MECANISMOS DE ADAPTACIN DE OENOCOCCUS OENI AL

MAYOR GRADO ALCOHLICO Y OTRAS CONDICIONES DEL

CAMBIO CLIMTICO

Albert Bordons; Cristina Reguant; Nicolas Rozs; Isabel Araque, Nair Olgun, Joan
Oriol Alegret, Meritxell Bordas

Lnia de Bacteris Lctics, Grup de Biotecnologia Enolgica, Departament de Bioqumica i Biotecnologia,

Facultat dEnologia, Universitat Rovira i Virgili, C. Marcell Domingo, s/n, 43007 Tarragona, Catalunya.
E-mail: albert.bordons@urv.cat

RESUMEN
En esta comunicacin se presenta el trabajo que se est realizando con las bacterias lcticas
del vino en la lnea troncal del proyecto del consorcio Dmeter (2008-2010), del Programa
Cenit, subvencionado por el CDTI en el programa Ingenio 2010. Los cambios en la
composicin del vino debidas al cambio climtico, sobretodo el aumento de etanol, pueden
afectar a Oenococcus oeni, la principal bacteria implicada en la fermentacin malolctica. Por
ello, procedemos a estudiar en esta bacteria los diversos genes relacionados con el
metabolismo y la resistencia al estrs, viendo como el mayor contenido en etanol y otras
condiciones cambiantes afectan la expresin de DNA a RNA, as como las variaciones en
protenas mediante estudios protemicos.

RESUM
En aquesta comunicaci es presenta el treball que s'est realitzant amb els bacteris lctics del
vi a la lnia troncal del projecte del consorci Dmeter (2008-2010), del Programa Cenit,
subvencionat pel CDTI en el marc del programa Ingenio 2010. Els canvis en la composici
del vi degudes al canvi climtic, sobretot l'augment d'etanol, poden afectar Oenococcus oeni,
el principal bacteri implicat en la fermentaci malolctica. Per aix, hem procedit a estudiar
en aquests bacteris els diversos gens relacionats amb el metabolisme i la resistncia a l'estrs,
veient com el major contingut en etanol i altres condicions canviants afecten l'expressi de
DNA a RNA, aix com les variacions en protenes mitjanant estudis protemics.

ABSTRACT
In this communication we present the work being done with lactic acid bacteria of wine, in
the main line of Demeter consortium project (2008-2010), the Cenit Program, funded by the
CDTI in the Ingenio 2010 program. Changes in the composition of the wine due to climate
change, especially the increase of ethanol, may affect Oenococcus oeni, the main bacteria
involved in malolactic fermentation. Therefore, we proceed to study in this bacterium the
various genes related to the metabolism and resistance to stress, seeing as the higher ethanol
content and other changing conditions affect the expression of DNA to RNA, as well as
variations in proteins by proteomics .

1
INTRODUCCIN
El cambio climtico que ya se est percibiendo a nivel global est dando lugar a un
incremento de las temperaturas en la mayora de nuestras D.O., con el consiguiente aumento
de contenido de azcares en mosto, que da lugar a un mayor grado alcohlico. Entre otros
efectos, la mayor maduracin de las uvas tambin da lugar a pH ms altos del mosto y a un
menor contenido en cido mlico. Todo ello significa que las bacterias lcticas responsables
de la fermentacin malolctica como O. oeni, a consecuencia del cambio climtico, tendrn
que realizar su papel en unas condiciones diferentes respecto a las tradicionales. De estos
cambios, el que sin duda puede afectar ms a la correcta realizacin de la FML es el mayor
contenido en alcohol.
Las condiciones tradicionales de actuacin de O. oeni en el vino ya suponen de por s un
estrs para estas bacterias. Su posible crecimiento, cuando tiene lugar, y la realizacin de la
FML, estn sometidos a unas inhspitas condiciones de etanol, bajo pH y pocos nutrientes,
entre otros factores. Para superar esta situacin de estrs, las clulas de O. oeni tienen varios
mecanismos, que se resumen en tres (Figura 1): a) modificaciones de la membrana para
adecuarse a las variaciones que provoca el etanol; b) sntesis de protenas de estrs, que por un
lado ayudan a los enzimas y otras protenas a poder seguir realizando sus funciones, y por
otro lado contribuyen a la expulsin del etanol que ha entrado en la clula; y c) el sistema de
ATPasa, que expulsa los protones que han entrado en la clula a causa de las alteraciones en
la membrana que ha provocado el etanol, y que necesita ATP, el cual se puede producir
gracias al metabolismo del cido mlico (FML) o de la utilizacin de citrato. Con los cambios
comentados como el aumento de etanol, que son consecuencia del cambio climtico, esta
situacin de estrs se acenta.

Estrs:
Etanol, pH, etc

seal

modificaciones
protenas Respuesta membrana
de estrs

EtOH

nH+
sistema
ATPasa

nH+

Figura 1. Esquema de una clula de Oenococcus oeni, con los mecanismos

de respuesta al estrs que supone la supervivencia en el hbitat vino.

2
En O. oeni, la toxicidad del etanol se asocia al aumento de permeabilidad de la membrana
celular debido a modificaciones en la composicin lipdica (Desens y Lonvaud-Funel, 1988).
El aumento de la permeabilidad supone un aumento del transporte pasivo de protones hacia el
interior de la clula, provocando una acidificacin del medio interno, adems de prdida de
material intracelular. As pues, los mecanismos que contribuyen a la respuesta al pH cido
estaran tambin relacionados con la tolerancia al etanol.
Ahora bien, las clulas crecidas en presencia de etanol presentan adaptacin a este estrs y
pueden disminuir la permeabilidad celular manteniendo la integridad de la membrana (Da
Silveira et al, 2002). Las clulas adaptadas al etanol parece que presentan cambios de
composicin, aumentando los cidos grasos insaturados y disminuyendo la cantidad total de
lpidos celulares, con lo cual puede disminuir la fluidez de membrana y por tanto su
permeabilidad (Da Silveira et al, 2003). En cuanto a la variacin de la composicin en lpidos
de membrana de Oenococcus en presencia de etanol, uno de los efectos que se ha comprobado
es el aumento de cido lactobaclico (C19-ciclo) (Teixeira et al, 2002).
Por otra parte, se ha sugerido que un transportador del tipo ABC (ATP Binding Cassette)
podra estar implicado en la destoxificacin de la clula expulsando etanol al exterior
(Bourdineaud et al., 2004). En presencia de etanol tambin se han visto variaciones en
protenas relacionadas con el equilibrio redox de la clula, o de otras protenas transportadoras
de azcares, y en general parece existir un aumento de protenas de membrana (Da Silveira et
al, 2004).
Respecto a la respuesta al pH cido, los mecanismos involucrados seran los relacionados con
la degradacin de cidos presentes en el vino, como el mlico y el ctrico, asociados a bombas
de protones ligadas a ATPasa que ayudan a mantener la homeostasis del pH interno (Drichi-
Cachon et al., 1996; Galland et al., 2003). Finalmente, otro de los mecanismos descritos en O.
oeni de respuesta a las condiciones desfavorables es la sntesis de protenas de estrs. La
protena ms fuertemente inducida es la conocida como Hsp18 (18 kD), asociada a la
membrana citoplasmtica, aunque tambin detectada en la fraccin citoplasmtica (Jobin et
al., 1997). Algunos autores han sugerido que la protena Hsp18 podra ser regulada por los
niveles de fluidez de la membrana, por lo que se tratara de un mecanismo de activacin
rpida en condiciones de estrs (Tourdot-Marchal et al., 2000). De todas maneras, se ha
cuestionado el papel de la induccin de esta protena de respuesta al calor (Hsp) en relacin
con la tolerancia al etanol (Swan et al, 1999).

HIPTESIS Y OBJETIVOS
Dado que el aumento en la concentracin de etanol es el cambio que ms puede afectar a las
bacterias lcticas que llevan a cabo la FML, es preciso estudiar cules son los mecanismos
intracelulares que estn implicados en una mayor tolerancia a grados alcohlicos superiores
en vino, y al mismo tiempo ver cmo afectan las otras condiciones cambiantes (pH mayor,
menor mlico, etc) a dichos mecanismos del funcionamiento celular. Conociendo cuales son
los puntos clave de estos mecanismos, se podr actuar en los aspectos tecnolgicos de la
vinificacin para que la FML se lleve a cabo correctamente y al mismo tiempo se mantenga la
calidad de los vinos. Adems, dichos conocimientos podrn ser tiles para seleccionar cepas
de O. oeni con mayor potencial de expresin de genes relacionados con la tolerancia al etanol.
La aplicacin prctica de las cepas comerciales estrters que puedan sobrevivir la inoculacin
directa en vino requiere conocer los mecanismos involucrados en la toxicidad del etanol y la
tolerancia de Oenococcus al mismo.

3
Por ello, el objetivo de este trabajo es el estudio de mecanismos celulares de Oenococcus oeni
implicados en su tolerancia a un mayor grado alcohlico y a otras variaciones de las
caractersticas del vino debidas al cambio climtico

ESTUDIO DE LA FERMENTACIN MALOLCTICA POR UN CONJUNTO DE

CEPAS DE OENOCOCCUS OENI Y SELECCIN DE CEPAS MS RESISTENTES A
ETANOL Y MENOS RESISTENTES
Para estudiar los mecanismos moleculares de adaptacin de O. oeni a las condiciones
cambiantes, se ha pensado en realizarlo comparando cepas ms resistentes al etanol con otras
menos resistentes, y de esta manera, averiguar cuales son los mecanismos ms importantes
que participan en esta mayor resistencia o adaptacin.
Para ello, se han utilizado algunas cepas de coleccin y comerciales pero sobretodo se ha
procedido a realizar nuevos aislamientos de cepas de O. oeni a partir de muestras de FML
espontneas de vinos con contenidos superiores al 14% de etanol.
Se ha partido de muestras de FML de 19 vinos de la DOQ Priorat y de otros 11 de la DO
Montsant, y a partir de ellas se han aislado en placas de MRS con mlico y fructosa un total
de 300 colonias. Estos aislados han sido identificados mediante la tcnica de PCR especfica
para O. oeni (Zapparoli et al., 1998) y han sido confirmadas como dicha especie todos los
aislados menos dos. A continuacin, los aislados como O. oeni han sido tipificados mediante
la tcnica de RAPD-PCR multiplex (Reguant et al., 2003; Araque et al., 2009) y han
resultado agrupadas en 20 perfiles diferentes, o sea, podemos decir que todos los aislados son
de 20 cepas.
Para llevar a cabo la seleccin de cepas resistentes y no resistentes a etanol se ha partido de
estas 20 cepas, adems de otras cepas de nuestra coleccin y algunas comerciales. Se
incluyeron tambin 6 cepas de aislados de vinos de la DO Tarragona. Para ello, previamente
se ha optimizado el medio de vino simulado (VS) (Reguant et al., 2000) en el que se efectan
las pruebas de seleccin. La composicin del VS era (g/l): fructosa 2, tartrato-K 2, ctrico 0.5,
L-mlico 0.6, extracto de levadura 5, actico 0.1, glicerol 5, a pH 3.4. En este medio se
incluye etanol, y en los ensayos con todas las cepas se han probado dos concentraciones, 12 y
14% (v/v). Las cepas se crecieron en MRS hasta una DO de 1.5 y se inocularon diferentes
proporciones (1, 2.5, 5 y 10% en volumen). Se control la realizacin de la FML mediante la
DO (crecimiento) y el L-mlico a diario.
Despus de ensayar las diferentes condiciones, se optimiz el proceso de seleccin con
inoculacin de 2.5%. Se realizaron FML por triplicado con todas las cepas. En la Figura 2 se
muestra el % de realizacin de la FML para las diferentes cepas.
En base a estos resultados se han encontrado 5 cepas que han realizado la FML a 14% etanol
en unos 20 das. Entre ellas, la cepa 3P2 se ha seleccionado como ms tolerante para realizar
las tareas posteriores. Como cepa menos tolerante para efectuar las tareas posteriores se ha
seleccionado la 2T2. Se han reservado para realizar algunos de los anlisis posteriores de
biologa molecular, a modo de control, otras cepas ms usadas en nuestro laboratorio, como
PSU-1 (con la secuencia del genoma total publicado), Z42 (de la coleccin propia),
Microenos (MO, comercial) y la cepa tipo CECT 217.

4
 100

%
FML

Figura 2. Realizacin de la FML por cepas aisladas de Oenococcus oeni en vino

simulado, con etanol.

ESTUDIO DE LA EXPRESIN DE UN CONJUNTO DE GENES DE OENOCOCCUS

OENI RELACIONADOS CON LA TOLERANCIA AL ESTRS
La expresin o anlisis transcripcional es la cuantificacin del RNA que se est transcribiendo
a partir de los genes (DNA) en un determinado momento y condicin. El anlisis
transcripcional se lleva a cabo mediante la tcnica de la RT-PCR cuantitativa a tiempo real
(Bustin, 2000). A partir del RNA total se sintetiza el cDNA con hexanucletidos mediante la
reaccin de la transcriptasa inversa (RT). El cDNA se analiza por PCR cuantitativa a tiempo
real utilizando SYBR Green (Applied Biosystems) para monitorizar la amplificacin. La
metodologa para el anlisis transcripcional de algunos de los genes a estudiar, como el de la
enzima malolctica o la protena Hsp18, ya ha sido descrita (Beltramo et al., 2006;
Bourdineaud et al., 2004). Para el resto de los genes, como los asociados a la utilizacin de
citrato y arginina, se utiliza la metodologa puesta a punto en nuestro laboratorio.
Para ello, dentro de los posibles genes de O. oeni relacionados con la adaptacin a las
condiciones del vino y en la evolucin de la fermentacin malolctica (FML), se opt por
estudiar en primer lugar los genes de la va metablica del citrato. La utilizacin del citrato se
asocia a la extrusin de H+ mediante un sistema ATPasa que contribuira al mantenimiento
del pH interno, as como a la obtencin de energa metablica. Por otra parte, el consumo de
citrato tiene un impacto organolptico generando productos aromticos como el diacetilo y el
acetato, este ltimo responsable de aumentar la no deseada acidez voltil. Los genes de esta
ruta metablica no haban sido estudiados previamente a nivel de expresin, motivo por el
cual ha sido necesario el diseo de nuevos cebadores.
Los genes seleccionados para el estudio de la va del citrato han sido: pdh (piruvato
deshidrogenasa), ackA (acetato quinasa), alsS (acetolactato sintasa), alsD (-acetolactato
descarboxilasa), maeP (transportador malato/citrato), citE (subunidad citrato liasa) y citR
(regulador del opern cit). Se han diseado cebadores para estos genes en base a las
secuencias disponibles de la cepa PSU-1 (Genbank) y la recientemente publicada BA-1163
(Genbank). Se ha comprobado el buen funcionamiento de los cebadores diseados, los cuales

5
generan un nico producto de PCR segn lo esperado. Tambin se han optimizado las
condiciones de uso de dichos cebadores en la reaccin de Real Time PCR.
Se han evaluado dos genes como posible control interno para los estudios de expresin: ldh
(lactato deshidrogenasa) y rrs (gen ribosomal de la subunidad 16S). Ambos son genes
constitutivos que han sido utilizados como control interno en trabajos anteriores. Los genes
ribosomales muestran una expresin ms estable en diferentes condiciones de estrs, pero los
niveles de expresin son mucho mayores que los de la mayora de los genes asociados a la
respuesta al estrs. Sin embargo, ldh presenta niveles de transcripcin ms comparables a los
genes de estudio. Por ello se ha utilizado ldh como control interno.

Figura 3. Rutas principales del metabolismo de citrato en O. oeni, con los genes de
los que se ha analizado su transcripcin a RNA. Se muestran en barras los genes en
los que se ha observado mayor efecto del etanol (ver texto). (Olgun et al., 2009).

Con todo ello, se ha estudiado la expresin de dichos genes en la cepa PSU-1, como cepa
modelo, antes de proceder a hacerlo con las cepas seleccionadas resistentes y no resistentes a
etanol mencionadas. Se han ensayado diferentes condiciones de etanol (0% y 10%) y pH (3.5
y 4.0) para evaluar la respuesta transcripcional a estos factores. En presencia de etanol la
respuesta transcripcional fue claramente distinta que en su ausencia, mientras que el efecto del
pH no fue tan manifiesto (Figura 3). Entre los genes estudiados, los genes que revelaron una
mayor respuesta fueron citE (subunidad citrato liasa), ackA (acetato quinasa) y alsD
(acetolactato descarboxilasa). Las diferencias observadas estn en correlacin con los

6
productos finales como actico y diacetilo. Este incremento de expresin observado en
presencia de etanol y a bajo pH sugiere la participacin del metabolismo del citrato en la
respuesta a las condiciones de estrs.
Tambin se ha puesto a punto la metodologa de la transcripcin de otros genes aparte de los
de la ruta del citrato, sobretodo con la cepa PSU-1. Se han optimizado los ensayos de RT-
qPCR a partir de RNA aislado de clulas en vino sinttico, en condiciones cercanas a las del
vino (12% etanol y pH 3.5). Se ha estudiado la expresin relativa de los genes seleccionados a
mitad de FML, tomando como condicin control el tiempo cero del ensayo.
Los resultados para las cuatro cepas control estudiadas (Figura 4) han sido que el gen hsp18,
que codifica para una protena de estrs, se sobreexpresa en presencia de etanol. Para el gen
clpP, que codifica para otra protena de estrs que tiene propiedades de chaperona, o sea,
protectora de otras protenas, se ha visto que no se sobreexpresa tanto. Para el gen clpX,
asociado a una ATPasa, tampoco se ha visto en esta cepa una mayor sobreexpresin.
En cambio, para genes asociados a cambios en la pared y membrana celular como dal (D-
alanina: D-alanina ligasa, de sntesis de componentes de la pared celular), cfa (ciclopropano,
de sntesis de cidos grasos de membrana) y mlB (dTDP-glucosa-4,6-dehidratasa, de
lipopolisacridos de membrana) se ha obtenido una sobreexpresin de los mismos en
respuesta al estrs por el etanol. En estos casos, cuando se estudien las cepas tolerante y no
tolerante al etanol se estudiar tambin la composicin lipdica y proteica de membrana y se
podrn interpretar globalmente los resultados del papel relevante de la membrana
citoplasmtica en la proteccin frente al estrs.

Z42 MO PSU-1 217T

193 141
60
55
50
Relative Gene Expression

45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
hsp18 clpP clpX ctsR trxA dal cfa rmlB

Figura 4. Expresin relativa (RNA mensajero cuantificado mediante RT-qPCR) de genes

relacionados con estrs en condiciones similares al vino, para cuatro cepas control (ver texto).

7
ESTUDIO PRELIMINAR DE PERFILES DE PROTENAS (PROTEMICA) DE
OENOCOCCUS OENI EN PRESENCIA DE ETANOL
Se ha visto que como respuesta a la situacin de estrs del etanol, puede haber cambios en los
perfiles electroforticos de las protenas de la membrana plasmtica (Garbay et al., 1996;
Guzzo et al., 1997; Teixeira et al., 2002), pero tambin son muy importantes a nivel de
protenas citoplasmtica, como las relacionadas con el mantenimiento del equilibrio redox
(Cecconi et al., 2009) y de hecho son menos conocidos.
Para ello se ha puesto a punto la metodologa del estudio de perfiles de protenas
citoplasmticas, de 2D (isoelectroenfoque y SDS-PAGE) (Snchez et al., 2005), seguido de
caracterizacin de las protenas detectadas por espectrometra de masas MALDI-TOF (Guillot
et al., 2003). Se han realizado ensayos con la cepa control PSU-1 crecida en MRS con mlico
y fructosa, a pH 5, y con adicin de etanol 12 % al final de la fase exponencial. Se han
obtenido extractos celulares a partir de las clulas recogidas por centrifugacin y se han
sometido a un disruptor celular bajo presin. Tras centrifugar y desechar los restos de pared,
se ha ultracentrifugado el sobrenadante para quedarse con la fraccin citoplasmtica, y con
sta se ha procedido a la electroforesis 2D para separar las protenas.
Se han detectado 215 protenas, de las cuales, al comparar el perfil en presencia de etanol con
su ausencia, se han visto 45 protenas con variacin significativa tras 5 horas de la adicin de
etanol (Figura 5). La mayora de ellas muestran un descenso de su concentracin. Una vez
identificadas, se ha visto que ms de la mitad eran protenas relacionadas con biosntesis y
estabilidad de protenas, y tambin se han detectado algunas relacionadas con la biosntesis de
componentes de pared celular.

Figura 5. Electroforesis 2D de protenas citoplasmticas de O. oeni PSU-1

(ver texto). Se sealan las protenas que varan su concentracin tras la
adicin de etanol.

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