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Clonagem de amplicons de Nosema apis e Nosema ceranae usando

TOPO TA(1)
Éverton Cadaval(2), Rafael Hencke Tresbach(3), Andrés Delgado Cañedo(4), Juliano
Tomazzoni Boldo(5)
(1) Trabalho

executado com recursos do Edital CNPq Universal 2013 (Processo nº. 473528/2013-4).
Discente de Ciências Biológicas, bolsista do Programa de Desenvolvimento Acadêmico; Universidade Federal do
Pampa (UNIPAMPA); São Gabriel, Rio Grande do Sul; evertoncadaval@yahoo.com.br;
(3) Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas; Universidade Federal do Pampa (UNIPAMPA);
São Gabriel, Rio Grande do Sul; tresbach@gmail.com;
(4) Professor Adjunto IV; Universidade Federal do Pampa (UNIPAMPA), Campus São Gabriel;
(5) Orientador; Professor Adjunto III; Universidade Federal do Pampa (UNIPAMPA), Campus São Gabriel;
(2)

RESUMO: Nosemose é uma doença que afeta gravemente as abelhas na atualidade, causando danos em todos os
produtos gerados por elas, como a produção de mel, própolis, cera e apitoxina, além da diminuição de culturas
dependentes da polinização por parte destes insetos. Visando estudos de controle da doença, o presente trabalho tem
como objetivo a síntese e manutenção de fragmentos de DNA de duas espécies do gênero Nosema, N. apis e N.
ceranae através das técnicas de PCR e clonagem gênica. A clonagem foi realizada utilizando-se o kit TOPO TA® e a
transformação bacteriana por eletroporação em células eletrocompetentes da espécie Escherichia coli, cultivadas em
meio LB suplementado com ampicilina, para posterior extração de DNA plasmidial com o método de lise alcalina e
clivagem do material obtido. Após a realização de todos os processos, o DNA plasmidial extraído foi enviado para o
sequenciamento. Com os resultados dos experimentos foi possível obter amostras facilmente sintetizáveis para
utilização em estudos de caso de nosemose no estado.
Palavras-Chave: Nosema sp., eletroporação, lise alcalina, Escherichia coli.

INTRODUÇÃO
Nosema apis é um parasita intestinal que coevoluiu com a abelha europeia (Apis mellifera) e é
conhecido como o causador de uma série de mudanças metabólicas no hospedeiro (MARTÍN-HERNANDÉZ
et al., 2007). Como um contraste, Nosema ceranae é um microsporídio relativamente novo, que é a causa
de stress energético nas abelhas melíferas, diminuindo a porcentagem de sobrevivência dos indivíduos
infectados (MARTÍN-HERNANDÉZ et al., 2007). Um estudo sobre os casos de nosemose no estado já está
em andamento, utilizando-se de ferramentas de biologia molecular. Porém, a falta de amostras de controle
positivo vem sendo um empecilho na continuidade do projeto. A melhor alternativa encontrada para resolver
o problema foi a clonagem gênica.
A clonagem gênica consiste na inserção de um fragmento específico de DNA (inserto) em um
plasmídeo ou no cromossomo de um bacteriófago, que agem como vetores de clonagem, levando a uma
replicação do inserto em um hospedeiro apropriado, como uma célula de levedura ou uma bactéria. A
replicação ocorre quando o sistema de síntese do DNA do hospedeiro replica o DNA que foi inserido na
célula hospedeira. Dessa maneira, partindo das células transformadas, é possível obter-se grande
quantidade de células idênticas (clones), todas portando o DNA recombinante. O clone, depois de formado,
pode ser extraído das células transformadas, bem como, sequenciado e comparado com outras sequencias
já descritas, utilizado no estudo de expressão gênica dos genes contidos no clone, ou ser usado para gerar
um produto específico (BROWN, 2003).
Neste sentido, devido à necessidade de controles positivos padronizados para experimentos de
prevalência de Nosema sp. no estado, objetivamos a clonagem de segmentos de DNA de N. apis e N.
ceranae utilizando o sistema TOPO® TA Cloning (Invitrogen).
METODOLOGIA
Inicialmente, foi realizada uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), utilizando os primers
descritos por Martín e colaboradores (2007), em fragmentos utilizados como controle positivo de N. apis e
N. ceranae gentilmente cedidos pela Drª. Erica Weinstein Teixeira (APTA - SP), com posterior eletroforese
em gel de agarose 1 %. Os fragmentos utilizados correspondem ao gene ribossomal 16S (MARTÍNHERNANDÉZ et al, 2007). A purificação do DNA de N. apis e N. ceranae foi realizada com o kit Gel DNA
Purification (Mebep Bioscience®, China). Após a purificação, o preparo do material para a clonagem foi feito
com o kit TOPO® TA Cloning (Invitrogen, EUA), com algumas alterações no protocolo do fabricante.
Foi realizada a eletroporação dos vetores contendo os fragmentos de N. apis e N. ceranae
utilizando cubetas de 0,2 mm, a uma voltagem de 2,5 kV por 5 ms, ambos com 1 µL de vetor TOPO e do
vetor íntegro px461 (controle positivo), em bactérias Escherichia coli DH5α eletrocompetentes. A
eletroporação foi feita para N. apis e N. ceranae separadamente. Para cada eletroporação, foi efetuado um
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. JABAJI.. PRIETO. é necessário sequenciar os plasmídeos para confirmarmos a identidade das sequências clonadas. EUA) com 100 µg/µL de ampicilina e 2% de ágar. 20. Cold Spring Harbor. Detection of Nosema apis and Nosema ceranae in honey bee bottom scraps and frass in naturally infected hives. The University of Mississippi Medical Center. Após. Como perspectivas futuras para este trabalho. 2001). GARRIDO. foi recolhido com o auxílio de um palito estéril. D. pois é simples e ainda eficiente. Outcome of Colonization of Apis mellifera by Nosema ceranae. procedeu-se com a extração de DNA plasmidial pelo protocolo de lise alcalina (SAMBROOK e RUSSEL. ceranae clivado com BamHI e XhoI. Com o produto da lise foi realizada uma clivagem do vetor com inserto de N.ed. Pesquisa e Extensão – Universidade Federal do Pampa . ceranae sem clivagem.controle negativo sem vetor. COPLEY. SAMBROOK. MEANA. S.. MARTÍN-HERNANDEZ.BAILÓN. MING-YI. com a clivagem utilizando um dos vetores. 3 e 5: N. R. podem-se incluir estudos mais específicos dos casos de nosemose no estado. 2003. 4.. Z. 7 e 9: N. as quais foram incubadas em meio LB líquido contendo 50 µg/µL de ampicilina a 37 ºC com 250 RPM de agitação. L. Observamos que. M. apis clivado com BamHI e XhoI.. H. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. O cultivo das bactérias foi realizado em meio SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression). P. Artmed Editora S. pode-se concluir que as técnicas de clonagem gênica com eletroporação são eficazes e podem contribuir de diversas maneiras para estudos futuros. foi possível observar o DNA linear dentro do padrão de bandas esperado.M. 73. A.. 6 e 8: N. incluindo a Thermus aquaticus (Taq) polimerase (MING-YI e GOMEZ-SANCHEZ. utilizando o DNA sintetizado nesse experimento como controle positivo. produzindo resultados satisfatórios. A clonagem utilizando TOPO TA é um dos mais simples e eficientes métodos para clonagem de produtos de PCR. R. 2007. sendo as endonucleases de restrição escolhidas a BamHI (Thermo Scientific. RUSSEL. ceranae com o tamanho do vetor utilizado. pois o procedimento explora as atividades terminais da transferase de algumas polimerases termofílicas. 2012. apis e N. A. A clivagem com as duas enzimas nos mostrou que o padrão de bandas do amplicon que utilizamos está dentro do tamanho esperado. 2001. Canaleta 1: Marcador Molecular GeneRuler (Thermo Scientific. quando somado o padrão de N.. Universal TA Cloning.. NY. USA. Applied and Enviromental Microbiology. C. 6331-6338. Anais do VII Salão Internacional de Ensino. Cold Spring Harbor Laboratory. T. EUA). SALVADOR. 753-760. apis ou N. as quais foram incubadas na estufa a 37 °C por 24 horas. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10000pb 2500pb 1000pb 500pb 100pb Figura 1 . Endocrinology. sendo quatro placas com vetores e as demais quatro placas com o controle negativo. Apidologie. amostras das colônias positivas. Porto Alegre. de acordo com o mapa do vetor. E. EUA). apis sem clivagem. 2000). No entanto. ceranae. A clivagem foi efetuada de acordo com as instruções do fabricante e foi visualizada em gel de agarose 1%. 2 e 4: N. Foram feitas oito placas de cultivo contendo meio LB (Lysogeny Broth) Lennox (Invitrogen.Confirmação da obtenção dos clones positivos. GIOVENAZZO. REFERÊNCIAS BROWN. Para a realização da extração de DNA plasmidial.. O resultado da clivagem foi enviado para o sequenciamento. conforme pode ser observado na Figura 1. Portanto esse foi o método escolhido para a preparação dos vetores para a clonagem. T. EUA) e a XhoI (Thermo Scientific.A. RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste trabalho foi possível observar que a clonagem foi bem sucedida. HIGES. GOMEZ-SANCHEZ. CONCLUSÃO A partir dos resultados obtidos. 43. E. 2000. J. Clonagem Gênica e Análise de DNA. por 16 h. A.