Espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier con

reflectancia total atenuada horizontal (FTIR HATR)

Garrido Iris, Laya Yaniret
Laboratorio de Qumica Analtica Instrumental. Facultad Experimental de Ciencias y Tecnologa.
Universidad de Carabobo. Naguanagua, Venezuela.
Revisado por: Prof. Jimnez Jos
Resumen
El uso de espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier con reflectancia total atenuada horizontal (FTIR-HATR)
permiti medir cido ascrbico en muestras de diferente estado fsico y a distintas concentraciones. En los espectros FTIR
obtenidos en los diferentes cambios fsicos que mostraba cada muestra se logro observar la variacin entre ellos, lo que dio
pie a la posibilidad de construir curvas de calibracin a diferentes concentraciones y evaluar as en cul de los espectros
obtenidos del cido ascrbico se aproxima al terico y con cual podemos obtener una mejor curva de calibracin para
determinar concentraciones. La curva de calibracin se construy a diferentes concentraciones y con los espectros FTIR
correspondientes. El modelo se desarroll utilizando el algoritmo PLS (Partial Least Square) el cual mostr la mejor
correlacin entre los componentes y las imgenes espectrales obteniendo valores de R 2 mayores de 0.99 en todas las
propiedades analizadas.

Abstract
The objective is to determine m S. ionization constant acid bromothymol blue by UV-visible
spectroscopy absorption. Bromothymol blue coloring presents both its molecular form and in its
dissociated form, through dis technique can build a curve of pH vs. S. absorbance and determine
the pKa of the indicator. Therefor five solutions with pH Near the pKa of Metric1 were performed
using a buffer solution of NaH2PO4 / K2HPO4. In addition, two solutions were made pH extremes
ensuring that the balance completely displace Training One-Of Species (HIN strongly acidic pH and
basic pH in- kind). Each of the solutions was measured absorbance at 400 ranges from 10 to 700
, thus building a 3D calibration curve. UN Maximum absorption was obtained for 420 species HIn
and for In- 605. The VA than the pKa of bromothymol blue is 0.003 7.02.

INTRODUCCIN
La espectrofotometra de infrarrojos por transformada de
Fourier es una tcnica de absorcin de radiacin
infrarroja. El espectro obtenido durante una medida FTIR representa la absorcin de radiacin infrarroja por
parte de las molculas que forman la muestra, crendose
una huella molecular caracterstica que est relacionada
con los modos de vibracin de los enlaces de la molcula.
Cada molcula genera su propia huella caracterstica lo
que la convierte en una tcnica idnea tanto para el
anlisis cualitativo como el cuantitativo.
El desarrollo de FT-IR vino dado para corregir las
limitaciones que tenan los mtodos usados hasta ese
momento, sobretodo mtodos dispersivos cuyo principal

inconveniente era la lentitud del proceso. Para solucionar

esto se desarroll un dispositivo ptico conocido como
interfermetro.
El interfermetro produce un nico tipo de seal
codificada que contiene todas las frecuencias del
infrarrojo. La seal se mide de forma muy rpida en el
orden de un segundo. El interfermetro ms comn en
espectroscopia FTIR es el conocido como interfermetro
de Michelson, que emplea un divisor de haz que divide el
haz incidente en dos, haciendo que uno de ellos se refleje
en un cristal plano que est fijado en un punto
determinado (espejo fijo) y el otro se refleje en otro
cristal plano pero que a diferencia del anterior tiene un
mecanismo que permite su movimiento (espejo mvil). A
continuacin, el haz vuelve a recombinarse al volver al

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Determinacin de la concentracin de cido scorbico por FTIR-HATR.FACYT-UC

divisor y ser dirigido hacia la muestra, tras atravesarla
llega al detector, donde se obtiene un patrn de
interferencia conocido como interferograma.

puede cambiar de medio, de tal forma que se refleja

completamente. Sin embargo, en el punto en el que se
produce la reflexin total surge una onda estacionaria
conocida como onda evanescente que penetra unas pocas
micras (la penetracin depende de la longitud de onda del
haz incidente as como de otros factores como son el
ndice de refraccin del material de mayor ndice de
refraccin, de la muestra y del ngulo de entrada del haz
de luz) en el medio de ndice de refraccin menor. De
esta forma, si ese medio de ndice de refraccin menor es
una muestra desconocida, absorber parte de la radiacin
de la onda evanescente y el haz reflejado llevar, por
tanto, informacin sobre la absorcin de la muestra.

Figura 1. Espectrmetro FTIR de un solo haz

El interferograma lleva codificada en su interior
informacin sobre la absorcin a cada longitud de onda,
aunque sta no puede extraerse de forma trivial. Se
requiere emplear una compleja operacin matemtica
conocida como Transformada de Fourier (FT).
La espectroscopia de reflexin en el infrarrojo ha
encontrado varias aplicaciones, particularmente en el
caso de muestras solidas difciles de manipular. La
reflexin de la radiacin es de cuatro tipos; reflexin
especular, difusa, interna y total atenuada. En esta
prctica se utilizo un accesorio de reflectancia difusa total
atenuada.

Figura 2. Accesorio de reflectancia difusa para

espectrmetro de transformada de Fourier.
La reflectancia total atenuada horizontal se basa en el
fenmeno de reflexin total interna. Este fenmeno se
produce cuando un haz de luz intenta pasar de un medio
de ndice de refraccin mayor a otro de ndice de
refraccin menor con un ngulo menor que el conocido
como ngulo crtico. En esas condiciones, el haz no

Figura 3. Aparato de reflectancia total atenuada

horizontal (a) muestra colocada sobre la placa de
reflexin; (b) adaptador de reflexin interna.
Dispositivos de medida mediante reflexin total
atenuada horizontal, conocidos por sus siglas en ingls
HATR (Horizontal Attenuated Total Reflectance) pueden
ser de reflexin simple (si slo se produce una nica
reflexin en la muestra) o de reflexin mltiple (si se
producen varias). Normalmente, los HATR de los
dispositivos de infrarrojos consisten en un cristal de un
material de alto ndice de refraccin para el infrarrojo.
Para conseguir una buena calidad en la obtencin del
espectro se deben cumplir algunos requerimientos:
1- Buen contacto entre la muestra y el cristal HATR para
asegurarnos que la onda evanescente penetra en la
muestra.
2- El ndice de refraccin del cristal debe ser
significativamente mayor que el de la muestra. Las
ventajas que tiene el empleo de esta tcnica es: muestreo
ms rpido sin apenas preparacin, excelente
reproducibilidad entre muestras, mnimas variaciones
inducidas por cambios en el operador

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Determinacin de la concentracin de cido scorbico por FTIR-HATR.FACYT-UC

Este mtodo ofrece un nmero de ventajas importantes
sobre los mtodos qumicos tradicionales: no es
destructiva, es rpida, disminuye el uso de reactivos
txicos y perjudiciales para el medio ambiente, es un
mtodo no invasivo, requiere una mnima cantidad de
muestra y la precisin de la prediccin es generalmente
alta.
Materiales y equipos: Se emplearon pastilla de vitmina
C Cebion masticable 500mg, pastills de vitamina C
Cevax blanda, Acido ascorbiso y agua destilada
proporcionados por el laboratorio de anlisis
instrumental. Infrarrojo y hatr.

tomaron siete balones de 50 mL marca KIMAX, y se

adicionaron los volmenes de reactivos presentados en la
tabla 2 para los balones 1 y 7 se adiciono HCl y NaOH
respectivamente en exceso para garantizar que el
equilibrio se desplazara completamente hasta la
formacin de HIn y de In-.
Tabla 2. Volmenes de NaH2PO4 y KH2PO4
adicionados en los balones de 100 mL para obtener pH
cercanos al pKa del indicador, calculados mediante la
ecuacin de Henderson - Hasselbach.
Baln

NaH2PO4 (V0,5) mL

Procedimiento 1, solucin de cido ascrbico para la

curva de calibracion: se diluyo en 10mL de agua
destilada las cantidades mostradas en la tabla 1.

25,00 ms gotas de HCl

20,00

Tabla 1. Masas de cido ascrbico empleadas para la

preparacin de soluciones diluidas.

16,00

12,00

8,00

4,00

0,00

Peso de cido ascrbico

(m 0,0001)g
0
0,5
1
1,5
2

Porcentaje de cido
ascrbico en 10mL de
solucin (%)
0
5
10
15
20

Procedimiento 2, adicion estndar de acido ascorbico

realizada a las pastillas Cebion y cevax para la
construccin de la curva de calibracin.
Se homogenizaron las pastillas cebion y cevax, y se
adicionaron aditivamente las cantidades de acido
ascorbico descritas en la Tabla 2.
Tabla 2. Masas de cido ascrbico empleadas para la
preparacin de soluciones diluidas.
Peso de cido ascrbico
(m 0,0001)g
0
0,5
1
1,5
2

Porcentaje de cido
ascrbico en 10mL de
solucin (%)
0
5
10
15
20

Para la realizacin de la curva de calibracin por FTIRHATR se corri inicialmente para cada una de las
muestras un background, posteriormente se corri un
blanco y

25,00 ms

Observacin: Luego de realizado el barrido espectral se

encontr que las soluciones estaban muy concentradas,
saliendo del rango de medicin, por lo que se realiz una
dilucin de 25/50 mL para cada una de las soluciones.
Se dej en reposo cinco minutos las soluciones para que
desarrollara el color.
Seguidamente se calibro el spectronic 20 ajustando sin
cubeta a 0% de trasmitancia y con una cubeta con agua
destilada se ajust a 100% de trasmitancia. Se procedi a
realizar un barrido espectral desde 400 a 700 nm en
intervalos de 10 en 10nm, con las soluciones de pH
extremos. Encontrndose que la longitud de onda de
mayor absorcin para la especie acida es a 420nm y para
la ionizada es 605nm.
Se encontr que las soluciones estaban muy concentradas
y arrojaban valores de absorbancia por encima de 1, por
lo que se realiz para cada una de las soluciones una
dilucin de 25/50 mL, se midi para cada una de ellas el
pH con un pH metro Fisher scientific, arrojando los
valores reportados en la Tabla 3.
Tabla 3. pH de las soluciones de azul de bromotimol
medidas con el pHmetro Fisher scientific.
Solucione
s

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KH2PO4

Determinacin de la concentracin de cido scorbico por FTIR-HATR. FACYT

pH

6,1

6,36

6,7

7,1

7,4

- UC

12

Se prosigui a trasvasar cada una de las soluciones a

cubetas y se midi su absorbancia desde 400 a 700nm
con intervalos entre 5 y 10nm con la misma metodologa
descrita anteriormente. Se tuvo cuidado de mantener las
cubetas en la misma posicin dentro del
espectrofotmetro. Obteniendo las absorbancias para
cada una de las soluciones descritas en la Tabla 4.

Tabla 4. Barrido espectral realizado a diferentes pH del azul de bromotimol, desde una longitud de onda de 400 a 700nm,
utilizando un espectrofotmetro Milton Roy spectronic 20.

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Determinacin de la concentracin de cido scorbico por FTIR-HATR.FACYT-UC

6,01

6,36

6,7

7,1

7,4

12

400
405
410
415
420
425
430
435
440
445
450
460
470
480
490
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590
595
600
605
610
615
620
625
630
635
640
650
660
670
680
690
700

44,5
42,5
41,5
40,5
40
41
41,5
42
43,5
45
48
52,5
59
61
71
72
82
85
89
91
94
95
96
96
97
96
97
97
97
98
98
97
98
98
98
98
98
98
98
98
98

44
42,5
42
41,5
40,5
41
41,5
42,5
43,5
45
47,5
53,5
59
65
71
75,5
80
82
84
85,5
86
85,5
85
84,5
83
83
81,5
81,5
81,5
81,5
82,5
85
85
86
88
91
93,5
95
96,5
98
98

43
41,5
41
41
41
41
41,5
42,5
44
45,5
47,5
53
58
63
67,5
71
74
75
75,5
75
73
71,5
70
68,5
66
66
64
63,5
64
64
66
69
70
72
70,5
81,5
81,5
91
93,5
95
96

47
46
45,5
45,5
46
46,5
47
57
50
51,5
54
58
62,5
66,5
70
72,5
74
74
73
72
69
65,5
63
60
58
57
54,5
54
58
55,5
57
60
61,5
69
69
77
83
90
94
97
98

48,5
47,5
47
48
49
50
47,5
48,5
54,5
56
57,5
61
65
67
68
69
68
66
63,5
60
56
51
48
44,5
41,5
41
38
37
37,5
38
40
43,5
45,5
52,5
55
65
75
83,5
90
93
95

50
50
51
52
54
55
52
53
59
61
61,5
66
67
68,5
68
67
64
61
57
51,5
46
41
37,5
34
31
30
22
21
21,5
22
29
29
34,5
41
43,5
51,5
67
79
87
92
95

59
59,5
62
64
67
68
72
74
76
77
78
78
77
74
70
62
62
56
50,5
44
39
33
29,5
25,5
22,5
22
19
18
18,5
19,5
21
23
26
29,5
34,5
41,5
60
74
84
89,5
93

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Determinacin de la concentracin de cido scorbico por FTIR-HATR. FACYT

- UC

desplazamientos se considera que es debida a que la

conjugacin de los enlaces dobles hace que se produzca
una deslocalizacin de los electrones en los anillos
aromticos y como consecuencia se rebaja el nivel de
energa del orbital *, al ser menor la energa requerida
para las transiciones, los mximos de absorcin se
desplazan hacia mayores longitudes de onda, aumentando
adems las probabilidades de que tengan lugar las
mencionadas transiciones, lo que origina el aumento
simultaneo en la intensidad de la absorcin.

RESULTADOS Y DISCUSIN
El indicador acido base seleccionado para la
determinacin de la constante acida fue el azul de
bromotimol, cuya reaccin de disociacin se explica en la
Figura 1. Su valor terico de pKa es de kjljk .
Esta molcula posee transiciones energticas producidas
por la deslocalizacin electrnica
en los centros
insaturados de la molcula, adems por la presencia de
grupos carbonilos; cuando estas especies absorben
fotones de contenido energtico adecuado se pueden
producir transiciones a los correspondientes orbitales
* y n *, estos tomos son los responsables de la
absorcin en la regin del UV- visible, tambin
denominados grupos cromforos. Adems el azul de
bromotimol posee grupos bromuro los cuales producen
transiciones n *, estas por s mismas no comunican
color a la molcula, pero son capaces de reforzar la
accin de los grupos cromforos, estas grupos se
denominan ouxocronos.
En la Figura 3. Podemos observar la forma del espectro
visible de la solucin acida y bsica del indicador, para
las cuales se muestran los mximos de absorcin
alcanzados por cada una de estas especies, 420m para
HIn y en 605nm para In - ; la razn de estos

La Figura 4 muestra las absorbancias a diferentes pH del

indicador acido base, en la cual se puede observar el
punto de corte el cual representa el punto isosbstico, el
cual se encuentra a 490nm.
A esta longitud a el coeficiente de extincin molar es
igual para todas las especies (acida, bsica y neutras), es
decir, todas las especies tienen la misma capacidad de
absorber (extinguir) radiacin.
La dependencia de la absorcin molecular de la luz y del
pH de la disolucin se observo con los cambios de
coloracin observados en la desprotonacin del
indicador. La medicin de los porcentajes de trasmitancia
a diferentes valores de pH en disolucin, permiti
calcular el valor de pKa del indicador

Tabla 5. Parmetros Absorbancia calculada a partir de los valores obtenidos experimentalmente d % trasmitancia mediante
la frmula 1.

Absorbancia

400
405
410
415
420
425
430

6,01

6,36

6,7

7,1

7,4

12

0,3516
4
0,3716
11
0,3819
52
0,3925
45
0,3979
4
0,3872
16
0,3819

0,3565
47
0,3716
11
0,3767
51
0,3819
52
0,3925
45
0,3872
16
0,3819

0,3665315
44
0,3819519
03
0,3872161
43
0,3872161
43
0,3872161
43
0,3872161
43
0,3819519

0,3279
02
0,3372
42
0,3419
89
0,3419
89
0,3372
42
0,3325
47
0,3279

0,3142
58
0,3233
06
0,3279
02
0,3187
59
0,3098
04
0,3010
3
0,3233

0,3010
3
0,3010
3
0,2924
3
0,2839
97
0,2676
06
0,2596
37
0,2839

0,2291
48
0,2254
83
0,2076
08
0,1938
2
0,1739
25
0,1674
91
0,1426

Departamento de Qumica | Laboratorio de Anlisis Instrumental

Determinacin de la concentracin de cido scorbico por FTIR-HATR.FACYT-UC

435
440
445
450
460
470
480
490
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590
595
600
605
610
615
620
7

52
0,3767
51
0,3615
11
0,3467
87
0,3187
59
0,2798
41
0,2291
48
0,2146
7
0,1487
42
0,1426
68
0,0861
86
0,0705
81
0,0506
1
0,0409
59
0,0268
72
0,0222
76
0,0177
29
0,0177
29
0,0132
28
0,0177
29
0,0132
28
0,0132
28
0,0132
28
0,0087
74
0,0087
74

52
0,3716
11
0,3615
11
0,3467
87
0,3233
06
0,2716
46
0,2291
48
0,1870
87
0,1487
42
0,1220
53
0,0969
1
0,0861
86
0,0757
21
0,0680
34
0,0655
02
0,0680
34
0,0705
81
0,0731
43
0,0809
22
0,0809
22
0,0888
42
0,0888
42
0,0888
42
0,0888
42
0,0835
46

03
0,3716110
7
0,3565473
24
0,3419886
03
0,3233063
9
0,2757241
3
0,2365720
06
0,2006594
51
0,1706962
27
0,1487416
51
0,1307682
8
0,1249387
37
0,1220530
48
0,1249387
37
0,1366771
4
0,1456939
58
0,1549019
6
0,1643094
29
0,1804560
64
0,1804560
64
0,1938200
26
0,1972262
75
0,1938200
26
0,1938200
26
0,1804560
64

02
0,2441
25
0,3010
3
0,2881
93
0,2676
06
0,2365
72
0,2041
2
0,1771
78
0,1549
02
0,1396
62
0,1307
68
0,1307
68
0,1366
77
0,1426
68
0,1611
51
0,1837
59
0,2006
59
0,2218
49
0,2365
72
0,2441
25
0,2636
03
0,2676
06
0,2365
72
0,2557
07
0,2441
25

06
0,3142
58
0,2636
03
0,2518
12
0,2403
32
0,2146
7
0,1870
87
0,1739
25
0,1674
91
0,1611
51
0,1674
91
0,1804
56
0,1972
26
0,2218
49
0,2518
12
0,2924
3
0,3187
59
0,3516
4
0,3819
52
0,3872
16
0,4202
16
0,4317
98
0,4259
69
0,4202
16
0,3979
4

97
0,2757
24
0,2291
48
0,2146
7
0,2111
25
0,1804
56
0,1739
25
0,1643
09
0,1674
91
0,1739
25
0,1938
2
0,2146
7
0,2441
25
0,2881
93
0,3372
42
0,3872
16
0,4259
69
0,4685
21
0,5086
38
0,5228
79
0,6575
77
0,6777
81
0,6675
62
0,6575
77
0,5376
02

68
0,1307
68
0,1191
86
0,1135
09
0,1079
05
0,1079
05
0,1135
09
0,1307
68
0,1549
02
0,2076
08
0,2076
08
0,2518
12
0,2967
09
0,3565
47
0,4089
35
0,4814
86
0,5301
78
0,5934
6
0,6478
17
0,6575
77
0,7212
46
0,7447
27
0,7328
28
0,7099
65
0,6777
81

Laboratorio de Anlisis Instrumental| Departamento de Qumica

Determinacin de la concentracin de cido scorbico por FTIR-HATR. FACYT

625
630
635
640
650
660
670
680
690
700

0,0132
28
0,0087
74
0,0087
74
0,0087
74
0,0087
74
0,0087
74
0,0087
74
0,0087
74
0,0087
74
0,0087
74

0,0705
81
0,0655
02
0,0555
17
0,0409
59
0,0291
88
0,0222
76
0,0154
73
0,0087
74
0,0087
74

0,1611509
09
0,1549019
6
0,1426675
04
0,1518108
83
0,0888423
91
0,0888423
91
0,0409586
08
0,0291883
89
0,0222763
95
0,0177287
#REF!
67

0,2218
49
0,2111
25
0,1611
51
0,1611
51
0,1135
09
0,0809
22
0,0457
57
0,0268
72
0,0132
28
0,0087
74

- UC

0,3615
11
0,3419
89
0,2798
41
0,2596
37
0,1870
87
0,1249
39
0,0783
14
0,0457
57
0,0315
17
0,0222
76

0,5376
02
0,4621
81
0,3872
16
0,3615
11
0,2881
93
0,1739
25
0,1023
73
0,0604
81
0,0362
12
0,0222
76

0,6382
72
0,5850
27
0,5301
78
0,4621
81
0,3819
52
0,2218
49
0,1307
68
0,0757
21
0,0481
77
0,0315
17

Figura 2. Espectro de absorcin de luz visible del indicador azul de bromotimol, de su forma acida, bsica y
neutras, Vs los % trasmitancia obtenidos experimentalmente y las absorbancias calculadas.

Departamento de Qumica | Laboratorio de Anlisis Instrumental

Determinacin de la concentracin de cido scorbico por FTIR-HATR.FACYT-UC

0.8
0.7
0.6
0.5

Absorbancia

0.4
0.3
0.2
0.1
0

% Transmitancia

Figura 4. Espectros de absorcin de la obtenidos a diferentes pH del azul de bromotimol, en el que se muestran

las

CONCLUSIONES
REFERENCIAS
1.

Cannizzaro,
S.
1853.
Ueber
den
130. doi:10.1002/jlac.18530880114

der

Benzosure

entsprechenden

Alkohol. Liebigs

Annalen 88:

Laboratorio de Anlisis Instrumental| Departamento de Qumica

129-

Determinacin de la concentracin de cido scorbico por FTIR-HATR. FACYT

- UC

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Morrison, R. Boyd, R. 1998. Qumica Orgnica. 5ta Edicin. Pearson Education. Pg 722.

3.

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Institute
of
medicine.
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https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/243#section=Solubility
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Institute
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APENDICE

Departamento de Qumica | Laboratorio de Anlisis Instrumental

10

Determinacin de la concentracin de cido scorbico por FTIR-HATR.FACYT-UC

11

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