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INTRODUO A MTODOS CROMATOGRFICOS

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA E EM COLUNA
OBJETIVOS

Estudar o comportamento de substncias orgnicas em termos de estrutura qumica versus

fenmeno adsoro/partio cromatogrfica.
Demonstrar experimentalmente princpios fundamentais da cromatografia.
Empregar a tcnica de cromatografia em camada delgada na anlise de uma amostra e utilizar o R f
na identificao de compostos orgnicos usualmente presentes em diversas formulaes
farmacuticas.
Empregar a tcnica de cromatografia em coluna na purificao de compostos orgnicos.

LEITURA RECOMENDADA
Mtodos de separao, cromatografia, fator de reteno, em livros de Qumica Analtica ou Qumica
Orgnica.
INTRODUO
Os termos cromatografia, cromatograma e mtodo cromatogrfico so atribudos ao botnico
russo Mikhael S. Tswett, que em 1906 utilizou estes termos para descrever suas experincias com extratos
de folhas e gema de ovo. Tswett usou colunas de vidro contendo vrios slidos finamente divididos atravs
das quais filtrou os extratos, lavando-os a seguir com ter de petrleo. Obteve assim, uma separao dos
componentes em bandas coloridas ao longo das colunas. Os termos derivam das palavras gregas chrom
(cor) e graphe (escrever), embora o processo no dependa da cor, exceto para facilitar a identificao dos
componentes separados.
Existem vrias tcnicas cromatogrficas, desde as mais simples, como cromatografia em coluna ou
camada fina, at as mais sofisticadas, como a cromatografia gasosa e cromatografia lquida de alta
eficincia (CLAE), que exigem aparelhagem complexa. Dentre os mtodos de anlises, as tcnicas
cromatogrficas as tcnicas instrumentais ocupam um lugar de destaque na rea de qumica e bioqumica,
devido eficincia e facilidade na separao, identificao e quantificao das espcies qumicas presentes
em uma amostra, mesmo que constituda de misturas complexas.
A cromatografia , fundamentalmente, um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de
uma mistura, realizada por meio da distribuio dos mesmos entre duas fases em ntimo contato. Uma das
fases permanece estacionria enquanto a outra se move atravs dela. Durante a passagem da fase mvel
pela estacionria, os componentes de uma mistura se distribuem entre elas, de tal forma que cada um dos
componentes retido seletivamente na fase estacionria, de acordo com sua maior ou menor interao,
resultando em migraes diferenciadas.
A cromatografia de adsoro baseia-se no grau de partio relativa das substncias entre uma fase
lquida mvel (o eluente) e uma fase slida estacionria (o adsorvente) geralmente a slica-gel (SiO 2.xH2O)
ou o xido de alumnio (Al2O3). Outros adsorventes ocasionalmente usados so o Florisil (um silicato de
magnsio), o carvo ativo, o hidrxido de magnsio, o carbonato de clcio, certas poli-amidas e at mesmo
o acar. O grau de adsoro depende de vrios fatores, como a quantidade de gua presente na fase
slida (que ser mais reativa quanto mais seca estiver), da estrutura da substncia adsorvida (presena de
grupos funcionais polares, capacidade de formar ligaes hidrognio, etc.), da ocupao dos stios ativos da
fase slida pelo solvente e da fora atrativa entre o soluto e o solvente (Figura 1).

Al2O 3
O Al

N
H

R
H O

O Al
R
C O
R

O
R

C O

HOAl

Figura 1. Algumas formas de visualizar as interaes entre alumina e componentes orgnicos

de uma amostra. Estruturas similares poderiam ser escritas para a slica gel.

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PARTE A - CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica de fcil execuo, rotineiramente usada no
laboratrio de qumica orgnica. Amostras em quantidades muito pequenas (1-100 g) podem ser
rapidamente analisadas. Devido convenincia e rapidez, usamos a tcnica para estabelecer se dois
compostos so idnticos, verificar a pureza de um composto, determinar o nmero de componentes em
uma mistura, determinar o solvente apropriado para separao em uma coluna cromatogrfica, monitorar a
separao de uma mistura em uma coluna cromatogrfica ou acompanhar o progresso de uma reao.
A tcnica consiste em aplicar uma camada fina do adsorvente finamente pulverizado (geralmente
slica ou xido de alumnio, s vezes adicionados de material fluorescente luz ultra-violeta) sobre uma
placa lisa e plana (vidro ou alumnio). O adsorvente fixado placa por adio de gesso ou lcool
polivinlico. Alguns microlitros de soluo da amostra a ser examinada so aplicados prximos a uma das
bordas da placa, e a mesma imersa alguns milmetros em um eluente mantido em recipiente fechado. O
eluente, por fora da capilaridade, percorre a fase fixa em movimento ascendente, carreando consigo os
componentes da amostra. Diferentes compostos ascendem a diferentes alturas dependendo de suas
estruturas moleculares. A tcnica especialmente til no caso de compostos pouco volteis ou sensveis ao
calor, isto , substncias para as quais a cromatografia em fase gasosa inadequada.
Instrues gerais sobre a tcnica CCD
A escolha do solvente de eluio (desenvolvimento) adequado realizada da seguinte maneira: uma
soluo da amostra nos vrios solventes que se deseja testar aplicada, por meio de tubos capilares, sobre
uma camada do adsorvente a ser usado (Figura 2). Quando o crculo do solvente tiver atingido a posio
final, o solvente apropriado aquele que tiver arrastado a amostra a cerca de 0,3 a 0,5 do raio do crculo do
solvente (caso a amostra seja incolor obviamente necessrio revelar a posio da substncia eluda
mediante uso de um reagente adequado!).

Figura 2. Escolha de solvente para a cromatografia em camada delgada

(a) Bom desenvolvimento. (b) Superdesenvolvimento. (c) Subdesenvolvimento.

Na Tabela 1 encontramos uma relao, em ordem crescente de polaridade, dos solventes mais
usados em cromatografia. Pode-se usar misturas de dois ou mais solventes como eluente, de maneira a
modular a polaridade. A mistura mais usada a de acetato de etila com ter de petrleo ou hexano, por ser
constituda de solventes razoavelmente baratos, volteis e de regular ou baixa toxicidade.
Tabela 1. Solventes cromatogrficos em ordem crescente de polaridadea.
ter de petrleo
Ciclohexano
Tetracloreto de carbono
Benzeno
Cloreto de metileno
Clorofrmio
ter etlico
Acetato de etila
Piridina
Acetona
lcool n-proplico
Etanol
Metanol
gua
cido actico
a
Polaridade, neste contexto, s tem sentido para a cromatografia e no coincide,
necessariamente, com a polaridade medida, por exemplo, pela constante dieltrica.

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As amostras so aplicadas nas cromatoplacas em forma de solues (a 1-10% em solvente voltil) a
cerca de 1 cm da base inferior (Figura 3.1), mediante uso de um tubo capilar. Alguns cuidados devem ser
tomados para evitar que a camada do adsorvente seja alterada, ou que o halo de difuso da amostra
seja maior que 2 mm. Solues diludas da amostra podem ser aplicadas repetidamente, esperando-se a
evaporao do solvente antes de nova aplicao, a fim de obter maior concentrao no ponto de partida.
Mais de uma amostra pode ser aplicada em uma placa, mantendo-se uma distncia de 1 cm entre os
pontos, para evitar contato entre as amostras. A placa, com a extremidade semeada para baixo, ento
mergulhada no solvente selecionado, mantido em cuba fechada (cmara). importante observar que o
nvel do solvente dever ficar abaixo dos pontos de aplicao (Figura 3.2). Durante a corrida do
solvente o sistema deve permanecer fechado, para garantir saturao da cmara pelo vapor do solvente.
Um pedao de papel de filtro, colocado na parede interna da cmara, acelera a saturao. A cromatoplaca
dever ser retirada da cuba somente quando a frente do solvente atingir um limite pr-determinado na parte
superior da placa (cerca de 1 cm). Aps o desenvolvimento as cromatoplacas so secas e as posies dos
componentes da amostra visualizadas por um meio adequado. A visualizao (revelao) pode ser feita por
mtodos fsicos ou qumicos. Placas preparadas com adio de um material fluorescente permitem
visualizar facilmente compostos UV-ativos, que aparecem como manchas escuras em fundo fluorescente,
se a placa for iluminada com lmpada de luz ultravioleta (cuidado).

Figura 3. (1) Aplicao da amostra na cromatoplaca (2) Eluio de uma placa cromatogrfica;
(3) Revelao de uma placa cromatogrfica em cuba de iodo.

Reagentes qumicos podem tambm ser usados. Quase todas as classes de substncias orgnicas
(exceto alcanos e haletos alifticos) reagem com iodo formando complexos de transferncia de carga.
Exposio da placa aos vapores do iodo (Figura 3.3) revelam manchas marrons, tanto mais escuras quanto
maior o tempo de exposio e a concentrao da amostra. A formao desses complexos reversvel
(muitas vezes rapidamente), de modo que a posio das manchas escuras deve ser marcada prontamente.
A grande vantagem desse mtodo que, na maioria dos casos, o iodo pode ser eliminado posteriormente
por aquecimento da placa, a qual pode ser borrifada, a seguir, com outro revelador (cido sulfrico, vanilina
sulfrica, tricloreto de antimnio, permanganato de potssio/cido sulfrico, etc.). A literatura qumica traz
uma srie de referncias a reveladores para cromatografia em camada delgada, variando desde os de
aplicao muito especfica at os mais gerais. Em geral os mtodos qumicos de revelao so destrutivos
e aplicveis a separaes analticas, mas no em separaes preparativas.
Quando as condies experimentais so completamente especificadas possvel identificar uma
substncia pelo seu valor de Rf. Define-se Rf, como a razo entre a distncia percorrida na placa pela
substncia e a distncia percorrida pelo solvente (medidas no centro da mancha da substncia e a frente
do solvente, Figura 4b). Contudo, para fins de identificao de uma substncia o solvente escolhido para
eluio deve carrear o composto a um Rf entre 0,3 e 0,6 e uma amostra autntica deve ser aplicada lado a
lado na mesma placa, para assegurar igualdade de condies experimentais. Alm disso, como muitas
substncias podem ter o mesmo valor de R f, assim com podem ter o mesmo ponto de fuso, mtodos
adicionais devem ser utilizados para identificao inequvoca do composto.
Distncia percorrida pela mancha desde a origem (x)
Rf = -------------------------------------------------------------------------------Distncia percorrida pelo solvente desde a origem (y)

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Marca da
frente do
solvente

Marca da
frente do
solvente

Mancha
cromatogrfica
y
Componente 1

Rf = x/y

x
Origem
Componente 2

(a)

Origem

(b)

Figura 4. (a) Cromatograma de uma separao em coluna; (b) Determinao de Rf no cromatograma em camada fina.

EXPERIMENTAL DA PARTE A-I PREPARAO DAS PLACAS CROMATOGRFICAS

EXPERIMENTO DEMONSTRATIVO
Objetivo: Demonstrar experimentalmente a preparao artesanal de placas para uso na cromatografia em
camada delgada.
Procedimento
1. As placas limpas e secas no devem ser tocadas com os dedos. Segure-as pelas bordas.
2. Misture num bquer 30 g de slica gel com 60 mL de gua destilada at obter uma suspenso
homognea.
3. Mantendo-se as placas em posio horizontal, transferir uma poro adequada da suspenso para a
superfcie das placas, espalhando-a uniformemente com o auxlio de um basto de vidro.
4. Para facilitar a distribuio homognea da suspenso, manter a placa apoiada sobre a bancada,
erguendo-se alternadamente as extremidades at que visualmente toda a superfcie esteja
uniforme. A espessura do recobrimento deve ser aproximadamente 0,3 mm.
5. Repousa-se a placa em uma superfcie plana horizontal e deixa-se secar ao ar durante 15 a 30
minutos, quando o adsorvente adquire uma aparncia opaca.
6. Para serem utilizadas, as placas devem ser ativadas por aquecimento em uma estufa a 110 oC durante
30 minutos . Este processo visa eliminar toda a gua adsorvida no suporte.
7. As placas assim preparadas esto prontas para uso e podem ser guardadas em lugar protegido
tomando-se cuidado para no tocar, contaminar ou ferir a camada de adsorvente.
Microplacas, muito teis na anlise rpida de misturas reacionais, podem ser facilmente obtidas por
imerso de lminas de microscpio numa suspenso de 35 g de slica (para CCD) em cerca de 100 mL de
clorofrmio ou tetracloreto de carbono. Duas lminas, arrumadas face a face, so rapidamente imersas e,
com um movimento constante, removidas da suspenso. Aps a separao das lminas, e evaporao do
CHCl3 (ou CCl4), umedecem-se as placas com vapor de gua para fixar o adsorvente. Obtm-se, assim,
duas microplacas com superfcie homognea de adsorvente em um dos lados, prontas para uso.

PARTE EXPERIMENTAL A-II. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) NA ANLISE DE

CAFENA E N-ACETIL-p-AMINOFENOL EM ANALGSICOS
Objetivo: Investigar a presena de cafena e N-acetil-p-aminofenol (paracetamol) em analgsicos
[Tylenol, Saridon, Dorflex, Paracetamol (Genrico), etc.].
Procedimento
1. Aplicar em pontos separados da placa cromatogrfica, a 1 cm da borda inferior e mantendo cerca de 1
cm de distncia entre os pontos de aplicao, uma gotinha (tubos capilares) das solues de cafena (1),
N-acetil-p-aminofenol (2) e das amostras de analgsicos (solues 3 a 5).

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2. Adicionar uma certa quantidade de acetato de etila cuba de cromatografia de modo que o mesmo
alcance o nvel de cerca de 5 mm.
3. Revestir a parede interna da cuba com um pedao de papel de filtro que v at o fundo. Feche a cuba e
aguardar alguns minutos para que a atmosfera da cuba fique saturada com vapores do solvente de
eluio. Eventualmente o nvel do lquido dever ser completado.
4. Introduzir a placa na cuba de modo que o nvel do lquido fique abaixo dos pontos de aplicao.
Esperar o desenvolvimento do cromatograma mantendo a cuba fechada.
5. Quando a frente do solvente chegar a 1 cm da borda superior da placa, retir-la e marcar a distncia
percorrida. Deixar a placa secar totalmente ao ar (10 a 15 minutos) ou em superfcie ligeiramente
aquecida.
6. Antes da revelao com iodo, examinar o cromatograma sob a luz UV em comprimento de onda longo
ou curto. Marcar cuidadosamente o contorno das manchas das substncias UV-ativas, com o auxlio de
uma lapiseira ou outro objeto pontiagudo.
7. Para revelao definitiva, inserir a placa em recipiente seco contendo um pouco de cristais de iodo
slido. Fechar devidamente a cmara de iodo e aguardar o surgimento de manchas na placa.
8. Medir (pelo centro da mancha!) as distncias percorridas pelos componentes de cada amostra
analisada.
Discusso
1. Com base no experimento realizado responda as seguintes questes:
(a) Esquematize um desenho do cromatograma e diga quantos componentes foram detectados em cada
amostra aplicada?
(b) Determine os Rf das substncias puras (cafena e N-acetil-p-aminofenol) e de todos os componentes
das solues de analgsico analisadas (solues 3 a 5).
(c) Voc pode inferir inequivocamente que algumas amostras contm paracetamol? Ou cafena? Ou
nenhum dos dois? Ou outros constituintes? Explique.
2. Sobre a tcnica cromatografia em camada delgada, responda:
(a) Quais os fundamentos bsicos?
(b) Cite os usos mais consagrados da tcnica (importncia).
(c) Enumere as vantagens e desvantagens da tcnica.
(d) Que caractersticas deve ter um solvente para ser considerado um bom eluente de desenvolvimento?
No caso em questo voc considera o acetato de etila um bom solvente de eluio?
(e) Que artifcios podem ser utilizados quando suspeitamos que o(s) componente(s) da amostra a ser
analisada pode no ser visvel a olho nu?
3. (Provo 2000) Uma mistura contendo os compostos I, II e III, representados abaixo, foi analisada pela
tcnica de cromatografia em camada fina. A mistura foi aplicada em uma cromatoplaca de slica sem
indicador de fluorescncia. Aps eluio com hexano:ter etlico (4:1) e revelao sob luz ultravioleta
(254 nm), a cromatoplaca apresentou o seguinte aspecto:
O

(I)

(II)

(III)

Quando a cromatoplaca foi revelada com iodo, foram observadas trs manchas. Pode-se afirmar que as
manchas obtidas nos Rf 0,34 e 0,77 correspondem, respectivamente, s estruturas:
(a) I e II
(b) I e III
(c) II e III
(d) III e I
(e) III e II

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PARTE B - CROMATOGRAFIA EM COLUNA
A cromatografia em coluna geralmente usada na separao preparativa ou purificao de
substncias orgnicas. A tcnica requer uso de tubos de vidro, montados verticalmente, contendo o suporte
slido finamente dividido (fase estacionria), em geral slica gel ou xido de alumnio. A substncia que se
deseja purificar (ou mistura que se quer fracionar) aplicada no topo da coluna e a eluio da substncia
efetuada mediante a percolao com solvente adequado. Na parte inferior da coluna recolhe-se um nmero
de fraes, nas quais se encontram os componentes da mistura separados.
A velocidade com que uma substncia trafega pela coluna depende de sua polaridade, da polaridade
da fase estacionria e da polaridade do solvente (eluente). Se o composto mais atrado pela fase
estacionria do que pelo solvente, ele migrar lentamente. Se sua afinidade for maior pelo solvente ele
migrar mais rapidamente, gastando menos tempo e solvente. O xito de uma coluna depender ento da
escolha do suporte e solvente adequados. Em alguns casos possvel visualizar a separao dos
componentes de uma mistura observando o desenvolvimento de faixas diferentes na coluna ou iluminandoa com luz ultravioleta (a coluna precisa ser de quartzo!). Entretanto, na maioria das vezes, torna-se
necessrio acompanhar a separao dos componentes examinando cada frao eluda por cromatografia
em camada delgada (CCD).
Cromatografia em coluna clssica - Instrues gerais sobre a tcnica
1. Escolha da fase estacionria e do solvente para uma coluna cromatogrfica - Os suportes e
solventes usados em uma coluna cromatogrfica so, normalmente, os mesmos utilizados em CCD.
Portanto, devem ser escolhidos mediante um exame prvio da amostra por cromatografia em camada
delgada. A quantidade de adsorvente utilizada depende da quantidade de amostra a ser separada e do
tipo de adsorvente. Misturas pouco complexas, tendo slica gel como suporte requer, no mnimo, a
relao 1:50 amostra/slica.
2. Empacotamento da coluna - As colunas de vidro utilizadas na tcnica tm a configurao que lembra
uma bureta. Suas dimenses, obviamente, dependem da quantidade da amostra a ser processada. Dois
mtodos so comumente usados para a introduo do suporte na coluna (empacotamento). No primeiro
mtodo o suporte introduzido seco (Figura 5a-b). Coloca-se uma pequena bucha de algodo na base
inferior da coluna para evitar a passagem do suporte slido pela torneira e a mesma preenchida at
cerca da metade com solvente. Com a ajuda de um funil adaptado na parte superior da coluna introduzse, lentamente, a fase estacionria que ser empacotada com o solvente, tendo-se o cuidado de retirar
quaisquer bolhas de ar formadas. O empacotamento poder ser auxiliado com a introduo e
escoamento de novas quantidades de solvente. Nunca deixe a superfcie do suporte livre de
solvente. No segundo mtodo o suporte introduzido em suspenso no solvente, portanto, os mesmos
cuidados devem ser observados durante a preparao e o empacotamento da coluna.

suporte
slido
funil
slido

nvel do
solvente
nvel do
solvente

algodo
ou placa
sinterizada

(a)

suporte
slido
algodo
ou placa
sinterizada

(b)

Figura 5. Colunas cromatogrficas. (a) Solvente adicionado coluna;

(b) suporte slido sendo introduzido na coluna.

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3. Introduo da mistura de compostos a ser separada; eluio dos compostos e monitoramento da
coluna - Quando a coluna estiver preparada deixa-se escoar o solvente at que reste uma diminuta
quantidade de solvente na superfcie (evitar a todo custo que a coluna seque!). Introduzir, na sequncia,
uma soluo concentrada (no solvente de eluio) do material que se deseja separar, com a ajuda de uma
pipeta de Pasteur, tendo cuidado para no perturbar a superfcie do adsorvente. Se a mistura for lquida
ela poder ser introduzida diretamente na coluna. Uma metodologia alternativa envolve a impregnao da
amostra em pequena quantidade do adsorvente, com o auxlio de um solvente, seguida de evaporao e
introduo do p resultante (farofa) na coluna. Esse procedimento particularmente til quando pelo
menos um dos constituintes da amostra se dissolve apenas em solventes muitos polares.
Inicialmente deixa-se eluir a amostra com um pouco de solvente at quase a secura (evitando-se
que a coluna seque!). Introduz-se uma nova quantidade de solvente e a operao repetida. A coluna ,
ento, preenchida com o solvente, e iniciada a eluio propriamente dita. medida que as fraes vo
sendo recolhidas na base da coluna (usando vrios Erlenmeyers numerados) torna-se necessrio adicionar
mais solvente (Figura 6), cuja polaridade eventualmente pode ser modificada mediante mistura com outro
solvente polar. Faa um monitoramento das fraes recolhidas por CCD, para verificar se todos os
componentes da amostra foram eludos e quais as fraes podem ser combinadas, pois um componente
individual pode estar presente em vrias fraes contguas. Algumas fraes podem conter mais de um
componente, essas fraes no devem ser reunidas com as que contm apenas um componente. Posto
que as fraes recolhidas encontram-se diludas, necessrio evapor-las para obter o componente puro.
Em alguns casos, a evaporao do solvente indispensvel, mesmo antes da anlise cromatogrfica.

funil de
separao

nvel do
solvente
suporte
slido
algodo
ou placa
sinterizada

Figura 6. Coluna cromatogrfica acoplada a um funil de separao

para manter o nvel do solvente na superfcie superior.

Cromatografia Rpida (flash-column chromatography, FC) 1

Uma tcnica muito utilizada no fracionamento de uma mistura de compostos a cromatografia rpida
ou cromatografia sob presso reduzida. A tcnica, que se vale de colunas curtas e eluio acelerada sob
presso, efetua a separao de componentes com diferenas de R f 0,05 em tempo relativamente reduzido
(1-3 h). Presses mais elevadas permitem a separao de maneira mais rpida (10-15 min), no entanto, a
resoluo apenas moderada (Rf 0,15).
1

Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A.; Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate
Resolution. J. Org. Chem., 1978, 43, 2923.

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O aparato necessrio para a tcnica consiste em uma coluna com dimetro apropriado, equipada
com reservatrio de solvente e vlvula de controle de presso (Figura 7). A presso necessria fornecida
por cilindro de nitrognio ou argnio, e a quantidade de suporte a ser utilizada normalmente calculada
multiplicando-se a quantidade de material que se deseja separar por fator de 20-60. A coluna empacotada
dever ter cerca de 10 a 15 cm. A escolha do eluente feita da mesma forma que numa coluna normal
(CCD), recomendando-se o eluente capaz de carrear o componente desejado da mistura a um Rf = 0,35.
A coluna preenchida com adsorvente (slica gel 60) e o solvente de eluio forado sob presso at
que a coluna esteja empacotada (livre de bolhas de gs). Adiciona-se, ento, a amostra no topo da coluna
(com as precaues mencionadas na cromatografia de coluna convencional) e procede-se a eluio sob
presso, a uma velocidade controlada ( 2 pol/min medida pelo nvel do eluente). Uma separao tpica por
esta tcnica mostrada na Figura 8. Por essa tcnica tambm se recomenda no deixar a coluna secar.

Figura 7. Coluna para cromatografia rpida.

Figura 8. Separao tpica em cromatografia rpida.

A cromatografia rpida um bom mtodo para a separao de componentes de uma mistura de

complexidade moderada. Entretanto, a necessidade de presso e aparelhagem sofisticada (colunas com
dimetros variveis, vlvula para controle de presso, reservatrio de solvente, cilindro de gases)
constituem fatores limitantes da tcnica.
Cromatografia rpida a seco (dry-column flash chromatography) 2
Um mtodo alternativo cromatografia rpida (FC) a cromatografia rpida a seco. A tcnica
combina as vantagens de aparelhagem e operao simples. Um fator de distino entre ambas o uso de
suco em lugar da presso positiva. Um segundo fator de diferenciao que os solventes de eluio so
adicionados em volumes pr-determinados e a coluna drenada at a secura, antes da adio de um novo
volume do eluente. A aparelhagem usada constitui-se apenas de um funil cilndrico sinterizado, adaptado a
um balo com sada para trompa dgua (Figura 9).

Figura 9. Equipamento para cromatografia rpida a seco.

2

Harwood, L. M.; Dry-Column Flash chromatography. Aldrichimica Acta, 1985, 18, 25; (b) Yau, E. K.; Coward, J. K.;
Filtering-Column Chromatography - A Fast, Convenient Chromatographic Method - Aldrichimica Acta, 1988, 21, 106.

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A tabela abaixo fornece a orientao para escolha do tamanho de funil, da quantidade de adsorvente,
de amostra e do solvente utilizados.
Tamanho do funil (mm)
dimetro/comprimento
30/46
40/50
70/55

Slica
(g)
15
30
100

Quantidade de
amostra
15-500 mg
500 mg 3 g
2-15 g

Frao de solvente
(mL)
10-15
15-30
20-50

O procedimento tcnico envolve o preenchimento do funil com o adsorvente sob suco, de forma
que se obtenha uma superfcie superior uniforme. Ainda sob vcuo, adicione coluna o solvente de menor
polaridade (e no qual a amostra a cromatografar seja solvel); se a coluna estiver empacotada
corretamente, a frente de solvente ser vista descendo em uma linha horizontal. Se isto no ocorrer,
repita o procedimento de empacotamento. Com a coluna corretamente empacotada adicione
(cuidadosamente!) o eluente superfcie da mesma at que o solvente chegue ao frasco receptor. Nesse
momento cesse o fornecimento do eluente e seque o adsorvente sob suco.
Introduza a amostra a ser processada no topo da coluna pelos mtodos usuais. Sempre sob
suco, inicie a eluio das fraes por adio sucessiva de pores definidas do solvente, drenando
completamente a coluna aps cada adio (a superfcie do adsorvente no dever ser perturbada
durante a adio de solvente). Os solventes mais recomendados para a maioria das separaes so
pentano (hexano), ter, acetato de etila e metanol. A polaridade dos solventes pode ser alterada mediante
misturas, observando-se que o gradiente de aumento dever situar-se na faixa de 5 a 10%.
Separaes com a mesma eficincia das obtidas em CCD so facilmente realizadas. A perda de
material mnima, e h economia de tempo e solventes. A baixa difuso das bandas dos componentes da
mistura durante a cromatografia significa que, geralmente, cada um eludo praticamente puro em uma ou
duas fraes.
PARTE EXPERIMENTAL B-I. ANLISE DE AMOSTRAS DE ORTO E PARA-NITROFENIS POR CCD
Objetivo: Estabelecer as condies experimentais para a separao de o- e p-nitrofenol por CCD
(cromatografia em camada delgada). Nesse estudo sero utilizadas solues de amostras autnticas de pnitrofenol (soluo 1) e de o-nitrofenol (soluo 2).
Procedimento
1.
Preparar trs cmaras cromatogrficas com alguns mL dos solventes em ensaio (acetato de etila,
uma mistura de hexano e acetato de etila 3:1, diclorometano e metanol). Colocar meia folha de papel de
filtro encostada parede das cmaras para acelerar a saturao das mesmas com o vapor do solvente.
2.
Preparar trs microplacas com slica gel para CCD (confira mtodos descritos na parte terica sobre
CCD). Com um tubo capilar, aplicar em cada microplaca, devidamente espaada entre si e a cerca de
1 cm da margem, as solues autnticas de p-nitrofenol e o-nitrofenol. As manchas resultantes no
devem atingir dimetros superiores a 3 mm.
3.
Mergulhar cuidadosamente cada microplaca em cada solvente escolhido, de modo que os pontos
de aplicao das amostras fiquem acima do nvel do solvente. Aguardar o desenvolvimento dos
cromatogramas at cerca de 1 cm da borda superior da placa. Marque com a ponta de um lpis ou
esptula a posio atingida pela frente do solvente e remova imediatamente as placas da cuba de
desenvolvimento.
4.
Observar os resultados, estabelecendo qual solvente efetuou melhor separao (as manchas
devem ser visveis!). Para fins de registro, desenhar as cromatoplacas.
5.
De acordo com o resultado obtido, e caso seja necessrio, sugerir outra proporo de acetato de
etila e hexano, e repetir o procedimento anterior com esse novo solvente de desenvolvimento.
Discusso
1. Com base nos resultados escolha o melhor solvente de desenvolvimento (melhor separao).
2. Determine os valores de Rf para cada componente obtido na melhor separao.
3. Qual (ais) dos solventes de desenvolvimento testados voc recomendaria para eluir a coluna
cromatogrfica? Justifique.

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PARTE EXPERIMENTAL B-II. SEPARAO
CROMATOGRAFIA EM COLUNA DRY-FLASH

DA MISTURA DE

O-

P-NITROFENOL

POR

Procedimento:

Prepare a montagem mostrada na Figura 10. No funil de placa sinterizada coloque cerca de 15 g de
slica gel 60 mesh em suspenso numa mistura de hexano e acetato de etila 5:1 ou diclorometano puro,
em volume compatvel com o volume do tubo de ensaio a ser usado para recolhimento das fraes
eludas da coluna. Faa suco por meio de uma trompa de gua at completa secura do adsorvente .
Desconecte o sistema de vcuo e introduza no topo da coluna com ajuda de uma pipeta de Pasteur
a soluo de 0,5 g da mistura de nitrofenis 1:1, dissolvida num mnimo de solvente (hexano e acetato de
etila 5:1 ou diclorometano) ou alternativamente adsorvida em uma pequena quantidade de slica (farofa).
Deixe que a soluo contendo a amostra penetre na coluna e com pequenas quantidades de solvente (a
definir) carreie toda a amostra para dentro dos primeiros milmetros de slica da coluna.
Coloque uma rodela de papel de filtro ou camada de algodo no topo da coluna (precauo para
que a introduo do solvente de eluio no perturbe a superfcie do adsorvente).
Introduza na coluna o eluente em volumes predeterminados (cerca de 10 a 15 mL, a depender do
volume do tubo de ensaio para recolhimento das fraes) e faa a suco para que o mesmo seja
carreado rapidamente e totalmente para o tubo de ensaio no interior do Kitazato,
Desconecte o vcuo, troque o tubo de ensaio e repita vrias vezes o procedimento anterior usando
volumes predeterminados (cerca de 10 a 15 mL) de solvente escolhido. Os tubos de ensaio para recolher
as fraes eludas devem ser previamente numerados e reservados para anlise cromatogrfica.
Monitorar a separao e pureza de cada frao por cromatografia em camada delgada (CCD)
usando placas de slica gel e uma mistura de hexano e acetato de etila 3:1. Recomenda-se colocar na
placa cromatogrfica um padro da mistura inicial que est sendo fracionada para verificar se todos os
componentes j eluram.
A eluio da coluna dever ser continuada at a sada total de todos os componentes.
As fraes contendo cada componente puro devero ser reunidas em bales apropriados tarados e
o eluente evaporado com o auxlio do roto-evaporador. Aps remoo do solvente, pesar os bales
contendo as amostras recolhidas para o clculo do rendimento, considerando a massa da mistura inicial.

Figura 10. Montagem alternativa para cromatografia rpida a seco.

PARTE EXPERIMENTAL B-III. SEPARAO DA MISTURA DE ORTO E PARA-NITROFENOL POR

CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLSSICA
EXPERIMENTO DEMONSTRATIVO
1. Preparao da coluna

Colocar um pequeno chumao de algodo hidrfilo na base inferior da coluna (use basto de
tamanho adequado). Encher a coluna at cerca de 1/4 com solvente escolhido (hexano e acetato de etila
5:1 ou diclorometano). Testar se a torneira est estanque.

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Pesar aproximadamente 10 a 20 g de slica gel em bquer de 100 mL; adicionar o primeiro eluente
em quantidade bastante para formar uma papa homognea; misturar bem removendo as bolhas de ar.
Abrir a coluna de modo a gotejar o solvente em um frasco de Erlenmeyer durante o processo de
empacotamento.
Com a ajuda de basto de vidro deitar, de modo contnuo, a suspenso de slica na coluna ( o
solvente recolhido no Erlenmeyer deve ser utilizado novamente para carrear todo adsorvente para
a coluna). Se a adio da suspenso de adsorvente coluna for interrompida por algum tempo, o
mesmo tende a sedimentar-se, formando zonas estratificadas. Uma maneira de evitar esta situao
agitar o solvente na coluna com uma vareta de vidro entre duas adies sucessivas.
Deixar gotejar o solvente 5-10 minutos aps o enchimento da coluna para facilitar a sedimentao
da slica. Fechar a torneira quando o solvente apenas cobrir a coluna de slica.
Opcionalmente colocar uma rodela de papel de filtro, ou fina camada de algodo, no topo da coluna
para proteger a superfcie da slica (recomendvel aps introduo da amostra a fracionar!).

2. Preparao e introduo da amostra

Introduza no topo da coluna com ajuda de uma pipeta de Pasteur a soluo de 0,5 g da mistura de
nitrofenis 1:1, dissolvida num mnimo de solvente (hexano e acetato de etila 5:1 ou diclorometano) ou
alternativamente adsorvida em uma pequena quantidade de slica (farofa).

Deixar que a soluo a ser cromatografada penetre na coluna mediante controle da torneira. Com
pequenas quantidades de solvente carrear toda a amostra para dentro da coluna.
3. Eluio dos componentes da amostra

Recolher as fraes eludas com hexano e acetato de etila 5:1 ou diclorometano, em frascos de
Erlenmeyer de 50 mL ou tubos de ensaio previamente numerados. O volume de cada frao deve ser, em
mdia, de aproximadamente 15 a 20 mL. Vigiar constantemente o volume de solvente na coluna, a
qual deve jamais secar!

Monitorar a separao e pureza de cada frao por cromatografia em camada delgada (CCD). A
eluio dever ser continuada at a sada total de todos os componentes.

As fraes contendo cada componente puro devero ser reunidas em bales apropriados e o
eluente evaporado com auxlio de roto-evaporador.
DISCUSSO
1. Baseado em argumentos estruturais, comente sobre a separao cromatogrfica do o-nitrofenol e pnitrofenol. Que outras diferenas nas propriedades fsicas desses dois ismeros podem ser explicadas
usando-se os mesmos argumentos? (Pesquisar dados sobre PE e PF do o-nitrofenol e p-nitrofenol).
2. Pela CCD possvel obter informaes importantes sobre a composio quali-quantitativa do produto da
reao de nitrao do fenol, tais como: a eficincia do mtodo sinttico na converso de matria-prima
em produtos, a proporo relativa dos ismeros formados, a identidade dos ismeros formados por
comparao de suas caractersticas cromatogrficas (R f, cor e formato da mancha) com padres. Sobre
cada uma dessas informaes, comente se os resultados quali-quantitativos obtidos na separao por
cromatografia rpida a seco esto de acordo com o previsto por CCD.
3. (Provo 2001) Um qumico deseja separar os compostos abaixo por cromatografia em coluna, utilizando
slica como adsorvente. Para tal, percolou a coluna seqencialmente com os solventes I, II e III, que
formam uma srie eluotrpica. A primeira frao continha o composto X, a segunda frao, o composto
Y, e a ltima frao, o composto Z. Qual dos sistemas de solventes abaixo serve como fase lquida para
justificar a ordem de eluio encontrada?

(a)
(b)
(c)
(d)

Solvente I
hexano
hexano
tolueno
acetonitrila

Solvente II
acetonitrila
Tolueno
hexano
CH2Cl2

Solvente III
tolueno
CH2Cl2
acetonitrila
hexano

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(e)

CH2Cl2

Tolueno

hexano

4. (Provo 2001) A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) um dos mtodos cromatogrficos mais
modernos utilizados em anlise (CLAE analtica) e separao/purificao de misturas (CLAE
preparativa). Abaixo so dados os cromatogramas X, Y e Z de uma mistura de compostos presentes em
analgsicos: aspirina (A), cafena (B), fenacetina (C) e paracetamol (D), utilizando trs fases mveis
diferentes, no modo isocrtico, em uma mesma coluna. Avaliando esses cromatogramas, responda s
perguntas abaixo.

(a) Qual a fase mvel mais apropriada para ser utilizada em escala preparativa, e a fase mvel mais
adequada para utilizao em escala analtica, considerando um grande nmero de amostras a serem
analisadas? Justifique sua resposta.
(b) Qual o tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada nestes trs experimentos? Justifique sua
resposta.
(c) Sabendo-se que o composto mais polar elui primeiro, qual o composto de maior tempo de reteno?
Justifique sua resposta.

DISPOSIO DOS RESDUOS E INSUMOS

Alguns resduos aquosos podero ser descartados na pia com gua corrente. O demais resduos lquidos
e slidos (solventes, mistura de solventes, slica, etc.) devero ser acondicionados em frascos
apropriados, segundo orientao do instrutor.
Os produtos slidos e lquidos devero ser reservados, aps a purificao, para utilizao como insumos
em prticas posteriores.