UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOQUIMICA
BQA7016-08108 (20111) - Mtodos Analticos em Bioqumica
Bolsistas REUNI: Gianni Mancini e Josiane Budni
Determinao de GSH Fluorimtrico e Peroxidao Lipdica

Preparao das Amostras:

-

Tecido: Crebro total e Fgado

Homogenato: Homogeneizar em Tampo Fosfato 50 mM 1:10
Centrifugao por 1.000g por 10 min a 4C
Separar o sobrenadante S1 para o ensaio

Ensaio de oxidao:
-

Pipetar 200 ul de sobrenadante S1 em 290 ul de Tampo Fosfato 50

mM e adicionar 10 ul de peroxido de T-butil 25 mM (concentrao

final 500 uM).

Incubar por 1 hora a 37C em banho maria
Aps a incubao, separar as alquotas para as dosagens.

Nveis de GSH
GSH Fluorimtrico (Hissin and Hilf (1976) Analytical Biochemistry 74 214226)
Fundamento:
Formao de um produto fluorescente pela reao entre os grupos tiis
(SH) e o o-ftalaldedo (OPT) durante uma excitao de 350 nm e emisso de
420 nm.

Procedimento:
-

Pipetar 150 uL de cada amostra em um novo eppendorf e adicionar

150 uL de cido Perclrico 0,6M (G1).

Centrifugar a 10.000g por 10 min.
EM DUPLICATA: pipetar 50 uL do centrifugado e adicionar 1850 uL

de Tampo Fosfato de sdio 100mM (G2).

Adicionar 100 uL de G3 (OPT 1 mg/mL)
Incubar por 15 min a temperatura ambiente.
Pipetar 200 uL de cada amostra no leitor de placas para
fluorescncia (preta) e fazer a leitura com excitao de 350 nm e

emisso de 420 nm.

Curva padro de GSH:

b
ug de GSH
Sol. Stock (GSH padro)
Tampo Fosfato de
Sdio 100mM pH=8,0
OPT 1mg/ml

1
2
3
0,02
5
0,15 0,25

0,5

0,75

30

50

100

150

200

1,9

1,985

1,87

1,85

1,8

1,75

1,7

100

100

100

100

100

100

100

Peroxidao Lipdica
TBARs (Esterbauer and Cheeseman (1990) Methods Enzymol. 186 407-421)
Fundamento:
Formao de um complexo de colorao rosa pela reao entre o TBA e
produtos de peroxidao lipdica como o MDA, observados a 540 nm.
Procedimento:
-

Pipetar 350 uL de cada Amostra e adicionar 350 ul de TCA 10% (T1).

Centrifugar a 10.000g por 10 min.
EM DUPLICATA: pipetar 300 uL do centrifugado e adicionar TBA

0,67% (T2).
Incubar por 45 min a 100C em banho maria.
Aps incubao, Centrifugar novamente a 10.000g por 10 min.
Pipetar 200 uL de cada amostra no leitor de placas e ler em 540 nm.
Curva padro de MDA:

uM de MDA

1,5

4,5

10

sol. MDA 60 nmol/ml

TFK 20 mM
c. Actico pH= 3,5
TBA 0,67 %

14

28

43

75

75

68

61

47

32

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100