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La investigacin bsica y traslacional

INFORME AMPLIADO

La autofagia regula la destruccin

articular TNF mediada por la artritis
experimental
Neng-Yu Lin, 1 Cristiano Beyer, Andreas 1 Giel, 2 Trayana Kireva, 1 Carina Scholtysek,
1,3 Stefan Uderhardt, 1,3 Luis Enrique Muoz, 1 Clara Dees, 1 Alfiya Distler, 1 Stefan
Wirtz, 4 Gerhard Krnke, 1,3 Brian Spencer, 5 Oliver Distler, 6 Georg Schett, 1 Jrg HW
Distler1
suplementaria
adicional cifras se
publican en lnea
solamente. Para ver
estos archivos, visite la
revista en lnea(Http: //
dx.doi.org/10.1136/
annrheumdis-2012201671)
1

Departamento de
Medicina Interna III y el
Instituto de Inmunologa
Clnica, Universidad de
Erlangen-Nuremberg,
Erlangen,
2

Alemania Departamento
de Biologa, Fisiologa
Animal de la Universidad
de Erlangen-Nuremberg,
Erlangen, Alemania
3

Centro Fiebiger
Nikolaus de Medicina
Molecular de la
Universidad de
Erlangen, Universidad
de ErlangenNuremberg, Erlangen,
Alemania
4

Departamento de
Medicina Interna I,
Universidad de
ErlangenNuremberg,
Erlangen,
Alemania
5

Departamento de
Neurociencias de la
Universidad de California,
San Diego, La Jolla,
California, EE.UU.
6

Centro Experimental de
Reumatologa y centro de
Zrich de Integrativa
Fisiologa Humana,
Hospital Universitario de
Zurich, Zurich, Suiza

Correspondencia a
Dr. Jrg H W
Distler,
Departamento de Medicina
Interna III y el Instituto de
Inmunologa Clnica,
Universidad de ErlangenNuremberg,

PO Box Glcksstr.4a,
Erlangen D-91054,
Alemania;
joerg.distler@ukerlangen.de

Aceptado 9 de
agosto de 2012

Publicado por primera vez en lnea

12 de septiembre de 2012

ABSTRACTO
objetivos La autofagia es un proceso
homeosttico de reciclar los orgnulos
celulares prescindibles y daadas. La
desregulacin de las vas de
autofgicas ha sido recientemente
implicada en la patognesis de diversas
enfermedades. Aqu, hemos investigado
el papel de la autofagia durante la
destruccin de las articulaciones en la
artritis.
mtodos Autofagia en los osteoclastos se
analiz en vitro y ex vivo mediante
microscopa electrnica de transmisin,
Western Blot e inmunohistoqumica para
Beclin1 y ATG7. inhibidores de molculas
pequeas, knockout mediada por LysMCre de
ATG7 y la sobreexpresin lentiviral de Beclin1
se usan para modular la autofagia in vitro e in
vivo. marcadores de diferenciacin de
osteoclastos fueron cuantificados por PCR en
tiempo real. El grado de destruccin de hueso
y cartlago se analiz en el factor de necrosis
tumoral humano transgnico ratones (hTNF
tg) despus de la transferencia adoptiva con
mieloide mdula sea especfica ATG7
deficientes.
resultados La autofagia se activ en
osteoclastos de artritis humana reumatoide
(RA) que muestra aumento de la expresin de
Beclin1 y ATG7. TNFa inducida potentemente
la expresin de genes relacionados con la
autofagia y se activa la autofagia in vitro e in
vivo. La activacin de la autofagia por la
sobreexpresin de la osteoclastognesis
Beclin1 inducida y el aumento de la capacidad
de resorcin de los osteoclastos en cultivo,
mientras que la inactivacin farmacolgica o
gentica de la autofagia impidi la
diferenciacin de osteoclastos. TG ratones
trasplantados con hTNF artrticas ATG7fl / fl
LysMCre+ clulas de mdula sea (BMC)
mostraron un nmero reducido de
osteoclastos y fueron protegidos de la erosin
sea TNFa inducida, la prdida de
proteoglicanos y la muerte de condrocitos.
conclusiones Estas hallazgos demuestran que
autofagia se activa en RA de una manera
dependiente de TNF-y regula la diferenciacin
de osteoclastos y la resorcin sea. por tanto,
aportar pruebas para un papel central de la
autofagia en la destruccin articular en la AR.

INTRODUCCI
N
La
artritis
reumatoide (RA)
es una enfermedad
crnica
enFloridaenferme
dad
amma-toria
que se traduce en
una
grave
destruccin
del
cartlago articular
y el hueso.1 Los
osteoclastos son
los
principales
mediadores
celulares de la
degradacin sea
en la AR, lo que
resulta
en
erosiones
articulares
y
osteoporosis syssistmicas. En este
contexto,
los
osteoclastos
precursores
de
osteoclastos
maduros y son
abundantes en los
sitios de erosiones
seas artrticas.2 3
El Differenti-acin
de los osteoclastos
a partir de sus
precursores,
los
llamados
osteoclastognesis,
depende de la
presencia de factor
estimulante
de
colonias
de
macrfagos (MCSF)
y
el
activador
del
receptor
de
NFligando
B
(RANKL).4-6

Adems,
PROINFloridacitoquinas
inflamatorias, como el factor de necrosis
tumoral (TNF) Puede mejorar la
diferenciacin de los osteoclastos.7 De
hecho, los ratones overexpres-TNF
humano cantar (hTNF tg) demuestran
ms osteoclastognesis y la artritis
destructiva muy parecidas a la AR.8 9
La autofagia describe un mecanismo
general, por el cual las clulas degradan
orgnulos celulares innecesarios o
disfuncionales a travs de la lisosomal
Machin-ery.10 La degradacin de los
orgnulos celulares puede mantener los
niveles de energa celular y garantizar la
supervivencia celular durante la inanicin,
pero puede convertirse en la muerte
celular si el suministro de nutrientes no
puede ser restaurado.10 Una adecuada
regulacin de la autofagia garantiza la
fiequilibrio ne de la sntesis, la
degradacin y el reciclaje de los
componentes celulares. Estas funciones
hacen que AUTOP-hagy esencial para la
diferenciacin celular apropiado y el
desarrollo de rganos.11
La autofagia es iniciada por la
formacin de una membrana de iso-cin,
que luego se alarga para encerrar los
orgnulos diana y para formar el llamado
AUTOP-hagosome. El autofagosoma
fusiona posteriormente con lisosomas para
degradar los intravesiculares componentes. Varios reguladores clave de la
autofagia
se
han
identificadofila
disfuncin erctil en los ltimos aos.
Beclin1 es esencial para la iniciacin de la
autofagia.12-15 ATG7 media la elongacin
de la membrana de aislamiento, que
culmina en la conversin de una forma
soluble de asociada a microtbulos
protena una cadena ligera tres (-I LC3) a
forma
unida
a
membrana
fosfatidiletanolamina-conjugado (LC3-II),
un proceso usado a menudo para
demostrar la autofagia activo.diecisis
Aunque la autofagia est estrechamente
regulada para limitar la activacin no
controlada, la autofagia desregulada puede

contribuir a la patognesis de diversas disenfer- incluyendo infecciones, cncer,

enfermedades neurodegenera-tivo y el
corazn.17 De particular inters, un estudio
ms reciente mostr que la autofagia regulates la liberacin de componentes
lisosomales por los osteoclastos.18 Esta
fihallazgo puede tener un impacto
profundo en la comprensin de los
mecanismos de dao seo en la artritis, y
en fiNding nuevas estrategias de
prevencin y tratamiento.
En este estudio, encaminado a dilucidar
el papel de la autofagia en la AR humana y
de murino inFloridaartritis amma-toria, y
la funcin de la autofagia en el
TNFdestruccin sea mediada. Nos
demonio-strated que la autofagia se activa
en la AR en un TNF-dependiente y
estimula la diferenciacin de los
osteoclastos. Por el contrario, la inhibicin
selectiva de la autofagia en monocitos
reduce fuertemente

Ann Rheum Dis 2013; 72: 761-768. doi: 10.1136 / annrheumdis-2.012-201.671

761

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La investigacin bsica y traslacional

la diferenciacin de los osteoclastos y la destruccin
de las articulaciones en hTNF TG ratones. Juntos,
estos fihallazgos proporcionan evidencia de un papel
central de la autofagia en la destruccin articular en
la AR.

MATERIALES Y MTODOS
Los ratones y el trasplante de mdula sea
Para trasplante de mdula sea, 4 semanas de edad
destinatario hTNF tg los ratones (cepa Tg197;
C57BL / 6 antecedentes)8 fueron irradiados con 10,5
Gy (Stabilipan; Siemens, Erlangen, Alemania).
Despus de 24 h, la mdula sea se reconstituy por
inyeccin intravenosa de 5 10 6 ATG7Florida/Florida
Florida/Florida
LysMCre BMC, o ATG7
LysMCre+
BMC, BMC o transducidas con lentivirus encod-ing
Beclin1 (LVBeclin1), o vectores de control de
lentivirus (LVscramble).19 20 Los estudios con
animales fueron aprobados por el comit local de
bienestar de los animales.

El aislamiento de precursores
de osteoclastos y ensayo de
diferenciacin de los
osteoclastos
osteoclastos derivados de mdula sea se prepararon
como se ha descrito anteriormente.21 En resumen, los
ratones donantes fueron sacrificed a la edad de 6-8
semanas. La mdula sea de tibia y el fmur
fueronFloridabarri con PBS y se fise filtr a travs
de un 0,4 metrofiltro. Las clulas se cultivaron en
-MEM (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.),
que contiene 10% suero bovino fetal. Un da despus
de la siembra, Floridaclulas flotantes se har-recaen
en medio completo con 20 ng / ml murino M-CSF
(RMM-CSF) y 1-30 ng / ml RANKL murino (R & D
Systems, Ambington, Reino Unido) durante 3 das.
Mediano y citoquinas fueron reemplazados despus
de 72 h. la diferenciacin de osteoclastos fue
evaluada por tincin de las clulas para la fosfatasa
cida resistente al tartrato (TRAP) usando un
leucocito fosfatasa cida Kit (Sigma-Aldrich, St
Louis, Missouri, EE.UU.).

infeccin lentiviral
Despus de 72 h de estimulacin con M-CSF y
RANKL, los osteoclastos derivados de mdula sea
fueron infectadas con cualquiera de LV-Beclin1 o
LVscramble19 a una multiplicidad de infeccin de 10
durante 24 h.

Ensayo de resorcin sea in vitro

BMC se sembraron en secciones de hueso (IDS,
Londres, Gran Bretaa) a una densidad de 5 10 4
clulas / rebanada en placas de cultivo de 96 pocillos
con 200 metrol medio de cultivo por pocillo. El
medio de cultivo se cambi cada tres das. Despus
de 14 das, los hoyos de hueso se tieron con 1%
azul de toluidina O (Sigma-Aldrich).

La evaluacin clnica
La evaluacin clnica se realiz cada semana y se
llev a cabo en una forma ciega tal como se
describe.22 queso BrieFloridaY, pata hinchazn fue
examinado en las cuatro patas, y una puntuacin

clnica de 0-3 se asignaron de la siguiente manera: 0

= sin hinchazn, 1 = inflamacin leve, 2 = modeRate inflamacin y 3 = severa hinchazn de los
dedos del pie y tobillo. Adems, la fuerza de agarre
se examin en cada pata, utilizando un cable de 3
mm de dimetro, y se puntu en una escala de 0 a -4
como sigue: 0 = normal, la fuerza de agarre, -1 =
redujeron ligeramente, -2 = moderadamente
reducida, -3 = severamente reducidos, y -4 = sin
adherencia fuerza. Los ratones se pesaron
semanalmente.

El anlisis histomorfomtrico
descalcificacinfied, parafinafipatas traseras nincrustado se cortaron en 5 m sec-ciones y se
tieron con azul de toluidina, hematoxilina (Merck,
Darmstadt, Alemania) o TRAP, utilizando un kit de
tincin de cido leucocitos Phos-phatase (SigmaAldrich). La erosin del hueso, los osteoclastos
nmero, y la destruccin del cartlago fueron
cuantified con un Zeiss Axioskop 2 microscopio
(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania)

equipado con una cmara de imgenes y anlisis de

sistemas digitales (OsteoMeasure; Osteometrics,
Decatur, Georgia, EE.UU.).23

La tincin de inmunofluorescencia
secciones de tejido sinovial de pacientes con AR y
osteoarth-ritis (OA) se incubaron con anticuerpo
policlonal de conejo anti-ATG7 (AnaSpec, San Jose,
California, EE.UU.) o Beclin1 (Abcam, Cambridge,
Reino Unido). anticuerpos de isotipo irrelevantes se
utilizaron como controles negativos. anticuerpos
anti-conejo
de
cabra
policlonal
marcado
conFloridacolorante fluorescente Alexa Fluor 488
(Invitrogen, Darmstadt, Alemania) se utilizaron
como anticuerpos secundarios. Quantificacin se
realiz con el software ImageJ (v.1.41; Institutos
Nacionales de Salud) y la intensidad de
inmunoFloridafluorescencia se analiz en igualdad
de condiciones para todas las muestras dentro de los
experimentos. Esto incluye el tiempo de exposicin y
la
igualdad
de
intensidad
de
la
luz.
losFloridafluorescencia
intensidad
de
5-10
osteoclastos seleccionados al azar por muestra fue
cuantificadafied por Imagen J.

siguientes pares de cebadores: Ratn de la catepsina K:

0
0
0
5 -GGAAGAAGACTCACCAGAAGC-3 y 5 -GT
0
CATATAGCCGCCTCCACAG-3 ; El desvo del ratn
0
0
0
5 -CGACCATT GTTAGCCACATACG-3 y 5
0
-TCGTCCTGAAGATACTGCAG GTT-3 ; OSCAR
0
0
0
ratn 5 -TCGCTGATACTCCAGCTGTC-3 y 5
0
-ATCCCAGGAGTCACAACTGC-3 ; el factor nuclear
0
de ratn de clulas activadas c1 T (NFATc1), 5
0
0
-CAACAAGCGCAAGTA CAGTCTC-3
y
5
0
-CAGGTATCTTCGGTCACACTGA-3 ; ratn 0
0
actina, 5 -TGGCATTGTGGAAGGGCTCATGAC-3
0
0
y 5 -ATGCCAGTGAGCTTGCCGTTCAGC-3 . Las
muestras sin enzima en la reaccin de transcripcin
inversa (RT-no-controles) se utilizaron como controles
negativos para excluir genmico contaminaci-acin. actina se utiliz para normalizar las cantidades de ADNc
cargado. Las diferencias se calcularon con el ciclo
umbral (Ct) y el mtodo comparativo Ct para cuanti
relativaficatin.

El anlisis microTC
patas traseras fueron analizados por microCT (CT)
(CT35; Scanco Medical AG, Brttisellen, Suiza).
Se utilizaron los parmetros de adquisicin de
seguimiento ing: Tensin: 40 kV; x-ray actual:
250UN; tiempo de exposicin: 5000 ms /
proyeccin, 720 proy-ciones; matriz: 1024 1024; y
el tamao del voxel imagen reconstruida en: 9
metro.

El anlisis de transferencia Western

lisados de clulas enteras se prepararon como se ha
descrito anteriormente.24 polivinilideno Floridalas
membranas se incubaron con uoruro de conejo poli
clonal anti-ATG7 (AnaSpec), Beclin1 (Abcam) o
LC3 (Novus, Jena, Alemania). Peroxidasa de rbano
conjugada de cabra policlonal anti-conejo o
anticuerpos anti-ratn de conejo monoclonal
(DAKO, Hamburgo, Alemania) fueron utilizados
como anticuerpos de segunda-aria. La igualdad de
carga de protenas fue conficonfirmada por -actina
(Sigma-Aldrich).

Cuantitativa en tiempo real PCR

La expresin gnica se cuantified por SYBR Green PCR
24
en tiempo real como se describe. Se utilizaron los
762
doi: 10.1136 / annrheumdis-2.012-201.671

microscopa electrnica de transmisin

Para la microscopa electrnica de transmisin, se
recogieron las clulas y fijos con glutaraldehdo al
2,5% en solucin tampn cacodilato (PH 7,4, que
contiene sacarosa). A partir de entonces, se lavaron
las clulas, puestofifijado con 2% de tetrxido de
osmio en tampn cacodilato y se incluyeron en 2%
de agarosa. Durante la deshidratacin por el etanol,
las clulas se fijos con acetato de uranilo al 1,0% en
etanol al 70%, fol-guido mediante la incorporacin
en Araldite y se corte con un ultrami-crotomo
(Reichert Ultracut, Viena, Austria). Las imgenes
fueron capturadas con un microscopio electrnico
Zeiss EM10 (Carl Zeiss
Ann Rheum Dis 2013; 72: 761-768.

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AG) y una cmara Gatan SC1000

OriusTM CCD en combin-acin con el
software digital Micrografa TM (Gatan
GmbH, Munich, Alemania).

anlisis estadstico
Todos los datos se presentan como
mediana con IQR usando el software
GraphPad Prism 4.0. Las diferencias
entre los grupos fueron evaluados por
su signi estadsticaficado por Mann no
paramtrico- Whitney U test. Un valor
de p inferior a 0,05 se consider
estadsticamente
significativafihipocresa.

RESULTADOS
ATG7 y Beclin1 se sobreexpresa
en los osteoclastos RA
Nosotros fiprimer analiz si la autofagia
se activa en los osteoclastos humanos
de pacientes con AR. De hecho, la
expresin de ATG7, que es esencial
para el alargamiento de la membrana de
aislamiento durante la autofagia, se
aument en las clulas TRAP positivas
de los pacientes con AR en
comparacin con muestras de pacientes
con OA (fi1A figura). La expresin de
Beclin1, que estimula el inicio de la
autofagia, tambin se increment en las
clulas TRAP positivas de pacientes
con AR (fifigura 1B). La media
Floridala intensidad de la fluorescencia
se increment en un 77% para ATG7 y
en un 284% para Beclin1 (p = 0,002 y
0,004; fifigura 1C). En conjunto, estos
resultados sugieren que la autofagia se
activa en los osteoclastos en la AR.

TNFa estimula la autofagia en

osteoclastos murinos in vitro e
in vivo
Dado el papel clave de TNF en
enFloridala resorcin sea inflamatoria
en la artritis, la hiptesis de que el
TNF podran estimular AUTOP-hagy
en los osteoclastos con AR. De hecho,
encontramos que el TNF upreguRELAClONADAS la expresin de
ATG7 y Beclin1 con el aumento de los
niveles de ARNm y protenas de ambos
marcadores de autofagia en murino

La
investigacin
bsica y
traslacional
osteoclastos,
en
particular,
en
condiciones con menores concentraciones de RANKL (1 ng / ml) que
pueden ser similares en inicio
deFloridaam-macin o enfermedad
menos activa. El efecto estimulante de
TNF en ATG7 y Beclin1 fue menos
pronunciado en la presencia de
concentraciones muy altas de RANKL
(30 ng / ml) (fifigura 2A-DO).
Consistente con la induccin de
ATG7 y Beclin1, TNF tambin
estimulado la conversin de I en LC3
LC3 II en osteo-clastos, que es otra
caracterstica de la autofagia activo.
Embaucarfirm los efectos estimulantes
de TNF en la autofagia en vivo, hemos
analizado la expresin de ATG7 y
Beclin1 en osteoclastos de hTNF TG
ratones de tipo salvaje y hermanos de
camada. Los niveles de expresin de
ATG7 y Beclin1 se incrementaron en un
160% y un 380% en los osteoclastos de
hTNF los ratones Tg en comparacin
con el fihallazgos en las clulas TRAP
positivas en las secciones de los ratones
de control (p = 0,007 y 0,009; fifigura
2E, F). En conjunto, estos resultados
demuestran que el TNF activa la
autofagia en osteoclastos murinos in
vitro e in vivo.

La autofagia regula la
diferenciacin de
osteoclastos y la resorcin
sea murina in vitro
Para determinar, si la autofagia juega un
papel de osteoclastos DIF-diferencia-,
nosfiprimer
realiz
microscopa
electrnica (fifigura 3A). Hemos
observado numerosos autofagosomas
contienen mitochon-dria y otros
orgnulos en la diferenciacin de
osteoclastos generados a partir de BMC
de los ratones de tipo salvaje. Por el
contrario, las vacuolas autophagocy-tic
maduros engulfing mitocondrias y otros
orgnulos estaban ausentes en ATG7defiosteoclastos
cientes,
pero
autofagosomas imma-ture electrndensos y lisosomas acumulados en el
citoplasma
de
ATG7-deficientes
(clulasfifigura 3A). Por lo tanto, la
hiptesis de que la degradacin de los
problemas de ORGA-Nelles daados,
junto con la acumulacin de inmaduros
autophago-lisosoma, podra interferir
con la osteoclastognesis. En efecto,

Figura 1 ATG7 y Beclin1 se sobreexpresa en los osteoclastos de los pacientes

con AR. La sobreexpresin de ATG7 y Beclin1 en osteoclastos indica autofagia
activado en los sitios de erosiones seas en pacientes con AR. (A, B) Imgenes
representativas de los osteoclastos en el tejido sinovial de pacientes con AR y OA
doble teidas para fosfatasa cida resistente al tartrato (TRAP) y, o bien ATG7 o
Beclin1 se muestran con una ampliacin de 1000 veces. tinciones TRAP
(prpura) se muestran en los paneles superiores. La tincin de
inmunofluorescencia, ya sea para ATG7 (A) o Beclin1 (B) (tanto verde) se
muestran en los paneles inferiores. Barra de escala: 10 m, n = 6 cada uno. (C, D)
la intensidad de fluorescencia relativa de ATG7 (C) o Beclin1 (D) se determin por
Image J. ** indica p <0,01. Esta cifra slo se reproduce en color en la versin en
lnea.
Ann Rheum Dis 2013; 72: 761-768. doi: 10.1136 / annrheumdis-2.012-201.671
763

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La investigacin bsica y traslacional

Figura 2 TNFa induce la autofagia en osteoclastos in vitro e in vivo. (A) transferencias de Western representativas de lisados de la
osteoclastos maduros estimulado con activador del receptor del ligando NF-kappa B (RANKL) (1 ng / ml), RANKL + TNFa (1 ng / ml,
40 ng / ml), RANKL + TNFa (1 ng / ml, 200 ng / ml) o RANKL (30 ng / ml) usando anti-ATG7, anti-Beclin1, anti-LC3 I, anticuerpos II, y
anti--actina para la deteccin (n = 3 para cada uno). niveles (B, C) y ATG7 ARNm Beclin1 en los osteoclastos se analizaron mediante
PCR en tiempo real. n = 3 para cada uno. (D, E) Imgenes representativas de secciones de unin de tipo salvaje o ratones tg hTNF
doble teidas con tartrato resistente a la fosfatasa cida (TRAP) y los marcadores de autofagia ATG7 (D) o Beclin1 (E). tincin TRAP
de osteoclastos (prpura) se muestra en los paneles superiores de ambas figuras. La tincin de inmunofluorescencia con ATG7 o
Beclin1 (verde) como se indica por las flechas se muestra en los paneles inferiores. Barra de escala: 15 m, n = 6 para cada grupo. *
Indica p 0,05 y ** indica p 0,01. Esta cifra slo se reproduce en color en la versin en lnea.

gentica o frmaco-lgica de la autofagia reducida drsticamente

hueso reabsorcin-cin in vitro (fifigura 4). Para distinguir entre los
efectos mediados
inhibicin de la autofagia por enfoques genticos o farmacolgicos
impidi la diferenciacin de osteoclastos. diferenciacin de los
osteoclastos se redujo en clulas de mdula sea derivadas de
Florida/Florida
ATG7
LysM Cre+ con una disminucin de los
nmeros de los osteoclastos y la disminucin de tamao medio de
los osteoclastos en comparacin con ATG7Florida/Florida LysM CreClulas. Se obtuvieron resultados similares despus de la
incubacin de clulas de mdula sea de tipo salvaje con
bafilomycin, un inhibidor qumico de AUTOP-hagy (fifigura 3B,
C).
Para investigar si la activacin de la autofagia aumenta el
potencial de los monocitos a diferenciarse en osteoclastos, que
sobreexpresado Beclin1 utilizando un constructo lentiviral. La
sobreexpresin de Beclin1 autofagia inducida potentemente en
osteoclastos murinos (ver material en lnea complementariafiS1A
figura). La activacin de la significacin AUTOPhagyficativamente aument el nmero de osteoclastos
multinucleadas, TRAP positivas. Adems, el tamao medio de
osteo-clastos aument a la sobreexpresin de Beclin1 (fi3D figura).
Seguidamente, evalu si la modulacin de la autofagia altera la
expresin de genes de osteoclastos asociada. En consonancia con
los efectos sobre el nmero y tamao de los osteoclastos, la
sobreexpresin de Beclin1 aument los niveles de mRNA de
NFATc1, OSCAR, TRAP y catepsina K (fi3E figura-GRAMO). Por
el contrario, deficiencia de ATG7, o el tratamiento con
BAfilomycin, un inhibidor selectivo de AUTOP-hagy, disminucin
de la expresin de genes de osteoclastos asociada.
Para aclarar an ms los efectos de la autofagia en funcin de los
osteoclastos, se realiz en los ensayos de resorcin sea in vitro. La
activacin de la autofagia significativamente mejorado la capacidad
de resorcin de los osteoclastos murinos, mientras que la inhibicin

la funcin y la alteracin de la diferenciacin tanto contribuyen a la

capacidad de reabsorcin sea reducida.
por disminucin del nmero de osteoclastos y los efectos del
deterioro de la funcin osteo-clast, aumentamos el nmero de BMC
por doble para compensar nmero de osteoclastos disminuy
debido a la osteoclastognesis deteriorado. despus de
estafaficonfirmando el mismo nmero de osteoclastos en todos los
escenarios con este enfoque, hemos repetido los ensayos de
resorcin sea utilizando esas modificondiciones ed. Se encontr
que a pesar de un nmero similar de los osteoclastos, respor-cin
Florida/Florida
sea fue todava disminuy en ATG7
LysM Cre+
clulas o clulas tratadas con Bafilomycin A1, respectivamente, en
Florida/Florida
comparacin con ATG7
LysM Cre y dimetil sulfxido
controles tratados. Sin embargo, las diferencias fueron menos
pronunciadas a continuacin en los experimentos anteriores, en los
que nmeros iguales de BMC se sembraron en el comienzo del
experimento. Juntos, los fihallazgos dem-trar que la disminucin de

764
201.671

los nmeros de erosin del hueso y los osteoclastos locales

estn disminuidos en los ratones trasplantados con hTNF tg
fl / fl
+
ATG7 LysM Cre BMCS

Para determinar los efectos de la autofagia en TNFinducida por

Arth-ritis y la destruccin sea, hTNF TG ratones fueron
trasplantados con clulas de mdula sea de ATG7 Florida/Florida
LysM Cre+ ratones para orientar selectivamente los monocitos en
hTNF modelo tg (ATG7Florida/Florida Cre+hTNF ratones tg).
Nosotros ficon primerafirm que el agotamiento de ATG7 produjo
Florida/Florida
selectivamente en los monocitos de ATG7
LysM Cre+,
Pero no en otros tipos de clulas, tales como fifibroblastos (ver
complementaria en lnea fiS1B figura). La inhibicin efectiva de la
autop-hagy en clulas monocticas de ATG7 Florida/Florida LysM
Cre+ los ratones se demostr mediante transferencias Western para
ATG7, Beclin, FJ 3 I y II LC3 (ver lnea complementaria figura
S1C).
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La investigacin bsica y
traslacional

figura 3 La autofagia regula activador del receptor de NF-kB inducida por ligandos diferenciacin de los osteoclastos. La activacin de la
autofagia por lentiviral la sobreexpresin de Beclin1 estimula la diferenciacin de los osteoclastos, mientras que, la inhibicin de la autofagia,
ya sea por knockout de ATG7 o por tratamiento con bafilomicina A1, impide la diferenciacin de osteoclastos. (A) Imgenes de microscopa
electrnica Representante de los osteoclastos derivados de Atg7fl / fl LysMCre- BMC o Atg7fl / fl LysMCre + BMC se muestran con una
ampliacin de 12 000 veces. Barra de escala: 0,5 micras. Tenga en cuenta la mitocondria envuelto en autofagosoma con doble membrana
tpica de los osteoclastos derivados de Atg7fl / fl LysMCre- y vacuolas autofgicos inmadura electrn-densos en BMC derivados de Atg7fl / fl
LysMCre +. (B-D) Imgenes representativas de la fosfatasa cida resistente al tartrato (TRAP) coloraciones de los osteoclastos diferenciados
vitro en derivados de BMC derivado de Atg7fl / fl LysMCre- o Atg7fl / fl LysMCre ratones + (B), se trata con cualquiera de bafilomicina A1 o
su disolvente DMSO (C), o infectadas con lentiviral Beclin1, o el lentivirus control de mezcla aleatoria (D), respectivamente, se muestran (n = 5
para cada ajuste) con una ampliacin de 100 veces. El nmero relativo de los osteoclastos se definen como clulas positivas para TRAP con
ms de tres ncleos en cada ajuste se muestran en los grficos en el medio. El rea relativa cubierto por osteoclastos (media de 100
osteoclastos por ajuste) se presentan en los paneles de la derecha. (E-G) Cuantificacin de niveles de mRNA de NFATc1, OSCAR, TRAP y
CatK en osteoclastos indicados derivados de BMC, as como se ha descrito previamente (B, C y D, respectivamente). n = 5 para cada grupo
en cada escenario. * Indica p <0,05; ** Indica p <0,01. Esta cifra slo se reproduce en color en la versin en lnea.

Los signos clnicos de enFloridainflamacin, tales como

hinchazn de la pata, la fuerza de agarre y el peso corporal no fue
Florida/Florida
diferente entre ATG7
LysM Cre+hTNF TG ratones
Florida/Florida
y ATG7
LysM Cre hTNF TG ratones. Tampoco se
observaron diferencias en la deFloridarea amed por
histomorfometra (fifigura 5), lo que indica que la inhibicin
selectiva de la autofagia en clulas monocticas no afecta a las
articulaciones enFloridainflamacin en el TNFLa artritis
inducida.
A continuacin se investig si la orientacin de la autofagia
afecta a daos estructurales en hTNF TG ratones. De hecho, el
rea de los osteoclastos cubierta y el nmero de osteoclastos se
redujo fuertemente en ATG7Florida/Florida LysM Cre+ hTNF los
ratones Tg en comparacin con hTNF TG ratones reconstituidos
Florida/Florida
Florida/Florida
con ATG7
LysM Cre BMC (ATG7
LysM
Cre hTNF tg ratones) (fi6A figura, B). La zona de erosionado
tambin era significativamente reducida en ATG7Florida/Florida
LysM Cre+ hTNF (TG ratonesfifigura 6C). Consecuentemente,
metroCT demostr que ATG7Florida/Florida LysM Cre+ hTNF
tg fueron protegidos en gran parte de TNFla destruccin sea
inducida con significativamente erosiones seas reducidos (fi6D
figura).

Tambin se analizaron los ratones no transgnicos trasplantados

Florida/Florida
con mdula sea de ATG7
LysM Cre+ o
Florida/Florida
ATG7
LysM Cre ratones. En consonancia con el papel
del TNF como un potente inductor de

autofagia, no observamos diferencias en el nmero de osteoclastos

o estructura sea en la no-TNF ratones transgnicos (datos no
mostrados).
Delawareficiencia de ATG7 con la consiguiente inhibicin de la
autofagia tambin impidi que el TNFmediada por la prdida de
proteoglicanos como se muestra por tincin con azul de toluidina y
redujo el nmero de lagunas vacas (fi6E figura-MARIDO). A fin
de dilucidar el mecanismo por el cual LysM Cre impulsado
desmontables de ATG7 puede proteger de la prdida de la edad
cartil, se analizaron los niveles de expresin de las citoquinas de los
monocitos / macrfagos derivados de IL-1 e IL-6, los cuales han

sido implicados en la destruccin del cartlago en la artritis. Los

niveles de IL-1 y IL-6 eran ambos significativamente disminuy
Florida/Florida
en suero de ATG7
LysM Cre+ hTNF los ratones
Tg en comparacin con ATG7 Florida/Florida LysM Cre- hTNF
tg (ver lnea flexible-mentario fiS3 figura). Por lo tanto, la
disminucin de expresin de IL-1 y IL-6 puede contribuir a la
Florida/Florida
proteccin observada de cartlago en ATG7
LysM Cre+
hTNF TG ratones.

DISCUSIN
TNF es un jugador clave en la patognesis de la AR que Orchestrados en la sinovialFloridainflamacin y la degradacin de hueso.
En el

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La investigacin bsica y traslacional

Figura 4 La autofagia regula la resorcin sea mediada por osteoclastos in vitro. (A-C) Imgenes representativas de los
ensayos de resorcin sea in vitro a partir BMC murinas infectadas con LV-scramble (con) o LV-Beclin1 (A), BMC derivan de
ATG7fl / fl LysMCre- o ATG7fl / fl LysMCre+ ratones (B) y BMC tratados con el disolvente DMSO o bafilomicina A1 (C),
respectivamente, se muestran a la izquierda con un aumento de 200 veces. El rea de la resorcin sea para cada ajuste se
presenta a la derecha; n = 6 * indica p <0,05; ** Indica p <0,01. Esta cifra slo se reproduce en color en la versin en lnea.
presente estudio, hemos demostrado que el TNF estimulado
AUTOP-hagy en los osteoclastos. En detalle, TNF inducida por
la expresin de ATG7 y Beclin1, dos mediadores esenciales de la
autofagia, y estimulado la conversin de LC3 I a II, otro sello
distintivo de la autofagia. En consonancia con estos in vitro
fihallazgos, y ATG7

Beclin1 se upregulated en osteoclastos de hTNF TG ratones. La

autofagia tambin se activ en pacientes con AR con aumento de
la tincin para ATG7 y Beclin1 en osteoclastos en los sitios de la
erosin sea. Nuestra fihallazgos ponen de manifiesto que el
TNF estimula la autofagia en osteoclastos tanto en la artritis
experimental y

Figura 5 inflamacin de las articulaciones no se mejora en hTNF TG ratones trasplantados con ATG7fl / fl LysMCre+ BMC. tincin (A) Representante
H & E imgenes de los huesos del tarso de ATG7fl / fl LysM Cre- hTNF o ATG7fl / fl LysM Cre+ ratones tg hTNF se mostraron con un aumento
de 100 veces. N = 6 para cada grupo. (B) la cuantificacin histomorfomtrico de la zona inflamada en las articulaciones del tarso demostr que no
hubo diferencias entre ATG7fl / fl LysM
Cre- hTNF y ATG7fl / fl LysM Cre + ratones hTNF tg. (C-E) Los parmetros clnicos de la inflamacin, tales como inflamacin de la pata (C), la
fuerza de agarre (D) y el peso corporal (E) no fueron diferentes entre los dos grupos de ratones. NS = no significativo. Esta cifra slo se reproduce
en color en la versin en lnea.

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201.671

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La investigacin bsica y
traslacional

Figura 6 eliminacin selectiva de ATG7 en clulas monocticas previene el dao estructural en hTNF TG ratones. (A) cido Representante tartrato
resistente tinciones de secciones de fosfatasa articulaciones del tarso de ratones hTNF 5 semanas despus del trasplante BMCS se muestran con
una ampliacin de 200 veces.

anlisis (B) histomorfomtrico de la superficie de los osteoclastos cubierto demostraron una reduccin significativa en ATG7 fl / fl LysM Cre +
hTNF ratones Tg en comparacin con Atg7fl / fl LysM creacin ratones hTNF. (C) La zona erosionada tambin se redujo significativamente
en / + hTNF TG ratones Atg7fl fl LysM Cre en comparacin con Atg7fl / fl LysM Cre hTNF ratones. (D) MCT confirm la disminucin
de erosiones seas en fl LysM Cre + hTNF ratones tg / Atg7fl. Una imagen representativa para cada grupo de ratones se muestra; barra
de escala: 0,5 mm. (E) Representante de toluidina azul manchado secciones demuestran la prdida de proteoglicanos reducido / + hTNF
TG ratones Atg7fl fl LysM Cre en comparacin con Atg7fl / fl LysM Cre hTNF ratones. El aumento de la prdida de proteoglicanos dentro
del cartlago se indica mediante flechas en las secciones teidas con azul de toluidina (ampliacin de 200 veces). (F) histomorfomtrico
cuantificacin demostr diferencias significativas en la prdida de proteoglicanos. secciones (G) Representante H & E-manchado con
prominentes lagunas vaca en Atg7fl / fl LysM Cre hTNF ratones, pero no en Atg7fl / fl LysM Cre + hTNF ratones (400 aumentos). (H)
se redujo significativamente el nmero de lagunas vacas en fl LysM Cre + hTNF ratones Atg7fl / tg comparacin con Atg7fl / fl LysM
creacin hTNF tg ratones. n = 6 para cada grupo en todos los experimentos. * Indica p 0,05. Esta cifra slo se reproduce en color en la
versin en lnea.

REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTES. Es de destacar que otra

PROINFloridacitoquinas
inflamatorias,
incluyendo
interinterleucina (IL) -1 e IL-6, as como ligandos de TLR, tambin se
han mostrado para estimular la autofagia en otros tipos de
clulas,25-27 y tambin puede contribuir a la mayor activacin de la
autofagia en la enfermedad erosiva conjunta. Esto puede resultar en
un medio altamente estimulador para activar la autofagia en
enFloridaAR articulaciones de Amed. De hecho, el tratamiento con
glucocorticosteroides
que
inhiben
la
liberacin
de
PROINFloridacitoquinas inflamatorias inhibe la autofagia. 28 29
TNF tiene un papel destacado en la destruccin articular en la
AR. Teniendo en cuenta sus efectos estimulantes sobre la autofagia,
la hiptesis de que la autofagia puede regular la diferenciacin de
los osteoclastos y la funcin. De hecho, encontramos que la
autofagia regula la diferenciacin de monocitos en osteoclastos
maduros. La activacin de la autofagia por la sobreexpresin de
Beclin1 impulsarse el potencial de mono-citos de diferenciarse en
osteoclastos maduros con aumento de los niveles de mRNA de
NFATc1, OSCAR, TRAP y la catepsina K, y nmero y tamao de
los osteoclastos aument. Por el contrario, Pharma-cologic o
inhibicin gentica de la autofagia redujeron la expres-sion de los
marcadores de osteoclastos, disminucin de la talla media de los
osteoclastos y reducen los recuentos de osteoclastos in vitro e

impidieron la osteoclastognesis sinovial en hTNF ratones tg in

vivo. Un estudio reciente pone de relieve, adems, que controlan la
autofagia

osteoclastognesis inducida por hipoxia a travs de HIF-1 va de

sealizacin.30 Adems de su papel en la formacin de osteoclastos,
se encontr que la estimulacin de la autofagia aument la
capacidad de resorcin de los osteoclastos in vitro, mientras que, la
inhibicin de la reduccin de AUTOP-hagy la resorcin sea. Estos
efectos de la autofagia en la resorcin sea osteoclstica pueden
depender de Rab7. Un estudio muy reciente demostr que las
protenas relacionadas con la autofagia son esenciales para dirigir
Rab7 al RUFFloridafrontera ed, regular la fusin de los lisosomas
secretores, y la liberacin de la catepsina K y otras enzimas que
degradan los huesos.18

En nuestro estudio, hemos demostrado, adems, que la inhibicin

de la autofagia impidi la destruccin articular en Arthexperimental ritis. Aunque los signos clnicos e histolgicos de
enFloridainflamacin fueron comparables entre ATG7Florida/Florida
LysMCre+ hTNF ratones y mandos tg, dao estructural se
redujo fuertemente en ATG7Florida/Florida LysM Cre+hTNF TG
ratones. Ambos erosiones osteoclas-togenesis y hueso sinoviales se
redujeron en ATG7Florida/Florida LysMCre+hTNF TG ratones.
Es de destacar que el dao del cartlago tambin se redujo en
ATG7Florida/Florida LysMCre+hTNF TG ratones con
disminucin de la prdida de proteoglicanos y la apoptosis de
condrocitos. Dada la inhibicin altamente selectiva de la autofagia
en clulas monocticas, la proteccin observada de cartlago en
ATG7Florida/Florida LysMCre+

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La investigacin bsica y
traslacional
hTNF ratones Tg es ms probable
mediada por efectos indirectos. En
efecto, los niveles de expresin de los
monocitos / macrfagos derivados
citoquinas IL-1 y IL-6 eran ambos
significativamente disminuy en suero
Florida/Florida
de
ATG7

LysM
Cre+hTNF los ratones Tg en
Florida/Florida
comparacin con ATG7

LysM Cre hTNF TG ratones. La

inhibicin de la autofagia en enfiltrating
monocitos y macrfagos residentes
puede perjudicar, y as disminuir
fibroblastos activa-cin por alteracin
en la liberacin de IL-1 e IL-6
destinado a mejorar la destruccin del
cartlago. Sin embargo, se necesitan
ms experimentos para abordar el
mecanismo
subyacente.
Estas
fihallazgos ms alta la luz el papel clave
de la autofagia en el TNFinducida por
la enfermedad de las articulaciones y
sugieren implicaciones traslacionales.
Los inhibidores selectivos actualmente
son desarrolladas en el tratamiento de
pacientes con cncer, pero no estn
disponibles para la rutina clnica
todava.31 32 Varios frmacos en uso
clin-ical, sin embargo, tienen efectos
inhibitorios concomitantes sobre la
autofagia. Entre esos agentes son
cloroquina e hidroxi-cloroquina, que
puede prevenir erosiones seas y son
terapias estab-bleci de la AR. 33 34
Aunque menos potente que el
bafilomycin
A,
cloroquina
e
hidroxicloroquina inhibir la autofagia
elevando el pH intralisosomal. Esto
perjudica la degradacin de protenas
dentro de la autophagosome y conduce
a la acumulacin de autofagosomas
ineficaces.35 Aunque no exclusivamente
mediada por la inhibicin de la
autofagia,
los
efectos
antirreeleccionistas de sorcin de
ambos frmacos, sin embargo, apoyan
el concepto de que la inhibicin de la
autofagia puede ser un enfoque
prometedor Thera-putico en la
prevencin de la resorcin sea en la
AR.
En resumen, nos proporcionan la
prueba para un papel central de
AUTOP-hagy en la osteoclastognesis
y la enfermedad de las articulaciones
destructiva. La autofagia es activado
por TNF en la AR, y estimula la
diferenciacin osteo-clast. La inhibicin
selectiva de la autofagia en las clulas
de mono-cytic previene el dao
estructural en hTNF TG ratones.
Damos las gracias al Dr. George (Alexander
Fleming Centro de Investigacin Biomdica
Ciencia, Vari, Grecia) Kollias para proporcionar
los ratones del hTNF tg. Agradecemos a Nadja

Schrder-Kre ayuda tcnica con el

microscopio electrnico de transmisin.
Agradecemos tambin a Madeleine
Demleitner, Stefan Fritz, Mara Halter, AnnaMaria Herrmann y Verena Wsch por su
excelente apoyo tcnico.
Colaboradores Diseo del estudio: NYL, GS, JHWD.
Adquisicin de datos: NYL, CB, AG, TK, CS, SU, LEM, CD,
AA. Interpretacin de los datos: NYL, CB, AG, TK, CS, SU,
LEM, AA, JHB, CB, GK, BS, OD, CD, JHWD. Preparacin
del manuscrito: NYL, CB, GS, JHWD.

Financiacin El estudio fue apoyado por la

Deutsche Forschungsgesellschaft (subvenciones
DI-1537 / 2-1, DI-1537 / 4-1, DI-1537 / 5-1, AK
144 / 1-1 y SCHE 1583 / 7-1), el Focus
Programa SPP1468 (immunobone) de la
Deutsche Forschungsgesellschaft y conceder
A40 del Centro Interdisciplinario de Investigacin
clnica (IZKF) en Erlangen. El estudio tambin
fue apoyada por el proyecto FP7 Masterswitch
de la Unin Europea, el proyecto financiado por
el IMI BTCure, y el premio de soporte del
portador de la Fundacin Ernst-Jung. N-YL tiene
una beca doctoral de la Fundacin de
Investigacin de Baviera. Cristiano Beyer tiene
una beca de investigacin en el Centro
Interdisciplinario de Investigacin Clnica (IZKF)
en Erlangen.

Conflicto de intereses Ninguno.

tica aprobacin del Comit tico de la
Universidad de Erlangen-Nuremberg.
Procedencia y la revisin paritaria No encarg;
externamente revisadas por pares.

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Rheum Dis 2013; 72: 761-768. doi: 10.1136 / annrheumdis-2.012-201.671

Ann

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La autofagia regula TNFmediada por la

destruccin de las articulaciones en la
artritis experimental
Neng-Yu Lin, Christian Beyer, Andreas Giel, Trayana Kireva, Carina
Scholtysek, Stefan Uderhardt, Luis Enrique Muoz, Clara Dees, Alfiya
Distler, Stefan Wirtz, Gerhard Krnke, Brian Spencer, Oliver Distler,
Georg Schett y Jrg H W Distler
Ann Rheum Dis 2013 72: 761-768 originalmente publicado en Internet
el 12 de septiembre de, 2012

doi: 10.1136 / annrheumdis-2.012-201.671

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