Disciplina de Bioqumica I Curso de Qumica - UFSCar

Prtica 2- AMINOCIDOS E PROTENAS

A - REAES GERAIS PARA IDENTIFICAO DE PROTEINAS E
AMINOCIDOS
A.1. Reao de ninidrina Identificao de aminocidos
Monte as seguintes reaes:
TUBO
1
2 (branco)

Glicina 0,1 M
2 mL
-

Ninidrina em lcool
250 L
250 L

gua
2 mL

Cor observada

Ferva os tubos durante 1 ou 2 minutos.

Observe e explique o aparecimento de colorao azul na soluo por
meio de reao qumica.
A.2. Prova do biureto Pesquisa da ligao peptdica
Nos experimentos seguintes, ser utilizado plasma bovino diludo em
gua na proporo 1:3 como amostra.
Proceder segundo o protocolo a seguir:
TUBO
com
tampa
3

--

NaOH
2
mol/L
2 mL

8 gotas

--

--

2 mL

8 gotas

--

2 mL

--

2 mL

8 gotas

--

--

2 mL

2 mL

8 gotas

Plasma
(1:3)

Gelatin
a 2%

Glicina 0,1
M

gua

2 mL

--

--

--

2 mL

--

6 (branco)

--

CuSO4
0,5%

Cor
observad
a

Misture bem a soluo aps a adio de cada gota. O aparecimento de

uma colorao violeta indica a presena de ligaes peptdicas.
Observe e explique o aparecimento de colorao na soluo por meio de
reao qumica.
A.3. Reao de Folin-Ciocalteau
Proceder segundo o protocolo a seguir, utilizando tubos de ensaio
grandes. Utilize pipeta de vidro para a gua:

A (branco)

Soluo de
tirosina
-

NaOH
2 mol/L
600 L

H2O
destilada
8,2 mL

Plasma
1:3
-

Reagente de
Folin
300 L

B
C

200 L
-

600 L
600 L

8 mL
8 mL

200 L

300 L
300 L

TUBO

Cor
observada

Adicionar o reagente de Folin a todos os tubos lentamente. Discutir as

cores observadas em cada tubo.
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2
Observe e explique o aparecimento de colorao na soluo por meio de
reao qumica. A reao de Folin funciona para qualquer aminocido?
Explique.
A.4. Reao Xantoprotica
Proceder segundo o protocolo a seguir. Utilize pipeta de vidro para a
TUBO
com
tampa
7
(branco)
8

Plas
ma
(1:3)

Tirosin
a (0,1
M)

Glicina
(0,1 M)

gua

HNO3
concentrado

2 mL

250 L

2 mL

250 L

2 mL

250 L

10

2 mL

250 L

Cor

Ferver por 2 minutos; resfriar

gua:
NaOH
12 M
250 L
250 L
250 L

250 L

Ferver com cuidado cada tubo por dois minutos em banho-maria;

Aps resfriar, adicione, gota a gota o 250 L da soluo de NaOH 12 M;
Misture, observe e anote os resultados.
Observe e explique o aparecimento de colorao na soluo por meio de
reao qumica.
B REAES DE PRECIPITAO DE PROTENAS
B.1. PRECIPITAO IRREVERSVEL
B.1.1. Desnaturao pelo calor
No tubo de ensaio D (grande), pipetar 2 mL de plasma 1:3. e aquecer
diretamente na chama. Observar e explicar.
B.1.2. Desnaturao por cidos
Montar os tubos conforme a tabela:
TUBO
11
12

Plasma
1:3
1 mL
1 mL

TCA 20% (cido

tricloroactico)
1 mL
-

HNO3 1
mol/L
1 mL

Observar a formao do cogulo e explicar.

B.1.3. Desnaturao por metais pesados
TUBO

Plasma
1:3

AgNO3 1
mol/L

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3
13

1 mL

1 ml

Observar a formao do cogulo e explicar.

B.1.4. Desnaturao por solventes orgnicos

14

Plasma
1:3
1 mL

15

1 mL

TUBO

Acetona 100%

Etanol absoluto

1 mL

1 ml

Observar a formao do cogulo e explicar o seu aparecimento.

B.1.5. Precipitao fracionada pelas solues salinas concentradas
Adicione 5 mL de soluo saturada de (NH 4)2SO4 em 5 mL de plasma 1:3
no TUBO 16. O precipitado formado deve ser tratado de acordo com o
fluxograma a seguir:
Plasma (1:3) + (NH4)2SO4 (4M) TUBO
16
Filtrar sobre falcon de 50 mL (tubo
17)
Precipitado 1 (slido no
filtro)

Filtrado 1
TUBO 17 FALCON
+ (NH4)2SO4 slido at
saturao

TUBO 18

Teste do Biureto

Precipitado 2
(slido no
filtro)
TUBO 20

Filtrar sobre falcon de 50

mL
Filtrado 2
TUBO 19 FALCON
Retirar 2 mL
TUBO 21

Teste do Biureto

Teste do Biureto

Teste do Biureto (utilize pipeta de vidro para a gua):

TUBO

gua

NaOH

CuSO4

Precipita

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4

18 (com precipitado
1)
20 (com precipitado
2)
21 (com filtrado 2)
22 (branco: sem
amostra)

2
mol/L

0,5%

2 mL

2 mL

10 gotas

2 mL

2 mL

10 gotas

2 mL

10 gotas

2 mL

2 mL

10 gotas

o
observada

.
Descreva porque ocorreu a precipitao fracionada das protenas.
Explique quais protenas podem estar presentes no precipitado 1 e no
precipitado 2.
B.2. PRECIPITAO REVERSVEL
B.2.1. Salting-in- solubilizao
Adicione 5 mL de H2O clara de ovo (6 mL) contida no recipiente. Agite
vigorosa e rapidamente com um basto de vidro at observar o aspecto de
leve turbidez e espuma. Pipete 3 mL nos tubos 23 e 24 (reservando o restante
para o prximo ensaio), como na tabela a seguir:
TUBO

Clara de
ovo +
gua

NaCl 1 M

23

2 mL

Goteje at
dissoluo

24 (branco)

2 mL

gua

Resultado

Adicione a mesma
quantidade usada
de NaCl

Observe a diferena entre os tubos e discuta.

B.2.2. Salting-out- precipitao
Da soluo restante de protena obtida no item anterior, pipete 3 mL
para o tubo E (grande com tampa). Proceda como na tabela seguinte. Utilize
pipeta de vidro para a gua:
TUB
O
E

Prote
(NH4)2SO4 Observar gu Inverter lentamente
na
4M
precipita a
at redissoluo do
B.2.1
o
precipitado
2 mL
3 mL
5 mL

Resultado

Discuta os resultados e o fundamento das tcnicas de salting in e salting

out.
C. DETERMINAO DO pH DA CASENA por precipitao isoeltrica
Preparar 5 tubos de ensaio contendo casena (0.5% em pH 8,5), de acordo
com a tabela. Utilize pipeta de vidro para a gua:

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5
TUBO
23
24
25
26
27

gua
(mL)
4,5
4,45
4,35
4
-

Casena, pH 8,5
( L)
500
500
500
500
500

cido Actico 0,1 M

(L)
10
50
150
500
4500 (4,5 mL)

pH

Precipit
ao

Agite bem os tubos e medir o pH com papel indicador universal. Observe

se ocorre precipitao e registre os resultados de maneira comparativa, +;++;
+++;++++, quanto maior for a precipitao.
Determine o pH que corresponde ao provvel pI da casena e compare
com os valores da literatura.
Questes para o relatrio
Nesta aula voc realizou a quantificao de protenas pelo mtodo do biureto.
Agora pesquise e descreva como funcionam os seguintes mtodos tambm
amplamente utilizados para a quantificao de protenas:
Mtodo de Lowry
Mtodo do cido Bicinchnico
Mtodo de Bradford
Descreva para cada um desses mtodos a metodologia empregada para
cada um, os reagentes utilizados e a sensibilidade de cada teste. Pesquise
tambm sobre a sensibilidade do mtodo do Biureto.

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