Las legumbres contienen factores antinutricionales que se deben minimizar o eliminar

antes de la ingestin. Los ms comunes procedimientos utilizados para reducir la

cantidad de factores antinutricionales y por lo tanto aumentar su valor nutricional son:
remojo, coccin, germinacin, fermentacin y adems enzimas (Cowan, 1995; Fras,
Vidal-Valverde, Sotomayor, D'az-Polla'n, y Urbano, 2000; Tabera, Fras, Estrella, Villa,
y Vidal-Valverde, 1995; Vidal-Valverde et al., 1994).
Los procedimientos biotecnolgicos de la adicin de enzimas en harinas de leguminosas
han sido reconocidos en la industria alimentaria, y el objetivo principal es mejorar la
utilizacin de los nutrientes en las materias primas. En la industria alimentaria, las
enzimas se consideran un suplemento nutricional y han sido utilizadas como
coadyuvante tecnolgico en el aumento del valor biolgico de ciertos alimentos. La
enzimologa actual y las tcnicas de biologa molecular estn seleccionando las fuentes
de enzimas sobre la base de un sustrato y las condiciones de selectividad de reaccin
(James & Simpson, 1996; Estell, 1993). Por lo general, los sustratos son complejos y las
enzimas comerciales son mezclas, por lo tanto el uso de enzimas puras, con propiedades
catalticas especficas y concretas sobre la actividad en un tipo concreto de sustrato es
de gran inters.
El resultado de la accin enzimtica depende de las reacciones bioqumicas que tienen
lugar durante el tratamiento, por lo que el sustrato debe estar perfectamente identificado
y caracterizado, y las reacciones deben ocurrir en las condiciones adecuadas de pH,
temperatura, tiempo, etc., para cada enzima.
La aplicacin de enzimas comerciales en el tratamiento de legumbres para consumo
humano puede minimizar o eliminar ciertos factores antinutricionales, mejorando sus
propiedades nutricionales, como se observ en un estudio de semillas de soja trituradas
(Classen, Balnave, y Bedford, 1993). Varios autores han reportado que la adicin
selectiva de enzimas para harina de legumbres disminuye los niveles de cido ftico
(Fredrikson, Biot, Alminger, Carlsson, y Sandberg, 2001; Fras, Doblado, Antezana, Y
Vidal-Valverde, 2003a; Wu, Ravindran, y Hendriks, 2004) o -galactosidasa (Fras,
Doblado, Y Vidal-Valverde, 2003b; Mulinari y Devendra, 1997).
Algunas de las enzimas ms utilizadas en la industria alimentaria son:
Fitasas. Estas son las enzimas responsables de la desfosforilacin de los fitatos y estn
ampliamente distribuidas en microorganismos, plantas y animales (Konietzny, Greiner,
Y Jany, 1995). La adicin de fitasas a los alimentos puede disminuir los efectos
antinutricionales de cido ftico, lo que hace que estas enzimas sean importantes en
aplicaciones biotecnolgicas de alimentos y piensos de origen animal (Fredrikson y
col.,2001; Konietzny y Greiner, 2002; Wu et al., 2004).
-galactosidasas. Las -galactosidasas son las enzimas responsables de la hidrlisis de
un -galactsido ya que hidrolizan el en lace - (1-6) de las molculas de galactosa. Los
-galactsidos en las legumbres son la razn de la flatulencia ya que son degradados por
microorganismos productores de dixido de carbono, hidrgeno y metano (precio,
Lewis, Wyatt, y Fenwick, 1988), y las -galactosidasas pueden disminuir o eliminar
estos compuestos (Fras et al., 2003b). Estas enzimas se producen en un gran nmero de
plantas y microorganismos (Dey y Pridman, 1972; Mansour y Khalil, 1998).

Las enzimas que actan sobre los polisacridos no amilceos. Los polisacridos no
amilceos se encuentran en la pared celular de verduras y pueden limitar el acceso de
enzimas endgenas para disminuir los nutrientes por su uso. El uso de complejos
multienzimticos, tales como Viscozyma, que contiene celulasas, arabinasas,
hemicelulasas, gluconases y xilanasas, provoca la ruptura de las paredes celulares,
favoreciendo la extraccin de compuestos tiles a partir de los tejidos vegetales,
aumentando su digestibilidad y absorcin (Bedford, 2002; Peterson, Wiseman, y
Bedford, 1999). Antezana et al. (2003) observaron que la accin de Viscozyma 120 l de
la harina de guisante aumenta el contenido de fibra soluble, mejorando la proporcin de
fibra insoluble de fibra / soluble, causando un aumento en la utilidad de estas harinas.
Tanasa. Esta enzima hidroliza el dpsido y el enlace ster de taninos hidrolizables
liberando cido glico y glucosa (Ramrez-Coronel, Viniegra-Gonzlez, Darvill, y
Augur, 2003). La tanasa es una enzima producida por diversos hongos filamentosos,
principalmente Aspergillus y Penicillium en la presencia de cido tnico (RamrezCoronel et al., 2003).Esta enzima se utiliza en varios procedimientos de alimentos, tales
como la produccin de t instantneo (Agbo y Spradlin, 1995; Boadi Y Neufeld, 2001),
o la produccin de aditivos de aroma de caf para refrescos (Chae y Yu, 1983; Pourrat,
Regerat, Pourrat, y Jean, 1985). Tiene tambin su uso potencial en la clarificacin de
cervezas y zumos de frutas (Cantarelli, Brenna, Giovanelli, y Rossi, 1989). La
liberacin de cido glico por la accin de tanasa, en taninos glicos, sera beneficioso
ya que este compuesto se supone que tiene un gran poder antioxidante (Netzel,
Shahrzad, Winter, y Bitsch, 2000).
Las lentejas presentan compuestos fenlicos flavonoides y no-flavonoides que se
distribuyen entre los cotiledones y la cubierta de la semilla de una manera
cualitativamente diferente (Duen~, Herna'ndez, y Estrella, 2002). Las proantocianidinas
son la mayora de los polifenoles abundantes, que se encuentran principalmente en el
escudo y la semilla que junto con flavonas y flavonoles representan ms del 80% de los
compuestos fenlicos totales en las lentejas de la variedad Pardina (Dueas, Sol,
Herna'ndez, Estrella, y Spranger, 2003). Los compuestos fenlicos se consideran
sustancias bioactivas, con actividad antioxidante a travs de su actividad de eliminacin
de radicales libres; esta actividad est directamente relacionada con la estructura
qumica de los polifenoles, como el nmero de grupos hidroxilo, el grado de
glicosilacin, etc. (Baderscheneider y Winterhalter, 2001; Decker, 1997; Montoro,
Braca, Pizza, & De Tommasi, 2005; Natella, Nardini, Di Felice, y Scaccini, 1999).
Algunos procesos llevados a cabo en las legumbres, aumentan la capacidad antioxidante
en relacin a su composicin polifenlica, por ejemplo, la fermentacin de caup con
Lactobacillus plantarum producen un aumento en su capacidad antioxidante (Dueas,
Ferna'ndez, Herna'ndez, Estrella, y Mun~ oz, 2005).
Varios autores (Antezana, 2002; Duen~ como, 2003; Fras et al., 2003a; Fras et al.,
2003b) han observado los efectos del tratamiento de la harina de lentejas Pardina con las
enzimas fitasa, -galactosidasa, Viscozyma o tanasa con el propsito de reducir o
eliminar factores antinutricionales.

Por lo que sabemos, hay pocos informes sobre el efecto de la adicin de enzimas en la
composicin polifenlica de las legumbres y los que estn disponibles con frecuencia se
refieren nicamente a evaluacin de taninos general y no sobre el contenido polifenlico
de una manera detallada. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de
la adicin de las enzimas fitasa, -galactosidasa, Viscozyma o tanasa en la composicin
fenlica de la lenteja (Lens culinaris) en harinas acuosas en medio a pH 5,5 y 37C, a
escala piloto en un fermentador. La actividad antioxidante de las muestras fue evaluadas
por la actividad de eliminacin de radicales libres utilizando la mtodo de DPPH. Un
anlisis de componentes principales era llevado a cabo con el fin de correlacionar la
actividad antioxidante y el contenido de compuestos polifenlicos en los diferentes
tratamientos enzimticos.

Lentejas (Lens culinaris var. Pardina). Fueron tritutadas en un molino de bolas, se

tamiz y se recogi la fraccin de 0,050-0,250 mm.
Enzimas. Se utilizaron las siguientes enzimas comerciales: Fitasa EC 3.1.3.8 (fitasa
Novo L, 5000 FYT / g; 1 FYT de 1 lmol de cido ftico / min). -galactosidasa CE
3.2.1.22 (Novo Nordisk de Aspergillus niger, 1000 GALU / g; 1 GALU de prensa 1
lmol de galactosa / min a pH 5,5 a 37 C). Viscozyma [Novo Nordisk 120 l, 100 FBG
(b-glucanasa fngica) / g, incluyendo una mezcla de actividades glucanasa, arabinasa,
hemicelulasa y xilanasa; 1 FBG es la cantidad de enzima que en condiciones estndar
libera hidratos de carbono de glucosa u otros reductores con una poder de reduccin
correspondiente a 1 lmol glucosa / min]. Tanasa EC 3.1.1.20 (Juelich Enzyme
productos, desde Aspergillus ficuum, 24,4 U / mg; 1 U libera 1 lmol de glico cido en 1
min a 37? C y un pH 5,5, a partir de sustrato de tanino).
El tratamiento con adicin de fitasa, a-galactosidasa, Viscozyme o tanasa. Se
suspendi la harina de lentejas (300 g) en 300 ml de una solucin tampn (cido
hidrxido de sodio / cido actico, 0,1 N, pH 5,5) a 37C con las diferentes enzimas
comerciales, en las condiciones ptimas de concentracin y tiempo de incubacin
establecido con anterioridad para cada una de ellas (Antezana, 2002; Dueas, 2003;.
Fras et al, 2003b; Fras et al., 2003a). Se llev el volumen total hasta 3000 ml con agua
destilada calentada previamente a 37C. Las suspensiones se incubaron en un
fermentador con agitacin (Microferm fermentador, MF-100, New Brunswick
Cientfico, Edison N. J. EE.UU.). Despus del tratamiento con las enzimas, las muestras
de harinas de lentejas se centrifugaron a 4C y 10.000 rpm durante 10 min, y el
sobrenadante se descart. Los residuos se secaron por congelacin y se almacenaron
durante anlisis.
La extraccin de compuestos fenlicos. La harina de lenteja bruta y la tratada
enzimticamente (10 g) se maceraron con 3 x 80 ml de una solucin de HCl-metanol
(10/000) / agua (80:20 v / v). Una alcuota de la solucin macerada fue extrada de
acuerdo a Dueas et al. (2002). Los extractos obtenidos se analizaron mediante
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC-PAD y HPLC-MS). Las muestras se
prepararon y se extrajeron por triplicado.

El anlisis por HPLC-PAD y HPLC-MS. Se realizaron anlisis de compuestos

fenlicos usando un sistema de cromatografa Waters 2690 (Milford, MA-EE.UU.)
equipado con un sistema de automuestre. Los espectros de masas se obtuvieron usando
un Hewlett Packard 1100MS (Palo Alto, CA) equipado con cromatgrafo una fuente
API, utilizando una interfaz ESI por el mtodo de Dueas et al. (2002).
La identificacin de compuestos se llev a cabo por comparacin de los tiempos de
retencin y espectros UV con los estndar y confirmada por HPLC-MS. Los
compuestos para los que no se disponan estndares, se identificaron por sus parmetros
espectrales de UV y por HPLC-MS (ESI) (Dueas et al., 2002).
La cuantificacin se realiz utilizando el mtodo estndar externo a 280 y 340 nm de
acuerdo con la mxima absorbancia para cada compuesto. Los derivados del cido
hidroxicinmico se cuantificaron utilizando la curva de calibracin del cido libre
correspondiente y las proantocianidinas se cuantificaron como catequina (+).
2.1. Actividad antioxidante
La actividad antioxidante (EC50) se determin por el mtodo de Brand-Williams
(Brand- Williams, Cuvelier, y Berset, 1995), con el radical 2,20difenil-1- picrilhidrazil
(DPPH), adaptado a la leguminosa, por Lpez-Amors, Lomas, Estrella, y Hernndez
(1998). La reaccin se lleva a cabo con 2 ml de una solucin de DPPH (0,025 g / l) en
metanol y soluciones de diferentes concentraciones de las diferentes muestras. La
absorbancia se midi en intervalos de 1 min a 515 nm, hasta que la reaccin alcanz una
meseta (tiempo en estado constante). Se represent el porcentaje de DPPH mantenido
vs. la concentracin de la muestra para obtener la cantidad de antioxidante (mg de
harinas de leguminosas) necesario a disminuir en 50%. A un valor EC50 ms pequeo
corresponde a una mayor actividad antioxidante. Las muestras se prepararon y midieron
separado por triplicado.
2.2. Anlisis estadstico
Los datos fueron sometidos a ANOVA multifactorial mediante el mnimos cuadrados
diferencias de prueba (el LSD, el nivel 5%) y mltiple correlacin con el Statgraphics
Plus 5.0 Programa (Statistical Sistema de software de grficos, Rockville, MD,
EE.UU.).