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Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti

(HEMORIO)
Coordenao de Desenvolvimento Institucional e Servio de Ensino
Curso de Especializao em Imunohematologia HEMORIO 2014
Coordenadora: Dra. Shirley Castilho
Aluna: Gabriela de Souza Sedano
Mdulo 4

Resumo do Artigo DETERMINAO DO MTODO IDEAL PARA


IDENTIFICAO DE ANTICORPOS NUM LABORATRIO DE REFERNCIA
(J.R. Haywood, M.K.G. Moulds, and B.J. Bryant)

Mtodos normalmente usados para a identificao de anticorpos so de


hemaglutinao (tubo), a aglutinao em coluna (gel), e na fase slida por
aderncia dos glbulos vermelhos. Nosso laboratrio de referncia em
imunohematologia (IRL) credenciado pela AABB realizou um estudo para
determinar qual o mtodo de teste de identificao de anticorpos seria melhor
para detectar todos os anticorpos clinicamente significativos. As amostras de
pacientes foram enviadas para o nosso laboratrio a partir de agosto de 2008 a
setembro de 2009. Testes de rotina foram realizados pelo mtodo do tubo e,
em seguida, por gel manual e mtodos em fase slida manuais. Das 254
amostras analisadas, 115 apresentaram concordncia na identificao de
anticorpos com todos os trs mtodos. O mtodo do tubo identificou todos, mas
6 anticorpos eram clinicamente significativos. O mtodo de gel no identificou
59 anticorpos clinicamente significativos. 56 anticorpos clinicamente
significativos no foram identificados por meio de testes de fase slida. O tubo
de teste identificou 27 anticorpos clinicamente insignificantes, auto-anticorpos
principalmente frios. Gel e metodologias em fase slida identificaram dois e trs
anticorpos frios, respectivamente. Ensaio de fase slida para detectar falha
identificaram 12 exemplos de anti-K. Nenhum padro identificvel de
reatividade foi encontrado em 13 amostras usando o teste em gel quando
comparadas com as 6 amostras encontradas por fase slida e nenhum padro
de reatividade tambm foi encontrado para metodologias de tubo. Mtodo do
tubo de hemaglutinao foi a melhor escolha para o nosso laboratrio porque
um menor nmero de aloanticorpos clinicamente significativos foi perdido.
Benefcios tambm incluem a possibilidade de usar vrios fatores
potencializadores, tempos de incubao e fases de temperatura para aumentar
a identificao de anticorpos.

Os trs mtodos vulgarmente utilizados nos Estados Unidos para testes


pr-transfusionais e de identificao de anticorpos so os mtodos de
hemaglutinao (tubo), aglutinao em coluna (gel), e em fase slida por
aderncia de clulas vermelhas. Todos so eficazes, mas geralmente um
selecionado por um laboratrio como o mtodo primrio. Dos 58 laboratrios de
referncia em imunohematologia pesquisados no momento no nosso estudo,
49 amostras so utilizadas em tubo, 7 utilizadas pelo mtodo em gel, e 2
utilizadas em fase slida. Nosso laboratrio utilizou o mtodo do tubo como o
principal mtodo para a determinao de anticorpos, embora a maioria das
instalaes que receberam as amostras utilizou o mtodo em gel ou ensaio em
fase slida para a deteco, e em alguns casos, a identificao preliminar, de
anticorpos, antes de enviar as amostras para uma identificao completa. O
objetivo deste estudo foi avaliar tubo, gel, e os resultados dos testes de fase
slida para determinar o melhor mtodo para a deteco e identificao de
todos os anticorpos clinicamente significativos.
Amostras de pacientes utilizadas no estudo foram enviadas ao nosso
laboratrio de referncia a partir de agosto de 2008 at setembro de 2009. As
amostras vieram de hospitais, clnicas, e centros de dilise que usam nosso
laboratrio para identificao de anticorpos. Da maioria das amostras referidas,
nosso laboratrio de referncia possua identificaes de anticorpos
incompletos ou inconclusivos. A maioria dos laboratrios referentes utilizou
metodologia de gel automatizado (Ortho ProVue, Ortho Clinical Diagnostics,
Inc., Rochester, NY) e outros utilizaram ensaios de fase slida automatizado
(Immucor Galileu ou Galileo Echo, Immucor Gamma, Norcross, GA). O mtodo
menos comum usado pelos laboratrios referentes estava testando tubo. Os
testes de rotina no nosso IRL foram realizados pelo mtodo do tubo, e uma
alquota de soro ou plasma foi guardada para gel manual e ensaios de fase
slida manual (alquota refrigerada para o teste em 24 horas ou congelada para
o ensaio posterior).
O teste em tubo foi realizado utilizando uma metodologia de teste em
tubo modificado introduzido por John Moldes quando entrou no Hemocentro de
LifeShare em Shreveport, Louisiana no ano de 2004 como Diretor de Suporte
Cientfico. Duas gotas de soro ou plasma do paciente foi incubada com 1 gota
de clulas vermelhas do sangue reagente durante 5 minutos temperatura
ambiente. Os tubos foram centrifugados e, posteriormente foi feita a leitura.
Duas gotas de salina de baixa resistncia inica (LISS) foram adicionadas a
cada tubo; os tubos foram incubados a temperatura ambiente durante um
adicional de 10 minutos antes de serem centrifugados e, mais tarde lidos. Os
tubos foram ento incubados a 37 C durante 30 minutos, centrifugados, e
lidos. Os tubos foram lavados quatro vezes com cloreto de sdio a 0,9%, e na
ltima lavagem foram decantados. Uma a duas gotas de anti-IgG (gama-Clone
Anti-IgG, Immucor Gama) foram adicionadas a cada tubo, os tubos foram
centrifugados, e lidos. Foram utilizados mtodos de realce adicionais, conforme
necessrio, dependendo dos resultados do teste inicial, ou seja, soluo salina

durante 60 minutos e incubados a 37 C, sem reforo, ou um polietilenoglicol


(PEG) para reforar reaes fracas ou excluir aloanticorpos ou enzimas e
testes qumicos.
O teste de fase slida manual utilizou 14 clulas nos painis de
identificao de anticorpos (Capture-R Pronto-ID, Immucor gama). Painis de
identificao de anticorpos em gel manual usaram cartes em gel (cartes em
gel IgG, Ortho Clinical Diagnostics, Inc.) com hemcias comerciais (painel de
10 celulas Panocell, Immucor Gamma) diludas a 0,8% de concentrao.
Mtodos em fase slida e de aglutinao de coluna (gel) foram realizados de
acordo com as recomendaes dos fabricantes.
Os resultados de cada amostra de identificao de anticorpos foram
classificados em um dos cinco grupos com base nos resultados dos trs
mtodos de teste: todos os mtodos estavam de acordo, os mtodos de tubo e
gel concordaram, os mtodos de tubos e em fase slida tambm estavam de
acordo, e em fase slida e gel, ambos os mtodos de acordo.
Num perodo de 13 meses, um total de 254 amostras foram processadas
por todos os trs mtodos. Os trs mtodos demonstraram os mesmos
resultados de identificao de anticorpos em 115 amostras (45% do total
testado).
Mtodos em fase slida e de gel estavam de acordo, mas o mtodo do
tubo no, em 51 amostras (20%). Havia 16 anticorpos clinicamente
significativos detectados pelo mtodo de tubo que foram perdidos por ambos
os mtodos em fase slida e em gel. Estes incluem anti-D, -C, -E, -K, -Jka e Jkb. Houve apenas um exemplo no qual o mtodo do tubo perdeu um anticorpo
clinicamente significativo, anti-C, o qual foi detectado por mtodos de fase
slida e de gel.
Os resultados obtidos pelos mtodos de tubos em gel estavam de
acordo, mas a fase slida perdeu 15 anticorpos clinicamente significativos em
29 amostras (12% das amostras testadas). Anticorpos clinicamente
significativos no foram contemplados pelo mtodo em gel incluindo anti-D, -E,
-e, -K, -S, -Jka, -Jkb e -U. No entanto, em uma amostra, anti-Jka foi identificado
em fase slida, mas no em mtodos de tubo ou de gel.
Os resultados dos testes de tubo e em fase slida, mas no em gel,
revelaram os mesmos anticorpos em 23 amostras (9%). O teste em gel perdeu
19 anticorpos clinicamente significativos: anti-D, -C, -c, -e, -K, -s, -Fya, -Jka,
-Jkb e de auto-anticorpos quentes. Uma amostra revelou anti-E identificado por
gel quando no era detectvel no tubo ou nos mtodos de ensaio de fase
slida. Nenhum dos mtodos concordou em 36 amostras (14%). Nesta amostra
coorte, o mtodo do tubo perdeu trs anticorpos significativos (um anti-C e dois
anti-E). O mtodo de fase slida perdeu 24, e em gel perdeu 23. O mtodo em
gel era o nico mtodo que demonstrava a hemlise com duas amostras
testadas. Havia muitos painis que eram inconclusivos, que complicaram a
anlise dos dados.

Nenhum mtodo capturou cada anticorpo clinicamente significativo. O


mtodo de gel perdeu 59 anticorpos e parecia dar o mximo de resultados que
demostravam nenhum padro de reatividade. Testes em fase slida perderam
56 anticorpos. O mtodo do tubo perdeu apenas 6 anticorpos, mas tambm
identificaram os anticorpos mais insignificantes, auto-anticorpos principalmente
frios.
Vrios estudos tm comparado vrios mtodos de deteco e
identificao de anticorpos em busca do melhor mtodo para testes sorolgicos
pr-transfusionais. Nosso estudo difere a partir desses estudos comparativos
anteriores na medida em que procuraram determinar a metodologia de testes
de rotina ideal para a identificao de anticorpos a que se refere o nosso
laboratrio de referncia em imunohematologia (IRL). Referindo laboratrios
utilizados, vrios so os mtodos de testes pr-transfusionais; gel
automatizado mais utilizado ou mtodos em fase slida. Painis de anticorpos
que se refere ao nosso IRL incluindo anticorpos detectados, mas no
identificados, identificaes de anticorpos incompletos, e painis de anticorpos
com resultados inconclusivos fracos. Os laboratrios referentes dependiam do
IRL para identificar com preciso e completamente os anticorpos detectados.
Testes de mtodo em Tubo perdem o menor nmero de anticorpos
clinicamente significativos (6). Isso foi por causa das muitas maneiras que este
mtodo poderia ser manipulado, tais como temperatura, tempo e meios de
melhoria. O mtodo do tubo detectou no s anticorpos clinicamente
significativos, mas tambm anticorpos frios reativos e insignificantes. Este
mtodo demonstrou a melhor sensibilidade, detectando 188 anticorpos
clinicamente significativos. No entanto, no mtodo em tubo 49 anticorpos
insignificantes foram detectados, 30 dos quais eram auto-anticorpos frios. A
Identificao de anticorpos frios requer tempo e trabalho intensivos, embora em
alguns casos, a identificao de auto-anticorpos frios pelo mtodo do tubo, seja
reaes inexplicveis/inespecficas obtidas pelo laboratrio de referncia.
Ensaio de fase slida para detectar falha identificou 6 exemplos de
anticorpos do sistema Knops. Dois destes seis anticorpos foram detectados por
gel, e todos os 6 foram detectados pelo mtodo do tubo. Em um exemplo, o
anti-Jka foi identificado pelo mtodo de fase slida enquanto que em tubo e gel
no apresentou reatividade. Em ensaios de fase slida tambm foram
demonstrados que no detectaram a maioria dos anticorpos frios e reativos,
embora tenham sido identificados 3 anticorpos. Anti-K foi desperdiada 12
vezes por meio de testes de fase slida no presente estudo, enquanto que o
teste de gel falhou 9 vezes e o teste em ensaio perdeu um tubo. Ensaios de
fase slida tambm foram inconsistentes na identificao de anticorpos anti-Rh.
Tal como acontece com o mtodo de fase slida, ensaio em gel no
detecta a maioria dos anticorpos frios e reativos, embora tenham sido
identificados 2 anticorpos. Anti-E reagiu fortemente em gel, mas ainda no foi

atingido, em alguns exemplos em que o mtodo de tubo o identificou. Teste Gel


deu o mximo de resultados que no tinham padro especfico de reatividade.
Muitas especificidades dos anticorpos foram sugeridas, mas no confirmadas
porque nem todas as clulas antgeno-positivas foram reativas. Gel foi o nico
mtodo que demonstrou hemlise inexplicada durante os testes com dois
espcimes.
Um fator a considerar na anlise de vrios mtodos de identificao de
anticorpos o nmero de anticorpos anti-D adquiridos passivamente
resultantes de Rh imunoglobulina (RhIg) administrado contra o verdadeiro aloanti-D. Com base em painis de anticorpos a partir de hospitais, RhIg
detectado de forma uniforme em ambos gel automatizado e mtodos de fase
slida. Em testes de tubo, a partir de anti-D detectado RhIg fracamente, se de
todo.
Este estudo no tentou avaliar a diferena nos resultados de
identificao de anticorpos obtidos pelo manual versus fase slida e gel testes
automatizados. Muitas das instalaes referentes utilizaram fase slida e gel
testes automatizados para deteces e identificaes de anticorpos iniciais, por
outro lado o nosso laboratrio de referncia utilizou apenas mtodos manuais.
O impacto desta variao desconhecido.
Em concluso, este estudo demonstrou que o mtodo do tubo de
hemaglutinao foi a melhor escolha para a identificao de anticorpos, uma
vez que perdeu o menor nmero de aloanticorpos clinicamente significativos
em comparao com os outros dois mtodos. Um laboratrio de referncia
responsvel pela identificao de todos os anticorpos presentes, seja
clinicamente significativo ou no. As principais vantagens do mtodo do tubo
so a identificao de todos os anticorpos presentes e a capacidade de
melhorar o teste usando vrios fatores potencializadores, tempos de incubao
e fases de temperatura. O mtodo do tubo fornece dados importantes para a
determinao de anticorpos com significado clnico. No entanto, ele benfico
para um laboratrio de referncia para ter mtodos em gel e em fase slida
disponveis para comparao porque muitos hospitais referem utilizar estes
mtodos para a deteco de anticorpo inicial. Em geral, o mtodo do tubo foi o
mtodo mais confivel para a identificao de anticorpos em nosso laboratrio
de referncia.