07/10/2016

Recordando
Qu quiero responder?
Infeccin aguda
Infeccin crnica

Introduccin a la bioinformtica

Qu tipo de muestra necesito?

Qu debo entender antes de decidir por la
prueba?

TM Steev Loyola
2016

REACTIVOS NECESARIOS PARA PCR:

MUESTRA CLINICA

METODOS INDIRECTOS

METODOS DIRECTOS

VIRUS O EFECTO CELULAR

ESPECIFICO

AISLAMIENTO
VIRAL

CULTIVO
CELULAR

DETECCION INMUNOLOGICA
DE ANTIGENOS VIRALES

MICROSCOPIA

INMUNOFLUORESCENCIA
(IFA)

OPTICA

FIJACION DE COMPLEMENTO
(FC)

TECNICAS
MOLECULARES

HIBRIDACION

REACCION EN
CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
SECUENCIAMIENTO

NEUTRALIZACION

Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura

INMUNOFLUORESCENCIA
(IFA)
FIJACION DE COMPLEMENTO
(FC)

de la polimerasa

NEUTRALIZACION

INMUNOENSAYOS
RIA)

ambiente) y 1.5 mM MgCl2.

MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Cofactor para la funcin

(EIA,

dNTPs (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

ELECTRONICA
HUEVO
EMBRIONARIO

RATONES

INMUNOENSAYOS
RIA)

(EIA,

REACCION EN
CADENA DE LA
LIGASA (LCR)

HEMAGLUTINACION (HA) E
INHIBICION DE LA HA

HEMAGLUTINACION (HA) E
INHIBICION DE LA HA

HEMADSORCION (Had)E
INHIBICION DE LA Had

HEMADSORCION (Had)E
INHIBICION DE LA Had

WESTERN BLOT Y DOT BLOT

Cebadores primers: Son secuencias cortas de nucletidos 18-24

nucletidos de longitud, complementarias a una regin del ARN/ADN que
se quiere amplificar.
ARN/ADN molde
Polimerasa o Transcriptasa inversa

POLIMERASAS TERMOESTABLES

TRANSCRIPTASA INVERSA
TRANSCRIPTASA INVERSA
Sintetiza ADN utilizando ARN como molde
Necesita un primer que facilite el extremo 3OH
No posee actividad exonuclesica 3-5
Tasa de error mayor que la ADN Polimerasa
AMV RT: Purificada del virus AvianMyeloblastoisis.Catalizala sntesis de ADN a partir de
ADN,ARN o hbridos de ADN:ARN (primers ADN/ARN) Actividad RNAsaH

Pol termoestables:
activas despus de un tiempo a 95C
ptimo a 72C

M-MLV RT: Producto del gen pol del virus MoloneyMurineLeuKemia ADN Polimerasa
dependiente de ARN Actividad RNAsaH ms dbil

Taq: Thermus aquaticus

Tli: Thermococcus litoralis
Pfu: Pyrococcus furiosus
Tth: Thermus thermophilus

Thermus thermophilus (Tth):

actividad transcriptasa inversa dependiente de Mn2+ , (ARN a ADN )
DNA polimerasa dependiente de Mg2+ (ADN a ADN)
es capaz de copiar ARN en cADN y amplificarlo mediante PCR mediante

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EXISTEN DIFERENTES PROTOCOLOS

RANGOS EN GEL DE AGAROSA

RT Y PCR
2 PASOS

POR QUE?
RT-PCR
1 PASO

NESTED-PCR
DESPUES DE UN PCR O
RT-PCR

RESULTADOS EN GEL
La posterior visualizacin se puede realizar con bromuro
de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata,
fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers
inespecficos se pegan a varios
sitios)

DESVENTAJAS DEL PCR

VENTAJAS DEL PCR

A partir de una muestra pequea de ARN/ADN se puede
obtener una cantidad considerable para el estudio que se
vaya a realizar.
El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y
anlisis.
Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o
muerto.
Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense,
diagnsticos, anlisis prenatales, etc.

SECUENCIAMIENTO CON TERMINADORES

FLUORESCENTES

Se puede reproducir solamente partes del genoma en

donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de
20 40 pb.
Se necesitan primers especficos que sean
complementarios al fragmento que se desea sintetizar.
La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el
ADN
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo
investigador o de cualquier otro)

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INTERPRETACIN DE SEALES

IDENTIFICANDO LA SECUENCIA OBTENIDA

ELECTROFEROGRAMAS

RESULTADO DE LA BUSQUEDA USANDO BLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

GENOMAS DIFERENTES ENTRE VIRUS

DISEO DE PRIMERS

ORTHOMIXOVIRUS

Regin variable, conservada o semi conservada

Identificacin por familia, gnero, virus o subtipo de virus
Tcnica molecular elegida
Diagnstico, identificacin o epidemiologa molecular

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REGIONES DEL GENOMA

ESTRUCTURAL

NO ESTRUCTURAL
MISMO
GNERO

Cul es la ms variable?
CPSIDE

LOS PRIMERS PUEDEN SER DISEADOS PARA:

MEMBRANA

ENVOLTURA

IDENTIFICACIN

EPIDEMIOLOGA MOLECULAR

COMPARACIN DE SECUENCIAS EN EL DISEO

DE PRIMERS

Plan prctico
Reconocer genbank
Descargar secuencias del genbank
Realizar un blast de una secuencia y
determinar el mejor hit en trminos de
identidad