Você está na página 1de 10

Instituto Tecnolgico de

Acapulco
Departamento de Ingeniera
Qumica y Bioqumica
Microbiologa en Alimentos
M.C Miguel ngel Daz Alday

DETERMINACION DE SHIGELLA Y
SALMONELLA EN CARNES

Alumno: Guillermo Sustegui Vargas

16/04/2016

Introduccin
El gnero Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Como el nombre
lo indica, Enterobactericeae comprende bacterias que proliferan en el intestino;
varios gneros de esta familia contienen especies patgenas. Adems de
Salmonella, se incluyen especies patgenas transmitidas por los alimentos de los
gneros Escherichia, Shigella y Yersinia (Yousef y Carlstrom, 2006).
Salmonella es una bacteria gram-negativa en forma de bacilo que posee flagelos.
Las bacterias del gnero Salmonella son microorganismos anaerobios facultativos.
Son oxidasa negativa, fermentan la glucosa y producen cido y gas. Una de las
caractersticas de este gnero es que la mayora de los miembros no fermenta la
lactosa ni la sacarosa (Mndes y col., 2006).
Shigella es un bacilo gram negativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae,
que se encuentra estrechamente relacionada con el gnero Escherichia, por sus
propiedades bioqumicas, serolgicas y por similitudes genticas. Se caracteriza
por no fermentar la lactosa, ser inmvil, no produce lisina decarboxilasa y
raramente produce gas a partir de hidratos de carbono. Su identificacin se basa
en caractersticas bioqumicas y antignicas (Perilla y col., 2004).
Salmonella es una bacteria invasora que causa infecciones humanas, conocidas
como salmonelosis. Puesto que el intestino es el hbitat natural de algunas
variedades de Salmonella, los alimentos sin procesar de una fuente animal
ocasionalmente albergan al patgeno. Por consiguiente, Salmonella se encuentra
en productos derivados de aves de corral, incluidos pollo, huevo y pavo. De igual
manera, mariscos, leche y ensaladas han estado implicados en brotes de
salmonelosis. Slo algunas especies de Salmonella son patgenas para los seres
humanos, pero todas las salmonelas son inaceptables en alimentos listos para
comer.
Los mtodos convencionales de deteccin de Salmonella y Shigella dependen de
las caractersticas del cultivo. Estos mtodos implican el pre enriquecimiento y el
enriquecimiento selectivo, seguidos de los pasos de aislamiento y las pruebas de

identificacin. Los pasos de enriquecimiento y aislamiento son tcnicos


principalmente de cultivo, en tanto que la identificacin se basa en el anlisis
bioqumico (Yousef y Carlstrom, 2006, NOM-114-SSA1-1994).
Mtodo:
Deteccin de Salmonella y Shigella en alimentos
Conocer los mtodos para determinar Salmonella y Shigella en alimentos
utilizando medios selectivos y diferenciales as como pruebas de identificacin
bioqumica.
La presente tcnica se describe un esquema general que consiste de 5 pasos
bsicos:

Pre enriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un


medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de
Salmonella daadas, logrando de esta manera una condicin fisiolgica
estable.

Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que


conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de
Salmonella y Shigella, y por otro inhibir otros microorganismos presentes en
la muestra.

Seleccin en medios slidos, este punto se deriva directamente del


anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de
otros gneros diferentes a Salmonella y Shigella, y que permitan el
reconocimiento visual caracterstico de colonias sospechosas.

Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de


los cultivos de Salmonella y Shigella, y la eliminacin de cultivos
sospechosos falsos.

Serotipificacin, es una tcnica inmunolgica (antgeno-anticuerpo) que


permite la identificacin especfica de un microorganismo.

Material:

1 Matraz Erlenmeyer
1 Probeta de 100 ml
1 Vaso de precipitado de 100 ml
1 Vaso de precipitado de 250 ml
2 Mecheros
Tubos de ensayo 13x100
Cajas Petri
Agitador
Agua destilada
Asa microbiolgica
Autoclave
Balanza granataria
Incubadoras de 35C y 42C
Microscopio ptico
Motor para licuadora
Papel aluminio
Papel estraza
Pipetas de vidrio de 1 mL, estriles
Pipetas Pasteur estriles
Portaobjetos
Un vaso de licuadora estril
Utensilios necesarios para la manipulacin de muestras.

Medios:

Agar bilis verde brillante


Agar citrato de Simmons
Agar entrico de Hekten
Agar infusin cerebro corazn
Agar KIA
Agar LIA
Agar Mac Conkey
Agar para Salmonella y Shigella
Agar sulfito de bismuto
Agar TSI
Agar XLC
Caldo Lactosado
Caldo malonato

Caldo manitol
Caldo RM-VP
Caldo selenito-cistina
Caldo SIM
Caldo soya tripticasena
Caldo Urea
Tetrationato
Vassiliadis-Rappaport

Muestra:
Carne de Chivo

Pre-enriquecimiento.
1 Se pesara 25.0 g de muestra.
2 Transferir la muestra pesada al vaso de licuadora estril.
3 Adicionar 225.0 mL de caldo lactosado.
4 Homogeneizar 20 segundos en licuadora a velocidad mnima.
5 Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril
de boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a
temperatura ambiente con la tapa perfectamente cerrada.
6 Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz.
7 Incubar la muestra homognea a 35+/-2C durante 24 hr.
Enriquecimiento selectivo.
1. Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de
Preenriquecimiento y agitar suavemente.
2. Transferir 1.0 mL del cultivo de Preenriquecimiento a un tubo con 10.0 mL de
cada uno de los siguientes medios de enriquecimiento:
a. Caldo tetrationato
b. Caldo selenito cistina

c. Caldo Vassiliadis-Rappaport
3. Incubar 24 h a 35C
Aislamiento.
1. Sembrar por estra simple 2 placas de:
Agar BGA Color del medio: rojo brillante.
Para el aislamiento de Salmonella
o Incubar 24h a 35C.
o Seleccionar colonias rosa a blanco y opacas.
Agar ASS Color del medio: rosa-anaranjado.

Para el aislamiento de Salmonella


o Incubar 24h a 35C.
o Seleccionar colonias incoloras con centro negro.
Para el aislamiento de Shigella
o Incubar 24 h a 35C.
o Seleccionar colonias incoloras.
Agar XLD Color del medio: rojo.

Para el aislamiento de Salmonella


o Incubar 24h a 35C.
o Seleccionar colonias rojas con centro negro.
Para el aislamiento de Shigella
o Incubar 24 h a 35C.
o Seleccionar colonias rojas o incoloras.
Agar AMC Color del medio: rojo-caf.

Para el aislamiento de Shigella


o Incubar 24h a 35C.
o Seleccionar colonias incoloras.
2. Invertir las cajas e incubar 24 h a 35C.
3. A partir del crecimiento en los medios anteriores, identificar una colonia
caracterstica de Salmonella.
Pruebas Bioqumicas

Agar TSI

Incubar 24 h a 35C
Para la identificacin de Salmonella
Sembrar por picadura en el fondo y por estra en la superficie.
Prueba positiva: superficie del medio roja, fondo del medio
amarillo.
Prueba negativa: no hay cambio de color en el medio.
Para la identificacin de Shigella
Sembrar por picadura en el fondo y por estra en la superficie.
Prueba positiva: superficie del medio roja, fondo del medio

Agar ALH

amarillo.
Incubar 24 h a 35C
Para la identificacin de Salmonella
Sembrar por picadura en el fondo y por estra en la superficie.
Prueba positiva: superficie del medio prpura, fondo del medio
prpura.
Para la identificacin de Shigella
Sembrar por picadura en el fondo y por estra en la superficie.
Prueba positiva: superficie del medio prpura, fondo del medio

AGAR AHK

amarillo.
Prueba negativa: no hay cambio de color en el medio.
Incubar 24 h a 35C
Para la identificacin de Salmonella
Sembrar por picadura en el fondo y por estra en la superficie.
Prueba positiva: superficie del medio roja, fondo del medio
amarillo.
Prueba negativa: no hay cambio de color en el medio.
Para la identificacin de Shigella
Sembrar por picadura en el fondo y por estra en la superficie.
Prueba positiva: superficie del medio roja, fondo del medio
amarillo.
Prueba negativa: no hay cambio de color en el medio.

Identificacin serolgica
Para Salmonella
Investigacin de los antgenos somticos de Salmonella (suero anti
Salmonella O polivalente).

1. Colocar con una asa bacteriolgica, dos gotas separadas de solucin salina
estril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa
para aglutinacin.
2. Suspender en cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en
TSI/KIA o LIA.
3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella O polivalente y
mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.
4. Agitar inclinando la lmina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un
minuto.
5. Observar bajo una buena iluminacin y sobre un fondo oscuro la reaccin.
6. Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva.
7. Interpretacin de los resultados.
Investigacin de los antgenos flagelares de Salmonella (suero anti
Salmonella H polivalente).
1. Para ensayo el antgeno flagelar en el mismo da, inocular el crecimiento del
cultivo de TSI/KIA o LIA en agar infusin cerebro corazn (BHI).
2. Incubar a 35C durante 4 a 6 h.
3. Para ensayo del antgeno flagelar al da siguiente inocular una asada del cultivo
desarrollado en el tubo de TSI o KIA, en un tubo de 13 x 100 mm conteniendo 5.0
mL de caldo soya tripticasena.
4. Incubar a 35C durante 24 h.
5. Adicionar al cultivo (ya sea de agar infusin cerebro corazn o caldo soya
tripticasena), 2.5 mL de solucin salina formalizada.
6. Colocar 0.5 mL del suero anti flagelar H polivalente en un tubo de ensayo para
serologa (12 x 75 mm).
7. Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado (el obtenido en el punto 5 de este inciso).
8. Preparar un control de solucin salina mezclando 0.5 mL de solucin salina
formalizada con 0.5 mL del antgeno formalizado.
9. Incubar las mezclas en bao de agua a una temperatura entre 48 y 50C.
10. Observar en intervalos de 15 minutos por espacio de 1 hora.
11. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinacin en la muestra de prueba
pero no en el control.
12. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas
muestre aglutinacin.
13. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecfica.
14. La interpretacin de los resultados.

Para Shigella:
Confirmacin serolgica.
1. Sobre un porta objetos bien limpio se coloca una gota de suero anti-shigella
polivalente del grupo D
2. en otra gota del porta objetos de coloca una gota de solucin salina.
3. Una porcin del cultivo se mezcla con el suero
4. se mezcla para ver si se observa una aglutinacin.
La sepa mezclada con la solucin salina debe permanecer perfectamente
emulsionada, sin presentar aglutinacin.
Conclusin
Por tanto, el alimento se analiza para determinar la presencia o ausencia de
Salmonella (Centro de Control y Enfermedades, CDC).
Las distintas especies de Shigella constituyen la principal causa de disentera,
diarrea caracterizada por eliminacin frecuente de heces con pus, sangre y/o
mucus. El ser humano es el nico reservorio conocido de este agente. La mayora
de los casos ocurren en nios, en general trasmitidos por contacto directo. Los
brotes a gran escala, vinculados a alimentos, son ms raros. A pesar de ello,
constituye

un

importante

problema

de

salud

pblica

mundial,

debido

fundamentalmente a su elevada transmisibilidad, la emergencia de cepas


resistentes a antimicrobianos y la falta de vacunas efectivas (Neglia y col., 2006).

Bibliografa

Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y Servicios.


Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos.