbios
a
facultativos

refratam
fortemente
a luz

refratam
fracamente
a luz

aerbios
a
facultativos









Pediococcus

Lactobacillus

sem
esporos

sem
esporos

anaerbios
(microaeroflicos)

refratam
fortemente
a luz

sntese de
diacetil

anaerbios
(microaeroflicos)

refratam
fortemente
a luz









imveis

imveis

cocos

imveis

bastonetes

cocos

bastonetes

flagelos
pentrquios

sintetizam
cido ltico

no sintetizam
cido ltico

catalase
negativo

catalase
positivo

Teste de catalase

Gram positivo

COLORAO DE GRAM

sem
esporos





facultativos

Streptococcus
Leuconostoc

bastonestes
curtos a
cocides




Pseudomonas

Klebslella
Citrobacter

E. coll
Enterobacter

fermenta
lactose




lactose
negativo




Hafnia
Zymomonas








 Pectinatus

Acetobacter
(flagelos
peritrquios)





Megasphae






sem esporos

refratam
fracamente a luz

imveis




cocos
(levemente
ovais)

catalase
negativo

sem esporos

glucanobacter
(flagelos polares)





sem
esporos






flagelos
peritrquios

aerbios

bastonetes
ou
espirillos

refratam
fracamente
a luz





sntese de
cido actico

Teste de catalase

Gram negativo

COLORAO DE GRAM

no
coliformes

Enterobacteraceae

aerbios a facultativos

sem
esporos

sem
esporos






 

geralmente
flagelos
peritrquios






refratam
 fracamente
a luz


geralmente
flagelos
polares





no sintetizam
cido actico

bastonetes
curtos a
cocides


oxidase
negativo


oxidase
positivo

teste de
oxidase

catalase
positivo

Esquemas de testes para bactrias


Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Classificao e identificao de leveduras


Para o caso de leveduras, a aplicao de testes simplificados (como KOH, catalase ou oxidase)
no possvel.
Assim sendo, em primeiro lugar, macroscopicamente, avaliada a cor, o formato e a consistncia
das colnias.
As leveduras cervejeiras de alta e baixa fermentao e inmeras leveduras selvagens que igualmente
pertencem ao ciclo morfolgico dos Saccharomyces cerevisiae formam colnias esbranquiadas at
uma colorao creme ou levemente marrom (especialmente em culturas mais velhas), redondas com
bordas lisas.
Dependendo das condies de cultivo (determinados meios nutritivos de cultura) e da idade das
colnias, de vez em quando aparecem certas aberraes na configurao das colnias. As variantes
especficas das cepas so mnimas.
Para se ter uma viso geral sobre o aspecto das colnias de leveduras de cultura e leveduras
selvagens, aconselhvel o "Atlas e Manual de Microbiologia sobre Bebidas", do Prof. Dr. W. Back.
Microscopicamente, avalia-se:
o formato e o tamanho da clula;
o tipo do brotamento ou gemulao;
a eventual formao de pseudomiclio; e
os possveis componentes intracelulares, como, por exemplo, gotculas de gordura.
Estimulando-se a levedura esporulao, pode-se tambm observar a formao de "ascsporos".
Leveduras cervejeiras de baixa fermentao, usualmente, produzem clulas arredondadas at
ovaladas com tamanhos de 5 a 10 x 5 a 12 metros; parcialmente aparecem formatos elpticos e
cilndricos de 3,5 a 9,5 x 5,0 a 20,0 metros, raramente encontram-se clulas alongadas de at 40
metros ou de formato tubular. O tamanho mdio das clulas altera-se nas diferentes variedades. No
interior das clulas, comumente, encontram-se vacolos. A gemulao multilateral.

SENAI-RJ 155

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Levedura cervejeira de baixa fermentao


(campo escuro) ( S. carlsbergensis )

Kloeckera apiculata

Levedura cervejeira de alta fermentao


(campo escuro) ( S. c. var. cerevisiae )

Pichla membranaefaciens

Para a identificao de uma levedura, alm da avaliao das caractersticas macroscpicas e


microscpicas, deve-se analisar o "espectro de acares". Nesse caso, pesquizam-se os carboidratos
que so fermentados e aqueles que so "assimilados".

A expresso "assimilados" incorreta; a correta seria "degradados


aerobicamente".

A levedura inoculada em tubos "Durham", contendo cada tubo uma soluo de cada acar
isoladamente.
Observaes:
1. Geralmente quando uma levedura fermenta, a mesma tambm fermenta a glicose.
2. Quando a levedura fermenta a glicose, ento tambm fermentar a frutose e a manose.
3. Uma levedura nunca fermenta, simultaneamente, a maltose e a lactose.
4. Leveduras que fermentam a sacarose podem fermentar a rafinose, porm no obrigatoriamente.
5. Os mesmos acares assimilados (respirados) tambm so fermentados, podendo alguns, s
vezes, serem somente assimilados.

SENAI-RJ 156

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Glicose

Sacarose

Maltose

Lactose Frutose Galactose Rafinose

S. uvarum

3/3

S. cerevisae

1/3

S. bavanus

3/2

1/3

Hansenula
anomala
Kloeckera
apiculata

Onde:
+ = fermentao positiva (produo de gs).
= fermentao negativa (sem produo de gs).

= fermentao (produo de gs) negativa, raramente positiva.

Sistemas de testes comerciais


Os sistemas de testes "Roche Mycotube" e API 20C" so oriundos da rea mdica. Eles economizam
o preparo de diferentes solues de acares estreis.
O Micotubo da Roche consiste em um tubo de plstico com oito cmaras, que contm diversas
fontes de carboidratos.

Uma colnia de levedura fresca e recm-obtida inoculada na ponta do arame de passagem e


puxada por todas as cmaras. A incubao realizada, conforme instrues, a 37C (temperatura do
corpo) durante 24 e 48 horas.
Para a interpretao dos resultados, utilizam-se tabelas de comparao de cores, sendo reaes
positivas ou negativas indicadas pela viragem do indicador.

SENAI-RJ 157

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Bolores ou fungos filamentosos


A colorao e o formato da colnia fornecem a primeira referncia. Enquanto colnias novas de
bolores geralmente possuem uma colorao branca ou amarelada (cor do miclio), as colnias mais
velhas colorem-se de verde, verde-azulada, avermelhadas, marrons ou pretas (cor dos esporngios/
condios). Somente fungos pretos possuem um miclio escuro.
Microscopicamente pode-se julgar se so esporngios ou condios. O esporngio tpico de Mucor
arredondado sem apfise. Absidia possui esporngio com apfise. Aspergillus possui uma base tpica
em forma de bolha, com esterigmas e, presos nelas, os condios.

1
2
3

5
6

7
9

10
11
12

1. Membrana
2. Esporos (esporngios)
3. Columela (parede de separao)
4. Hifa
5. Apfise (engrossamento da Hifa)
6. Condios
7. Esterigma
8. Medula
9. Hifa conidial
10.
10.Miclio areo
11.
11.Miclio vegetativo
12.
12.Meio de cultura

SENAI-RJ 158

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Exerccios
1.

2.

Marque (X) na(s) alternativa(s) correta(s):


a) (

) Esterilizao significa destruio de m.o. patognicos.

b) (

) Esterilizao significa destruio de clulas viveis e esporos.

c) (

) Esterilizao significa destruio de m.o. deteriorados.

d) (

) Tindalizao consiste na destruio de clulas vegetativas.

e) (

) Toda substncia termolbil deve ser esterilizada por filtrao.

f) (

) Tindalizao consiste na destruio de esporos e clulas vegetativas.

Coloque verdadeiro (V) ou falso (F):


a) (

) Calor seco e calor mido so exemplos de mtodos de esterilizao.

b) (

) O forno Pasteur e a autoclave so exemplos de mtodos de esterilizao.

c) (

) O calor mido menos eficiente do que o calor seco, pois seu mecanismo de ao
de baseia na oxidao dos componentes celulares, enquanto o calor seco se
fundamenta na coagulao prottica, sendo essa reao catalisada pela gua.

d) (

) Alta temperatura e presso constituem-se no princpio de ao do calor mido,


enquanto que alta temperatura por tempo prolongado constitui-se no princpio de
ao do calor seco.

e) (

) Toda levedura Gram+, mas nem toda bactria Gram.

f) (

) A catalase a enzima que decompe o perxido de hidrognio em gua e oxignio.

g) (

) Todos os m.o. catalase-positivos so anaerbicos ou microaerfilos.

h) (

) O hidrxido de potssio 5% usado na microscopia de campo escuro, com o


objetivo de desnaturar protenas.

i) (

) As bactrias Gram refratam fortemente a luz, pois tm a parede celular espessa.

j) (

) A colorao de Gram baseia-se na composio da parede celular das bactrias.


As bactrias Gram+, por terem mais lipdios, permitem a entrada do lcool e se
coram com o corante de fundo, safranina.

k) (

) As bactrias Gram tm sua parede celular composta por glicoprotenas


(peptoglicano), o que confere rigidez.

l) (

) O leo mineral diminui o ndice de refrao da luz, devendo ser usado somente na
objetiva de imerso.

m) (

) No teste de Gram, o qual utiliza KOH a 5%, observa-se a formao de filamento.


Assim, toda bactria Gram apresenta positividade neste teste.

n) (

) O teste de oxidase serve para diferenciar as famlias Pseudomonadaceae e


Enterobacteriaceae.

SENAI-RJ 159

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

3.

4.

Correlacione as colunas:
a) Colorao de Gram

) Lacctobacillus e Pedococcus.

b) Bactrias Gram+

) a fase diferenciadora da colorao de Gram

c) Bactrias Gram

d) Lugol

) Constitui-se na tcnica de diferenciao de


bactrias, que se utiliza de corantes.

e) lcool

) Bactrias acticas e Zymomonas.

Tem a funo de mordente, ou seja, ajuda a


fixar o corante primrio cristal violeta.

Complete as lacunas:

a) O Agar-MRS um meio de cultura _________________________ para m.o. danosos


cerveja, devendo ser incubado em condies ____________________________.

b) So exemplos de fontes de nutrientes para o crescimento dos m.o.:


_______________________________e __________________________.

c) O Agar-mosto permite o crescimento de: __________________________________


e ________________________________.

d) A actidiona um agente ___________________________________________ do


crescimento de ____________________________________________.

e) O Agar ________________________________ permite o desenvolvimento de


bactrias aerbias.

f) No Agar-NBB, os m.o. danosos cerveja metabolizam a glicose modificando o pH do


meio de cultura; assim, o indicador __________________________________ vira
para _______________________________________.

SENAI-RJ 160

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Chave de respostas

Exerccio 1
b) (X) Esterilizao significa destruio de clulas viveis e esporos.
e) (X) Toda substncia termolbil deve ser esterilizada por filtrao.
f) (X) Tindalizao consiste na destruio de esporos e clulas vegetativas.

Exerccio 2
a) (V)
b) (V)
c) (F)
d) (V)
e) (V)
f ) (V)
g) (F)
h) (V)
i) (F)
j) (F)
k) (F)
l) (V)
m) (V)
n) (V)

Exerccio 3
a) (B)
b) (E)
c) (D)
d) (A)
e) (C)

SENAI-RJ 161

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Exerccio 4
a) O Agar-MRS um meio de cultura seletivo para m.o. danosos cerveja, devendo ser
incubado em condies anaerbias.
b) So exemplos de fontes de nutrientes para o crescimento dos m.o.: glicose e peptona.
c) O Agar-mosto permite o crescimento de: leveduras cervejeiras e selvagens.
d) A actidiona um agente inibidor do crescimento de leveduras.
e) O Agar STANDARD permite o desenvolvimento de bactrias aerbias.
f) No Agar NBB, os m.o. danosos cerveja metabolizam a glicose modificando o pH do
meio de cultura; assim, o indicador vermelho de clorofenol vira para amarelo.

SENAI-RJ 162

Curso Tcnico de Cervejaria Introduo anlise laboratorial laboratrio II

Referncias bibliogrficas
PELCZAR, Michael; REID, Roger; CHAN, E; C. S. Microbiologia. So Paulo: McGrawHill do Brasil, 1980. v.1 il.
SENAI R.J. CENATEC de Produtos Alimentares. Garantia da Qualidade Microbiolgica
em Cervejaria. Vassouras, 1996. 124p. Material Didtico do Curso Tcnico Especial de
Cervejaria.
SENAI R.J. CENATEC de Produtos Alimentares. Microbiologia. Vassouras, 1996. 1.v.
Material Didtico do Curso Tcnico Especial de Cervejaria.
SOARES, Juarez Braga; CASIMIRO, Antonio Renato S. de; ALBUQUERQUE, Laurencia
Maria B. de. Microbiologia Bsica. Fortaleza: EUFC, 1991. 180 p. il. tab. Inclui bibliografia.

SENAI-RJ 163

FIRJAN
CIRJ
SESI
SENAI
IEL
FIRJAN

SENAI

Av. Graa Aranha, 1

Federao

Servio Nacional

Centro CEP 20030-002

das Indstrias

de Aprendizagem

Rio de Janeiro RJ

do Estado do

Industrial do

Tel.: (21) 2563-4526

Rio de Janeiro

Rio de Janeiro

Central de Atendimento:
0800-231231