Carla Zanella

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA
FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA
Fermentao Alcolica em Batelada

Alimentada Empregando Saccharomyces
cerevisiae de Caractersticas Floculantes
Carla Zanella Guidini
UBERLNDIA MG
ABRIL DE 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA
Fermentao Alcolica em Batelada

Alimentada Empregando Saccharomyces
cerevisiae de Caractersticas Floculantes
Carla Zanella Guidini

Orientador: Dr. Elozio Jlio Ribeiro (UFU)
Co-orientadora: Dra. Vicelma Luiz Cardoso (UFU)
Tese de doutorado apresentada ao

Programa de Ps-Graduao em
Engenharia Qumica da Universidade
Federal de Uberlndia como parte dos
requisitos necessrios obteno do
ttulo de Doutora em Engenharia
Qumica, rea de concentrao em
Pesquisa e Desenvolvimento de
Processos Qumicos.
UBERLNDIA MG
ABRIL DE 2013
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Sistema de Bibliotecas da UFU, MG - Brasil
G947f
2013
Guidini, Carla Zanella, 1983Fermentao alcolica em batelada alimentada empregando Saccharomyces cerevisiae de caractersticas floculantes / Carla Zanella Guidini. 2013.
127 f. : il.
Orientador: Elozio Jlio Ribeiro.
Coorientadora: Vicelma Luiz Cardoso.
Tese (doutorado) Universidade Federal de Uberlndia, Programa
de Ps-Graduao em Engenharia Qumica.
Inclui bibliografia.
1. Engenharia Qumica - Teses. 2. lcool - Teses. 3. Fermentao -Teses.
4. Levedos - Teses. I. Ribeiro, Elozio Jlio.II. Cardoso, Vicelma Luiz. III.
Universidade Federal de Uberlndia. Programa de Ps-Gradua-o em
Engenharia Qumica. IV. Ttulo.
CDU: 66.0
Dedico em especial a Deus que a maior razo de meu viver, pois sem Ele,
nada seria possvel, aos meus pais Selvino e Fiora, pela fora, encorajamento
e amor, a minha irm Kelli e ao meu amado esposo Paulo Henrique; pelo
apoio e compreenso, em todos os momentos desta e de outras caminhadas.
Muito Obrigada
AGRADECIMENTOS
A Deus, meu mestre maior, por mais uma oportunidade de crescimento e aprenizado
confiada a mim, pelo seu amparo, auxlio e amor incondicional.
Aos meus amados pais, Selvino e Fiora, pela formao do meu carter, pelos
ensinamentos e exemplos preciosos, principalmente sobre o que gentileza, respeito e
educao para com os outros. Agradeo tambm as oraes que minha me, incansavelmente,
fez nos momentos mais dificies da minha vida. minha querida irm, Kelli, pelo amor e
apoio demonstrado.
Ao Paulo Henrique, meu amado esposo e eterno companheiro. Minha eterna gratido
e todo meu amor.
Ao meu querido orientador, mestre e amigo, Professor Elozio Jlio Ribeiro, os
maiores e mais sinceros agradecimentos, com quem aprendi muito nesses mais de cinco anos
de convivncia.
professora Vicelma Luiz Cardoso, pela pacincia, amizade, disponibilidade e
solicitude constante. A sua dedicao foi de extrema importncia para a concluso deste
trabalho.
Gostaria de agradecer aos professoresda FEQUI, em especial professora Miriam
Maria de Resende, pela ajuda prestada e pelo carinho pelo qual sempre me tratou.
banca examinadora por terem aceitado o convite e contriburem com o
enriquecimento do trabalho.
Aos funcionrios da FEQUI: Cecilia, Silvino, Tiago, Gabriel, dio, Paulo, Roberta e
Cleuzilene pela disposio e prontido em ajudar-me sempre que precisei. Aos alunos de
iniciao cientfica Arthur e Larissa pela ajuda prestada.
Ao Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica da Universidade Federal de
Uberlndia, pela oportunidade concedida.
Aos queridos amigos de laboratrio, pela amizade e companherismo.
A FAPEMIG pela confiana depositada e suporte financeiro.
Ao CPQBA e ao CTC pela doao das leveduras.
Enfim, agradeo a todos que contriburam direta ou indiretamente para a concluso
desta etapa...
Trs verbos existem que, bem conjugado, sero lmpadas luminosas em nosso caminho
Aprender, Servir e Cooperar.
Trs atitudes exigem muita ateno Analisar, Reprovar e Reclamar.
D trs normas de conduta jamais nos arrependeremos
Auxiliar com a inteno do bem, Silenciar e Pronunciar frases de bondade e estmulo.
Trs diretrizes manter-nos-o, invariavelmente, em rumo certo
Ajudar sem distino, Esquecer todo mal e Trabalhar sempre.
Trs posies devemos evitar em todas as circunstncias
Maldizer, Condenar e Destruir.
Possumos trs valores que, depois de perdidos, jamais sero recuperados
A hora que passa, A oportunidade e A palavra falada.
Trs programas sublimes se desdobram nossa frente, revelando-nos a glria da Vida
Superior
Amor, Humildade e Bom nimo.
Que o Senhor nos ajude, pois, em nossas necessidades, a seguir sempre trs abenoadas
regras de salvao
Corrigir em ns o que nos desagrada em outras pessoas.
Amparar-nos mutuamente.
Amar-nos uns aos outros
Chico Xavier
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................
LISTADE TABELAS......................................................................................................
vi
LISTA DE SMBOLOS..................................................................................................
viii
RESUMO..........................................................................................................................
ix
ABSTRACT......................................................................................................................
CAPTULO 1 INTRODUO...................................................................................
CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA...........................................................
2.1 Etanol................................................................................................................
2.2 Matrias-prima..................................................................................................
2.2.1 Cana de acar como principal matria-prima para produo de

etanol.................................................................................................................................
2.2.2 Outras matrias-primas para produo de etanol.................................
2.3 Biorreatores.......................................................................................................
2.3.1 Processo batelada..................................................................................
10
2.3.2 Processo batelada alimentada...............................................................
11
2.3.4 Processo contnuo.................................................................................
12
2.4 Bioqumica da fermentao alcolica...............................................................
13
2.4.1 Fatores que a afetam a fermentao alcolica.....................................
16
2.5 Levedura............................................................................................................
18
2.5.1 Efeitos dos produtos de fermentao sobre a levedura........................
18
2.6 Levedura floculante...........................................................................................
19
2.6.1 Fatores que influenciam a floculao...................................................
23
2.6.1.1 Fatores genticos......................................................................
23
2.6.1.2 Fatores fisiolgicos..................................................................
24
2.6.1.3 Influncia da concentrao de clcio e sais do meio...............
24
2.6.1.4 Acar.......................................................................................
25
2.6.1.5 Influncia do etanol..................................................................
26
2.6.1.6 Agitao e aerao....................................................................
26
2.6.1.7 Temperatura..............................................................................
27
2.6.1.8 pH.............................................................................................
28
2.7 Floculao por bactrias e contaminao bacteriana.........................................
28
2.8 Desfloculao de leveduras...............................................................................
30
2.9 Aplicaes das leveduras floculantes em processos biotecnolgicos...............
30
2.10 Produo de bioetanol a partir de levedura floculante.....................................
31
2.11 Capacidade fermentativa.................................................................................
31
2.12 Cintica da fermentao alcolica...................................................................
33
CAPTULO 3 MATERIAL E MTODOS.................................................................
37
3.1 Material.............................................................................................................
37
3.1.1 Micro-organismo e meio de cultura.....................................................
37
3.1.2 Procedimento e unidade experimental.................................................
37
3.2. Mtodos............................................................................................................
39
3.2.1 Mtodos analticos................................................................................
39
3.2.1.1 Determinao da concentrao celular.....................................
39
3.2.1.2 Desfloculao...........................................................................
39
3.2.1.3 Contagem do nmero inicial de clulas...................................
39
3.2.1.4 Contaminao bacteriana..........................................................
40
3.2.1.5 Determinao de acar e etanol..............................................
41
3.2.1.6 Pr-fermentao........................................................................
41
3.2.2 Metodologia experimental....................................................................
41
3.2.2.1 Seleo da levedura..................................................................
41
3.2.2.2 Caractersticas fenotpicas.......................................................
43
3.2.2.3 Concentrao celular no inculo..............................................
44
3.2.2.4 Influncia da concentrao inicial de substrato, concentrao

celular
do
tempo
de
enchimento
do
reator
operado
em
batelada
alimentada..........................................................................................................................
44
3.2.2.5 Estudo da recirculao de clulas e concentrao inicial de

etanol na fermentao alcolica.........................................................................................
48
3.2.2.6 Cintica da fermentao alcolica e modelagem matemtica..
52
3.2.2.6.1 Modelo para a fermentao alcolica em processo

batelada..............................................................................................................................
52
3.2.2.6.2 Validao do modelo para a fermentao alcolica em

processo batelada alimentada com e sem recirculao.....................................................
54
3.2.2.6.3 Ajustes dos parmetros cinticos...................................
56
3.2.2.7 Estudo da produo mxima de etanol na fermentao
alcolica (Pmx)..............................................................................................................
56
3.2.2.8 Concentrao mxima de etanol em que cessa o crescimento

microbiano (Pmx)............................................................................................................
57
3.2.2.9 Estudo da velocidade especfica de sedimentao da levedura

C2/00...............................................................................................................................
57
3.2.2.9.1 Estudo em proveta da sedimentao da levedura em

pH 5...................................................................................................................................
3.3 Fluxograma representativo de todas as etapas realizadas nesse trabalho........
58
59
CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO........................................................
60
4.1 Avaliao da capacidade fermentativa.............................................................
60
4.2 Caractersticas fenotpicas da levedura C2/00..................................................
62
4.3 Concentrao celular no inculo.......................................................................
63
4.4 Influncia da concentrao inicial de substrato, concentrao celular no

inculo e de tempo de enchimento do reator batelada alimentada...................................
64
4.4.1 Anlise dos resultados obtidos para a resposta rendimento em etanol

das variveis estudadas.....................................................................................................
65
4.4.2 Anlise dos resultados obtidos para a resposta produtividade em

etanol das variveis estudadas...........................................................................................
71
4.4.3 Anlise dos resultados obtidos para a resposta sacarose residual das
variveis estudadas............................................................................................................
76
4.5 Influncia da recirculao de clulas e concentrao de etanol e sacarose no

inculo na fermentao alcolica......................................................................................
84
4.6 Estimativa dos parmetros do modelo para a fermentao em batelada..........
94
4.6.1 Validao do modelo para a fermentao em batelada alimentada.....
95
4.6.2 Validao do modelo para a fermentao em batelada alimentada

com recirculao de meio fermentativo............................................................................
97
4.7 Perfil da produo mxima de etanol (Pmx).................................................. 100

4.8 Estudo da concentrao mxima de etanol em que cessa o crescimento
microbiano (Pmx)............................................................................................................
101
4.9 Velocidade especfica de sedimentao da levedura C2/00.............................. 101

4.9.1 Sedimentao da levedura utilizando uma proveta em pH 5................ 103
CAPTULO 5 CONCLUSES...................................................................................
105
CAPTULO 6 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS............................. 107
CAPTULO 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..............................................
109
CAPTULO 8- ANEXOS...............................................................................................
124
CAPTULO 9- APNDICES.........................................................................................
126
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 -
Sequncia de reaes enzimticas pela fermentao alcolica de

carboidratos endgenos (glicognio e trealose) ou exgenos
(sacarose e maltose), conduzida por Saccharomyces cerevisiae.........
Figura 2.2 -
15
Mecanismo da teoria da lectina na floculao da levedura

Saccharomyces cerevisiae. (a) ons de clcio permitem que as
lectinas alcancem sua conformao ativa e (b) as lectinas ativam a
floculao.............................................................................................
Figura 2.3 -
Representao esquemtica da multiplicidade de fatores que afetam

a floculao da levedura Saccharomyces cerevisiae...........................
Figura 3.1 -
22
26
Representao esquemtica da unidade de trabalho (batelada

alimentada)..........................................................................................
38
Figura 3.2 -
Fermentador Bioflo 110 operando em batelada...................................
38
Figura 3.3 -
Mtodo de plaqueamento em superfcie..............................................
40
Figura 3.4 -
Fluxograma representativo das etapas realizadas no trabalho.............
43
Figura 4.1 -
Comportamento das leveduras em meio fermentativo, (a) C19, (b)

C14, (c) C2/95, (d) CTC, (e) C4/00 e (f) C2/00..................................
61
Figura 4.2 -
Morfologia lisa da cepa C2/00.............................................................
63
Figura 4.3 -
Valores preditos em funo dos observados em relao ao

rendimento...........................................................................................
68
Figura 4.4 -
Distribuio dos resduos relativos ao rendimento.............................
68
Figura 4.5 -
Superfcie de resposta e curva de contorno para a resposta

rendimento em funo da concentrao de sacarose e concentrao
celular no inculo................................................................................
Figura 4.6 -
69

rendimento em funo da concentrao de sacarose e tempo de
enchimento...........................................................................................
Figura 4.7 -
70

rendimento em funo do tempo de enchimento e da concentrao
celular de inculo.................................................................................
Figura 4.8 -
Valores preditos em funo dos observados em relao
70
ii
produtividade.......................................................................................
Figura 4.9 -
Distribuio dos resduos relativos produtividade...........................
Figura 4.10 -

produtividade em
funo da concentrao
73
de sacarose e
concentrao celular no inculo..........................................................

Figura 4.11 -
73
74

produtividade em funo da concentrao de sacarose e tempo de
enchimento...........................................................................................
Figura 4.12 -
75

produtividade em funo do tempo de enchimento e da
concentrao celular de inculo...........................................................
Figura 4.13 -
75
Valores preditos em funo dos observados em relao sacarose

residual.................................................................................................
78
Figura 4.14 -
Distribuio dos resduos relativos sacarose residual......................
78
Figura 4.15 -
Superfcie de resposta e curva de contorno para a resposta sacarose

residual em funo da concentrao de sacarose e concentrao
celular no inculo................................................................................
Figura 4.16 -
79

residual em funo da concentrao de sacarose e tempo de
enchimento...........................................................................................
Figura 4.17 -
80

residual em funo do tempo de enchimento e da concentrao
celular de inculo.................................................................................
Figura 4.18 -
80
Perfis de concentrao de sacarose (), Concentrao de etanol ()

e concentrao celular () em funo do tempo para o experimento
de validao das condies de otimizao obtido pela superfcie de
resposta e curvas de contorno..............................................................
Figura 4.19 -
82

e concentrao celular () em funo do tempo para o Experimento
A, realizado nas condies timas do PCC e com recirculao do
meio fermentativo, aps as 6 horas de enchimento do reator..............
Figura 4.20 -

85
iii
B, realizado nas condies timas do PCC e com recirculao do

meio fermentativo durante toda a fermentao alcolica....................
Figura 4.21 -
86

C realizado nas condies timas do PCC. Foi retirado o
sobrenadante contendo etanol e preenchido com meio at completar
1,5 L de inculo e realizada a recirculao do meio fermentativo
durante toda a fermentao alcolica..................................................
Figura 4.22 -
87

D D realizado nas condies timas do PCC. Foi retirado o
sobrenadante contendo etanol e iniciado o tempo de enchimento
apenas com a levedura decantada no fundo do reator e realizada a
recirculao do meio fermentativo aps o enchimento de 1,5 L do
reator....................................................................................................
Figura 4.23 -
88

E realizado nas condies timas do PCC. Foi retirado o
sobrenadante contendo etanol e preenchido com gua destilada at
completar 1,5 L de inculo e realizada a recirculao do meio
fermentativo durante toda a fermentao alcolica.............................
Figura 4.24 -
89

F F realizado nas condies timas do PCC, porm a concentrao
celular no inculo foi de 50 % (v/v). Foi retirado o sobrenadante
contendo etanol e preenchido com meio at completar 1,5 L de
inculo e realizada a recirculao do meio fermentativo durante
toda a fermentao alcolica...............................................................
Figura 4.25 -

G realizado nas condies timas do PCC, porm a concentrao
celular no inculo foi de 50 % (v/v) e o tempo de enchimento de 4
horas. Foi retirado o sobrenadante contendo etanol e preenchido
90
iv
com meio at completar 1,5 L de inculo e realizada a recirculao

do meio fermentativo durante toda a fermentao alcolica...............
Figura 4.26 -
91

H realizado nas condies timas do PCC, porm a concentrao
celular no inculo foi de 50 % (v/v) e a concentrao de sacarose
foi de 220 g/L. Foi retirado o sobrenadante contendo etanol e
preenchido com meio at completar 1,5 L de inculo e realizada a
recirculao do meio fermentativo durante toda a fermentao
alcolica...............................................................................................
Figura 4.27 -
92
Perfil da concentrao celular (), sacarose () e etanol () em

funo do tempo para o experimento com 160 g/L de concentrao
de sacarose e 4% (v/v) de concentrao celular no reator. As linhas
() representam o modelo aplicado aos dados experimentais. As
linhas pontilhadas (---) representam a perturbao de 5% no perfil
simulado..............................................................................................
95
Figura 4.28 -
Perfil do volume do reator em relao ao tempo.................................
96
Figura 4.29 -

de sacarose, 12% (v/v) de concentrao celular no reator e 6 horas
de enchimento. As linhas () representam o modelo aplicado aos
dados experimentais. As linhas pontilhadas (---) representam a
perturbao de 5% no perfil simulado..............................................
Figura 4.30 -
Perfil do volume do reator em relao ao tempo para o experimento

em batelada alimentada com recirculao...........................................
Figura 4.31 -
97
98

de sacarose, 15% (v/v) de concentrao celular no reator e 6 horas
de enchimento. As linhas () representam o modelo aplicado aos
dados experimentais. As linhas pontilhadas (---) representam a
perturbao de 5% no perfil simulado..............................................
Figura 4.32 -
99
Perfis de concentrao de sacarose () e concentrao de etanol (),

concentrao celular () em funo do tempo para o Pmx..............
100
Figura 4.33 -
Perfis de sedimentao em pH 3 (), pH4 (), pH5 (), pH6 () e

pH 7 () em funo do tempo.............................................................
Figura 4.34 -
102
Perfil do modelo da velocidade de sedimentao para o teste em

proveta (
), perfil de posio do micro-organismo () e o perfil
do modelo proposto (
) em funo do tempo................................
104
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1-
Composio da cana-de-acar.........................................................
Tabela 3.1 -
Matriz Planejamento Composto Central do efeito da concentrao
de sacarose, concentrao celular no inculo e tempo de

enchimento do reator.........................................................................
Tabela 3.2 -
Massa de sacarose adicionada ao meio em funo do tempo de

fermentao.......................................................................................
Tabela 4.1 -
63
Variveis utilizadas no PCC e suas respectivas respostas em 10,5

horas de fermentao.........................................................................
Tabela 4.4 -
62
Relao entre concentrao celular no inculo e respectiva massa

seca no reator.....................................................................................
Tabela 4.3 -
57
Parmetros cinticos, de rendimento e produtividade obtidos para

cada cepa...........................................................................................
Tabela 4.2 -
46
65
Resultados da regresso mltipla para a resposta rendimento com

todas as variveis e seus respectivos parmetros e nveis de
significncia......................................................................................
Tabela 4.5 -
66
Resultados da regresso mltipla para a resposta rendimento,

apenas com as variveis significativas e seus respectivos
parmetros e nveis de significncia..................................................
Tabela 4.6 -
67
Resultados da regresso mltipla para a resposta produtividade

com todas as variveis e seus respectivos parmetros e nveis de
significncia......................................................................................
Tabela 4.7 -
71
Resultados da regresso mltipla para a resposta produtividade,

Tabela 4.8 -
72
Resultados da regresso mltipla para a resposta sacarose residual

com todas as variveis e seus respectivos parmetros e nveis de
significncia......................................................................................
Tabela 4.9 -
76
Resultados da regresso mltipla para a resposta sacarose residual,

Tabela 4.10 -
Parmetros obtidos a partir dos dados experimentais e do ajuste do
77
vii
modelo em batelada...........................................................................
Tabela 4.11 -

modelo em batelada alimentada........................................................
Tabela 4.12 -
94
96

modelo em batelada alimentada com recirculao............................
98
Tabela 4.13 -
Crescimento da levedura em diferentes concentraes de etanol.....
101
Tabela 4.14 -
Velocidade especfica de sedimentao em diferentes valores de

pH para a levedura C2/00..................................................................
102
viii
LISTA DE SMBOLOS
Abs0
Absorbncia no tempo inicial t0
Abst
Absorbncia medido no tempo t
E0
Concentrao de etanol no inculo
g/L
Vazo de alimentao do substrato
L/h
Ki
Constante de inibio do crescimento celular pelo substrato
gS/L
KS
Constante de saturao para o crescimento celular
gS/L
MS
Constante de manuteno celular
g/L.h
NCO
Nvel de Converso de Substrato
Concentrao de etanol
g/L
Pmx
Concentrao mxima de produto em que cessa o crescimento do micro-
g/L
organismo
Pmx
Concentrao mxima de etanol
g/L
Concentrao de sacarose no reator, considerando uma batelada
g/L
S0
Concentrao de sacarose no inculo
g/L
SF
Concentrao de substrato na alimentao
g/L
Tempo de fermentao
Volume de trabalho do fermentador
VCS
Velocidade de consumo de sacarose
g/L.h
VES
Velocidade especfica de sedimentao
min-1
Concentrao de clulas
X0
Concentrao celular no inculo
Posio da partcula em um tempo t
YP/S
Rendimento em etanol
% (gp/gs)
YX/S
Rendimento celular
% (gc/gs)
Produtividade
mx
Taxa mxima especfica de crescimento celular
Expoente do termo de inibio pelo produto
Produo de etanol no associado ao crescimento
Contribuio de substrato para o crescimento e manuteno celular
h-1
Termo de formao de produto associado e no-associado ao crescimento
h-1
Velocidade de sedimentao
g/L
% (v/v)
cm
g/L.h
h-1
g/L.h
cm/min
ix
RESUMO
Com o objetivo de melhorar o desempenho na produo de etanol e diminuir os custos de
produo, pesquisas so realizadas no intuito de selecionar linhagens de leveduras que vm
sendo diferenciadas no processo de fermentao alcolica. Neste trabalho estudou-se a
aplicao de leveduras Saccharomyces cerevisiae com caractersticas floculantes em reator
batelada alimentada. Avaliou-se a capacidade fermentativa de seis cepas de leveduras
floculantes. A levedura C2/00 foi a gerou maiores produtividade e rendimento em etanol em
comparao s outras leveduras testadas. Posteriormente, estudou-se a fermentao alcolica
em processo batelada alimentada utilizando a levedura C2/00. As fermentaes foram
realizadas a 32C e pH inicial ajustado em 4,5. O processo foi otimizado com concentrao de
sacarose de 170 g/L, concentrao celular no inculo de 40% (v/v) e tempo de enchimento de
6 horas, obtendo-se um rendimento de 92,20% em relao ao terico, produtividade de 6,01
g/L.h e sacarose residual de 42,84 g/L em 10,5 horas de processo fermentativo. Com o intuito
de melhorar a produtividade e reduzir o acar residual foi estudada a influncia da
recirculao de clulas durante o processo fermentativo e a influncia da concentrao inicial
de etanol e substrato no inculo no processo em batelada alimentada. A partir deste estudo
obteve-se 92,75% de rendimento, 9,26 g/L.h de produtividade, 2,9 g/L de concentrao de
sacarose residual e a concentrao de etanol produzido foi de 83,37 g/L em 9 horas de
processo fermentativo. Foi proposto o modelo de inibio pelo substrato e produto para a
cintica da fermentao alcolica. Os parmetros do modelo foram calculados por meio de
ajuste no linear aos resultados experimentais de crescimento de leveduras, consumo de
substrato e formao de produto para o reator batelada. A velocidade especfica mxima de
crescimento foi de 0,103 h-1 com KI e Ks iguais a 109,86 e 30,24 g/L, respectivamente. Com
os resultados experimentais do reator batelada alimentada e batelada alimentada com reciclo,
constatou um bom ajuste do modelo proposto, resultando em uma velocidade especfica
mxima de crescimento de 0,080 h-1 para o processo em batelada alimentada sem reciclo e
0,182 h-1 para o processo batelada alimentada com reciclo de meio fermentativo. A
concentrao mxima de etanol na qual a produo do mesmo foi completadamente inibida
(Pmx) foi de 110 getanol /L , aproximadamente 13,92% (v/v). No entanto a concentrao
mxima de produto que cessa totalmente o crescimento do micro-organismo (Pmx) foi de
12% (v/v), correspondendo a 94,8 g/L de etanol. A velocidade especfica de sedimentao
(VES) para a levedura C2/00 em pH 5 foi de 0,240 min-1 e a velocidade de sedimentao pelo
teste da proveta foi de 0,444 cm/min. A fermentao alcolica, utilizando a levedura
floculante Saccharomyces cerevisiae em reator batelada alimentada com reciclo de meio
fermentativo forneceu maior produtividade e rendimentos quando comparados a dados
reportados pela literatura, nos quais utilizaram reator batelada ou batelada alimentada sem
reciclo de meio fermentativo.
Palavras-chave: etanol, fermentao alcolica, levedura floculante, reator batelada
alimentada.
ABSTRACT
Researches are done with the aim of select yeast strains that plays a differentiated role in the
process of alcoholic fermentation, with the purpose of improve the performance in the ethanol
production and decrease the productions costs. In this work it was studied the application of
Saccharomyces cerevisiae yeasts with flocculent features in fed batch reactor. It was
evaluated the fermentative capacity of six strains of flocculent yeasts. The yeast C2/00 was
involved in higher productivity and yield in ethanol compared to other yeasts tested. After it
was studied the alcoholic fermentation in fed batch reactor using the yeast C2/00. The
fermentations were performed at 32C and initial pH adjusted in 4.5. The process was
optimized in sucrose concentration of 170 g/L, cell concentration in the inoculum of 40%
(v/v) and filling time of 6 hours, it is obtaining a yield of 92.20% in relation to the theoretical
one, productivity of 6.01 g/L.h and residual sucrose of 42.84 g/L in 10.5 hours of fermentative
process. It was studied the influence of cells recirculation during the fermentative process and
the influence of initial concentration of ethanol and substrate in inoculum on the fed batch
process with the aim of improve the productivity and reduce the residual sugar. From of this
study it was obtained 92.75% of yield, 9.26 g/L.h of productivity, 2.9 g/L of residual sucrose
concentration and the ethanol concentration produced was 83.37 g/L in 9 hours of
fermentative process. The inhibition by the substrate and product model to the kinetics of
alcoholic fermentation was proposed. The parameters of model were calculated by means of
nonlinear adjust to the experimental results of growth of yeast, substrate consumption and
formation of product to the batch reactor. The maximum specific speed of growth was 0.103
h-1 with KI and Ks equal to 109.86 and 30.24 g/L, respectively. With the experimental results
of fed batch reactor and fed batch with recycle, it can be noted a good fit to the model
proposed, resulting in a maximum specific velocity of growth of 0.080 h-1 to the process in
fed batch without recycle and 0.182 h-1 to the fed batch process with recycle of fermentative
media. The ethanol concentration in which the production of it is completely inhibited
(Pmax) was 110 gethanol /L , approximately 13.92% (v/v). For the result of maximum
concentration of product that inhibits fully the microorganisms growth (Pmax) was 12% (v/v),
corresponding to 94.8 g/L of ethanol. The specific velocity of sedimentation (SVS) to the
yeast C2/00 in pH 5 was 0.240 min-1 and the sedimentation rate of the test beaker was 0.444
cm/min. The alcoholic fermentation, using the flocculent yeast Saccharomyces cerevisiae in
fed batch reactor with recycle of fermentative media provided higher productivity and yields
when compared to the reported data by literature, in which used batch reactor or fed batch
without recycle of fermentative media.
Keywords: ethanol, alcoholic fermentation, flocculent yeast, fed batch reactor.
CAPTULO 1
INTRODUO
Com a acelerao da demanda por combustveis fsseis, principalmente com relao
aos surtos de crescimento da ndia e da China, e fontes relativamente estagnadas, refletindo
em altos preos do petrleo, as bases fundamentais de nossos sistemas de energia, transporte e
agricultura esto sendo questionados. Embora tenha havido muita discusso sobre a
necessidade de desenvolver fontes limpas e renovveis de energia como a elica, at o
momento no h nenhum sinal de que essa tecnologia seja capaz de produzir energia em
grande escala e suficiente para o futuro. A produo de biocombustveis tem crescido de
forma constante e h uma projeo de crescimento ainda maior durante as prximas dcadas
(HIRA e OLIVEIRA, 2009; ROLZ e LEN, 2011). O etanol tem um grande potencial para
substituir os combustveis fsseis, principalmente pelo fato de ser um bicombustvel
renovvel, podendo melhorar a segurana energtica e reduzir os dficits comerciais. Alm
disso, a degradao ambiental resultante do excesso de consumo de derivados de petrleo,
est ameaando a sustentabilidade da sociedade humana (SMEETS et al., 2008;
GOLDEMBERG, COELHO e GUARDABASSI, 2008; BAI, ANDERSON e MOO-YOUNG,
2008; LIU, ZHAO et al., 2012).
O etanol da cana-de-acar representa um caso de sucesso tecnolgico para o pas. A
indstria da cana mantm o maior sistema de energia comercial de biomassa no mundo, por
meio da produo de etanol e do uso do bagao e da palha para gerao de eletricidade
(SCHULZ, 2010; WU et al., 2011). O uso de etanol base de cana-de-acar no resulta em
emisses significativas de gases de efeito estufa. A razo disso que o CO2 liberado no
processo reabsorvido pela fotossntese durante o crescimento da cana-de-acar. Toda a
energia (calor e eletricidade) gasta durante a produo de etanol vem a partir do bagao que
usado para gerar eletricidade (GOLDEMBERG, COELHO e GUARDABASSI, 2008). Uma
srie de pases em desenvolvimento conseguiram adotar o sistema brasileiro, reduzindo assim
a sua dependncia pelo petrleo. A evoluo do sistema brasileiro de etanol e seus parmetros
so de interesse primordial para pases interessados em produzir bioetanol (HIRA e
OLIVEIRA, 2009).
O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, sigla em ingls)
divulgou no dia 11 de fevereiro de 2013 o relatrio "USDA's Agricultural Projections to
2022", que traz projees para a agricultura para o ano de 2022. Dedicado, em parte, ao
Captulo 1 - Introduo
mercado dos biocombustveis, o relatrio apresenta tambm o possvel cenrio para o

mercado de etanol para daqui dez anos, levando em conta suposies especficas relacionadas
a condies climticas, condies macroeconmicas e polticas nacionais e internacionais de
biocombustveis (NOVACANA, 2013).
Entre 2013 e 2022, a oferta dos principais produtores globais (EUA, Brasil, Unio
Europia, Argentina, Canad, China e Indonsia) dever subir em cerca de 30% no caso do
biodiesel e em 40% para o etanol. Argentina e Brasil devem seguir na liderana das
exportaes mundiais de biocombustveis. Os argentinos seguiro especializados em biodiesel
de soja, e o Brasil, em etanol de cana. No Brasil, a projeo de que a produo de etanol
cresa 90%, especialmente para suprir crescente demanda interna por combustveis com
maior mistura de etanol (BRASILAGRO, 2013). Enquanto isso, a Unio Europia continuar
como a maior consumidora e importadora de biocombustveis. O ritmo das exportaes do
pas para os EUA e Unio Europia continuar crescendo de maneira estvel, o que mantm o
Brasil no domnio das exportaes mundiais, ao lado da Argentina. A Agncia de Proteo
Ambiental (EPA) espera que em 2013 os EUA importem 2,5 bilhes de litros de etanol do
Brasil. Acredita-se que ser preciso ter pelo menos 120 novas usinas no pas at 2020, para
aumentar a oferta de etanol (UDOP, 2013; NOVACANA, 2013).
A possibilidade de obter um combustvel renovvel, acessvel, disponvel, seguro e
eficaz um dos desafios que a humanidade deve enfrentar. No entanto, em alguns casos os
custos de produo de etanol combustvel so maiores do que os custos de produo de
gasolina, embora haja uma forte influncia de fatores como os preos do petrleo e matriasprimas para a produo de etanol. No entanto, muitos grupos e centros de pesquisa de
diferentes pases esto continuamente realizando estudos que visam reduzir os custos de
produo do etanol para que este processo seja rentvel para a indstria e vivel para o
consumidor. Tendncias de pesquisa e diversas melhorias de processo esto sendo realizadas
para reduzir os custos do etanol. Estas tendncias de pesquisa esto relacionadas com as
diferentes etapas no processamento, como na natureza da matria-prima, equipamentos,
sntese de processos, integrao e otimizao (CARDONA e SNCHEZ, 2007; GOMES et
al., 2012).
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem dominado h anos a fermentao
alcolica. A levedura floculante tem uma caracterstica importante, o qual permite que as
clulas de levedura formem flocos e decantem facilmente no caldo fermentado. Quando a
separao celular realizada pela decantao, uma economia significativa notada no
processo, pois no se utiliza centrifugas, o que acarreta em um gasto energtico para o
Captulo 1 - Introduo
processo (LI et al., 2009; ZHAO et al., 2012; GOMES et al., 2012). Na China, est se
utilizando essa tecnologia de levedura floculante e tem sido comercializada com sucesso e
sendo economicamente competitiva (ZHAO et al., 2012). Os reatores que utilizam levedura
floculante so operados com alta concentrao celular, resultando em alta produtividade
(CHOI et al., 2010; TANG et al., 2010). Durante a produo de etanol por fermentao em
batelada ou batelada alimentada, o uso de levedura floculante muito promissor, pelo fato de
reduzir os custos do processo pela utilizao de decantao ao final do processo (CHOI et al.,
2010; GOMES et al., 2012).
Baseado no exposto, o objetivo geral do presente trabalho foi estudar o processo de
fermentao alcolica para a produo de etanol, utilizando uma cepa da levedura floculante
da espcie Saccharomyces cerevisiae em reator operando em batelada alimentada. Como
objetivos especficos tm-se:
Avaliar a capacidade fermentativa de seis cepas de Saccharomyces cerevisiae com
caractersticas floculantes;
Estudar o efeito da concentrao celular, da concentrao do substrato e do tempo
de enchimento do reator operando em batelada alimentada na fermentao alcolica,
utilizando a metodologia de superfcies de resposta;
Avaliar a influncia do reciclo de meio fermentativo e da concentrao de etanol e
de sacarose no inculo na fermentao alcolica;
Realizar estudo cintico do processo de fermentao alcolica na condio
otimizada;
Avaliar a velocidade de sedimentao da levedura C2/00, em diferentes valores de
pH, ao final da fermentao.
CAPTULO 2
REVISO BIBLIOGRFICA
Neste captulo apresentada uma reviso da literatura sobre os temas

pertinentes a este trabalho. Foi realizada uma reviso atualizada em artigos cientficos,
dissertaes e teses a respeito do processo de fermentao alcolica. A nfase principal
dessa reviso foi pela produo de etanol, utilizando cana-de-acar como matria
prima e a tecnologia de leveduras floculantes no processo em reator batelada
alimentada.
2.1 Etanol
Em meados do sculo XIX, Louis Pasteur estudou o papel dos microorganismos em fermentaes como queijo, leite, iogurte e outros produtos lcteos,
algumas bebidas como vinho, combustveis e a indstria qumica. A partir desse estudo
identificou muitos processos microbianos e descobriu o papel principal da fermentao,
qual substrato era necessrio para o metabolismo e seus respectivos produtos finais. No
novo milnio, a aplicao extensiva de bioprocessos criou um ambiente para muitos
engenheiros expandirem o campo da biotecnologia. Uma das aplicaes teis da
biotecnologia a utilizao de micro-organismos para a produo de alcois e acetona,
que so utilizados nos processos industriais (AIBA, HUMPHREY e MILLIS, 1973;
BAILEY e OLLIS, 1986).
Em 1929, a grande crise internacional colocou em risco as economias de todos
os pases, e no Brasil nem a indstria aucareira ficou a salvo, sobrava acar e faltava
combustvel. Em 1931, a primeira destilaria de lcool anidro foi instalada no Brasil e o
Governo Federal estabeleceu a obrigatoriedade da mistura de 5% de etanol gasolina
(Decreto 19.717 como medida de economia na importao de combustvel e para
amparar a lavoura canavieira). Por muitos anos no houve produo de lcool suficiente
para misturar com todo o combustvel consumido (LIMA, BASSO e AMORIM, 2001).
A fim de enfrentar esta situao, foi criado o Instituto de Acar e lcool (IAA) em
1933, fazendo com que a produo brasileira fosse crescente desde ento (PORTO,
2005).
Captulo 2 Reviso Bibliogrfica
Em 1975, o governo brasileiro criou o Programa Nacional do lcool

(Prolcool), que diversificou a atuao da indstria aucareira com grandes
investimentos apoiados pelo Banco Mundial, possibilitando a ampliao da rea
plantada com cana-de-acar e a implantao de destilarias de etanol. Neste mesmo ano
estimulou-se a substituio da gasolina pelo etanol para uso em automveis e
intensificou o uso da mistura de etanol e gasolina como combustvel (SIQUEIRA et al.,
2008). A experincia serviu como alternativa para diminuir a vulnerabilidade energtica
do pas, devido crise mundial do petrleo. O desenvolvimento da engenharia nacional,
aps o segundo choque do petrleo, em 1979, permitiu o surgimento de motores
especialmente desenvolvidos para funcionar com etanol hidratado. Em 1984, os carros
a etanol passaram a responder por 94,4% da produo das montadoras instaladas no
Brasil. Desde 1986, a reduo do impacto da crise do petrleo e os planos econmicos
internos para combater a inflao estimularam uma curva descendente na produo de
carros a etanol, que culminou com a crise de abastecimento de 1989. Com isso, a
participao anual dos veculos a etanol caiu para 1,02% na frota nacional, em 2001
(UNICA, 2012).
O Brasil, desde o incio de 1970, tem sido o principal produtor de etanol no
mundo, utilizando a cana-de-acar como matria-prima. Etanol a partir da cana-deacar com a sua natureza biorrenovvel j um recurso que o Brasil pode utilizar
como um dos substitutos para os combustveis fsseis (LUO, VOET e HUPPES, 2009).
A cana-de-acar utilizada como matria-prima mais eficiente quando comparada a
outras matrias-primas como milho e trigo, usados em outros pases. Na verdade, a
eficincia melhorou com relao ao desperdcio. J que o bagao da cana utilizado
para produzir eletricidade, tanto para suprir as necessidades da usina como para venda
do excesso dessa energia produzida, e os resduos remanescentes so utilizados como
fertilizante (HIRA e OLIVEIRA, 2009).
A indstria revitalizou-se apenas com a introduo dos veculos de combustvel
flex, em Maro de 2003. O governo estimulou o emergente mercado do bicombustvel.
Veculos de combustvel flex podem utilizar vrias misturas de lcool e gasolina,
permitindo assim que os consumidores possam abastecer conforme os preos do
mercado. No incio de 2005, a venda de veculos flex correspondeu por 57% de todas as
vendas (HIRA e OLIVEIRA, 2009). Em 2010 a Agncia de Proteo Ambiental dos
Estados Unidos (U. S. Environmental Protection Agency - EPA) classificou o etanol de
cana-de-acar brasileiro como bicombustvel avanado, capaz de reduzir 50% as
emisses de gases de efeito estufa quando se comparado gasolina. Diversos estudos

confirmam que a reduo proporcionada pelo etanol de cana-de-acar supera essa
exigncia, podendo chegar a 90%. Essa importante classificao posiciona o etanol
brasileiro com destaque no programa americano de Padro de Combustvel Renovvel,
o Renewable Fuel Standart (RFS2), que regula a produo e uso de bicombustveis no
pas (UNICA, 2012).
O etanol pode ser produzido por fermentao alcolica com acares
fermentescveis a partir de produtos agrcolas, materiais celulsicos ou resduos de
plantas (BAPTISTA et al., 2006). As matrias-primas como acar e amido so
atualmente predominantes a nvel industrial, e so at agora economicamente mais
favorveis. Algumas das vantagens da utilizao de etanol em relao a outros
combustveis podem ser citadas (HIRA e OLIVEIRA, 2009):
Combustvel renovvel;
O lcool pode ser produzido, de forma simples e com baixo custo;
Vrias fontes de substrato para produo do biocombustvel.
Em contrapartida, tambm existem as desvantagens como: custo alto do etanol,
por falta de incentivos do governo e rendimento inferior no motor que o da gasolina
(PORTO, 2005, LAVADO, 2009). As desvantagens do petrleo em relao ao lcool
combustvel so:
Petrleo tem uma maior toxicidade;
Produo de poluentes mais perigosos e ameaadores ao meio ambiente;
Maior facilidade de exploses e queima acidental;
Produz uma goma de resduo sobre as superfcies onde armazenado, e o
combustvel deixa depsitos de carbono na cmara de combusto;
Alto custo na explorao e desenvolvimento do produto.
Para uma produo industrial de etanol vivel, o processo de fermentao deve
ser extremamente robusto e pouco afetado por pequenas alteraes da matria prima,
alm
da
minimizao
dos
custos,
como
(GOLDEMBERG,
COELHO
GUARDABASSI, 2008; MISSAWA, 2009):

Obteno do mximo rendimento em etanol;
Minimizao na sntese de outros produtos (como glicerol e cido lctico);
Minimizao do tempo de fermentao;
Baixa contaminao bacteriana (aes preventivas, como tratamento cido
do fermento);
Manuteno da alta viabilidade do fermento;

Minimizao de produtos qumicos (como cidos, antibiticos e
antiespumante);
Minimizao dos gastos com manuteno (como limpeza e vazamentos);
Minimizao de gastos de energia e gua;
Automatizao das operaes manuais (como temperatura, brix e pH).
2.2 Matrias-prima
2.2.1 Cana de acar como principal matria-prima para produo de
etanol
A cana-de-acar (Saccharum officinarum) uma das gramneas mais
cultivadas nas regies tropicais e subtropicais do globo terrestre devido enorme
contribuio scio-econmica que representa a sua explorao, alm de sintetizar e
armazenar significativa quantidade de sacarose em seus tecidos de reserva. A cana-deacar foi introduzida no Brasil pelos portugueses no incio do sculo XVI, sendo
introduzida em duas regies distintas: no Nordeste, onde no estado de Pernambuco teve
melhores resultados no seu cultivo, e no Sudeste brasileiro, na regio de So Paulo
(MICHEL JUNIOR, 2010). Sua composio essencialmente formada de duas partes:
uma subterrnea, formada pelos rizomas e pelas razes e outra area constituda pelo
colmo, folhas e flores. O colmo constitui um sistema de duas fases: slida e lquida. A
fase slida um complexo composto de celulose, lignina e pentosanas, conhecida
geralmente como fibra. A fase lquida uma soluo aquosa, contendo uma grande
variedade de substncias orgnicas, entre as quais aproximadamente 90% sacarose. A
composio bsica da cana-de-acar est apresentada na Tabela 2.1 (DIAS, 2008).
O processamento da cana-de-acar se d pelo esmagamento do colmo,
liberando assim o caldo, que transformado nos principais produtos que o acar e o
etanol, via processo fermentativo. Praticamente todos os resduos da agroindstria
canavieira so reaproveitados. A torta de filtro, formada pelo lodo da clarificao do
caldo e bagacilho, que muito rica em fsforo, utilizada como adubo para a lavoura
de cana-de-acar. A vinhaa, um subproduto da produo de lcool, contm elevados
teores de potssio, gua e outros nutrientes, sendo utilizada para irrigar e fertilizar o
campo.
Tabela 2.1- Composio da cana-de-acar

Componentes
Teor (% em massa)
Slidos Totais
24 a 27
Slidos Solveis
10 a 16
Fibras (base seca)
11 a 16
gua
73 a 76
A cana-de-acar, tanto na forma de suco como de melao, a matria-prima

mais importante e utilizada em pases tropicais e subtropicais para a produo de etanol.
Nos pases europeus, o melao de beterraba contendo sacarose o mais utilizado como
matria-prima. Alm destas culturas energticas, o sorgo doce tornou-se uma matriaprima com grande perspectiva, considerando que a partir dos seus caules pode ser
extrado um suco com um elevado teor de sacarose, os seus gros contm uma elevada
quantidade de amido, e o seu bagao uma fonte importante de biomassa
lignocelulsica. Quando se compara a converso da cana-de-acar com a converso de
materiais amilceos ou biomassa lignocelulsica em etanol, percebe-se uma maior
converso da cana-de-acar, pois o acar contido na cana diretamente
fermentescvel. Para materiais amilceos h necessidade da hidrlise prvia da matriaprima o qual no necessrio para acares diretamente fermentenscveis como a
sacarose na cana-de acar (CARDONA e SNCHEZ, 2007).
2.2.2 Outras matrias-primas para produo de etanol
O bioetanol pode ser produzido a partir do amido, sendo encontrado no trigo,
milho, mandioca e batata. Neste processo se faz necessrio a hidrlise de cadeias de
carboidratos para a obteno de acares. Assim estes acares so convertidos em
etanol. O amido contido nos gros, como milho e trigo, o polmero mais utilizado para
a produo de etanol, principalmente na Amrica do Norte e Europa. Nos pases
tropicais, cultivos amilceos, como tubrculos (exemplo a mandioca), podem ser
utilizados para a produo comercial de etanol. Outra forma de se produzir etanol a
partir de biomassa lignocelulsica. Como exemplo pode ser citado bagao de cana,
palha de milho e trigo, variedades de capins e algumas madeiras, que um complexo
composto por vrios polissacardeos. Esta matria-prima considerada uma das mais
promissora, pois possui grande disponibilidade e baixo custo, mas ainda falta muito
estudo para tornar essa tecnologia vivel. Esta tecnologia utilizada em pases em que o
cultivo de culturas energticas que contenham sacarose ou amido se torna difcil,
principalmente pelo clima, tornando materiais lignocelulsicos em uma opo atraente
para a produo de biocombustveis. Porm o principal desafio na converso de
biomassa em etanol a operao do pr-tratamento. Devido estrutura do complexo
lignocelulsico, o pr-tratamento se torna necessrio para a sua degradao, a remoo
da lignina, a hidrlise parcial ou total da hemicelulose, e a diminuio da frao de
celulose cristalina. Consequentemente, as tecnologias envolvidas so mais complexas
levando a custos mais elevados de produo de etanol, se comparado com a cana-deacar, beterraba ou de milho (LIU, 2009; CARDONA e SNCHEZ, 2007).
A produo de etanol a partir de biomassa lignocelulsica referida como
biocombustvel de segunda gerao. A produo do etanol com base nessas fontes
possvel, mas exigir o domnio de processos e tecnologias que ainda no esto
completamente dominadas e desenvolvidas no mundo, em nvel de comercializao. O
maior problema da comercializao do etanol de segunda gerao est associado ao
valor do produto, por apresentar processos caros e complexos (LIU, WANG e OUYANG, 2009).
2.3 Biorreatores
Denominam-se biorreatores os reatores nos quais ocorre uma srie de reaes
qumicas catalisadas por biocatalisadores, que podem ser enzimas ou clulas vivas
(SCHIMIDELL e FACCIOTTI, 2001; PORTO, 2005). Para projetar um biorreator,
alguns objetivos devem ser definidos. As decises tomadas na concepo do biorreator
podem ter um impacto significativo no desempenho global do processo. O
conhecimento da cintica de reao essencial para a compreenso de como funciona
um reator biolgico. Outras reas de engenharia de bioprocessos, como balano e
transferncia de massa e energia tambm so necessrios para se ter um bom
desempenho. O biorreator o corao de qualquer processo bioqumico em que os
micro-organismos so utilizados para a fabricao de uma ampla variedade de produtos.
Podem ser citadas algumas das condies principais que um biorreator necessita para o
seu bom desempenho (BAILEY e OLLIS, 1986; DOMINGUES, 2001):
Concentrao de biomassa;
Fornecimento de nutrientes;
10
Condies estreis;
Remoo de produto;
Agitao;
Inibio pelo substrato ou produto;
Controle da temperatura;
Aerao;
Ajuste de pH;
Conhecimento do metabolismo e atividades microbianas.
As fermentaes industriais podem ser classificadas de acordo com os tipos de
alimentao das dornas, em processos contnuos e descontnuos. Um grande avano na
produo industrial de etanol foi alcanado na dcada de 30, quando surgiu na Frana o
processo Melle-Boinot, o qual consiste na reutilizao de fermento de uma batelada
para outra e na alimentao do substrato realizada em um determinado tempo. No Brasil
esse processo passou a ser chamado de batelada-alimentada (BAILEY e OLLIS, 1986;
DOMINGUES, 2001).
2.3.1 Processo batelada
O processo descontnuo simples efetuado com um inculo por tanque, que
consiste na preparao do substrato adequado ao desenvolvimento do micro-organismo.
Na batelada simples, a fermentao s tem incio aps o preenchimento do fermentador,
momento em que se mistura o mosto com o fermento. A fermentao considerada
concluda quando a cuba morre, ou seja, quando cessa a atividade biolgica por falta
de nutrientes ou por excesso de produto inibidor, no caso o etanol. A fermentao
descontnua pode levar a baixos rendimentos e produtividades, pois quando o substrato
adicionado de uma s vez no incio da fermentao ele exerce efeitos de inibio,
represso, ou desvia o metabolismo celular a produtos que no interessam. O uso desse
tipo de processo fica restrito praticamente para fermentaes laboratoriais,
farmacuticas e na produo de cachaa (TOSETTO, 2002; CARVALHO e SATO,
2001; PORTO, 2005).
O processo batelada tem como vantagem as boas condies de assepsia e a
possibilidade de realizar a manuteno sempre que for necessrio. Alm de menores
riscos de contaminao, este processo apresenta grande flexibilidade de operao,
condio de controle mais estreito da estabilidade gentica do micro-organismo, assim
11
como a capacidade de identificar todos os materiais relacionados quando se est

desenvolvendo um determinado lote de produto (CARVALHO e SATO, 2001;
SCHIMIDELL e FACCIOTTI, 2001).
2.3.2 Processo batelada alimentada
A utilizao do processo batelada alimentada, tambm conhecido como
Melle-Boinot no Brasil, se generalizou no final da dcada de 60 e nos anos 70.
Quando houve a criao do programa Nacional do lcool, em 1976, todas as destilarias
foram equipadas com este processo. Basicamente, o processo descontnuo alimentado
definido como uma tcnica em processos microbianos, onde um ou mais nutrientes so
adicionados ao fermentador durante o cultivo e os produtos gerados permanecem at o
final da fermentao. A vazo de alimentao pode ser constante ou variar com o
tempo, e a adio de mosto pode ser de forma contnua ou intermitente (CARVALHO e
SATO, 2001). Devido flexibilidade de utilizao de diferentes vazes de enchimento
dos reatores com meio nutriente, possvel controlar a concentrao de substrato no
fermentador, de modo que, por exemplo, o metabolismo microbiano seja deslocado para
uma determinada via metablica, levando ao acmulo de um produto especfico
(CARVALHO e SATO, 2001). O desenvolvimento de uma estratgia de alimentao
apropriada um ponto importante em cultivo de fermentao em batelada alimentada.
Vrias estratgias tm sido desenvolvidas para controlar a concentrao de nutrientes
dentro do intervalo timo, e tem sido aplicada para a cultura de clulas de alta densidade
de vrios micro-organismos (LEE et al., 1999). O processo Melle-Boinot foi
introduzido com o intuito de aumentar a produtividade em relao batelada, que tem
baixa produtividade e lenta. Algumas vantagens podem ser citadas, como:
Economia de acar para a reproduo celular;
Maior rendimento em etanol;
Eliminao de contaminantes pela centrifugao ou sedimentao do meio
fermentado (separao de clulas de levedura);
Fermentao mais pura devido ao tratamento do leite de levedura
(tratamento cido);
Eliminao da necessidade de cultura pura no preparo do p de cuba,
prtica exigida no processo clssico, diminuindo, portanto, a complexidade das
operaes na planta;
12
Grande potencial para a automao de processos e reduo de custos

operacionais.
Este tipo de processo tem como principal caracterstica o reciclo do fermento.
A separao das leveduras do mosto fermentado feita em centrfugas ou
sedimentadores pela diferena de dimenses e densidades. Assim, durante a
centrifugao ou decantao, uma boa parte das bactrias presente no mosto arrastada
com o vinho, conferindo, desse modo, uma elevada pureza ao leite de levedura
resultante. Aps a separao da levedura do vinho, o fermento sofre um tratamento com
cido sulfrico na cuba de tratamento. As bactrias remanescentes no conseguem
sobreviver alta concentrao de ons hidrognio, ocorrendo o mesmo com as clulas
velhas de leveduras, enquanto que as clulas jovens resistem muito bem ao baixo pH.
Aps o tratamento cido, o fermento retorna ao processo de fermentao na forma de
um p-de-cuba (VIEGAS, 1999; BORGES, 2008).
Choi et al. (2010) citam a reduo de custos ao se utilizar levedura floculante
em reator batelada alimentada com a recuperao de clulas sem a utilizao de
centrifugas, utilizando apenas sedimentadores. Durante a produo de etanol por
fermentao em batelada alimentada utilizando leveduras floculantes os custos podem
ser reduzidos na recuperao das clulas, pois as clulas floculantes so facilmente
separadas do meio sem o uso da centrifugao.
2.3.4 Processo contnuo
Em relao aos processos contnuos, os primeiros sistemas foram os de dornas
ligadas em srie, com quantidade e tamanhos variados, em cascata, em que as primeiras
dornas continham cerca de 70% do volume total da fermentao. Com a evoluo dos
processos da fermentao, ocorreu otimizao dos mesmos, diminuindo o tempo de
fermentao e aumentando a produtividade. O processo de fermentao alcolica
contnua pode ser dividido em 3 partes: unidade de tratamento cido, unidade de
separao de clulas de leveduras e fermentadores. As clulas de leveduras, aps terem
sido submetidas ao tratamento cido (fermento tratado), deixam as unidades de
tratamento e so misturadas com o meio de alimentao (mosto). Esta mistura ento
enviada aos fermentadores. A frao entre a vazo de fermento tratado e a vazo total de
alimentao dos fermentadores chamada de taxa de reciclo. Depois de ocorrida a
transformao dos acares em lcool, o vinho fermentado contendo clulas de
13
leveduras (vinho bruto) enviado para a unidade de separao (ANDRIETTA, 1994).

Algumas vantagens observadas na conduo dos processos contnuos podem ser citadas,
como (FACCIOTTI, 2001; BORGES, 2008; PACHECO, 2010):
Maior produtividade;
Menor volume de equipamentos em geral;
Amplas possibilidades de total automao;
Reduo do consumo de insumos, de uma maneira geral;
Trabalham em condies timas de operao no estado estacionrio.
Porm, tambm h desvantagens como:
Possibilidade maior de contaminao;
Possibilidade de ocorrncia de mutaes genticas espontneas e seleo de
mutantes menos produtivos;
Dificuldades de operao em estado estacionrio, como: formao de
espuma, crescimento do micro-organismo nas paredes do reator ou nos sistemas de
entrada e sada do produto;
Dificuldade de manuteno de homogeneidade no reator, quando se trabalha
com vazes baixas;
Maior investimento fixo na planta.
A implementao industrial de sistemas de fermentao contnua utilizando
clulas de levedura floculantes requer um conhecimento e compreenso dos
mecanismos de floculao de levedura, para poder controlar e desenvolver estirpes de
levedura com a capacidade de floculao adequada. Alm disso, esta perspectiva deve
ser integrada juntamente com o desenvolvimento do desenho do reator e condies de
operao. Geralmente utilizam-se fermentadores tubulares para fermentao alcolica,
utilizando levedura floculante em processo contnuo (ZARPELON e ANDRIETTA,
1992; PORTO, 2005). Ghose e Thyagi (1979) citam que sistemas de fermentao
alcolica contendo reatores em srie so mais produtivos que os constitudos de um
nico reator (ANDRIETTA, 1994; ANDRIETTA, STECKELBERG e ANDRIETTA,
2008).
2.4 Bioqumica da fermentao alcolica
A fermentao alcolica a ao das leveduras sobre acares fermentescveis
(LIMA e MARCONDES, 2002). Bioquimicamente, a fermentao a oxidao
14
incompleta do acar, gerando como subproduto um composto orgnico oxidvel.

Inicialmente a sacarose, que o seu acar de reserva, sofre hidrlise pela enzima
invertase sendo convertida em glicose e frutose. Ambas entram na via glicoltica e,
atravs de uma seqncia de reaes, so convertidas a piruvato. Este, primeiramente
descarboxilado pela enzima piruvato descarboxilase, formando acetaldedo e liberando
CO2. Posteriormente o acetaldedo reduzido a etanol, sendo essa reao catalisada pela
enzima lcool desidrogenase (ADH) (MISSAWA, 2009). Globalmente, a fermentao
alcolica pode ser entendida como a transformao de acares em etanol e pode ser
traduzida pela seguinte reao:
C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP
De acordo com a estequiometria, a converso de 1 g de glicose deveria
produzir 0,51 g de etanol e 0,49 g de dixido de carbono. No entanto, a sntese celular e
de produtos secundrios limitam o rendimento estequiomtrico a valores inferiores a
100% desta converso. A fermentao alcolica resulta de dois processos distintos,
gliclise (via de Embden-Meyerhof-Parnas) e o metabolismo anaerbio do piruvato. Em
micro-organismos eucariticos, a gliclise realiza-se na matriz citoplasmtica, e dividese em duas partes; a fase inicial de seis carbonos e a fase final de trs carbonos. O
objetivo principal da levedura, ao metabolizar anaerobicamente o acar gerar uma
forma de energia Adenosina Trifosfato (ATP) que ser empregada na realizao de
diversas funes fisiolgicas (absoro, excreo e outras) e biossnteses necessrias
manuteno da vida, crescimento e multiplicao. O etanol e CO2 resultantes
constituem to somente em produtos de excreo, sem utilidade metablica para a
clula em anaerobiose (ROMO, 2011).
Na fase dos seis carbonos, ocorre a fosforizao da glicose, por duas vezes,
originando frutose 1,6-bi fosfato, com consumo de duas molculas de adenosina
trifosfato (ATP). Na fase dos trs carbonos, ocorre a converso a piruvato, formando-se
quatro molculas de ATP. O processo de reduo de piruvato a etanol pode dividir-se
tambm em duas etapas; numa primeira etapa ocorre a descarboxilao do piruvato
numa reao irreversvel catalisada pelo piruvato descarboxilase, e na segunda etapa o
acetaldedo reduzido a etanol. O etanol e CO2 resultantes se constituem to somente
em produtos de excreo, sem utilidade metablica para a clula em anaerobiose
(LIMA, BASSO e AMORIM, 2001). A transformao da sacarose em etanol e CO2
15
envolvem 12 reaes em seqncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima
especfica, conforme apresentado na Figura 2.1.
Figura 2.1- Sequncia de reaes enzimticas pela fermentao alcolica de

carboidratos endgenos (glicognio e trealose) ou exgenos (sacarose e maltose),
conduzida por Saccharomyces cerevisiae (LIMA, BASSO e AMORIM, 2001).
Alm de etanol e de CO2, vrios subprodutos tambm so produzidos durante a
fermentao de etanol. Glicerol um dos principais subprodutos da fermentao
alcolica. Outros subprodutos, tais como os cidos orgnicos e outros alcois so
produzidos em nveis menores. A produo destes subprodutos, bem como o
crescimento de clulas de levedura, inevitavelmente diminui a produo de etanol. Na
16
indstria, o rendimento de etanol, que calculado com base na alimentao total de

acar no sistema chega faixa de 90 - 93% em relao ao seu valor terico (BAI,
ANDERSON e MOO-YOUNG, 2008).
As leveduras so os micro-organismos mais comumente usados para
fermentao alcolica. Cultivo anaerbico de Saccharomyces cerevisiae gera, alm de
etanol e dixido de carbono, glicerol, biomassa celular e outros subprodutos. O dixido
de carbono um produto de fermentao inevitvel, mas este gs pode ser recuperado e
comercializado. O glicerol pode ser produzido como um soluto compatvel durante o
estresse osmtico (SIQUEIRA et al., 2008). Durante o processo fermentativo, as clulas
de leveduras apresentam necessidades nutricionais que influenciam diretamente na
multiplicao, no crescimento celular e tambm na eficincia da transformao de
acar em lcool. O nitrognio um elemento essencial para o crescimento e
multiplicao das leveduras, na gerao de biomassa e na produo de carboidratos de
reserva (SANTOS, 2008). O fsforo integra as molculas de cidos nuclicos como na
formao de ATP. O enxofre citado como constituinte de aminocido (AMORIM,
BASSO e ALVES, 1996; SANTOS, 2008). Embora muitos pesquisadores tenham
estudado a fermentao alcolica com S. cerevisiae, ainda falta o conhecimento
aprofundado da sua via metablica.
2.4.1 Fatores que afetam a fermentao alcolica
- Temperatura: A temperatura um fator muito importante na fermentao
alcolica. As leveduras atuam melhor nas fermentaes em temperaturas de 28 e 35C.
Temperaturas elevadas afetam o comportamento da levedura e diminuem o teor
alcolico do vinho, alm de contribuir para a multiplicao bacteriana. Com o aumento
da temperatura a toxidez do etanol sobre o fermento intensificada, causando perda de
viabilidade celular e causando baixo rendimento (AMORIM, BASSO e ALVES, 1996;
SANTOS, 2008). Em temperaturas baixas a fermentao lenta e a produtividade
baixa. A temperatura tima de crescimento das leveduras , geralmente, inferior
temperatura tima para a produo de etanol (DIAS, 2008). A levedura Saccharomyces
cerevisiae tem uma boa atuao em temperaturas entre 30 a 33 C (AMORIM, BASSO
e ALVES, 1996; SANTOS, 2008).
17
- pH: O pH do meio fermentativo influencia muito no rendimento em etanol,

pelo fato de restringir o crescimento microbiano. O pH timo utilizado nas usinas fica
na faixa de 4 a 5. Nos mostos industriais, os valores de pH geralmente se encontram na
faixa de 4,5 a 5,5. O caldo de cana se adapta bem a essa faixa de pH, pois seu pH
natural fica em torno de 5,2 a 6,8. No processo com reutilizao da levedura realizado
tratamento com cido sulfrico em pH de 2,0 a 3,2, durante uma ou duas horas, visando
a reduo da carga microbiana (LIMA, BASSO e AMORIM, 2001, ROMO, 2011).
Embora o tratamento cido se mostre estressante levedura, ainda apresenta efeito
benfico de controlar a contaminao bacteriana, pois ocorre a reduo significativa no
nmero de bactrias (STECKELBERG, 2001).
- Oxignio: A fermentao alcolica inibida na presena de grandes
concentraes de oxignio, fenmeno este denominado Efeito Pauster. Este efeito est
associado ao estado fisiolgico da clula, sendo que se manifesta principalmente nas
leveduras que no esto na fase de crescimento nas quais ocorre ntida diminuio do
consumo especfico de glicose (STECKELBERG, 2001).
- Viabilidade celular: A viabilidade um fator importante para a fermentao
alcolica. Quanto maior for a viabilidade celular melhor ser o desempenho do
processo. Na literatura foi observado que a viabilidade celular diminui continuamente
em anaerobiose, mas permanece acima de 95% em aerobiose num sistema de
fermentao vcuo. O aumento da temperatura de fermentao produz uma forte
diminuio da viabilidade celular, devido ao aumento das taxas de produo e acmulo
de etanol no meio e nas clulas (STECKELBERG, 2001). A temperatura adequada
deve ser mantida na fermentao por meio de dispositivos para o resfriamento de
dornas. medida que a temperatura aumenta, a contaminao bacteriana favorecida e
a levedura fica mais sensvel toxidez do etanol. As linhagens industriais de S.
cerevisiae so normalmente resistentes a alta temperatura, mas este fator interfere na
viabilidade celular quando em sinergia com a presena de etanol ou meio com baixo pH
(SILVA FILHO et al., 2005).
18
2.5 Levedura
As leveduras so micro-organismos eucariticos e formam uma das classes
mais importantes dos fungos. As clulas Saccharomyces cerevisiae apresentam-se
normalmente na forma unicelular, tipicamente esfrica ou oval, no filamentosa, com 2
a 8 micrmetros de dimetro. Estas clulas se reproduzem basicamente por brotamento,
onde a clula me d origem a uma nova clula (STECKELBERG, 2001; MISSAWA,
2009). Estes micro-organismos anaerbios facultativos adaptam-se em condies tanto
de aerobiose como de anaerobiose. Tanto na presena de oxignio livre como na sua
escassez, uma srie de reaes ordenadas ocorrem no interior das leveduras, reaes
estas catalisadas por enzimas da prpria clula e que tm como meta a obteno de
energia qumica pela da degradao de acares. Industrialmente, condies so criadas
para que as leveduras possam se desenvolver e, paralelamente, produzir etanol em
quantidade economicamente vivel (SANTOS, 2008).
Entre muitos micro-organismos que tem sido explorados para produo de
etanol, Saccharomyces cerevisiae ainda permanece como a melhor espcie em muitos
aspectos. Zymomonas mobilis tambm tem sido intensamente estudada nas ltimas trs
dcadas (BAI, ANDERSON e MOO-YOUNG, 2008). O grande sucesso da S.
cerevisiae na indstria de biotecnologia devido alta capacidade de produzir etanol e
dixido de carbono a partir de aucares. Possui importantes caractersticas, como

tolerncia a baixos valores de pH e alta concentrao de acar e etanol, propriedades
como alta competitividade perante contaminao (bacteriana ou por outras leveduras) na
fermentao industrial e alta resistncia a inibidores presentes na biomassa hidrolisada,
alm da capacidade de crescer anaerobicamente (MISSAWA, 2009).
2.5.1 Efeitos dos produtos de fermentao sobre a levedura
- Etanol: O etanol o produto metablico principal na fermentao de acares
por leveduras. O efeito inibitrio do etanol resultado de vrios aspectos, como
composio do meio, temperatura, natureza das cepas e condies de cultura (batelada
ou contnua) (STECKELBERG, 2001). O etanol tem efeito inibitrio na taxa de
crescimento celular a concentraes acima de 15 g/L. medida que esse produto se
acumula durante a fermentao pode atuar como um potente fator de estresse para as
clulas (FERNANDES, 2008).
19
- Substrato: A levedura tambm sofre inibio pelo substrato. As linhagens de

leveduras normalmente utilizadas nos processos industriais apresentam uma
osmotolerncia limitada. O estresse induzido pelo aumento da osmolaridade externa
leva a reduo em crescimento e perda da viabilidade celular, devido s perturbaes no
gradiente osmtico atravs da membrana plasmtica. Isto leva a perdas em volume das
clulas que se contraem por causa de diferenas em presso osmtica entre o exterior e
o interior da clula. Essa inibio pode ocorrer em concentraes maiores que 150 g/L
(DIAS, 2008; SOUZA, 2009; SCHULZ, 2010).
- Glicerol, cido Succnico e Acetato: so subprodutos do metabolismo
fermentativo. O glicerol, juntamente com o cido succnico, so os principais
subprodutos da fermentao alcolica e so responsveis pela reduo do rendimento
em etanol, pois consomem 3-5% dos acares fermentveis (GANCEDO e SERRANO,
1989). A produo de glicerol deriva da necessidade, em limitao de oxignio, oxidar o
excesso de NADH formado na gliclise e que no utilizado como co-substrato da
lcool desidrogenase na reduo de acetaldedo a etanol. O cido succnico formado,
durante o metabolismo aerbio, na presena de elevadas concentraes de glicose, no
ciclo dos cidos tricarboxlicos (TCA). Uma pequena porcentagem do acetaldedo
produzido a partir do piruvato pode ser desviado para a formao de acetato. Embora
seja um produto secundrio minoritrio da fermentao alcolica, a produo de acetato
resulta num excesso de NADH que compensado pela formao de glicerol
(GANCEDO e SERRANO, 1989; FERNANDES, 2008).
2.6 Levedura floculante
A floculao uma propriedade importante das estirpes de levedura e
normalmente definida como a capacidade das clulas de se agregarem espontaneamente
e formar flocos que so facilmente sedimentados ao final da fermentao de forma
eficaz, em vez de centrifugao. Centrfugas so amplamente utilizadas na recuperao
de clulas de levedura livres, poupando o investimento na aquisio e manuteno das
centrfugas, bem como o consumo de energia para a operao das mesmas, sendo assim
uma operao no processo considerada ambientalmente correta (BAI, ANDERSON e
MOO-YOUNG, 2008; ANDRIETTA, STECKELBERG e ANDRIETTA, 2008; MA et
al., 2009; CHOI et al., 2010). Floculao de levedura apresenta tambm outras
20
vantagens, como a utilizao de reatores de alta densidade celular, o que conduz

produtividade elevada e tempos mais curtos de fermentao e tambm o uso de
diferentes configuraes de reatores (DOMINGUES et al., 2000; SOARES, 2010).
Leveduras floculantes tm sido tradicionalmente utilizadas pelas indstrias cervejeiras e
de vinho, sendo esse processo bem conhecido e desenvolvido. Porm a sua aplicao
em outras indstrias biotecnolgicas como em processos de fermentao alcolica ainda
necessita de novos avanos (TEIXEIRA et al., 1995, MA et al., 2009).
A levedura floculante pode ser definida como no sexuada, homotpica
(envolvendo apenas um tipo de clula nas interaes) e reversvel (os flocos podem ser
reversveis, por dispersarem pela ao do EDTA ou acares especficos, como a
manose e ser recuperada pela presena de ons Ca2+). Miki et al., (1982) apresentaram
dados que originariam um novo modelo de floculao. O modelo de Miki considerava
que a floculao era mediada por um mecanismo especfico de reconhecimento celular,
envolvendo a ligao entre protenas da superfcie tipo lectina com polissacardeos, em
clulas adjacentes. Este modelo colaborava com a estereoespecificidade dos ons Ca2+
assim como o envolvimento de acares na floculao, no explicada pela teoria de
pontes de Ca2+. Os ons Ca2+ manteriam as lectinas numa forma conformacional ativa.
De acordo com a hiptese da lectina, a floculao seria mediada pela interao de dois
componentes distintos da mesma superfcie celular. O processo multivalente de
agregao de clulas de levedura em massas multicelulares (composto por milhares ou
mesmo milhes de clulas) chamado de flocos, com a subsequente sedimentao a
partir do meio em que eles esto suspensos (STRATFORD, 1992; MA et al., 2008;
STEWART, 2009). As clulas com a capacidade de formar flocos so chamadas de
floculantes, enquanto que as clulas que no formam flocos esto geralmente na forma
livre. A floculao pode ser vista como um processo de baixo custo para a realizao da
fermentao, o qual no requer gastos de energia com centrfugas. Como um processo
de auto-imobilizao, leveduras floculantes podem ser utilizados em reatores de alta
densidade celular, que aumentam a eficincia do processo (BAI, ANDERSON e MOOYOUNG, 2008).
Um grande interesse tem atrado pesquisadores no estudo de clulas
imobilizadas e floculantes devido a atraentes vantagens tcnicas e econmicas em
comparao com o sistema de clula convencional livre (SIPSAS et al., 2009). A
tecnologia das leveduras floculantes de auto-imobilizao parece ser superior s
tecnologias de imobilizao de clulas de levedura utilizando suportes. Os principais
21
problemas com a imobilizao artificial so os requisitos para a operao da unidade,

pois necessita da operao de imobilizao das partculas com os micro-organismos,
com isso acarretando em custos adicionais no processo. Vrios suportes tem sido
utilizados para imobilizao de clulas na fermentao alcolica, como o alginato de
clcio, material celulsico, casca de laranja, bagao de cana e entre outros suportes
(LIU, WANG e OU-YANG, 2009). Estas clulas imobilizadas tem um curto tempo de
meia-vida, pois quando as clulas esto aprisionadas podem perder atividade ou morrer
(BAPTISTA et. al., 2006). Outro ponto que se deve levar em considerao o
crescimento do micro-organismo que afetado por fatores como as restries fsicas, o
esgotamento de nutrientes e acumulao de metablitos txicos por causa da limitao
da transferncia de massa (BAI, ANDERSON e MOO-YOUNG, 2008). A tecnologia de
levedura floculante no utiliza nenhum tipo de suporte, o que torna o processo mais
simples e economicamente competitivo em comparao com a imobilizao de clulas
de levedura, uma vez que o suporte est associado ao maior custo ao final do processo,
como tambm diminui a possibilidade da contaminao da levedura pelo suporte. O
crescimento de clulas de levedura no substancialmente afetado, garantindo que a
fermentao seja realizada de forma eficaz (BAI, ANDERSON e MOO-YOUNG,
2008).
A parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae constituda por uma
camada interior, composta principalmente por -glucano e quitina, e por uma camada
fibrilar externa constituda predominantemente de -manana (altamente glicosilada)
associado a protenas (manoprotenas) (VERSTREPEN e KLIS, 2006). Eddy e Phil
(1958) referiram necessidade de controlar de forma precisa alguns aspectos ambientais
que influenciam a floculao, pois de outra forma, podem conduzir a uma falsa
impresso de variabilidade, muitas vezes associada floculao. Estes aspectos
ambientais incluem a composio qumica do meio de cultura, nomeadamente o
contedo em acar e sal, pH, temperatura, aerao e agitao. A floculao um
fenmeno complexo influenciado por uma multiplicidade de fatores.
Outro ponto importante na floculao o estudo gentico das clulas
floculantes. Ao permitir um aumento na concentrao de biomassa no biorreator a
capacidade de floculao de leveduras pode ser um fator importante para o desempenho
global do processo. A concentrao de clulas em suspenso fundamental em
linhagens floculantes de Saccharomyces cerevisiae com uma tima taxa de agregao
em concentraes superiores a 108 clulas/mL (ESSER e KES, 1983). Existe a
22
necessidade de pelo menos 30% de leveduras floculantes no meio para que essas
induzam as leveduras no floculantes a flocular.
A levedura floculante est sob controle gentico e descrito como uma
interao da parede celular. O modelo proposto por Miki et al. (1982) sobre a teoria da
lectina (lectin-like) o modelo geralmente aceito por pesquisadores, como est
representado na Figura 2.2.
Figura 2.2 - Mecanismo da teoria da lectina na floculao da levedura Saccharomyces

cerevisiae: (a) ons de clcio permitem que as lectinas alcancem sua conformao ativa
e (b) as lectinas ativam a floculao (SOARES, 2010)

Neste modelo, um componente especfico da parede celular da estirpe
floculante, do tipo lectina, ir reconhecer e aderir aos carboidratos das mananas sobre
uma clula adjacente, com ons Ca2+ que atuam como co-fatores de ativao da
capacidade de ligao. As protenas responsveis pela adeso de clula-clula ou de
clulas a superfcies abiticas so chamados "adesinas" ou "floculinas", so protenas da
parede celular com diferentes composies de glicoproteinas (ZHAO E BAI, 2009).
Uma das primeiras propostas sugeridas pelos pesquisadores para explicar a
floculao foi a teoria coloidal (SPEERS et al., 1992). Segundo esta teoria, a floculao
ocorreria devido a uma neutralizao da carga da superfcie celular no contemplando a
23
especificidade do on clcio. No grupo FLO1 estaria envolvida uma lectina especfica

para a manose e no grupo NewFlo a lectina envolvida seria especfica no s para a
manose mas tambm para a glicose. Teunissen e Steensma (1995) propuseram que as
floculinas podem funcionar como lectinas ou pelo menos tm as propriedades de ligao
a acares associadas s lectinas. Colaborando com este modelo Kobayashi et al. (1998)
verificaram que a modificao de duas regies da protena FLO1 era suficiente para
alterar o padro de reconhecimento especfico da manose (FLO1) para o padro
especfico da manose e glicose (NewFlo) (DOMINGUES, 2001).
O fenmeno de co-floculao, entre duas estirpes de S. cerevisiae parece
resultar da interao entre uma protena de superfcie com um carboidrato presente na
superfcie celular das clulas da outra estirpe (NISHIHARA, KIO e IMAMURA, 2000).
A co-floculao definida como sendo o fenmeno de floculao observado quando
duas estirpes no floculantes so misturadas.
2.6.1 Fatores que influenciam a floculao
2.6.1.1 Fatores genticos
Na dcada de 70 foram identificados alguns genes cromossomais responsveis
pela floculao, o que originou novas pesquisas, mas estudos posteriores revelaram a
floculao como um complexo mecanismo molecular (DOMINGUES, 2001). Convm
salientar que sendo a hidrofobicidade uma funo da composio da parede celular e do
seu contedo protico, a influncia da hidrofobicidade na floculao no elimina a
existncia de um mecanismo tipo lectina.
Os fatores genticos esto associados a diferentes fentipos. A inibio
reversvel da floculao pode ser por acares, sais, baixo valor de pH e sensibilidade a
proteases. Os dois principais fentipos de floculao so FLO1 e NewFlo, como j
citado. O fentipo FLO1 pode ser inibido por manose e seus derivados, e apresenta uma
tolerncia ao pH ampliada entre 1,5 e 10. O grupo NewFlo, que encontrado na maioria
das vezes em leveduras de cervejarias, pode ser inibido por acares como a manose,
maltose, glicose e sacarose, mas no por galactose, e so mais sensveis inibio por
ctions, valores baixos de pH, e para a digesto por tripsina ou proteinase K. Estes
fentipos tambm exibem sensibilidade para diferentes condies de cultura, tais como
temperatura, alm do pH que j foi citado e disponibilidade de nutrientes. O mecanismo
24
exato de agregao das estirpes pertencentes a estes dois fentipos est longe de ser
compreendido (DOMINGUES, 2001; SOARES, 2010). A floculao em S. cerevisiae
controlada geneticamente, e vrios genes foram relatados como sendo dominantes e
responsveis por este fenmeno. Entre eles esto: FLO1, FLO5, FLO9 e FLO10
(MISSAWA, 2009). Outros genes FLO foram relatados sendo alelos de FLO1 como
FLO2 e FLO4. Produtos de genes FLO5, FLO9 e FLO10 so altamente homlogas de
FLO1 (SOARES, 2010). Tornou-se claro, tambm, que as interaes hidrofbicas
desempenham um papel crucial em fenmenos de adeso microbiana. Estudos indicam
(utilizando as estirpes de Saccharomyces) que um aumento na floculao est
fortemente correlacionado com um aumento da hidrofobicidade da superfcie celular
(TEIXEIRA et al., 1995; STRATFORD, 1989). Alguns pesquisadores descreveram um
aumento da hidrofobicidade quando FLO1, FLO5, FLO9, FLO10 e FLO11 esto
presentes na parede celular de levedura (MULDERS et al., 2009; SOARES 2010).
2.6.1.2 Fatores fisiolgicos
Foi descoberto em um estudo morfolgico que o envelhecimento e a
rugosidade da parede celular podem aumentar o potencial da rea de superfcie de
contato em comparao com as clulas lisas e mais jovens. Tambm relatado que as
clulas-filhas novas tm menor capacidade de floculao que clulas-me. No entanto, o
aumento de floculao para o final da fermentao dificilmente pode ser explicado
somente pelo aumento de clulas me (JIN e SPERRS, 1999).
2.6.1.3 Influncia da concentrao de clcio e sais do meio
A floculao muito influenciada pelo contedo salino do meio. geralmente
aceito o efeito positivo dos ons Ca2+ na floculao. De forma geral, pode-se afirmar que
para baixas concentraes de ctions ocorre um melhoramento da capacidade de
floculao, enquanto que, para concentraes elevadas, a inibio da floculao
observada. Outros ons indutores de floculao como Rb+, Cs+, Fe2+, Co2+, Cu2+, Ni2+,
Zn2+, Cd2+, Al3+ e, principalmente, Mg2+ e Mn2+ tambm foram descritos por alguns
autores. J os ctions de Ba2+, Sr2+ e Pb2+ inibem competitivamente a floculao das
leveduras pela semelhana da sua relao inica com Ca2+ (GOUVEIA E SOARES,
2004). Em baixas concentraes, Na+ e K+ induzem a floculao, devido reduo das
25
foras eletrostticas de repulso entre as leveduras e/ou estimulam a fuga intracelular de

Ca2+ (NISHIHARA, TORAYA e FUKUI, 1982; STRATFORD, 1989). Ctions tm um
papel importante na floculao da leveduras S. cerevisiae. Entre eles, o Ca2+ o mais
reconhecido em sua eficcia na promoo da floculao (MIKI et al., 1982).
No entanto, tem sido relatado que o magnsio pode induzir a floculao
indiretamente por libertao e estimulao de ons de clcio intracelulares
(STRATFORD, 1989). H tambm relatos de floculao causada pela adio de sais de
sdio ou de potssio. No entanto, em concentraes altas de sdio ou de potssio, a
floculao inibida competitivamente (JIN e SPERRS, 1999).
2.6.1.4 Acar
Os acares podem afetar a floculao de levedura agindo em interaes
clula-clula, ao nvel da superfcie e sobre a regulao dos genes FLO. Os acares
fermentveis induzem a perda de floculao, na fase inicial de crescimento, sendo
provvel que afete os genes FLO (SOARES e DUARTE 2002; SOARES e VROMAN
2003). Diferentes acares afetam a floculao de forma diversa. KIHN, MASY e
MESTDAGH (1988) verificaram que enquanto a floculao de uma estirpe de levedura
cervejeira mostrava inibio por manose, outras duas eram inibidas por manose, maltose
e glicose, no se observando inibio na floculao de uma determinada cepa de S.
cerevisiae por nenhum destes acares (DOMINGUES, 2001). As clulas sob represso
catablica, quando transferidas para um meio com uma concentrao mais baixa de
acares tm mostrado um rpido desencadeamento de floculao; este fato sugere uma
ligao entre a limitao de acar e a induo de floculao (VERSTREPEN e KLIS
2006). A Figura 2.3 representa a multiplicidade dos fatores que afetam a floculao da
levedura Saccharomyces cerevisiae.
26
Figura 2.3- Representao esquemtica da multiplicidade de fatores que afetam a

floculao da levedura Saccharomyces cerevisiae (SOARES, 2010)
2.6.1.5 Influncia do etanol
O etanol parece ter um efeito positivo frente floculao. Uma das
possibilidades que pode ser observada que a adsoro de etanol superfcie da
levedura provoca uma reduo local da constante dieltrica e origina uma diminuio da
repulso eletrosttica da clula-clula. Segundo SOARES (2010), o etanol e glicerol em
concentrao de 4% (v/v) no induzem a perda de floculao das clulas ou
crescimento. Estes resultados indicam que a perda de floculao um processo que
exige energia e influenciado pelo metabolismo da fonte de carbono. A presena de
uma quantidade pequena de etanol e em concentraes baixas de fonte de carbono induz
uma fase de desenvolvimento da floculao em clulas que esto crescendo. A escassez
de nutrientes combinada com a presena de etanol pode induzir ao aparecimento da
floculao (CLARO, RIJSBRACK e SOARES, 2007; SOARES, 2010).
2.6.1.6 Agitao e aerao
A agitao mecnica permite o aumento da energia cintica das clulas para
superar a repulso mtua entre elas (SOARES, 2010). A agitao produz dois efeitos
antagnicos na floculao. Quando a agitao elevada, a taxa de coliso das partculas
27
induz a floculao e por outro lado, as maiores tenses de corte provocam a ruptura dos
flocos. Um aumento da intensidade de agitao tambm provoca uma diminuio no
tamanho dos flocos (STRATFORD e KENNAN, 1988; DOMINGUES, 2001). Agitao
elevada por outro lado pode causar grandes problemas, tais como a formao de
espuma. O uso de antiespumante no pode ser sempre adicionado fermentao, pois o
antiespumante pode ter efeitos inibitrios sobre o crescimento dos micro-organismos
(BAILEY e OLLIS, 1986).
Os propsitos da aerao e agitao em fermentao so, primeiramente,
fornecer oxignio aos micro-organismos, e agitar o caldo de fermentao de forma que
uma suspenso uniforme de micro-organismos esteja dispersa no meio (AIBA,
HUMPHREY e MILLIS, 1973; MALTA, 2006). A formao de CO2 durante a
fermentao produz uma agitao natural entre as clulas em suspenso, que um fator
de floculao. A aerao moderada benfica para a floculao da levedura, j uma
forte aerao ou em condies anaerbicas pode provocar a perda da floculao. Estas
observaes esto em concordncia com o fato das manoprotenas da parede celular
serem expressas de forma diferente em condies aerbias ou anaerbias (MIKI et al.,
1982; SOARES, TEIXEIRA e MOTA, 1991; SOARES, 2010).
2.6.1.7 Temperatura
A temperatura pode atuar em nveis diferentes no processo da floculao de
leveduras. O abaixamento da temperatura na fermentao leva a uma diminuio no
metabolismo da levedura e na produo de CO2, como consequncia, h uma reduo
da turbulncia, o que favorece a sedimentao da levedura. A temperatura tambm pode
afetar a floculao das leveduras, agindo sobre as interaes clula-clula. Um aumento
na temperatura de 50-60 C, durante alguns minutos, promove a disperso reversvel
dos flocos, provavelmente devido desnaturao das lectinas da floculao. A
incubao das estirpes de leveduras em temperaturas adeuqadas para produo de etanol
(32-37 C) conduz a uma reduo ou diminuio da floculao (SOARES, 2010).
Nas usinas de etanol as leveduras desenvolvem-se bem em temperaturas de 30
a 33C ou at em temperaturas superiores. Porm a elevao da temperatura do meio em
fermentao causa queda nos rendimentos e eficincias do processo fermentativo, pois
em altas temperaturas, a toxidez do etanol sobre o fermento intensificada, causando
perda de viabilidade celular (AMORIM, BASSO e ALVES, 1996).
28
2.6.1.8 pH
O pH do meio em processos fermentativos tambm muito importante.
Valores extremos de faixa de pH promovem a disperso reversvel dos flocos.
Provavelmente a alterao de pH altera a ionizao dos aminocidos das lectinas dos
flocos e como consequncia a alterao da sua conformao (JIN, RITCEY e SPEERS,
2001; SOARES, 2010). A adio de 0,35g de H2SO4 por litro de mosto supre as
necessidades de enxofre bem como serve para manter o pH na faixa de 3,5 a 4,5, o que
inibe o desenvolvimento de diversas bactrias (SANTOS, 2008).
Sengundo Jin e Speers (1999) a floculao ocorre mais facilmente ao final da
fermentao em que o valor de pH do mosto geralmente cai de 5,2 para 4,5 a 4,0. A
concentrao de ons de hidrognio foi considerada como um fator importante para
promover a floculao. A baixa carga de superfcie causada pelo aumento da
concentrao de ons de hidrognio pode ter um papel importante para a teoria coloidal
de floculao. de se esperar que a baixa carga de superfcie melhore o contato clulaclula e aumente a taxa de floculao (JIN e SPERRS, 1999). No entanto, o valor de pH
geralmente considerado como um fator secundrio, em condies de fermentao e as
clulas de levedura podem flocular entre a faixa de pH 3 - 8, variando de acordo com as
estirpes (CALLEJA,1987; SMIT et al., 1992, JIN e SPEERS, 1999).
2.7 Floculao por bactrias e contaminao bacteriana
A fermentao industrial no conduzida em condies de completa assepsia,
pois muito difcil de ter uma assepsia total do processo, com isso a contaminao
bacteriana, que causada principalmente por Lactobacillus e Bacillus, est presente no
processo. O mecanismo de floculao por contaminao bacteriana ocorre entre as
bactrias presentes na fermentao alcolica e as leveduras, e est associado ao contato
fsico entre a parede celular dos dois micro-organismos, existindo uma relao tima
entre a quantidade de clulas de bactria e levedura para causar a floculao (YOKOYA
e OLIVA-NETO, 1991).
O fenmeno de induo da floculao de leveduras por clulas de bactria
parece envolver lectinas da paredes celular das bactrias, ou, alternativamente,
polissacardeos de elevada massa molecular que formam pontes entre lectinas de clulas
floculantes (ZARATTINI et al., 1993, DOMINGUES, 2010).
Utilizando
cana-de-acar
29
como
matria-prima
pode-se
observar
contaminantes que so habitantes naturais da prpria planta, do solo, da matria

orgnica em decomposio e micro-organismos associados s pragas e molstias da
planta. Entre as espcies encontradas destacam-se as bactrias gram-negativas do
gnero Pseudomonas, Enterobacter e Klebsiella; as bactrias gram-positivas do gnero
Leuconostoc, Lactobacillus, Bacillus, Micrococcus; bactrias filamentosas do gnero
Streptomyces e Actinomyces e as leveduras e bolores como Torula, Pichia, Peniciliium,
Aspergillus e Cladosporiu (YOKOYA e OLIVA-NETO, 1991; STECKELBERG,
2001). Outros fatores alm da matria-prima levam a ocorrncia dos micro-organismos

contaminantes no meio fermentativo, como as operaes preliminares tanto na limpeza
como no armazenamento realizado antes da fermentao alcolica. Dependendo desses
fatores pode-se ter perda de acares, formao de compostos txicos causadores de
reduo da viabilidade celular, at mesmo ao comprometimento da qualidade do
produto final (STECKELBERG, 2001).
As altas temperaturas de fermentao favorecem a contaminao bacteriana
bem como o aumento do tempo de fermentao e o estresse da levedura. A infeco
bacteriana na fermentao pode causar outros danos ao processo tais como: consumo de
acar, formao de goma, inibio e queda da viabilidade das leveduras devido s
toxinas, cidos orgnicos excretados no meio e, por consequncia, reduo no
rendimento e na produtividade da fermentao (LIMA et al., 2001; SCHULZ, 2010).
Quando se trata de contaminao por bactrias, a contaminao pode ser
facilmente controlada utilizando-se agentes antibacterianos, como antibiticos
(AQUARONE, LIMA e BORZANI, 1983). A ao destes agentes decorre de suas
propriedades bacteriostticas, no qual a penicilina um bom inibidor de contaminaes.
A aplicao econmica, no exigindo modificaes no processo, assim as
fermentaes so mais puras e regulares. Pode-se usar tambm cloranfenicol,
tetraciclina e clorotetraciclina. A escolha do antibitico depende de seu custo no
tratamento (LIMA et al., 2001; CAETANO e MADALENO, 2011).
Os antibiticos Kamoran WP e Penicilina, o primeiro base de monensina,
so os mais utilizados, sendo que a concentrao industrialmente utilizada de Kamoran
WP de 3 ppm. A monensina considerada mais eficiente na ao contra bactrias
Gram-positivas, maiores produtoras de hidrognio, precursor de metano, do que contra
as Gram-negativas (MORAIS et al., 2006).
30
2.8 Desfloculao de leveduras

Acredita-se que o complexo exterior de fosfomananas e protenas seja essencial
para a floculao, j que o tratamento com enzimas como, por exemplo, tripsina e
papana e outras enzimas proteolticas e carboidrases reduzem a agregao (LUDWIG,
1998). Esse processo, tambm observado com leveduras do tipo Candida albicans,
que se aderem aos tecidos humanos, e que tem uma parede celular muito semelhante
de Saccharomyces cerevisiae. Enzimas como glucanases, manosil transferases e
proteases podem atuar no desligamento da levedura do epitlio (KRUPPA et al, 2003).
Tambm a adio de manose em uma suspenso de leveduras promove a completa
desfloculao das clulas (OLIVA-NETO, 1990).
A floculao fortemente inibida por EDTA, podendo ser superada essa
desfloculao por adio de ons de clcio a um nvel residual de 10-8M. Estrncio e
brio como anlogos de clcio, foram relatados como inibidores da floculao por
competio (JIN e SPEERS, 1999).
2.9 Aplicaes das leveduras floculantes em processos biotecnolgicos
A primeira indstria a utilizar a tecnologia de leveduras floculantes foi
cervejeira. Para a indstria cervejeira a levedura floculante tem um papel importante no
processo, pois facilita a remoo das clulas por sedimentao. A floculao apresenta
outras potencialidades, podendo ser utilizada como tcnica de imobilizao de clulas
em sistemas contnuos de elevada densidade celular. Alm da indstria cervejeira, o
estudo da utilizao de leveduras floculantes tem sido aplicada na produo de etanol. A
utilizao de sistemas contnuos de elevada densidade celular permite a obteno de
altas produtividades em etanol. Deve ser levada em considerao para o processo a
concentrao de acar na corrente de alimentao e a capacidade de reteno de
biomassa do reator, fatores estes fundamentais para a obteno de uma elevada
produtividade em etanol. O projeto do reator e o estudo das condies de operao so
determinantes na eficincia de um sistema com clulas floculantes, permitindo modelar
e manter o tamanho, forma e densidade dos flocos. Isto significa que as condies
hidrodinmicas do reator e as propriedades fsicas dos flocos devem ser mantidas
(FREITAS, 1996; CHOI et al., 2010).
31
2.10 Produo de bioetanol a partir de levedura floculante

As leveduras floculantes parecem ser bem adaptadas para a produo de
produtos em grande escala, como combustveis renovveis. Bioetanol, como um
produto considerado de baixo valor, muito sensvel aos custos de produo. As
indstrias de produo de bioetanol utilizam geralmente processos em batelada
alimentada, as clulas de leveduras so geralmente removidas do vinho fermentado por
centrifugao. A utilizao de clulas floculantes, tal como um processo de autoimobilizao, uma alternativa muito promissora, uma vez que reduz os custos
associados com energia para a centrifugao e de manuteno das centrfugas, tornando
o processo mais competitivo (ZHAO e BAI, 2009). A centrifugao considerada um
mtodo relativamente caro, em relao energia gasta por quantidade de microorganismos recuperados (MACHADO et al., 2008). Estima-se que o uso de clulas de
levedura floculantes permite uma economia de 16% dos custos de processamento e de
10% dos custos de instalao. Alm de facilitar o processo de separao do vinho das
clulas, as clulas floculantes podem ser utilizadas em reatores de alta densidade
celular, o que melhora a produtividade de etanol e reduz o tempo de fermentao
(ANDRIETTA, STECKELBERG, ANDRIETTA, 2008).
Algumas unidades industriais no Brasil (Usina Noroeste Paulista) e na China
utilizam a tecnologia de fermentao alcolica utilizando leveduras floculantes, em
processos contnuos e aps o ltimo reator utilizado um decantador que separa o
fermento, que aps o tratamento cido reciclado primeira dorna (BAI, ANDERSON
e MOO-YOUNG, 2008). Esses autores denominam tal tecnologia de fermentao com
alta concentrao celular (Very High Gravity VHG).
2.11 Capacidade fermentativa
Andrietta, Migliari e Andrietta (1999) desenvolveram um sistema de
classificao das cepas de leveduras utilizando alguns parmetros que levam em
considerao as caractersticas cinticas, de rendimento e produtividade das linhagens
(STECKELBERG, 2001; MIGLIARI, 2001).
- Coeficiente de rendimento celular (YX/S) Expressa a massa celular
produzida em relao massa de substrato consumida. Este parmetro determina a
32
quantidade de clulas que podem ser retiradas do processo para secagem ou para
descarte. Excesso de produo celular indica um desvio do acar para a produo de
clulas. Esta produo excedente de clulas pode ser utilizada para a produo de rao
animal, visando assim o reaproveitamento de um subproduto gerado durante a produo
de etanol.
-
Coeficiente
de
rendimento
em
etanol
(YP/S)
coeficiente
rendimento em etanol expressa a massa de etanol produzida em relao massa de

substrato. Este parmetro considerado um dos mais importantes para a indstria, pois
ele determina o rendimento da fermentao alcolica, ou seja, o potencial que a
levedura tem para produzir etanol em determinada condio.
- Produtividade () Este parmetro tambm muito importante na
fermentao alcolica, pois permite determinar a velocidade de transformao do
substrato em etanol. A produtividade expressa em massa de etanol produzida (g) por
volume de meio (L) por unidade de tempo (h). Quanto maior for a produtividade, menor
ser o tempo do processo, mostrando que a levedura escolhida se adequou ao processo.
- Converso de substrato (XS) Este parmetro indica porcentagem de
substrato convertido a produtos e mede a afinidade que o micro-organismo tem com o
substrato, ou seja, a capacidade que o micro-organismo possui de crescer em baixas
concentraes de acares. A unidade expressa em % (g de substrato consumido em
relao ao substrato inicial).
- Velocidade de consumo de substrato (VCS) Este parmetro indica a
velocidade com que o micro-organismo consome o substrato disponvel. Quanto maior
for este parmetro, melhor ser o micro-organismo escolhido para o processo. Por outro
lado, esse parmetro no o mais importante, pois pode estar produzindo subprodutos
ao invs de etanol. Este parmetro indica a velocidade com que a levedura consome o
substrato disponvel e expressa em massa de substrato consumido (g) por volume de
meio (L) e por unidade de tempo (h).
33
2.12 Cintica da fermentao alcolica

Teorias e modelos cinticos so a base para a otimizao de processos, projetos
e execuo da planta. Segundo Andrietta, Migliari e Andrietta (1999), o conhecimento
da cintica essencial para o entendimento da dinmica de populao de leveduras nas
dornas de fermentao. O intuito do estudo da cintica de processos microbianos de
quantificar a taxa de crescimento celular, consumo de substrato, formao de produtos e
demais parmetros relacionados. A partir deste estudo pode-se compreender ainda a
influencia em que fatores como pH, temperatura, agitao, inibidores e entre outros
podem exercer na cintica da fermentao. bem conhecido que o etanol inibitrio
para o crescimento de clulas de levedura e de produo de etanol. Alm disso, o etanol
um metabolito principal, cuja produo est intimamente ligada com o crescimento
das clulas de levedura. Alguns autores pesquisaram a influencia do etanol sobre a
cintica do crescimento celular como Aiba, Shoda e Nagatani (1968) que estudaram o
efeito inibitrio do etanol sobre a levedura e a produo de etanol em concentraes
altas do mesmo. Com base nos estudos destes autores, outros pesquisadores tambm
desencadearam uma srie de estudos e propuseram modelos matemticos que levavam
em considerao a influncia do etanol, como Levenspiel (1980 e 1988) que props uma
equao no linear para levar em considerao a influncia de etanol. Em meados da
dcada de 1980, Luong (1985) salientou que a inibio do crescimento de clulas de
levedura por etanol no-competitivo, semelhante s reaes enzimticas que so nocompetitivas. Assim, definiu um parametro Pmx, que a concentrao mxima de
etanol no qual o crescimento de clulas de levedura e produo de etanol so
completamente inibidos (BAI, ANDERSON e MOO-YOUNG, 2008). Estes autores
citados no levaram em considerao a inibio pelo substrato. A inibio pelo
substrato um fenmeno comum em fermentaes, e ocorre quando a concentrao do
substrato pode exceder um nvel de tenso sobre o micro-organismo. Andrews (1968)
estudou os efeitos de inibio pelo substrato em reatores batelada e contnuo e props o
modelo com inibio pelo substrato (BAI, ANDERSON e MOO-YOUNG, 2008).
O projeto de custo-benefcio do processo de produo de etanol implica na
seleo das matrias-primas adequadas, e na definio da configurao do processo
adequado. Para o estudo da viabilidade do processo muito importante a realizao da
modelagem e simulao do processo (CARDONA e SNCHEZ, 2007). Bailey e Ollis
(1986) classificaram os modelos cinticos em: no-estruturados e no-segregados
34
(clulas tratadas como soluto monocomponente), estruturados e no-segregados

(multicomponente com composio mdia semelhante), no-estruturados e segregados
(seres individuais distintos, multicomponentes) e, estruturados e segregados (indivduos
distintos, multicomponentes). Para o estudo da fermentao alcolica, o modelo noestruturado e no-segregado o mais utilizado para descrever o comportamento das
variveis envolvidas (VIEGAS, 1999; PORTO, 2005).
Os modelos matemticos que descrevem o comportamento de sistemas
microbiolgicos so importantes, uma vez que fornecem uma descrio matemtica do
mecanismo do processo e que so necessrios para a otimizao do mesmo. Em
problemas de engenharia bioqumica, muitas vezes necessrio estimar os parmetros
do modelo de equaes algbricas no-lineares ou diferenciais (VEERAMALLU e
AGRAWAL, 1990; WANG e SHEU, 2000). Os modelos no estruturados de um
biorreator so normalmente descritos por um conjunto de equaes no-lineares
diferenciais. Em contraste, os experimentos mais simples podem ser conseguidos com a
fermentao em batelada. Um modelo cintico estabelecido a partir de observaes de
experimentos em batelada , em geral, aplicado para avaliar a concentrao de perfis de
concentrao celular, substrato e de produto para os processos de fermentao em
batelada alimentada. Tal modelo cintico no pode ser perfeitamente aplicado e prever
os perfis de concentrao para um processo de fermentao em batelada alimentada.
Um modelo dinmico de processos de fermentao em batelada alimentada inclui o
termo de diluio. Este efeito de diluio na fermentao em batelada alimentada
provoca um efeito diferente nos micro-organismos em comparao ao realizado em
batelada. Por outro lado, o modelo cintico estabelecido a partir de experimentos em
batelada alimentada pode ser inadequado para prever os perfis de concentrao para a
fermentao em batelada (CAZZADOR e LUBENOVA, 1995, WANG e SHEU, 2000).
A equao mais simples e popular para descrever o crescimento microbiano a equao
de Monod, que assume a presena de substrato como limitante para o crescimento. A
cintica de Monod est apresentada na Equao 2.1.
= max .
S
S + KS
(2.1)
Sendo: a taxa de crescimento celular, mx a mxima taxa de crescimento celular, S a

concentrao do substrato limitante e KS a constante de Monod, que representa o valor
35
de S no qual a taxa especfica de crescimento a metade do seu valor mximo. O

modelo cintico de Aiba et al. (1968), o qual considera a inibio pelo produto, dada
pela Equao 2.2.
= mx
S
.e ( K P .P )
Ks + S
(2.2)
Sendo: KS a constante de saturao para o crescimento celular, S a concentrao de

substrato no fermentador, P a concentrao de produto e KP a constante de inibio
pelo produto. Levenspiel (1980) generalizou uma equao matemtica para o
crescimento celular contendo um termo para inibio pelo produto, alm de levar em
considerao o efeito do substrato limitante (Ks), dada pela Equao 2.3.
P S

= mx 1
P
K
+
S
mx
s
(2.3)
Sendo: Pmx a concentrao limite do produto inibidor. Para uma concentrao de P

bem menor que o valor de Pmx, a Equao 2.3 se reduz Equao 2.4, que
equivalente cintica de Monod (LEVENSPIEL, 1980).
= max .
S
S + KS
(2.4)
O modelo cintico mais utilizado na fermentao alcolica o de Ghose e Thyagi

(1979) que so consideradas algumas caractersticas no modelo como o efeito do
substrato limitante (Monod), inibio pelo substrato (exponencial), inibio pelo
produto (linear), conforme Equao 2.5.
= mx
S
P
S + K S + S 2 K I Pmx
(2.5)
36
O modelo de Tosetto e Andrietta (2002), conforme Equao 2.6, semelhante

ao de Ghose e Thyagi (1979), porm o valor do expoente do termo de inibio pelo
produto pode assumir valores diferentes de 1.
S
P
= mx
1
S + K S + S 2 K I Pmx
(2.6)
Sendo: KS a constante de saturao para o crescimento celular, KI a constante de

inibio do crescimento celular pelo substrato, Pmx a concentrao de produto onde
cessa o crescimento do micro-organismo e n a potncia do termo de inibio pelo
produto.
CAPTULO 3
MATERIAL E MTODOS
Neste captulo ser apresentado o material utilizado no desenvolvimento
experimental, bem como a metodologia empregada para cada etapa.
3.1 Material
3.1.1 Micro-organismo e meio de cultura
Inicialmente, avaliou-se seis cepas de leveduras floculantes de Saccharomyces
cerevisiae, sendo cinco delas (C14, C19, C2/95, C2/00 e C4/00) doadas pelo Centro
Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas, Biolgicas e Agrcolas (CPQBA) e uma cepa
doada pelo Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), proveniente da Usina Junqueira. A
cultura das leveduras foi mantida nos estados lquido e slido. Ambas as culturas foram
mantidas em refrigerador, a 7 1C, e eram repicadas semanalmente em meio lquido e
mensalmente em meio slido.
A composio do meio de cultura utilizado nos experimentos consistiu-se de
sacarose (varivel para cada experimento), KH2PO4 (5 g/L), MgSO47H2O (1 g/L),
(NH4)2SO4 (2 g/L) e extrato de levedura (6 g/L), j para o meio slido foi utilizado o
mesmo meio do estado lquido, porm com concentrao de sacarose 100 g/L e
concentrao de gar-gar de 30 g/L (PACHECO, 2010). Todos os reagentes
utilizados foram de grau analtico, com exceo do acar, o qual foi substitudo pela
sacarose comercial.
3.1.2 Procedimento e unidade experimental

Os experimentos foram realizados em um fermentador Bioflo 110 (New
Brunswick Scientific CO., NJ, USA) operado em batelada e batelada alimentada, com
volume til de 5 L, sendo este volume utilizado nas fermentaes. A representao
esquemtica da unidade de trabalho apresentada na Figura 3.1.
Captulo 3 Material e Mtodos
38
Figura 3.1 Representao esquemtica da unidade de trabalho (batelada alimentada)

Este reator dotado de uma manta para aquecimento do meio, de forma a
manter a temperatura constante durante os experimentos a 32 0,5C. O reator Bioflo
110 operando em batelada est apresentado na Figura 3.2.
Figura 3.2 Fermentador Bioflo 110 operando em batelada

Os experimentos no fermentador Bioflo 110 foram realizados sem agitao
mecnica e o pH do meio foi ajustado apenas no incio de cada fermentao em 4,5,
39
pela adio de H2SO4. As concentraes iniciais de sacarose, clulas e etanol variaram

para cada experimento e o volume do inculo correspondeu a 1,5 L do reator (30% do
volume total). Quando o reator foi operado em batelada alimentada, ao iniciar-se a
alimentao do reator, 3,5 L de meio de cultura eram alimentados, com tempos de
enchimento e concentrao do substrato na alimentao (SF) conforme experimentos
propostos.
3.2 Mtodos
3.2.1 Mtodos analticos
3.2.1.1 Determinao da concentrao celular
A concentrao de biomassa foi determinada por massa seca. Uma amostra de
15 mL era retirada do reator e o sedimento celular era lavado trs vezes com gua
destilada em um filtro a vcuo e a seguir era transferido para a estufa a 85 5 C, at
massa constante. O valor da massa seca foi obtido pela diferena a massa do sedimento
e a do papel de filtro (STECKELBERG, 2001).
3.2.1.2 Desfloculao
Para realizar a desfloculao da biomassa, a amostra era retirada do reator e
diluda com soluo desfloculante de tampo citrato 10-1 M a pH 3 com concentrao de
5 mM de EDTA. A amostra era retirada do reator e diluda com esta soluo por 30
minutos (MATSUMOTO et al., 2002).
3.2.1.3 Contagem do nmero inicial de clulas

Aps a desfloculao das clulas, conforme item 3.2.1.2, foi realizada a
contagem do nmero de clulas pela tcnica de colorao de azul de metileno (JONES,
1987). Este corante apresenta colorao azul na forma oxidada, tornando-se incolor na
forma reduzida. Neste mtodo as clulas viveis permanecem no coradas enquanto que
as no viveis coram de azul. O nmero de clulas viveis foi determinado empregando
cmara de Neubauer.
40
3.2.1.4 Contaminao bacteriana

As contagens bacteriolgicas foram realizadas no incio e ao final dos
experimentos. A semeadura em placas para contagem das unidades formadoras de
colnia por mL (UFC.mL-1) foi realizada pela tcnica de plaqueamento em superfcie,
conforme Figura 3.3 (TORTORA, FUNKE e CASE, 2000), utilizando o meio de Agar
para contagem (composio de acordo Anexo A1). A Nistatina, na concentrao de 20
ppm foi adicionada com o intuito de inibir o crescimento de leveduras e assim
possibilitar uma melhor contagem bacteriana. O procedimento constituiu-se na
inoculao de uma alquota de 0,1mL de cada diluio das amostras sobre a superfcie
de placas de Petri, previamente preparadas contendo gar. O inculo foi espalhado sobre
a superfcie do gar, com auxlio de uma ala de Drigalski, at sua completa absoro.
As placas foram incubadas em posio invertida a 35 0,5C, durante 48h. Foram
realizados cultivos em duplicata nas diluies 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7 em todos os
experimentos.
Figura 3.3 - Mtodo de plaqueamento em superfcie

Em todos os experimentos, a contaminao foi controlada pelo antibitico
comercial Kamoran, na concentrao de 3 ppm (quantidade recomendada pelo
fabricante), garantindo uma quantidade de bactrias inferior a 1.105 UFC/mL.
41
3.2.1.5 Determinao de acar e etanol

O etanol e dos acares totais foram quantificados pelo mtodo de
cromatografia de alta eficincia (HPLC - Cromatografia Lquida de alta eficincia).
Essa tcnica cromatogrfica utilizada para separar uma mistura de compostos em
analises qumica e bioqumica com a finalidade de identificar, quantificar ou purificar
os componentes individuais da mistura. A amostra foi diluda, filtrada e injetada no
sistema cromatogrfico de marca Shimadzu modelo LC-20A Proninence, coluna
SUPELCOGEL Ca, na qual os componentes so separados e detectados por refrao de
luz. A soluo de arraste utilizada foi gua deionizada, com fluxo de bomba de 0,5
mL/min, temperatura do forno de 80C e volume de injeo de 20 microlitros. Os
valores obtidos nos cromatogramas foram calculados com o auxlio de curvas padro
(conforme Apndices A1, A2, A3 e A4).
3.2.1.6 Pr-fermentao
Em alguns experimentos foi realizada uma pr-fermentao do inculo, com o
intuito de observar o comportamento da fermentao em relao inibio que a
levedura pode sofrer durante o processo fermentativo, e tambm simular as condies
utilizadas nas usinas de produo de etanol, em que toda a clula retorna ao processo
com certa quantidade de lcool inicial, principalmente quando se utiliza centrfugas para
separar a levedura. Essa pr-fermentao foi realizada com o mesmo meio do item
3.1.1, porm com concentrao de sacarose de 100 g/L.
3.2.2 Metodologia experimental

3.2.2.1 Seleo da levedura
Realizou-se o estudo da capacidade fermentativa, conforme proposto por
Andrietta, Migliari e Andrietta (1999), das seis cepas floculantes de Saccharomyces
cerevisiae (C14, C19, C2/95, C2/00, C4/00 e CTC). A composio do meio para cultivo
das leveduras consistiu-se de sacarose (180 g/L), KH2PO4 (5 g/L), MgSO47H2O (1
g/L), (NH4)2SO4 (2 g/L) e extrato de levedura (6 g/L). Os experimentos foram
realizados em triplicata para cada cepa em frascos de erlenmeyer com volume til de
42
250 mL, sendo 100 mL de cultivo estril. As culturas crescidas nesse meio foram
inoculadas nos erlenmeyers em volume correspondente a 10% de maneira que a
concentrao inicial de clulas foi de aproximadamente 1.108 clulas/mL. Os frascos
foram incubados durante 24 horas em shaker temperatura ambiente e agitao de 150
rpm. Aps o tempo de incubao foram analisados o teor de sacarose, etanol e massa
celular. Os clculos utilizados para se obter os parmetros necessrios para a
classificao das cepas foram:
- Coeficiente de rendimento celular (YX/S), conforme Equao 3.1:
Yx / s =
MX
MS
(3.1)
sendo,
Yx / s
= Coeficiente de rendimento celular (gclulas/gsubstrato);
M x = Massa celular produzida (g);
M S =Massa de sacarose consumida (g).

- Coeficiente de rendimento em etanol (YP/S), conforme Equao 3.2:
Yp / s =
ME
MS
(3.2)
sendo,
Yp / s
= Coeficiente de rendimento em etanol (getanol/gsubstrato);
M E = Massa de etanol produzida (g);

M S = Massa de sacarose consumida (g).
- Produtividade (), conforme Equao 3.3:
ME
Vm .T f
(3.3)
43
sendo,
= Produtividade (g/L.h);
M E = Massa de etanol produzida (g);
Vm
= Volume do meio (L);
Tf
= Tempo de fermentao (h).
- Converso de Substrato (XS), conforme Equao 3.4:
XS =
MSi MS f
MSi
.100
(3.4)
sendo,
X S = Converso de substrato (%);
MS i = Massa de sacarose inicial (g);
MS f = Massa de sacarose final (g).
- Velocidade de consumo de substrato (VCS), conforme Equao 3.5:
VCS =
MS
Vm .T f
(3.5)
sendo,
VCS = Velocidade de consumo de sacarose (g/L.h);

M S = Massa de sacarose consumida (g);
Vm
= Volume de meio (L);
Tf
= Tempo de fermentao (h).
3.2.2.2 Caractersticas fenotpicas

Por meio da capacidade fermentativa verificou-se a cepa que apresentou os
melhores parmetros cinticos e melhores caractersticas de floculao em meio, e foi
44
escolhida para todos os estudos subsequentes. O meio WLN (conforme Anexo A2) foi
utilizado para anlise da caracterstica fenotpica desta levedura.
3.2.2.3 Concentrao celular no inculo

Foram realizados testes no reator Bioflo 110, em triplicata, variando a
concentrao celular da levedura C2/00 em meio fermentativo, com a finalidade de
relacionar a concentrao de massa seca no reator (g/L) e massa mida (v/v) e tambm
realizar a contagem inicial de clulas (clulas/mL). A faixa de concentrao celular no
inculo estudada foi de 10,6 44,4% (v/v).
3.2.2.4 Influncia da concentrao inicial de substrato, concentrao

celular e do tempo de enchimento do reator operado em batelada alimentada
Uma anlise pontual de uma varivel no deve ser aplicada para processos
fermentativos complexos, pois uma srie de fatores interligados determina o
comportamento do sistema. Este fato justifica a anlise conjunta das variveis
propostas. Com isso, foi proposto um Planejamento Composto Central (PCC), com trs
variveis e trs repeties no ponto central, totalizando 17 experimentos. O alfa de
ortogonalidade utilizado neste planejamento experimental foi de 1,35313.
O objetivo deste PCC foi de analisar a influncia conjunta da concentrao
inicial de substrato, concentrao celular do inculo e tempo de enchimento do reator
batelada alimentada na fermentao alcolica. Os experimentos foram realizados em
triplicata, as amostras foram retiradas em intervalos de tempo de 1,5 h e foi realizada
tambm uma pr-fermentao, conforme item 3.2.1.6. Neste planejamento experimental
a concentrao celular do inculo variou de 10,6 - 44,4% (v/v), correspondendo
respectivamente a 3,18 13,32 % (v/v) no reator. As faixas de concentrao celular e de
substrato foram definidas com base em dados industriais e da literatura. Amorim (2005)
e Finguerut (2006) observaram que a faixa tima de concentrao celular no reator
situa-se de 10 a 13% (v/v) do reator. A faixa escolhida para concentrao de sacarose
variou em torno da mdia industrial, que de 145 a 190 g/L de sacarose (153 a 200 g/L
de acares redutores totais, ART). A faixa de tempo de enchimento do reator foi
definida com base em dados industriais, o qual variou de 2 6 horas. A alimentao foi
realizada por meio de uma bomba peristltica (Masterflex, modelo n 7553-76). Na
45
Tabela 3.1 esto apresentados os valores atribudos s trs variveis independentes no

planejamento experimental, sendo a varivel X1 a concentrao de sacarose (g/L), X2 a
concentrao celular no inculo % (v/v) e X3 o tempo de enchimento do reator (h). Os
nveis das variveis estudadas foram adimensionalizados pela Equao 3.6.
Xn =
(X X 0 )
X +1 X 1
(3.6)
Sendo,
Xn
= valor codificado da varivel (n = 1,2...);
X = valor da varivel a ser calculada;
X0
= valor da varivel no ponto central;
X +1 = valor da varivel no nvel superior;

X 1 = valor da varivel no nvel inferior.
As equaes de codificao da concentrao de sacarose (X1), concentrao
celular no inculo (X2) e tempo de enchimento (X3) esto apresentadas pelas Equaes
3.7, 3.8 e 3.9, respectivamente.
X1 =
X2 =
X3 =
( X 167,5)
22,5
( X 27,5)
12,5
( X 4)
2
(3.7)
(3.8)
(3.9)
46
Tabela 3.1 Matriz do Planejamento Composto Central do efeito da concentrao de

sacarose, concentrao celular no inculo e tempo de enchimento do reator
Valor Real (Valor Codificado)

X1
X2
X3
Concentrao de
Concentrao celular
Tempo de
sacarose (g/L)
no inculo % (v/v)
enchimento (h)
145 (-1)
15 (-1)
2 (-1)
145 (-1)
15 (-1)
6 (1)
145 (-1)
40 (1)
2 (-1)
145 (-1)
40 (1)
6 (1)
190 (1)
15 (-1)
2 (-1)
190 (1)
15 (-1)
6 (1)
190 (1)
40 (1)
2 (-1)
190 (1)
40 (1)
6 (1)
137,05 (-)
27,5 (0)
4 (0)
10
197,95 ()
27,5 (0)
4 (0)
11
167,5 (0)
10,6 (-)
4 (0)
12
167,5 (0)
44,4 ()
4 (0)
13
167,5 (0)
27,5 (0)
1,3 (-)
14
167,5 (0)
27,5 (0)
6,7 ()
15
167,5 (0)
27,5 (0)
4 (0)
16
167,5 (0)
27,5 (0)
4 (0)
17
167,5 (0)
27,5 (0)
4 (0)
Experimentos
As respostas obtidas e analisadas nesse planejamento experimental foram

rendimento em etanol, produtividade e acar residual. O rendimento foi calculado em
relao ao etanol produzido pela sacarose consumida, ao final de 10,5 horas de
fermentao, pela Equao 3.10.
YP / Sac =
Ce tan ol10,5 Ce tan ol0
1, 053. CSac0 CSac10,5
(3.10)
47
Para expressar o rendimento da produo de etanol em porcentagem, utilizouse a Equao 3.11, que considera o rendimento terico de 0,511 getanol/gART como
100%.
Re nd (%) =
YP / Sac. 100%
0,511
(3.11)
Sendo,
YP / Sac = rendimento de etanol formado em relao a sacarose consumida (getanoL/gsacarose);
CE tan ol 0 = concentrao de etanol inicial (g/L);
CE tan ol10,5 = concentrao de etanol (g/L) ao final de 10,5 horas de fermentao;

CSac 0 = concentrao de sacarose inicial (g/L);
CSac10,5 = concentrao de sacarose (g/L ) ao final de 10,5 horas de fermentao;
1,053 = fator de correo, em que 1 g de sacarose equivalente a 1,053 g de ART.
A produtividade foi calculada em relao ao etanol produzido pelo tempo de
fermentao definido em 10,5 horas, pela Equao 3.12.
Ce tan ol10,5 Ce tan ol0

t
(3.12)
Sendo,
= produtividade em etanol (g/ L.h);
t = tempo de fermentao de 10,5 horas.

O acar residual foi calculado em concentrao final de sacarose (g/L) aps
10,5 horas. A escolha do tempo de 10,5 h foi devido aos resultados obtidos no PCC.
Aps a realizao do planejamento experimental foi realizada uma anlise da regio
tima de trabalho pelas superfcies de respostas e efetuou-se a validao do ponto
escolhido nessa regio com o objetivo de testar a reprodutibilidade dos modelos obtidos.
48
3.2.2.5 Estudo da recirculao de clulas e concentrao inicial de etanol

na fermentao alcolica
Aps a realizao do Planejamento Composto Central, escolheu-se a melhor
regio em que se obteve os resultados selecionados de rendimento em etanol e
produtividade pelas variveis estudadas (concentrao de sacarose em g/L, concentrao
celular em % (v/v) e tempo de enchimento do reator em h). A partir dos resultados
definiu-se o ponto otimizado para as variveis em 170 g/L de concentrao de sacarose
(pesou-se 850g de sacarose e dissolveu-se em 3,5 L formando a soluo de alimentao
(SF) com 242,86 g/L de sacarose, a ser alimentada ao inculo de volume 1,5 L),
concentrao celular do inculo de 40 % (v/v) e tempo de enchimento de 6 horas. O
processo apresentou um bom rendimento e produtividade, porm o acar residual aps
10,5 horas de fermentao mostrou-se alto. A partir destes resultados realizaram-se
alguns experimentos, em duplicata, com o intuito de diminuir o acar residual ao final
da fermentao alcolica, mantendo o rendimento e a produtividade prximos aos
encontrados. A fim de melhorar o desempenho do processo e aumentar a mistura no
reator, foi utilizada uma recirculao externa das clulas, o qual era retirado o meio
fermentativo do fundo do reator por uma bomba peristltica (Masterflex, modelo n
7553-76) e alimentado pela tampa do reator, durante a fermentao, com vazo de 10
mL/s. Os experimentos realizados esto descritos a seguir com suas respectivas
condies de processo. Todos os experimentos foram realizados na temperatura de 32
0,5C e o pH ajustado apenas no incio da fermentao em 4,5. Os Experimentos A e B
foram realizados com o objetivo de analisar o efeito da recirculao de meio
fermentativo na produtividade e no tempo de fermentao.
Experimento A: Este experimento foi realizado com a pr-fermentao,

conforme item 3.2.1.6., nas condies do ponto timo do PCC. Neste experimento foi
iniciado a recirculao do meio fermentativo aps as 6 horas de enchimento, com vazo
de 10 mL/s. O meio foi preparado pesando-se os nutrientes e a sacarose para 5 L, porm
dissolvidos em 3,5 L. As condies do experimento foram:
- Concentrao de etanol no inculo (E0)= 62,41 g/L (cerca de 18,72 g/L de etanol
inicial, considerando uma batelada);
- Concentrao de sacarose no inculo (S0)= 0 g/L;
- Concentrao celular no inculo (X0)= 40%;
49
- Concentrao de sacarose no reator, considerando uma batelada (S)= 170 g/L;

- Concentrao de sacarose na alimentao (SF)= 242,86 g/L;
- Tempo de enchimento (t)= 6 h;
- Vazo de alimentao do substrato (F)= 0,583 L/h.
Experimento B: O experimento B foi realizado nas mesmas condies do

experimento A, porm a recirculao foi realizada durante todo o processo de
fermentao alcolica, com vazo de 10 mL/s. As condies do experimento foram:
- Concentrao de etanol no inculo (E0)= 63,68 g/L (cerca de 19,1 g/L de etanol
inicial, considerando uma batelada);
Os experimentos C, D e E foram realizados com o objetivo de analisar a
influncia da presena de etanol no inculo, sendo que o mesmo pode atuar como
inibidor do crescimento da levedura na fermentao alcolica. Outro ponto estudado
nestes experimentos foi a concentrao de sacarose inicial no inculo, sendo analisado
as respostas rendimento em etanol, produtividade e sacarose residual.
Experimento C: Para o experimento C foi realizado o mesmo procedimento

do experimento A, porm antes de iniciar o enchimento do reator era retirado o
sobrenadante (o qual continha lcool proveniente da pr-fermentao) e a massa celular
que estava decantada no fundo do reator era mantida. Aps a retirada do sobrenadante
as clulas eram lavadas com gua destilada para retirada do etanol residual e adicionado
meio com substrato at completar o volume de 1,5 L do reator, formando assim o
inculo. O meio para este experimento foi preparado pesando-se os nutrientes e a
sacarose para 5 L, porm dissolvidos em 4,4 L. O reator contendo as clulas foi
preenchido com 0,9 L deste meio at completar 1,5 L do reator e aps iniciou-se o
processo fermentativo. A recirculao foi realizada durante todo o processo de
- Concentrao de etanol no inculo (E0)= 0 g/L;
50
- Concentrao de sacarose no inculo (S0)= 115,91 g/L;

Experimento D: O experimento D seguiu o mesmo procedimento do

experimento C, porm o processo fermentativo comeou apenas com as clulas
decantadas no fundo do reator. O meio preparado de 4,4 L foi adicionado durante o
tempo de enchimento de 6 h e a recirculao iniciou-se aps o reator atingir 1,5 L de
volume, com vazo de 10 mL/s.
Os experimentos E, F e G foram realizados com o objetivo de analisar a
influncia do aumento da concentrao celular no inculo para melhoramento da
produtividade e diminuio do tempo de fermentao. Com o aumento da concentrao
celular do inculo foi estudado no Experimento F a diminuio do tempo de enchimento
do reator operando em batelada alimentada com o intuito de aumentar a produtividade.
Para o experimento G o objetivo foi analisar o rendimento, aumentando a varivel
concentrao de sacarose inicial.
Experimento E: O experimento E foi realizado utilizando os mesmos

procedimentos do experimento C, porm quando o sobrenadante foi retirado do inculo
no foi adicionado meio com substrato, mas sim gua destilada. O meio utilizado para
enchimento do reator foi preparado pesando-se os nutrientes e a sacarose para 5 L,
porm dissolvidos em 3,5 L. A recirculao foi realizada durante todo o processo de
51

Experimento F: O experimento F foi baseado no experimento C, porm a

concentrao celular utilizada no inculo foi maior. O meio para este experimento foi
preparado pesando-se os nutrientes e a sacarose para 5 L, porm dissolvidos em 4,25 L.
O reator contendo as clulas foi preenchido com 0,75 L deste meio at completar 1,5 L
do reator e aps iniciou-se o processo fermentativo. A recirculao foi realizada durante
todo o processo de fermentao alcolica, com vazo de 10 mL/s. As condies do
experimento foram:
- Concentrao de sacarose na alimentao (SF)= 200 g/L;
- Vazo de alimentao do substrato (F)= 0,583 L/h .
Experimento G: O experimento G seguiu o mesmo procedimento do

experimento F, utilizando a mesma concentrao celular, entretanto foi utilizado um
tempo de enchimento menor. O meio para este experimento foi preparado pesando-se os
nutrientes e a sacarose para 5 L, porm dissolvidos em 4,25 L. O reator contendo as
clulas foi preenchido com 0,75 L deste meio at completar 1,5 L do reator e aps
iniciou-se o processo fermentativo. A recirculao foi realizado durante todo o processo
de fermentao alcolica, com vazo de 10 mL/s. As condies do experimento foram:
- Concentrao de sacarose na alimentao (SF)= 200 g/L;
52

- Vazo de alimentao do substrato (F)=0,875 L/h.
Experimento H: O experimento H foi realizado nas condies do experimento

F. A diferena deste experimento foi a utilizao de uma concentrao maior de
substrato. O meio para este experimento foi preparado pesando-se os nutrientes e a
sacarose para 5 L, porm dissolvidos em 4,25 L. O reator contendo as clulas foi
preenchido com 0,75 L deste meio at completar 1,5 L e aps iniciou-se o processo
fermentativo. A recirculao foi realizado durante todo o processo de fermentao
alcolica, com vazo de 10 mL/s. As condies do experimento foram:
- Concentrao de sacarose no inculo (S0)= 129,41 g/L;
- Vazo de alimentao do substrato (F)=0,583 L/h.
3.2.2.6 Cintica da fermentao alcolica e modelagem matemtica

O reator operado em batelada alimentada muito utilizado em processos
fermentativos, pois permite a manuteno de baixos nveis de substrato por longos
perodos de tempo, que favorvel a estimao de parmetros cinticos, tambm
permite manter a concentrao celular constante e controlar velocidades de crescimento
em condies transientes. Alm disso, h evidncias que as mximas velocidades de
alguns processos podem ser encontradas somente nestas circunstncias (BORZANI et
al., 2001).
O processo fermentativo em batelada alimentada conduzido em duas etapas.
Na primeira etapa o cultivo operado em batelada alimentada. Inicia-se com o inculo
que corresponde cerca de 30% do volume da dorna, sendo o meio alimentado a vazo
constante ou linear com o tempo at o enchimento do reator. A partir desse enchimento
inicia-se a segunda etapa, operando apenas em batelada at o consumo total dos
aucares fermentescveis. Na etapa inicial, quando o experimento est sendo operado
em batelada alimentada a realizao da modelagem se torna difcil, pelo fato dos
53
modelos encontrados na literatura no se ajustarem bem aos dados experimentais. Isso

se deve alimentao ao reator, no qual ocorre inicialmente consumo do substrato ao
mesmo tempo que ocorre a formao do produto, sem se observar o crescimento celular
que se inicia aps um tempo de alimentao de meio. Na etapa final, na qual se opera
em batelada, o comportamento da fermentao alcolica, como crescimento celular,
consumo de substrato e gerao de produto explicado pelos modelos matemticos
clssicos (AMORIM, 2005; DAR, 2008).
O modelo cintico utilizado neste trabalho foi o modelo no estruturado
desenvolvido por Ghose e Thyagi (1979), e modificado por Tosetto e Andrietta (2002)
em que o valor do expoente do termo de inibio pelo produto pode assumir valores
diferentes de 1 e considera -se a inibio pelo substrato e pelo produto.
3.2.2.6.1 Modelo para a fermentao alcolica em processo batelada

Um experimento em processo batelada foi realizado para a estimao de alguns
parmetros que mais tarde, foram utilizados na modelagem do reator batelada
alimentada. Neste experimento foi realizada a pr-fermentao (conforme item 3.2.1.6)
do inculo. O experimento em batelada procedeu nas condies de 160 g/L de
concentrao inicial de sacarose, 4% (v/v) de concentrao celular no reator (cerca de
13,33% (v/v) concentrao no inculo), sem agitao a 32C 0,5 e pH inicial de 4,5.
O modelo para a fermentao no processo em batelada descrito pelo balano de massa
para clulas, conforme Equao 3.13, balano de massa para substrato Equao 3.14,
balano de massa para produto Equao 3.15 e o modelo de Tosetto e Andrieta (2002)
Equao 3.16.
dX
= X
dt
(3.13)
dS
1
=
X MS X
dt
Yx / S
(3.14)
dP Y p / S
=
X + bX
dt Yx / S
(3.15)
= max
S
P
1
2
K S + S + S K I Pmax
54
n
(3.16)
Sendo,
X= concentrao de clulas (g/L);
S= concentrao de sacarose (g/L);
P= concentrao de etanol (g/L);
t= tempo (h);
Yp/S = rendimento em etanol (gS/gP);
Yx/S = rendimento em clulas (gS/gX);
= taxa de crescimento celular (h-1);
mx= taxa mxima especfica de crescimento celular (h-1);

KS= constante de saturao para o crescimento celular (gS/L);
Ki = constante de inibio do crescimento celular pelo substrato (gS/L);
Pmx=concentrao de produto na qual cessa o crescimento do micro-organismo (g/L);
n= a potncia do termo de inibio pelo produto;
MS= a constante de manuteno celular (g/L.h);
b= produo de etanol no associado ao crescimento (g/L.h).
3.2.2.6.2 Validao do modelo para a fermentao alcolica em processo

batelada alimentada com e sem recirculao
Os experimentos em batelada alimentada foram realizados nas condies da
regio otimizada do Planejamento Composto Central, com concentrao de sacarose de
170 g/L, tempo de enchimento em 6 horas a 32C 0,5, sem agitao e pH inicial em
4,5. O experimento realizado sem recirculao iniciou com concentrao celular no
reator de 12% (v/v) (cerca de 40% (v/v) de concentrao no inculo), com etanol e sem
substrato inicial no inculo. J para o experimento com recirculao, a concentrao
celular no reator foi de 15% (v/v) (50% (v/v) no inculo), sem etanol e com sacarose
inicial no inculo. No experimento com recirculao o meio foi recirculado atravs de
uma bomba peristltica (Masterflex, modelo n 7553-76) com vazo de 10 mL/s. O
modelo da fermentao no processo em batelada alimentada, para os experimentos com
55
e sem recirculao, descrito pelas Equaes 3.17, 3.18, 3.19, 3.20, 3.21, 3.22, 3.22 e
3.23.
F
dX
= a X + X
dt
V
(3.17)
dS Fa
= (S F S ) X
dt V
(3.18)
F
dP
= a P + X
dt
V
(3.19)
dV
= Fa
dt
(3.20)
= max
S
P
1
2
(3.21)
+ MS
Yx / S
(3.22)
Yp / S
+ bX
Yx / S
(3.23)
Sendo,
Fa= vazo de alimentao de substrato (L/h);
V= volume de trabalho do fermentador (L);
SF= concentrao de sacarose na alimentao (g/L);
= contribuio de substrato para o crescimento e manuteno celular (h-1);

MS= a constante de manuteno celular (g/L.h);
= formao de produto associado e no-associado ao crescimento (h-1).
56
3.2.2.6.3 Ajustes dos parmetros cinticos

Os valores dos parmetros foram gerados pela tcnica de regresso no linear
aplicada aos dados experimentais obtidos pela validao nas condies definidas pelas
superfcies de resposta e curvas de contorno (X0 = 13,33 % (v/v) de clulas no inculo e
S0 = 160 g/L) utilizando um algoritmo multirresposta (MARQUARDT, 1963). A
integrao do conjunto de equaes diferenciais do modelo foi realizada utilizando o
algoritmo de quarta-ordem de Runge-Kutta (GILL, 1951). Os resduos entre os valores
experimentais e calculados pelo modelo foram obtidos pela minimizao da soma dos
quadrados dos resduos
A validao realizada para os experimentos em batelada alimentada e batelada
alimentada com recirculao foram realizadas utilizando o mtodo de Runge-Kutta
(GILL, 1951).
3.2.2.7 Estudo da produo mxima de etanol na fermentao alcolica

(Pmx)
O objetivo da determinao de Pmx foi quantificar a mxima concentrao de
etanol que a levedura C2/00 foi capaz de produzir durante o processo de fermentao
alcolica, at que o etanol formado comeasse a inibir a levedura, cessando assim a
formao de mais produto. Foi realizado um experimento em duplicata, em reator
batelada alimentada de 5 L com volume de meio de 2 L, sendo o meio utilizado
conforme item 3.1.1, com concentrao de sacarose de 180 g/L e concentrao celular
no reator de 12% (v/v) (correspondendo a 40 % (v/v) no inculo).
Quando a concentrao de sacarose no meio em fermentao atingia valores
menores que 10 g/L, era adicionado ao reator 0,1 L de uma soluo formada de sacarose
e dos demais nutrientes que compe o meio fermentativo, conforme Tabela 3.2.
57
Tabela 3.2 Massa de sacarose adicionada ao meio em funo do tempo de

fermentao
Tempo de Fermentao (h)
Massa de Sacarose (g)
15
73,5
20
77
27
80,5
30
84
41
87,5
60
91
3.2.2.8 Concentrao mxima de etanol em que cessa o crescimento

microbiano (Pmx)
Este estudo teve como objetivo analisar a concentrao mxima de produto,
onde cessa o crescimento microbiano, sendo assim submetida a diferentes
concentraes de produto. O meio de cultivo utilizado foi YEPD, sendo adicionando
etanol absoluto nas concentraes finais de 0; 3; 6; 9; 12; 12,5; 13; 13,5; 14; 14,5; 15;
18 e 21% (v/v), ao meio liquefeito a temperatura de 50 a 55oC. Aps a solidificao a
placa foi envolvida com papel filme. A levedura foi transferida para um tubo contendo
soluo salina e foi realizada a contagem celular (clulas/mL) pela tcnica de contagem
em cmara de Neubauer. Esta suspenso foi ajustada para 1x108clulas/mL e desta
foram retirados 10 L que foram cuidadosamente depositados na superfcie do meio
YEPD com diferentes concentraes de etanol. As placas foram incubadas a 30oC por 4
dias.
3.2.2.9 Estudo da velocidade especfica de sedimentao da levedura C2/00

O pH inicial utilizado nas fermentaes alcolicas deste trabalho foi de 4,5.
Este pH foi escolhido por meio de testes preliminares, em que se observou maior
rendimento na fermentao. O estudo da sedimentao da levedura foi realizado em
diferentes valores de pH com o objetivo de verificar em qual pH que a levedura
apresenta maior velocidade de sedimentao. Os valores de pH estudados foram 3; 4; 5;
6 e 7.
58
Os experimentos foram realizados em triplicada e conduzidos em erlenmayer

de 500 mL, sendo 300 mL de meio fermentativo. O meio utilizado foi conforme item
3.1.1, com concentrao de sacarose de 170 g/L. A concentrao celular foi de 15 %
(v/v) em relao ao volume do meio fermentativo. O tempo de fermentao foi de 15
horas temperatura ambiente e agitao de 100 rpm. Aps a fermentao foram
retirados alquotas de 30 mL do vinho fermentado e centrifugadas a 8000 rpm por 5
minutos. O precipitado formado foi ressuspendido duas vezes em gua destilada e
novamente centrifugado. O pH da gua destilada foi ajustado para cada experimento,
com HCl 0,5 M e NaOH 0,5 M. Posteriormente foi retirado um grama de precipitado e
diludo em 100 mL de gua destilada com seu respectivo pH ajustado. Esta diluio
sofreu forte agitao e rapidamente foi colocada na cubeta do expectrofotmetro e assim
acompanhada a absorbncia, durante 10 minutos, com leituras de 30 em 30 s,
empregando um comprimento e onda de 600 nm. A velocidade especifica de
sedimentao (VES) foi calculada pela Equao 3.24 (VIEGAS, 1999; VIEGAS, 2003):
Abst
1
Abs0
VES =
t t0
(3.24)
VES = Velocidade especifica de sedimentao;

Abs0 = Absorbncia no tempo inicial t0;
Abst = Absorbncia medido no tempo t.
3.2.2.9.1 Estudo em proveta da sedimentao da levedura em pH 5

Aps a realizao da fermentao do Experimento F (o qual utilizou a
recirculao de meio fermentativo), aps consumo total da sacarose foi realizado um
experimento para avaliar a sedimentao em pH 5. O vinho fermentado, com
concentrao celular no reator de 15% (v/v), aps homogeneizao foi retirado do reator
e colocado em uma proveta de 500 mL. O vinho contido na proveta foi homogeneizado
e aps foi realizada a leitura da altura da interface da sedimentao em funo do
tempo.
59
3.3 Fluxograma representativo de todas as etapas realizadas nesse

trabalho
Na Figura 3.4 est apresentado o fluxograma com todas as etapas realizadas
neste trabalho, com o intuito de melhorar o entendimento de como o trabalhou avanou
durante a pesquisa.
Figura 3.4 Fluxograma representativo das etapas realizadas no trabalho
CAPTULO 4
RESULTADOS E DISCUSSO
Neste captulo sero apresentados e discutidos os principais resultados obtidos

no desenvolvimento deste trabalho. Inicialmente, apresentam-se os resultados e
discusso da escolha da cepa, pela avaliao da capacidade fermentativa.
Posteriormente apresentado o estudo da influncia conjunta das variveis
concentrao inicial de sacarose, concentrao celular no inculo e tempo de
enchimento do reator batelada alimentada. Na sequncia do estudo do trabalho so
descritos os testes para melhoria do processo fermentativo, sendo eles: uso da
recirculao de clulas, alteraes de concentrao de sacarose e etanol no inculo. E
para finalizar so apresentados os resultados da modelagem matemtica do reator
batelada, batelada alimentada e batelada alimentada com recirculao de clulas e
completando com o estudo da produo mxima de etanol (Pmx), concentrao de
produto em que cessa o crescimento microbiano (Pmx) e estudo da sedimentao da
levedura com caractersticas floculantes.
4.1 Avaliao da capacidade fermentativa

O desempenho das leveduras no processo fermentativo nas indstrias
apontado como a nica metodologia capaz de realizar a distino definitiva entre
diferentes cepas (CAMPBELL, 1999). A metodologia para determinao da capacidade
fermentativa baseada principalmente em dados cinticos e de rendimento. Durante
este estudo pde-se observar que apesar de todas as cepas utilizadas apresentarem
caractersticas floculantes, nem todas formaram flocos, algumas delas formaram flocos
pequenos ou no formaram flocos durante o processo fermentativo. Pela Figura 4.1
pode-se observar o comportamento de cada levedura estudada. Para a cepa denominada
C19 foi observado uma mistura homognea com o meio (sem formar flocos) e sua
sedimentao foi bastante lenta. J para as cepas C14 e C2/95 observou-se a formao
de flocos menores. Observou-se que as cepas C2/00 e C4/00 formaram flocos grandes e
a sedimentao foi rpida. A cepa do CTC, proveniente da Usina Junqueira, no formou
flocos definidos, porm a sua sedimentao foi um pouco inferior a C2/00. Alguns
estudos apontam uma sedimentao melhor, para flocos com dimenses maiores e estes
Captulo 4 Resultados e Discusso
61
estudos mostraram tambm, que um aumento da intensidade de agitao provoca uma

diminuio no tamanho dos flocos (DOMINGUES, LIMA e TEIXEIRA 2005).
Figura 4.1 Comportamento das leveduras em meio fermentativo, (a) C19, (b) C14, (c)
C2/95, (d) CTC, (e) C4/00 e (f) C2/00
A Tabela 4.1 apresenta os resultados dos parmetros obtidos para cada cepa
testada. Os melhores resultados de velocidade de consumo de substrato e nvel de
converso de substrato foram obtidos pelas cepas C2/95 e C2/00, como mostra a Tabela
4.1. Analisando os resultados para o coeficiente de rendimento celular YX/S verifica-se
que a cepa C14 apresentou um nvel maior de coeficiente de rendimento quando
comparado aos obtidos para as outras cepas. Esses valores altos de coeficiente de
rendimento celular indicam um maior desvio de acar para a produo de clulas em
detrimento produo de etanol. Em casos nas quais existem unidades de secagem de
clulas, esta produo excedente pode ser aproveitada na produo de rao animal,
minimizando o prejuzo (STECKELBERG, 2001).
A cepa que apresentou melhores resultados em rendimento em etanol e
produtividade foi cepa C2/00, apresentando o maior coeficiente de rendimento YP/S.
Os parmetros de rendimento em etanol e produtividade so considerados os mais
62
importantes para a indstria alcooleira. Quanto maiores forem os parmetros de

produtividade e rendimento melhor ser a levedura para o processo (MIGLIARI, 2001).
Tabela 4.1 Parmetros cinticos, de rendimento e produtividade obtidos para cada
cepa
CTC
C14
C19
C2/95
C2/00
C4/00
Yp/s
0,43
0,44
0,37
0,41
0,50
0,43
(gp/gs)
0,01
0,01
0,02
0,02
0,02
0,01
Yx/s
0,036
0,052
0,037
0,040
0,044
0,036
(gx/gs)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
PROD
2,98
2,94
2,20
3,01
3,60
2,98
(gp/L.h)
0,07
0,02
0,11
0,15
0,14
0,07
VCS
7,00
6,72
5,93
7,39
7,21
7,00
(gs/L.h)
0,04
0,06
0,04
0,04
0,05
0,04
XS
92,35
90,59
79,55
98,58
96,22
92,35
(%)
0,53
0,83
0,50
0,52
0,73
0,53
Com os resultados obtidos de capacidade fermentativa, pode-se concluir que a

cepa floculante Saccharomyces cerevisiae C2/00, cedida pelo CPQBA, foi considerada
a levedura mais apta para o processo de fermentao alcolica. Esta cepa apresentou de
uma forma geral, os melhores resultados de rendimento em etanol e produtividade, bons
resultados de velocidade de consumo de substrato e converso de sacarose quando
comparado as outras cepas. Alm disso, a levedura C2/00 apresentou excelentes
caractersticas de floculao. A levedura C2/00 foi utilizada para o estudo subsequente
desse trabalho.
4.2 Caractersticas fenotpicas da levedura C2/00

Durante a etapa de isolamento desenvolvida em placas de Petri com meio
YEPD, estudou-se a morfologia da colnia formada. Pela Figura 4.2 pode-se notar que a
levedura C2/00 apresentou colnia mucosa (lisa). Na literatura observado que as
leveduras floculantes geralmente apresentam colnia rugosa (clulas em cacho).
Segundo Reis (2011), as linhagens com colnias rugosas apresentam velocidade de
63
fermentao mais lenta e capacidade fermentativa inferior s linhagens com colnias

mucosas de S. cerevisiae.
Figura 4.2 Morfologia lisa da cepa C2/00
4.3 Concentrao celular no inculo

Na Tabela 4.2 apresentada a relao entre a concentrao celular do inculo
expressa em % (v/v) em massa mida e sua respectiva massa seca em g/L no reator
(volume de 5L). Esta relao de massa seca por volume de inculo ficou muito prxima
da relao encontrada por Pacheco (2010), que tambm utilizou outra variedade com
caractersticas floculantes. Os resultados obtidos por Pacheco (2010) foram: 10 - 45 %
(v/v) de massa mida no inculo para 9,5 42,75 g/L de massa seca no reator.
Tabela 4.2 Relao entre concentrao celular no inculo e respectiva massa seca no
reator
Concentrao celular %
Massa seca no reator
(v/v) no inculo de 1,5 L
(g/L) em 5L
10,6
12,15 0,55
15
14,33 1,32
27,5
25,57 1,65
40
35,96 1,77
44,4
38,21 1,68
64
4.4 Influncia da concentrao inicial de substrato, concentrao celular

no inculo e de tempo de enchimento do reator batelada alimentada
No Planejamento Composto Central (PCC) estudou-se as variveis que afetam
fortemente o desempenho da fermentao alcolica, como a influncia da concentrao
inicial de substrato X1 (137,05 197,95 g/L), concentrao celular no inculo X2 (10,6
44,4 %) e o tempo de enchimento do reator X3 (1,3 6,7 h). Em todos os
experimentos foram realizadas as contagens iniciais de clulas vivas no reator,
correspondendo a um volume de 5 L. Essa contagem apresenta valores de
aproximadamente 7.107 clulas /mL para 10,6 % (v/v), 9.107 clulas /mL para 15 %
(v/v), 2.108 clulas /mL para 27,5 % (v/v), 3.108 clulas /mL para 40 % (v/v) e 3.108
clulas /mL para 44,4 % (v/v). A Tabela 4.3 mostra os valores codificados e reais das
variveis de estudo e as respostas rendimento em relao ao valor terico, produtividade
em etanol e sacarose residual.
Todas estas variveis foram analisadas durante 10,5 horas de processo
fermentativo. Este tempo de fermentao justificado pelo Experimento 9, o qual
mostra que decorrido 10,5 horas de processo fermentativo, o acar praticamente havia
sido consumido, sobrando apenas 6,12% em relao ao inicial. Alm disso, tempos
maiores podem comprometer os valores de produtividade obtidos na fermentao.
Dessa forma foi justificado a anlise dos resultados no referido tempo. Verifica-se
tambm que os pontos centrais apresentaram uma variao pequena para todas as
respostas, indicando uma boa reprodutibilidade do processo.
Neste planejamento experimental foi considerado um nvel de significncia de
95%, ou seja, foram considerados significativos os parmetros em que p<0,05. Com os
resultados apresentados na Tabela 4.3, foi possvel analisar estatisticamente o
comportamento de cada resposta. Para isto, determinaram-se os coeficientes de
regresso aps a realizao da regresso mltipla no programa Statistica 7.0.
65
Tabela 4.3 Variveis utilizadas no PCC e suas respectivas respostas em 10,5 horas de
fermentao
Valor Codificado (Valor Real)
Experimentos
X1
(g/L)
X2
(%) no
inculo
X3
Rendimento Produtividade
(h)
(%)
(getanol/L.h)
Sacarose
Residual
(g/L)
-1 (145)
-1 (15)
-1 (2)
85,73
4,99
31,18
-1 (145)
-1 (15)
+1 (6)
93,87
4,27
56,32
-1 (145)
+1 (40)
-1 (2)
89,09
5,3
31,99
-1 (145)
+1 (40)
+1 (6)
90,23
5,39
28,33
+1 (190)
-1 (15)
-1 (2)
77,19
4,2
83,84
+1 (190)
-1 (15)
+1 (6)
85,11
3,29
114,48
+1 (190)
+1 (40)
-1 (2)
88,23
6,18
53,33
+1 (190)
+1 (40)
+1 (6)
90,79
6,03
60,39
- (137,05)
0 (27,5)
0 (4)
84,48
5,57
8,39
10
+ (197,95)
0 (27,5)
0 (4)
82,71
5,87
59,44
11
0 (167,5)
- (10,6)
0 (4)
87,50
3,28
94,42
12
0 (167,5)
+ (44,4)
0 (4)
90,64
6,05
37,27
13
0 (167,5)
0 (27,5)
- (1,3)
85,45
6,47
19,69
14
0 (167,5)
0 (27,5)
+ (6,7)
90,52
5,59
52,02
15
0 (167,5)
0 (27,5)
0 (4)
86,81
6,17
29,76
16
0 (167,5)
0 (27,5)
0 (4)
86,62
6,12
31,13
17
0 (167,5)
0 (27,5)
0 (4)
86,93
5,97
33,44
4.4.1 Anlise dos resultados obtidos para a resposta rendimento em etanol

das variveis estudadas
A partir dos resultados obtidos, mostrados na Tabela 4.3, analisou-se
estatisticamente o comportamento da resposta rendimento. Dessa forma, determinou-se
os coeficientes de regresso das variveis e interaes, conforme Tabela 4.4, bem como
os valores dos nveis de significncia relacionados aos mesmos.
66
Tabela 4.4 Resultados da regresso mltipla para a resposta rendimento com todas as
variveis e seus respectivos parmetros e nveis de significncia
Variveis e
Coeficiente de
Nvel de
interaes
regresso
significncia p-valor
Termo Independente
86,61150
0,000000
X1 (L)
-1,71456
0,001643
X1 (Q)
-1,52493
0,012370
X2 (L)
1,77468
0,001354
X2 (Q)
1,46797
0,014761
X3 (L)
2,28268
0,000304
X3 (Q)
0,87273
0,097300
X1X2
2,12500
0,001418
X1X3
0,15000
0,730044
X2X3
-1,54500
0,007659
R= 0,96
Aps a regresso mltipla, obteve-se a Equao 4.1 completa com todos os
parmetros significativos e no significativos:
YRe n dim ento = 86, 61150 1, 71456 X 1 1,52493 X 12 + 1, 77468 X 2 + 1, 46797 X 22

+2, 28268 X 3 + 0,87273 X 32 + 2,12500 X 1 X 2 + 0,15000 X 1 X 3 1,54500 X 2 X 3
(4.1)
Observa-se na Tabela 4.4 que as variveis significativas do modelo foram:

concentrao de sacarose em seu termo linear X1 (L) e quadrtico X1 (Q), concentrao
celular do inculo em seu termo linear X2 (L) e quadrtico X2 (Q), tempo de enchimento
do reator apenas em seu temo linear X3 (L) e as interaes concentrao de sacarose/
concentrao celular no inculo (X1X2) e concentrao celular no inculo/tempo de
enchimento (X2X3). Aps a eliminao dos parmetros no significativos, que foram X3
(Q) e a interao X1X3, com p > 0,05, foram obtidos os seguintes parmetros, conforme
Tabela 4.5.
67
Tabela 4.5 Resultados da regresso mltipla para a resposta rendimento, apenas com
as variveis significativas e seus respectivos parmetros e nveis de significncia
Variveis e
Coeficiente de
Nvel de
interaes
regresso
Termo Independente
87,20982
0,000000
X1 (L)
-1,71456
0,001432
X1 (Q)
-1,52493
0,013722
X2 (L)
1,77468
0,001144
X2 (Q)
1,46851
0,016563
X3 (L)
2,28268
0,000196
X1X2
2,12500
0,001206
X2X3
-1,54500
0,008140
R= 0,94
O modelo ajustado com as variveis significativas codificadas est apresentado
na Equao 4.2.
YRe n dim ento = 87, 20982 1, 71456 X 1 1,52493 X 12 + 1, 77468 X 2 + 1, 46851X 22

+2, 28268 X 3 + 2,12500 X 1 X 2 1,54500 X 2 X 3
(4.2)
Pela Equao 4.2, pode-se notar uma considervel influncia da varivel X3 no

aumento do rendimento, o qual indica que a utilizao de um maior tempo de
enchimento do reator implica em um maior rendimento. O mesmo acontece com a
varivel X2, ainda que com um menor efeito que a varivel X3, mostra que para uma
maior concentrao celular no inculo, maior ser o rendimento obtido. J para a
varivel X1, o sinal negativo indica que na condio de maior concentrao de sacarose,
menores sero os valores de rendimento em etanol obtidos.
O coeficiente de correlao (R2) obtido aps o ajuste foi de 0,94, o qual indica
um ajuste adequado aos dados experimentais na obteno do rendimento, mostrando
que 94% da variabilidade dos dados foram explicados pela equao emprica proposta.
A Figura 4.3 ilustra os valores preditos em funo dos observados. Esses resultados
indicam uma boa concordncia entre os valores experimentais e previstos pelo modelo.
68
Figura 4.3 - Valores preditos em funo dos observados em relao ao rendimento

Pela Figura 4.4 pode-se observar que os erros de ajustamento se mostraram
independentes e a distribuio dos resduos comportou-se aleatoriamente em torno do
zero, sem apresentar tendncia.
Figura 4.4 - Distribuio dos resduos relativos ao rendimento

A Figura 4.5 ilustra a superfcie de resposta e a curva de contorno em funo
de X1 (concentrao de sacarose) e X2 (concentrao celular) para a resposta
rendimento.
69
Figura 4.5 - Superfcie de resposta e curva de contorno para a resposta rendimento em

funo da concentrao de sacarose e concentrao celular no inculo
Pela Figura 4.5 observa-se rendimentos maiores para concentrao de sacarose
variando de 150 190 g/L e concentrao celular no inculo maior que 35% (v/v). Vale
ressaltar que o emprego de uma faixa maior de concentrao de sacarose vivel para o
processo, pelo fato de poder utilizar caldos mais concentrados na indstria alcooleira. A
Figura 4.6 ilustra a superfcie de resposta e a curva de contorno em funo de X1
(concentrao de sacarose) e X3 (tempo de enchimento) para o rendimento. Nesta figura
fica claro o aumento do rendimento com maior tempo de enchimento, isso explicado
pelo fato das clulas sofrerem inibio pela concentrao elevada de substrato. A
utilizao de reatores operando em batelada alimentada particularmente muito
importante para os processos fermentativos, pois ameniza a inibio do crescimento dos
micro-organismos e a represso catablica (SENGUPTA e MODAK, 2001; ASTOLFI
et al., 2011).
70

funo da concentrao de sacarose e tempo de enchimento
Na Figura 4.6 observa-se que para obter rendimentos maiores que 90 %, o
tempo de enchimento deve ficar em torno de 6 horas e concentrao de sacarose de
aproximadamente 160 g/L. Isto tambm comprovado na Figura 4.7, na qual observase rendimentos maiores com tempo de enchimento maiores, podendo utilizar variadas
concentraes celulares no inculo.

funo do tempo de enchimento e da concentrao celular de inculo
71
4.4.2 Anlise dos resultados obtidos para a resposta produtividade em

etanol das variveis estudadas
Analisando estatisticamente o comportamento da resposta produtividade pela
Tabela 4.3, determinaram-se os coeficientes de regresso das variveis e interaes com
parmetros significativos e no significativos, conforme Tabela 4.6, bem como os
valores dos nveis de significncia relacionados aos mesmos.
Tabela 4.6 Resultados da regresso mltipla para a resposta produtividade com todas
as variveis e seus respectivos parmetros e nveis de significncia
Variveis e
Coeficiente de
Nvel de
interaes
regresso
Termo Independente
6,123165
0,000000
X1 (L)
0,013372
0,828928
X1 (Q)
-0,245735
0,016713
X2 (L)
0,848936
0,000002
X2 (Q)
-0,823351
0,000016
X3 (L)
-0,247022
0,004329
X3 (Q)
-0,076424
0,363409
X1X2
0,411250
0,000725
X1X3
-0,053750
0,479523
X2X3
0,196250
0,029483
R= 0,98
YPr odutividade = 6,123165+0,013372X 1 0, 245735 X 12 + 0,848936 X 2 0,823351X 22

0, 247022 X 3 0, 076424 X 32 + 0, 411250 X 1 X 2 0, 053750 X 1 X 3 + 0,196250 X 2 X 3
(4.3)
As variveis significativas do modelo para a resposta produtividade, mostradas

na Tabela 4.6, foram: concentrao de sacarose em seu termo quadrtico X1 (Q),
concentrao celular do inculo em seu termo linear X2 (L) e quadrtico X2 (Q), tempo
72
de enchimento do reator apenas em seu temo linear X3 (L) e as interaes concentrao

de sacarose/concentrao celular no inculo (X1X2) e concentrao celular no
inculo/tempo de enchimento (X2X3). Aps a eliminao dos parmetros no
significativos, que foram X1 (L), X3 (Q) e a interao X1X3, com p > 0,05, foram
obtidos os seguintes parmetros, conforme Tabela 4.7.
Tabela 4.7 Resultados da regresso mltipla para a resposta produtividade, apenas
com as variveis significativas e seus respectivos parmetros e nveis de significncia
Variveis e
Coeficiente de
Nvel de
interaes
regresso
Termo Independente
6,070771
0,000000
X1 (Q)
-0,245735
0,007007
X2 (L)
0,848936
0,000000
X2 (Q)
-0,823399
0,000001
X3 (L)
-0,247022
0,001178
X1X2
0,411250
0,000104
X2X3
0,196250
0,014578
R= 0,98
na Equao 4.4.
YPr odutividade = 6, 070771 0, 245735 X 12 + 0,848936 X 2 0,823399 X 22

0, 247022 X 3 + 0, 411250 X 1 X 2 + 0,196250 X 2 X 3
(4.4)
Pode-se notar pela Equao 4.4, que a varivel isolada X2 exerceu um maior
efeito sobre a produtividade, sendo que maiores concentraes de clulas no inculo
aumentam a produtividade e tambm o rendimento, como na Equao 4.2. Por outro
lado, a influncia da varivel X3, com sinal negativo, mostra que para um maior tempo
de enchimento h uma diminuio na produtividade, porm a varivel X3 tem menor
efeito que a varivel X2. O coeficiente de correlao (R2) obtido aps o ajuste foi de
0,98, o qual indica um ajuste adequado aos dados experimentais na obteno da
produtividade, mostrando que 98% da variabilidade dos dados foram explicados pela
73
equao emprica proposta. Na Figura 4.8 esto apresentados os valores preditos em

funo dos observados. Esses resultados indicam uma boa concordncia entre os valores
experimentais e previstos pelo modelo.
Figura 4.8 - Valores preditos em funo dos observados em relao produtividade

Pela Figura 4.9 pode-se observar que os erros de ajustamento se mostram
Figura 4.9 - Distribuio dos resduos relativos produtividade
74
Para a resposta produtividade em etanol houve uma variao de 3,28 getanol/L.h

(Experimento 11) a 6,47 getanol/L.h (Experimento 13). A partir do modelo, foram
construdas as superfcies de respostas e assim definido a regio de trabalho de maior
interesse para o processo. A Figura 4.10 ilustra a superfcie de resposta e a curva de
contorno em funo de X1 (concentrao de sacarose) e X2 (concentrao celular no
inculo) para a produtividade.
Figura 4.10 - Superfcie de resposta e curva de contorno para a resposta produtividade

em funo da concentrao de sacarose e concentrao celular no inculo
Observando a Figura 4.10 nota-se produtividade maior, com maiores
concentraes de clulas no inculo, o qual fica claro a influncia da varivel X2. A
Figura 4.11 ilustra a superfcie de resposta e a curva de contorno em funo de X1
(concentrao de sacarose) e X3 (tempo de enchimento) para a produtividade. Nesta
figura percebe-se que um menor tempo de enchimento, melhora a produtividade. Esse
comportamento j era esperado, pelo fato que quanto maior o tempo de enchimento,
maior ser o tempo para consumir o substrato que est sendo colocado no reator e
menor ser a produtividade.
75

em funo da concentrao de sacarose e tempo de enchimento
Para maiores produtividades, pode-se notar pela Figura 4.12 que deve se
utilizar concentrao celular no inculo de 30 a 40%.

em funo do tempo de enchimento e da concentrao celular de inculo
76
4.4.3 Anlise dos resultados obtidos para a resposta sacarose residual das
variveis estudadas
Outra resposta analisada foi sacarose residual, ou seja, a concentrao de
sacarose presente no meio aps 10,5 h de fermentao. Ao contrrio das respostas
rendimento e produtividade, de interesse que a sacarose residual seja minimizada.
Quando h sobras de sacarose ao final da fermentao a indstria acaba tendo prejuzos,
por no ter aproveitado este acar para transform-lo em lcool e tambm por estar
enviando o mesmo para o efluente do processo, podendo provocar problemas
ambientais. Na Tabela 4.8, esto apresentados os coeficientes de regresso das variveis
e interaes, incluindo os parmetros significativos e no significativos para a resposta
sacarose residual.
Tabela 4.8 Resultados da regresso mltipla para a resposta sacarose residual com
todas as variveis e seus respectivos parmetros e nveis de significncia
Variveis e
Coeficiente de
Nvel de
interaes
regresso
Termo Independente
30,4037
0,000015
X1 (L)
20,0051
0,000005
X1 (Q)
2,6453
0,256220
X2 (L)
-16,2191
0,000021
X2 (Q)
20,1190
0,000032
X3 (L)
8,8259
0,000966
X3 (Q)
3,7048
0,126974
X1X2
-7,1775
0,008026
X1X3
2,0275
0,335068
X2X3
-6,5475
0,012376
R= 0,98
77
YS Re sidual = 30, 4037+20,0051X 1 + 2, 6453 X 12 16, 2191X 2 + 20,1190 X 22

+8,8259 X 3 + 3, 7048 X 32 7,1775 X 1 X 2 + 2, 0275 X 1 X 3 6,5475 X 2 X 3
(4.5)
As variveis significativas do modelo para a resposta sacarose residual,

mostradas na Tabela 4.8, foram: concentrao de sacarose em seu termo linear X1 (L),
concentrao celular do inculo em seu termo linear X2 (L) e quadrtico X2 (Q), tempo
de enchimento do reator apenas em seu temo linear X3 (L) e as interaes concentrao
de sacarose/concentrao celular (X1X2) e concentrao celular/tempo de enchimento
(X2X3). Aps a eliminao dos parmetros no significativos, que foram X1 (Q), X3 (Q)
e a interao X1X3, com p > 0,05, foram obtidos os seguintes parmetros, apresentados
na Tabela 4.9.
Tabela 4.9 Resultados da regresso mltipla para a resposta sacarose residual, apenas
com as variveis significativas e seus respectivos parmetros e nveis de significncia
Variveis e
Coeficiente de
Nvel de
interaes
regresso
Termo Independente
34,7571
0,000000
X1 (L)
20,0051
0,000001
X2 (L)
-16,2191
0,000005
X2 (Q)
20,1230
0,000008
X3 (L)
8,8259
0,000675
X1X2
-7,1775
0,008508
X2X3
-6,5475
0,013854
R= 0,97
na Equao 4.6.
YS Re sidual = 34, 7571 + 20, 0051X 1 16, 2191X 2 + 20,1230 X 22

+8,8259 X 3 7,1775 X 1 X 2 6,5475 X 2 X 3
(4.6)
Observando a Equao 4.6, percebe-se que a varivel isolada X1 exerceu uma

grande influncia no aumento da resposta, mostrando que se deve utilizar menor
78
concentrao de sacarose para minimizar o seu resduo. A varivel isolada X2 mostra

que a utilizao de uma maior concentrao celular exerce um efeito de diminuio da
sacarose residual. O coeficiente de correlao (R2) obtido aps o ajuste foi de 0,97, o
qual indica um ajuste adequado aos dados experimentais na obteno do acar
residual, mostrando que 97% da variabilidade dos dados foram explicadas pela equao
emprica proposta. Na Figura 4.13 esto apresentados os valores preditos em funo dos
observados. Esses resultados indicam uma boa concordncia entre os valores
experimentais e previstos pelo modelo.
Figura 4.13 - Valores preditos em funo dos observados em relao sacarose residual
Pela Figura 4.14 pode-se observar que os erros de ajustamento se mostram
Figura 4.14 - Distribuio dos resduos relativos sacarose residual
79
O acar residual variou de 8,39 g/L (Experimento 9) a 114,48 g/L

(Experimento 6). A partir do modelo, foram construdas as superfcies de respostas e
assim definido a regio de menor acar residual ao final do processo. A Figura 4.15
ilustra a superfcie de resposta e a curva de contorno em funo de X1 (concentrao de
sacarose) e X2 (concentrao celular no inculo) para a sacarose residual. Nota-se que a
resposta sacarose residual menor para concentraes celular no inculo entre 20 a
40% (v/v) e concentraes de sacarose tendendo para o mnimo.
Figura 4.15 - Superfcie de resposta e curva de contorno para a resposta sacarose

residual em funo da concentrao de sacarose e concentrao celular no inculo
A Figura 4.16 apresenta a superfcie de resposta e a curva de contorno em
funo de X1 (concentrao de sacarose) e X3 (tempo de enchimento) para a sacarose
residual. Pode-se perceber que um menor tempo de enchimento resulta em uma pequena
diminuio na sacarose residual.
80

residual em funo da concentrao de sacarose e tempo de enchimento
A Figura 4.17 apresenta a superfcie de resposta e a curva de contorno em
funo de X2 (concentrao celular no inculo) e X3 (tempo de enchimento) para a
sacarose residual. Nota-se que para se obter uma menor concentrao de sacarose
residual melhor que se utilize um menor tempo de enchimento.

residual em funo do tempo de enchimento e da concentrao celular de inculo
81
Analisando as Figuras (4.5, 4.6, 4.7, 4.10, 4.11 e 4.12) de rendimento e

produtividade, constata-se que rendimentos em torno de 90% e produtividade em torno
de 6 g/L.h foram obtidos para tempos de enchimento maiores que 6 horas e
concentrao celular no inculo maior que 30%. Os resultados da Tabela 4.3 mostram
que para a condio de tempo de enchimento de 6 horas e concentrao celular no
inculo de 40% (experimentos 4 e 8) obteve-se as respostas mencionadas anteriormente,
porm o experimento 8, o qual utilizou uma concentrao de sacarose maior (190 g/L)
resultou em uma concentrao maior de sacarose residual. Para as respostas
produtividade e sacarose residual essa contribuio foi relativamente menor, sendo que
maiores tempos de enchimento proporcionaram reduo na produtividade e aumento na
sacarose residual. Nota-se, tambm, pelas figuras acima citadas, que rendimento e
produtividade superiores a 90% e 6 g/L.h, respectivamente, a concentrao de acar
deve ser maior que 160 g/L e a concentrao celular no inculo prxima de 40% (v/v).
Aps a anlise das variveis das Equaes 4.2, 4.4 e 4.6 para as respostas, rendimento
em etanol, produtividade e sacarose residual, respectivamente e observao das curvas
de contorno das Figuras (4.5, 4.6, 4.7, 4.10, 4.11, 4.12, 4.15, 4.16 e 4.17), foi possvel
estabelecer as faixas as quais se obteve melhores rendimentos e produtividades e valores
de sacarose residual que no foram os maiores obtidos no PCC. A concentrao de
sacarose estabelecida foi em 170 g/L, tempo de enchimento de 6 horas e concentrao
celular no inculo de 40% (v/v). A partir da definio destas variveis foi realizada a
validao das equaes dos modelos (4.2, 4.4 e 4.6) por meio de um experimento em
triplicata at que a produo de etanol se estabilizasse. Estes experimentos foram
realizados com a pr-fermentao, conforme item 3.2.1.6, e iniciou com uma
concentrao inicial de etanol no inculo de 65,94 g/L (considerando uma batelada de 5
L a concentrao de etanol inicial foi aproximadamente 19,78 g/L). O modelo previu
um rendimento de 91,22%, produtividade de 6,12 g/L.h e sacarose residual de 44,33
g/L. Pelo experimento obteve-se um rendimento de 92,20 0,55%, produtividade em
6,01 0,12 g/L.h e sacarose residual em 42,84 2,21 g/L. O etanol produzido neste
experimento foi de aproximadamente 63,07 3,83 g/L (com o desconto da
concentrao inicial de etanol no inoculo) em 10,5 horas de fermentao. A sacarose foi
completamente consumida at 21,5 horas de fermentao alcolica. Os perfis de
concentrao celular, de sacarose e etanol obtidos para o experimento de validao da
condio otimizada por meio do PCC esto apresentados na Figura 4.18.
82
90
140
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
6
Tempo (h)
Concentrao de Etanol (g/L)
140
Concentrao Celular (g/L)
Concentrao de Sacarose (g/L)
160
75
60
45
30
120
Figura 4.18 Perfis de concentrao de sacarose (), Concentrao de etanol () e

concentrao celular () em funo do tempo para o experimento de validao das
condies de otimizao obtido pela superfcie de resposta e curvas de contorno
Com a anlise completa dos resultados e do ponto timo escolhido, pode-se
perceber que o processo apresentou bom rendimento (92,20%) e produtividade (6,01).
Por outro lado, a sacarose residual (42,84 g/L) ao final do processo foi alta. Quando se
reduz o acar residual ao final do processo tem como uma das consequencias a
melhoria da produtividade.
Algumas pesquisas foram realizadas utilizando levedura floculante no processo
fermentativo em reator operado em batelada, e observaram-se concentraes elevadas
de acar residual e tempos longos de fermentao para o consumo total desses
aucares. Por outro lado os dados obtidos na literatura para reatores contnuos mostram
maiores produtividades quando comparado a reatores em batelada. Viegas, Andrietta e
Andrietta (2002) trabalharam com dois reatores tipo torre, ligados em srie, utilizando
leveduras floculantes e obtiveram produtividade mxima em etanol de 15,40 g/L.h e
rendimento em torno de 93%. Viegas (2003) estudou o desempenho de leveduras com
caractersticas floculantes em um sistema de trs reatores em srie, obtendo elevada
produtividade, 27,5 g/L.h, e rendimento em torno de 90%. Xu, Zhao e Bai (2005)
estudaram a fermentao alcolica contnua em quatro estgios (tanques em srie)
usando levedura floculante SPSC01 e obtiveram produtividade de 3,44 g/L.h e
83
rendimento terico de 91,1 %, com tempo de fermentao de 25 a 35 horas e glicose

residual de 2 a 3 g/L. Reddy e Reddy (2006) utilizaram uma levedura Saccharomyces
cerevisiae CFTRI 101 em reator em batelada e obtiveram 1,84 a 2 g/L.h e 20 a 75 g/L
de produtividade em etanol e glicose residual, respectivamente. Wang et al. (2006)
utilizaram um sistema de fermentao alcolica contnuo composto de trs estgios,
tanques em srie, juntamente com dois tanques de sedimentao. Uma estirpe de
levedura floculante desenvolvido por uma fuso a partir de Saccharomyces cerevisiae e
Saccharomyces pombe Schizo foi aplicado ao processo. A produtividade de etanol
obtida foi de 5,77 g/L.h. Andrietta, Steckelberg e Andrietta (2008) propuseram um
estudo para avaliar a reteno de 12 diferentes cepas de leveduras de Saccharomyces
sp., com caractersticas floculantes. Estas leveduras foram inoculadas em um processo
com reatores contnuos. O sistema foi composto por dois reatores ligados em srie, sem
reciclo de clulas. O sistema atingiu nveis de rendimento de 83,53% em relao ao
rendimento terico, com uma converso de acares redutores totais de 92,68%. Ma et
al. (2009) estudaram uma levedura floculante de Saccharomyces cerevisiae KRM-1.
Neste estudo foram realizadas 10 bateladas com reciclo de clulas, e obtiveram uma
produtividade de 8,25 g/L.h e ao final da ltima batelada obteve-se uma produtividade
de 10,08 g/L.h. O reciclo de clulas floculantes foi rpido e conveniente, e portanto,
pode ser aplicado em escala industrial para a produo de etanol. Li, Lin e Tran (2009)
utilizaram uma levedura floculante de Saccharomyces cerevisiae em reator em batelada,
com consecutivas bateladas, e obtiveram rendimento de 90,8% e produtividade de 8,2
g/L.h. O tempo de fermentao variou de 8 horas para 14 horas. Choi et al. (2010)
estudaram uma levedura de fuso hibrida, CHFY0321. Esta fuso foi obtida por meio de
uma levedura no floculante de Saccharomyces cerevisiae (CHY1011), com alta
capacidade de produo de etanol e com uma levedura floculante Saccharomyces
bayanus (KCCM12633), com baixa capacidade de produo de etanol. O reator
utilizado foi operado em batelada, obtendo um rendimento terico de 94,2% e
produtividade de 1,38 g/L.h. Tang et al. (2010) estudaram o processo de fermentao
alcolica em reator contnuo, utilizando uma estirpe de levedura floculante KF-7. Estes
pesquisadores encontraram uma produtividade de 6,6 g/L.h operado com sucesso
durante mais de um ms. Pacheco (2010) estudou o processo de produo de etanol
utilizando um reator tubular de escoamento ascendente com recirculao externa, com
uma cepa de levedura com caractersticas floculantes. O rendimento obtido nesse estudo
foi de 98%, produtividade de 13,4 g/L.h e concentrao residual de sacarose de 3,1 g/L.
84
Zhao et al. (2012) realizaram testes com leveduras floculantes em bateladas repetidas. A
levedura BHL01 de Saccharomyces cerevisiae atingiu de 8,30 g/L.h, concentrao final
de etanol de 121,6 g/L e o coeficiente de rendimento de 0,468 g/g. Em outro estudo foi
utilizado uma levedura floculante SPSC01 e a produtividade encontrada foi em torno de
7,63 g/L.h, concentrao final de etanol de 120,4 g/L e coeficiente de rendimento de
0,462 g/g. Gomes et al. (2012) estudaram uma estirpe floculante recombinante de
Saccharomyces cerevisiae. O gene FLO 1 foi transferido para a levedura industrial PE2. Em 10 bateladas repetidas e reciclo de clulas, atingiu uma produtividade mdia de
2,86 g /L.h e concentrao de glicose residual mdia de 28,4 g/L. Devido estirpe ser
floculante, possvel reduzir o custo de produo de etanol pelo fato de no utilizar
centrifugas na separao. Observando os resultados dos artigos pesquisados e
relacionando ao trabalho em questo, constata-se que estes pesquisadores citados
tambm obtiveram alta concentrao de acar residual e longo tempo de fermentao.
Os resultados apresentados no presente estudo empregando reator batelada
alimentada quando comparado com os obtidos na literatura mostram valores
promissores, sendo superior aos obtidos em vrios trabalhos citados anteriormente.
4.5 Influncia do recirculao de clulas e concentrao de etanol e

sacarose no inculo na fermentao alcolica
Com o objetivo de reduzir o acar residual, melhorar a produtividade e
aumentar a concentrao de etanol formado so apresentados alguns experimentos
realizados com pequenas modificaes de processo. Os experimentos A e B, conforme
item 3.2.2.5, foram realizados com as mesmas condies do ponto timo escolhido no
PCC, porm o Experimento A utilizou a recirculao de clulas aps o tempo de
enchimento enquanto o Experimento B utilizou a recirculao durante toda a
fermentao incluindo o tempo de enchimento. Na Figura 4.19 so apresentados os
perfis de concentrao celular, de sacarose e etanol obtidos para o Experimento A, com
recirculao aps as 6 horas de enchimento do reator.
140
140
120
120
120
105
100
100
90
80
75
80
60
60
40
40
20
20
0
0
60
45
30
85
0
12
Tempo (h)
Figura 4.19 Perfis de concentrao de sacarose (), Concentrao de etanol (),

concentrao celular () em funo do tempo para o Experimento A, realizado nas
condies timas do PCC e com recirculao do meio fermentativo, aps as 6 horas de
enchimento do reator
Na Figura 4.20 esto apresentados os perfis de concentrao celular, de
sacarose e etanol obtidos para o Experimento B, com recirculao durante toda a
fermentao. Analisando os resultados do Experimento A, pela Figura 4.19, nota-se que
em 10,5 horas de fermentao obteve-se rendimento de 92,5%, produtividade de 6,20
g/L.h e sacarose residual de 38,46 g/L. Para o Experimento B, conforme resultados
mostrados na Figura 4.20, observa-se um rendimento de 92,29%, produtividade de 6,24
g/L.h e sacarose residual de 37,94 g/L. O etanol produzido ao final da fermentao foi
de 65,12 g/L e 65,56 g/L para o Experimento A e B, respectivamente. Pode-se notar,
tanto para o Experimento A quanto para o Experimento B a obteno de resultados
semelhantes. Por outro lado quando feita a comparao ao Experimento do ponto
timo do PCC, pode-se notar que houve um pequeno acrscimo na produtividade e na
concentrao de etanol produzido e uma diminuio na sacarose residual, mantendo o
mesmo rendimento em torno de 92%. Com estes resultados pode-se avaliar que a
recirculao de clulas melhora o desempenho da fermentao, pois o movimento que a
86
mesma proporciona faz com que haja maior contato do meio com o micro-organismo e
a disperso de molculas no caldo.
120
80
100
80
60
60
40
40
20
0
0
105
90
75
60
45
30
100
140
20
12
Tempo (h)

concentrao celular () em funo do tempo para o Experimento B, realizado nas
condies timas do PCC e com recirculao do meio fermentativo durante toda a
fermentao alcolica
A partir deste estudo realizou-se alguns experimentos, sem etanol inicial, para
observar qual a influncia nas respostas (rendimento, produtividade e sacarose residual)
a concentrao de etanol no inculo pode representar na fermentao. O Experimento C
foi realizado nas mesmas condies do ponto timo do PCC, porm sem etanol inicial e
com substrato no inculo. Pelo fato do inculo conter substrato inicial utilizou-se a
recirculao durante toda a fermentao para que o meio fermentativo ficasse com boa
mistura. Na Figura 4.21 esto apresentados os perfis de concentrao celular, de
sacarose e etanol obtidos para o Experimento C, com recirculao durante toda a
fermentao, sem etanol inicial e com substrato no inculo.
87
140
80
100
60
80
40
60
40
20
20
0
0
90
120
100
75
60
45
30
15
0
0
12
Tempo (h)

concentrao celular () em funo do tempo para o Experimento C realizado nas
condies timas do PCC. Foi retirado o sobrenadante contendo etanol e preenchido
com meio at completar 1,5 L de inculo e realizado a recirculao do meio
fermentativo durante toda a fermentao alcolica
No Experimento C obteve-se um rendimento de 92,97%, produtividade de 7,03
g/L.h e sacarose residual de 22,39 g/L em 10,5 horas de fermentao. O etanol
produzido foi de 73,82 g/L. Quando comparados estes resultados com os resultados do
Experimento do ponto timo do PCC, pode-se notar maior rendimento e produtividade,
menor concentrao de sacarose residual ao final de 10,5 horas de fermentao e um
aumento na produo de etanol.
No Experimento C percebeu-se uma melhoria
significativa no processo. A partir desse resultado foi realizado mais dois Experimentos
(D e E), para observar alguma mudana no processo. O Experimento D foi realizado nas
mesmas condies do Experimento C, porm no foi adicionado meio com substrato no
inculo. Iniciou-se esse processo apenas com a levedura decantada no fundo do reator e
o meio fermentativo foi adicionado durante as 6 horas de enchimento. A recirculao
iniciou-se quando o reator atingiu 1,5 L de seu volume. Na Figura 4.22 esto
apresentados os perfis de concentrao celular, de sacarose e etanol obtidos para o
88
Experimento D, com recirculao durante toda a fermentao, sem etanol inicial e sem
substrato no inculo.
120
120
80
100
60
80
40
60
40
20
20
0
0
90
100
140
75
60
45
30
15
0
0
12
Tempo (h)

concentrao celular () em funo do tempo para o Experimento D realizado nas
condies timas do PCC. Foi retirado o sobrenadante contendo etanol e iniciado o
tempo de enchimento apenas com a levedura decantada no fundo do reator e realizado a
recirculao do meio fermentativo aps o enchimento de 1,5 L do reator
Analisando os resultados do Experimento D verificou-se um rendimento de
84,99%, produtividade de 6,23 g/L.h e sacarose residual de 26,95 g/L em 10,5 horas de
fermentao. O etanol produzido foi de 65,40 g/L. Quando comparados estes resultados
com os resultados do Experimento C, observa-se uma diminuio no rendimento, na
produtividade e no etanol produzido, com sacarose residual prxima para ambos
experimentos. Uma das hipteses para explicar os menores resultados obtidos foi o fato
da fermentao iniciar sem uma mistura do meio com o micro-organismo. O
experimento E foi realizado com as mesmas condies do Experimento C, porm o
inculo iniciou-se sem etanol inicial e sem substrato. A levedura decantada no fundo
reator foi completada com gua destilada para formar o inculo e assim comear o
enchimento do reator com o meio. Na Figura 4.23 esto apresentados os perfis de
89
concentrao celular, de sacarose e etanol obtidos para o Experimento E, com

recirculao durante toda a fermentao, sem etanol inicial e sem substrato no inculo,
apenas com gua destilada.
80
90
60
100
80
40
60
20
40
20
0
0
75
120
60
45
30
15
0
0
12
Tempo (h)

concentrao celular () em funo do tempo para o Experimento E realizado nas
condies timas do PCC. Foi retirado o sobrenadante contendo etanol e preenchido
com gua destilada at completar 1,5 L de inculo e realizado a recirculao do meio
Observando a Figura 4.23 e analisando os resultados obtidos, sendo rendimento
de 88,91%, produtividade de 6,69 g/L.h, sacarose residual de 23,13 g/L e etanol
produzido de 70,24 g/L em 10,5 horas de fermentao, pode-se notar que estas respostas
ainda ficaram abaixo das respostas obtidas no Experimento C.
Visando o melhoramento da produtividade e diminuio da sacarose residual
do Experimento C, foi realizado o Experimento F. Este experimento foi conduzido nas
mesmas condies do Experimento C, porm a concentrao celular foi maior, passando
de 40 para 50 % (v/v) do inculo. Pelas superfcies de resposta e curvas de contorno
para a resposta produtividade do PCC, pode-se avaliar que maior concentrao de clula
no inculo proporciona maiores produtividades. Na Figura 4.24 esto apresentados os
90
perfis de concentrao celular, de sacarose e etanol obtidos para o Experimento F, com

recirculao durante toda a fermentao, sem etanol e com substrato no inculo e
concentrao celular no inculo de 50% (v/v).
100
160
120
60
100
40
80
20
60
40
0
75
60
45
30
15
0
80
90
140
12
Tempo (h)

concentrao celular () em funo do tempo para o Experimento F realizado nas
condies timas do PCC, porm a concentrao celular no inculo foi de 50 % (v/v).
Foi retirado o sobrenadante contendo etanol e preenchido com meio at completar 1,5 L
de inculo e realizado a recirculao do meio fermentativo durante toda a fermentao
alcolica
Analisando a Figura 4.24, nota-se que a sacarose praticamente acabou em 9
horas de fermentao. Neste ponto o rendimento foi de 92,75%, produtividade de 9,26
g/L.h, concentrao de sacarose residual de 2,9 g/L e concentrao de etanol produzido
ao final da fermentao de 83,37 g/L. Em 10,5 horas de fermentao a sacarose foi
praticamente consumida. Este resultado confirma a orientao do PCC no sentido de
que o aumento na concentrao do inculo proporciona aumento na produtividade e no
rendimento e reduo na concentrao de sacarose residual. A partir deste experimento,
realizou-se o Experimento G, com o intuito de melhorar ainda mais a produtividade.
Este experimento foi realizado com as mesmas condies do Experimento F, porm o
tempo de enchimento passou de 6 para 4 horas. Na Figura 4.25 esto apresentados os
91
perfis de concentrao celular, de sacarose e etanol obtidos para o Experimento G, com

recirculao durante toda a fermentao, sem etanol inicial e com substrato no inculo e
tempo de enchimento de 4 horas.
80
80
60
40
60
20
40
90
75
60
45
30
15
0
100
100
20
12
Tempo (h)

concentrao celular () em funo do tempo para o Experimento G realizado nas
condies timas do PCC, porm a concentrao celular no inculo foi de 50 % (v/v) e
o tempo de enchimento de 4 horas. Foi retirado o sobrenadante contendo etanol e
preenchido com meio at completar 1,5 L de inculo e realizado a recirculao do meio
Na anlise dos resultados do Experimento G, pode-se notar que a sacarose
praticamente terminou em 9 horas de fermentao, com concentrao final de 1,98 g/L.
O rendimento obtido foi de 87,26%, produtividade de 8,76 g/L.h e etanol produzido ao
final de 9 horas de fermentao de 78,86 g/L. Este experimento mostrou uma
diminuio de rendimento, produtividade e produo de etanol em relao ao
Experimento F. Este fato tambm explicado pelas superfcies de resposta e curvas de
contorno para a resposta rendimento, pois quando se utiliza concentrao celular alta o
tempo de enchimento deve ficar em torno de 6 horas.
Alguns requisitos so importantes para a escolha de uma levedura para o
processo fermentativo, como: alto rendimento em etanol, alta produtividade, boa
92
resistncia bacteriana e boa adaptao com concentraes mais elevadas de substrato.

Com isso, foi realizado o Experimento H, nas mesmas condies do Experimento G,
porm a concentrao de sacarose do meio fermentativo passou de 170 g/L para 220
g/L. Na Figura 4.26 esto apresentados os perfis de concentrao celular, de sacarose e
etanol obtidos para o Experimento H, com recirculao durante toda a fermentao, sem
etanol inicial, com substrato no inculo e meio com concentrao de sacarose de 220
g/L .
90
100
75
100
60
80
60
60
40
40
0
80
120
140
45
30
15
0
12
Tempo (h)

concentrao celular () em funo do tempo para o Experimento H realizado nas
condies timas do PCC, porm a concentrao celular no inculo foi de 50 % (v/v) e
a concentrao de sacarose foi de 220 g/L. Foi retirado o sobrenadante contendo etanol
e preenchido com meio at completar 1,5 L de inculo e realizado a recirculao do
meio fermentativo durante toda a fermentao alcolica
A partir dos resultados obtidos pelo Experimento H, obteve-se um rendimento
de 86,11%, produtividade de 7,91 g/L.h, sacarose residual de 40,58 g/L e etanol
produzido ao final de 10,5 horas de fermentao de 83,10 g/L. Comparando este
experimento com o Experimento F, pode-se observar uma diminuio no rendimento e
produtividade. Porm o experimento se mostrou positivo quando comparado a dados da
literatura. Observando os dados da literatura, pode-se perceber que a maioria dos
93
estudos que envolvem leveduras floculantes com reator batelada, o processo necessitou
de tempos longos de fermentao. He, Zhao e Bai (2012) estudaram uma cepa
Saccharomyces cerevisiae com o gene FLO1 isolado da levedura floculante SPSC0 e
realizaram testes em frascos Erlenmeyer, com a concentrao inicial de glicose de 250
g/L. Quase toda a glicose foi consumida no prazo de 48 horas, cerca de 110 g de
etanol/L foi produzido.
O presente trabalho apresentou como principal contribuio para o processo de
fermentao alcolica com levedura floculante o emprego da recirculao de clulas.
Isso contribuiu sensivelmente para uma melhor homogeinizao do meio, com
diminuio das resistncias transferncia de massa, com conseqente aumento de
rendimento e produtividade em relao ao mesmo processo sem recirculao. A
decantao de clulas de levedura contribui para a diminuio do teor de lcool no
fermento reciclado e esse fato contribui para a diminuio da inibio pelo produto
durante a fermentao.
Os micro-organismos podem ser inibidos pelo prprio substrato utilizado ou
produtos formados. Por exemplo, os produtos tais como o etanol, butanol, acetona,
cido actico tm um forte impacto sobre o crescimento de clulas devido sua elevada
toxicidade. Quando se utiliza a levedura S. cerevisiae para produzir etanol, pode-se
notar ao longo do processo a morte celular pela toxidade do produto. Em concluso,
quando o produto altamente txico no se pode esperar um aumento significativo na
concentrao do produto final (DOMBEK e INGRAM, 1988; SRIYUDTHSAK e
SHIRAISHI, 2010).
Pelos experimentos realizados, nota-se que o etanol pode influenciar
fortemente na fermentao alcolica. Comparando o Experimento B com o
Experimento C essa influncia fica clara, pois a produo de etanol aumentou ao final
de 10,5 horas, pelo fato da fermentao no iniciar com etanol no inculo. O
experimento no qual se obteve os melhores resultados no processo fermentativo em
batelada alimentada neste trabalho, utilizando a levedura C2/00, foi o Experimento F.
Os resultados obtidos foram: 92,75% de rendimento, 9,26 g/L.h de produtividade, 2,9
g/L de concentrao de sacarose residual e concentrao de etanol produzido de 83,37
g/L em 9 horas de processo fermentativo. Este resultado mostra que a utilizao de
leveduras floculantes em processo batelada alimentada apresenta resultados satisfatrios
quando comparado aos da literatura apresentado anteriormente (XU, ZHAO e BAI,
2005; REDDY e REDDY, 2006; WANG et al., 2006; CHOI et al., 2010; TANG et al.,
94
2010; ZHAO et al., 2012; GOMES et al., 2012). A anlise conjunta das variveis
estudadas, empregando o Planejamento Composto Central, foi importante para orientar
a realizao de uma sequncia de experimentos. Com isso possibilitou determinar
condies que melhorasse o desempenho do processo batelada alimentada com levedura
floculante. Alm disso, os resultados alcanados neste estudo so iguais ou superiores
aos obtidos nas usinas brasileiras, que utilizam leveduras no floculantes.
4.6 Estimativa dos parmetros do modelo para a fermentao em batelada

A partir dos resultados experimentais da fermentao em batelada foi realizada
a estimativa dos parmetros do modelo de Tosetto e Andrietta (2002), conforme
Equao 4.7. Os parmetros calculados e os obtidos pelo ajuste do modelo aos
resultados experimentais esto apresentados na Tabela 4.10.
= max
S
P
1
2
(4.7)
Tabela 4.10 Parmetros obtidos a partir dos dados experimentais e do ajuste do

modelo em batelada
Parmetros
Dimensionais
m [h-1]
0,103 0,260x10-1
1/Yx/S [gS/(gX)]
16,2 3,70
1/Yx/P [gP/(gX)]
4,69 4,90x10-2
Pmx [g/L]
114,3 83,00x10-1
0,63 0,24
Ms[gS/(gX.h)]
b[gP/(gX.h)]
0,09 0,18 x 10-1
KS[gS/L]
30,24 0,11 x 10+1
KI[gS/L]
109,86 0,22 x 10+2
Pacheco (2010) utilizou a levedura floculante de Saccharomyces cerevisiae em

reator tubular, tipo torre, operando em batelada, sem agitao e encontrou valores para
KS e KI igual a 34,2 e 181,6 g/L. Avaliando os valores encontrados por Pacheco (2010),
95
pode-se notar que a inibio pelo substrato foi menor que a encontrada neste trabalho,
uma vez que o valor KI (109,86 g/L) foi inferior ao encontrado pelo outro autor (181,6
g/L). A Figura 4.27 apresenta os resultados simulados pelo modelo e os experimentais.
Pode-se notar que o modelo proposto, representou de forma satisfatria os resultados
experimentais. Outro indicativo positivo do bom ajuste foi o desvio padro obtido para
cada parmetro calculado.
100
160
90
140
80
30
120
25
100
20
80
60
15
40
10
70
60
50
40
35
180
40
30
20
5
12
15
20
Tempo (h)
Figura 4.27 Perfil da concentrao celular (), sacarose () e etanol () em funo do

tempo para o experimento com 160 g/L de concentrao de sacarose e 4% (v/v) de
concentrao celular no reator. As linhas () representam o modelo aplicado aos dados
experimentais. As linhas pontilhadas (---) representam a perturbao de 5% no perfil
simulado

Para verificar o comportamento do modelo para o processo em batelada
alimentada foi usado o experimento nas condies timas do PCC, com concentrao de
sacarose de 170 g/L, concentrao celular no inculo de 40% (v/v) e tempo de
enchimento em 6 horas. Os rendimentos de etanol e celular em relao ao consumo de
96
substrato foram calculados utilizando os valores experimentais. Na Tabela 4.11 esto

apresentados os parmetros obtidos a partir dos resultados experimentais.
modelo em batelada alimentada
Parmetros
Dimensionais
Calculados pelos dados experimentais do processo em

batelada alimentada
m [h-1]
0,080
1/Yx/S [gS/(gX)]
14,925
1/Yx/P [gP/(gX)]
6,849
Ms[gS/(gX.h)]
0,015
Ajustados pelo modelo
Pmx [g/L]
114,32
0,63
KS[gS/L]
30,24
KI[gS/L]
109,86
O perfil do enchimento do reator em 6 horas est apresentado na Figura 4.28.
Volume (L)
1
0
10
15
20
T em po (h)
Figura 4.28 Perfil do volume do reator em relao ao tempo
97
Os valores experimentais e o resultado predito pelo modelo para o reator
110
120
100
100
60
80
60
40
40
20
20
0
10
15
20
80
140
90
80
70
60
50
batelada alimentada, em relao ao tempo esto apresentados na Figura 4.29.
40
Tempo (h)

tempo para o experimento com 170 g/L de concentrao de sacarose, 12% (v/v) de
concentrao celular no reator e 6 horas de enchimento. As linhas () representam o
modelo aplicado aos dados experimentais. As linhas pontilhadas (---) representam a
perturbao de 5% no perfil simulado

com recirculao de meio fermentativo
Para avaliar a influncia da agitao, com o da recirculao de clulas, do
meio fermentativo no comportamento do processo em batelada alimentada, foi usado o
Experimento F, conforme item 4.5. Este experimento apresentou as melhores condies
de processo, com maior rendimento em etanol e produtividade. Esse experimento foi
realizado nas condies de 170 g/L de sacarose, 50% (v/v) do inculo e tempo de
enchimento em 6 horas. Este experimento tambm foi utilizado para verificar a
validao dos parmetros cinticos ajustados pelo processo com operao em batelada.
Assim, os coeficientes de rendimento em etanol e celular em relao ao consumo de
substrato foram calculados utilizando os dados experimentais e os demais parmetros
98
foram os ajustados para o experimento em operao batelada. Na Tabela 4.12, esto

apresentados os parmetros obtidos a partir dos valores experimentais e os ajustados
pelo modelo.
modelo em batelada alimentada com recirculao
Parmetros
Dimensionais
Calculados pelos dados experimentais do processo em

batelada alimentada
m [h-1]
0,182
1/Yx/S [gS/(gX)]
12,410
1/Yx/P [gP/(gX)]
5,854
Ms[gS/(gX.h)]
b[gP/(gX.h)]
Ajustados pelo modelo
Pmx [g/L]
114,32
0,63
KS[gS/L]
30,24
KI[gS/L]
109,86
O perfil do enchimento do reator durante o perodo de fermentao est

apresentado na Figura 4.30.
5,5
5,0
4,5
Volume (L)
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,00
10
Tem po (h)
Figura 4.30 Perfil do volume do reator em relao ao tempo para o experimento em

batelada alimentada com recirculao
99
Os valores experimentais para o experimento em batelada alimentada com

tempo de enchimento igual a 6 horas e o resultado predito pelo modelo esto
apresentados na Figura 4.31.
100
90
80
60
60
50
40
40
30
20
20
10
00
10
70
80
60
40
20
100
80
Tempo (h)

tempo para o experimento com 170 g/L de concentrao de sacarose, 15% (v/v) de
concentrao celular no reator e 6 horas de enchimento. As linhas () representam o
modelo aplicado aos dados experimentais. As linhas pontilhadas (---) representam a
perturbao de 5% no perfil simulado
De acordo com a Figura 4.31 o modelo proposto conseguiu descrever bem o
consumo de substrato e de formao de produto ao longo do processo fermentativo. A
concentrao celular s foi bem descrita pelo modelo aps o enchimento do reator o que
no invalida a utilizao do modelo cintico, pois o mesmo conseguiu descrever muito
bem as quatro ltimas horas do processo fermentativo.
Uma anlise dos valores de mx para os experimentos em batelada, batelada
alimentada e batelada alimentada com recirculao indica pouca variao entre os dois
primeiros experimentos, mas quando se operou com a recirculao verificou-se um
aumento significativo neste parmetro, mostrando que a mistura causada pela
recirculao aumentou o crescimento das leveduras. O mesmo comportamento foi
verificado quando se analisou o rendimento celular Yx/S. O Yp/s apresentou valores em
100
getanol/gsacarose de 0,29 para o batelada, 0,46 para o batelada alimentada e 0,47 para o
batelada alimentada com recirculao.
4.7 Perfil da produo mxima de etanol (Pmx)

Na Figura 4.32 esto apresentados os resultados do experimento da produo
de etanol, crescimento celular e consumo do substrato em relao ao tempo (conforme
item 3.2.2.7), visando determinar a produo mxima de etanol (Pmx). Pode-se
perceber pela Figura 4.32, que aps o tempo de 30 horas de fermentao, a levedura
sofreu inibio pelo produto no consumindo mais substrato. A produo mxima de
etanol foi de 110 g/L, aproximadamente 13,92% (v/v). Observa-se tambm que ao final
da fermentao no houve crescimento da levedura, mantendo sua concentrao inicial.
140
120
120
100
100
80
100
60
80
60
40
40
20
20
0
10
20
30
40
Tempo (h)
50
60
80
60
40
20
160
120
180
Figura 4.32 Perfis de concentrao de sacarose () e concentrao de etanol (),

concentrao celular () em funo do tempo para o Pmx
Alguns pesquisadores relataram que a adio de etanol no meio de cultura foi
menos txica para S. cerevisiae do que o etanol produzido pela fermentao alcolica.
Isto indica que existem outros subprodutos metablicos, que podem causar inibio e
podem apresentar impurezas no sistema de fermentao. As taxas de mortalidade,
tambm foram mais baixas com a adio de etanol quando comparado com a
101
concentrao de etanol produzido na fermentao alcolica (NAJAFPOUR, 2004). Por

esta razo, prefervel que os modelos cinticos sejam desenvolvidos sob as condies
de fermentao reais, o qual mostra que alm do etanol outros produtos da fermentao
podem agir como inibidores (BAI, ANDERSON e MOO-YOUNG, 2008).
4.8 Estudo da concentrao mxima de etanol em que cessa o crescimento

microbiano (Pmx)
Os micro-organismos podem ser inibidos pelos substratos prprios e/ou
produtos. Os resultados do crescimento da levedura em diferentes concentraes de
etanol esto apresentados na Tabela 4.13. Pode-se verificar que a concentrao limitante
de etanol foi de 12% (v/v), correspondendo a 94,8 g/L de etanol. Estes resultados
indicam que a levedura C2/00 apresentou uma boa resistncia ao etanol.
Tabela 4.13- Crescimento da levedura em diferentes concentraes de etanol
Concentraes (% v/v)
Cepa
12
12,5
13
13,5
14
14,5
15
C2/00
18
21
4.9 Velocidade especfica de sedimentao da levedura C2/00

Com os resultados de absorbncia medidos em funo do tempo, conforme
experimento do item 3.2.2.8, foram realizados os clculos de velocidade especfica de
sedimentao (VES) para cada valor de pH estudado. O clculo foi realizado no tempo
igual a 4 minutos. Este tempo foi escolhido pelo fato da sedimentao praticamente se
tornar constante neste ponto para todos os perfis de sedimentao. Na Tabela 4.14 esto
apresentados os valores calculados de velocidade especfica de sedimentao para cada
pH estudado.
102
Tabela 4.14- Velocidade especfica de sedimentao em diferentes valores de pH para a

levedura C2/00
pH
VES (min-1)
0,086
0,144
0,240
0,178
0,141
Analisando a Tabela 4.14, observa-se que a maior velocidade de sedimentao

foi para o pH 5 de 0,240 min-1. J para valores de pH menor que 5 houve uma queda
expressiva na velocidade de sedimentao. O pH final observado na fermentao
alcolica para a levedura C2/00 foi em torno de 4 0,1. Uma alternativa para obter uma
sedimentao mais eficiente para o processo seria ajustar, ao final da fermentao, o
valor de pH para 5. Na Figura 4.33 esto apresentados os valores de Abs/Abs0 em
funo do tempo para a levedura em diferentes valores de pH. Pela Figura 4.33 fica
evidente a maior velocidade de sedimentao para o pH 5.
1,0
(A/A0)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0
10
T em po (m in)
Figura 4.33 Perfis de sedimentao em pH 3 (), pH4 (), pH5 (), pH6 () e pH 7
() em funo do tempo
103
4.9.1 Sedimentao da levedura utilizando uma proveta em pH 5

A partir dos resultados obtidos da sedimentao em proveta da levedura C2/00,
com valor de pH 5 do meio, foi ajustado o modelo descrito pela Equao 4.8. Este
modelo descreveu a variao da altura da interface com o tempo para o clculo da
velocidade mdia de sedimentao. O perfil de velocidade foi calculado a partir da
derivada da Equao 4.8 com o tempo a qual descrito pela equao 4.9.
x
Y = a + b.exp
(4.8)
b
x
v = .exp
c
c
(4.9)
Sendo,
Y = Altura da interface em um tempo t (cm);
v = velocidade de sedimentao (cm/min);

X= tempo de sedimentao da levedura (min);
a,b,c= parmetros da equao.
O coeficiente de correlao (R2) obtido aps o ajuste foi de 0,99, o qual indica
um ajuste adequado aos dados experimentais na obteno da velocidade de
sedimentao, mostrando que 99% da variabilidade dos dados foram explicados pela
equao proposta. Os perfis de velocidade de sedimentao para o teste em proveta,
perfil da altura da interface e o perfil do modelo proposto em funo do tempo esto
apresentados na Figura 4.34.
O clculo de velocidade mdia de sedimentao foi realizado no tempo de 80
minutos, pois a partir desse tempo a velocidade se tornou praticamente constante. A
velocidade mdia de sedimentao foi de 0,444 cm/min.
104
Figura 4.34 Perfil do modelo da velocidade de sedimentao para o teste em proveta

(
), perfil da altura da interface () e o perfil do modelo proposto (
) em funo do
tempo
Os resultados relativos sedimentao da levedura sero de grande
importncia no dimensionamento do decantador a ser usado na separao do fermento
em processos industriais.
CAPTULO 5
CONCLUSES
A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que:
A cepa C2/00 apresentou os melhores resultados no estudo da capacidade

fermentativa, obtendo 0,50 gp/gs de coeficiente de rendimento e 3,60 g/L.h de
produtividade. Os parmetros de rendimento em etanol e produtividade so
considerados os mais importantes para a indstria alcooleira;
A levedura C2/00 apresentou colnia lisa, pelo estudo da caracterstica

fenotpica;
As melhores condies selecionadas pela tcnica de superfcie de respostas

para as variveis estudadas foram: concentrao de sacarose de 170 g/L, concentrao
celular no inculo de 40% (v/v) e tempo de enchimento de 6 horas do reator batelada
alimentada. Com estas condies obteve-se rendimento em etanol de 92,20 0,55%,
produtividade de 6,01 0,12 g/L.h e sacarose residual de 42,84 2,21 g/L. O etanol
produzido neste experimento foi de aproximadamente 63,07 3,83 g/L em 10,5 horas
de fermentao;
Os resultados do estudo da influncia derecirculao de clulas,

concentrao de etanol e sacarose no inculo, mostrou que o experimento que obteve os
melhores resultados no processo fermentativo em batelada alimentada neste trabalho,
foi o Experimento F. O experimento F foi realizado praticamente nas mesmas condies
timas do PCC, porm foi realizada a recirculao de clulas durante toda a
fermentao. O inculo iniciou sem etanol, com substrato e a concentrao celular no
inculo foi de 50 % (v/v). Os resultados obtidos foram: 92,75% de eficincia, 9,26 g/L.h
de produtividade, 2,9 g/L de concentrao de sacarose residual e concentrao de etanol
produzido foi de 83,37 g/L em 9 horas de processo fermentativo;
Captulo 5 - Concluses
106
O modelo cintico de Tosetto e Andrietta (2002) se ajustou bem aos dados

experimentais. Houve uma boa correlao entre os valores experimentais e os valores
obtidos;
A produo mxima de etanol (Pmx) para a levedura C2/00 foi de 110

g/L, sendo aproximadamente 13,92% (v/v);
Os resultados do crescimento da levedura em diferentes concentraes de

etanol (Pmx) resultou em uma concentrao limitante de etanol de 12,5% (v/v),
correspondendo a 94,8 g/L de etanol. Estes resultados indicam que a levedura C2/00
obteve uma boa resistncia ao etanol.
A velocidade especifica de sedimentao para a levedura C2/00 em pH foi

de 0,240 min-1. A velocidade de sedimentao para o teste realizado em proveta foi de
0,444 cm/min. Pelos resultados obtidos, observou-se uma boa velocidade de
sedimentao para a levedura C2/00 o que viabiliza o seu uso industrial.
CAPTULO 6
SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS
Avaliar a eficincia fermentativa das leveduras em funo do nmero de

ciclos de fermentao;
Avaliar a fermentao alcolica com alta concentrao celular (VHG) em

termos de inibio pelo substrato e inibio pelo produto;
Estudar a influncia da composio do meio fermentativo em relao ao

estresse celular e em relao floculao;
Avaliar a contaminao bacteriana no processo em batelada alimentada.
CAPTULO 7
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and improved ethanol fermentation using stable genetically engineered flocculating
yeast strains. Process Biochemistry, v. 47, p. 16121619, 2012.
CAPTULO 8
ANEXO
Anexo (A1): Agar de contagem

- Componente/Concentrao (g/L);
- KH2PO4: 1,0g;
- NaCl: 5g;
- Extrato de carne: 3g;
- Peptona: 10g;
- Agar: 15g;
- Nistatina: 0,02 g/L;
- pH do meio: 7,5.
Anexo (A2): Meio WLN (Wallerstein Laboratory Nutrient Medium)

- Quantidade para 100 mL:
Glicose
5,0000 g
KH2PO4
0,0550 g
(a)
KCl
0,0425 g
(b)
CaCl2 . 2H2O
0,0125 g
(c)
MgSO4 . 7H2O
0,0125 g
(d)
FeCl2 . 6H2O
0,2500 mg (e)
MnSO4 . 4H2O
0,2500 mg (f)
Casena hidrolisada enzimaticamente
0,5000 g
Extrato de levedura
0,4000 g
Agar
2,0000 g
Verde de Bromocresol
0,0022 g
cido Nalidxico
5,0000 mg (h)
Ampicilina
5,0000 mg (i)
O pH foi acertado em 5,5 0,1.
(g)
Captulo 9 - Apndice
125
Observao: Os componentes a, b, c, d, e, f, g, h, i foram adicionados na forma de

soluo.
- Soluo de KH2PO4 - 5,5 g/100 mL. Foi usado 1 mL para 100 mL de meio.
- Soluo de KCl - 4,25 g/100 mL. Foi usado 1 mL para 100 mL de meio.
- Soluo de CaCl2 . 2H2O - 1,25 g/100 mL. Foi usado 1 mL para cada 100 mL de meio.
- Soluo de MgSO4 . 7H2O - 1,25 g/100 mL. Foi usado 1 mL para cada 100 mL de
meio.
Soluo de FeCl2 . 6H2O - 0,5 g/200 mL. Foi usado 0,1 mL para cada 100 mL de meio
(2,5 mg/mL ou 0,15 mL de soluo com 1,625 mg/mL para cada 100 mL de meio).
- Soluo de MnSO4 . H2O - 0,5 g/200 mL. Foi usado 0,1mL para cada 100 mL de meio.
- Verde de bromocresol - 200 mg/100mL. Foi dissolvido em 5 mL de lcool e e
completado com 100 mL de gua. Usou-se 1 mL para cada 100 mL de meio.
- Soluo de ampicilina Diluiu-se um comprimido de 500 mg de ampicilina em gua
destilada, completando o volume a 100 mL. Usou-se 1 mL para 100 mL de meio.
- Soluo de cido nalidxico Diluiu-se um comprimido de 500 mg de cido nalidxico
em soluo de NaOH 0,05N completando o volume a 100 mL.
Anexo (A3): Meio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose)

- Componente/Concentrao (g/L);
- Extrato de levedura: 10g;
- Peptona: 20g;
- Dextrose: 20g;
- gar: 20g.
CAPTULO 9
APNDICE
Apndice (A1): Curva de calibrao para a concentrao de sacarose
Apndice (A2): Curva de calibrao para a concentrao de glicose
Captulo 9 - Apndice
Apndice (A3): Curva de calibrao para a concentrao de frutose
Apndice (A4): Curva de calibrao para a concentrao de etanol
127

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

Fermentao Alcolica em Batelada

Carla Zanella Guidini

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA

Fermentao Alcolica em Batelada

Carla Zanella Guidini

Tese de doutorado apresentada ao

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA...........................................................

2.2.1 Cana de acar como principal matria-prima para produo de

2.2.2 Outras matrias-primas para produo de etanol.................................

2.3.1 Processo batelada..................................................................................

2.3.2 Processo batelada alimentada...............................................................

2.3.4 Processo contnuo.................................................................................

2.4 Bioqumica da fermentao alcolica...............................................................

2.4.1 Fatores que a afetam a fermentao alcolica.....................................

2.5.1 Efeitos dos produtos de fermentao sobre a levedura........................

2.6 Levedura floculante...........................................................................................

2.6.1 Fatores que influenciam a floculao...................................................

2.6.1.1 Fatores genticos......................................................................

2.6.1.2 Fatores fisiolgicos..................................................................

2.6.1.3 Influncia da concentrao de clcio e sais do meio...............

2.6.1.5 Influncia do etanol..................................................................

2.6.1.6 Agitao e aerao....................................................................

2.7 Floculao por bactrias e contaminao bacteriana.........................................

2.8 Desfloculao de leveduras...............................................................................

2.9 Aplicaes das leveduras floculantes em processos biotecnolgicos...............

2.10 Produo de bioetanol a partir de levedura floculante.....................................

2.11 Capacidade fermentativa.................................................................................

2.12 Cintica da fermentao alcolica...................................................................

CAPTULO 3 MATERIAL E MTODOS.................................................................

3.1.1 Micro-organismo e meio de cultura.....................................................

3.1.2 Procedimento e unidade experimental.................................................

3.2.1 Mtodos analticos................................................................................

3.2.1.1 Determinao da concentrao celular.....................................

3.2.1.3 Contagem do nmero inicial de clulas...................................

3.2.1.4 Contaminao bacteriana..........................................................

3.2.1.5 Determinao de acar e etanol..............................................

3.2.2 Metodologia experimental....................................................................

3.2.2.1 Seleo da levedura..................................................................

3.2.2.2 Caractersticas fenotpicas.......................................................

3.2.2.3 Concentrao celular no inculo..............................................

3.2.2.4 Influncia da concentrao inicial de substrato, concentrao

3.2.2.5 Estudo da recirculao de clulas e concentrao inicial de

3.2.2.6 Cintica da fermentao alcolica e modelagem matemtica..

3.2.2.6.1 Modelo para a fermentao alcolica em processo

3.2.2.6.2 Validao do modelo para a fermentao alcolica em

3.2.2.6.3 Ajustes dos parmetros cinticos...................................

3.2.2.7 Estudo da produo mxima de etanol na fermentao

3.2.2.8 Concentrao mxima de etanol em que cessa o crescimento

3.2.2.9 Estudo da velocidade especfica de sedimentao da levedura

3.2.2.9.1 Estudo em proveta da sedimentao da levedura em

CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO........................................................

4.1 Avaliao da capacidade fermentativa.............................................................

4.2 Caractersticas fenotpicas da levedura C2/00..................................................

4.3 Concentrao celular no inculo.......................................................................

4.4 Influncia da concentrao inicial de substrato, concentrao celular no

4.4.1 Anlise dos resultados obtidos para a resposta rendimento em etanol

4.4.2 Anlise dos resultados obtidos para a resposta produtividade em

4.5 Influncia da recirculao de clulas e concentrao de etanol e sacarose no