A cromatografia em coluna utilizada em laboratrios como tcnica de purificao.

O
empacotamento da coluna o fator experimental mais importante, no entanto, existem outros
fatores que podem ser otimizados para ajudar a atingir a melhor separao possvel no menor
tempo, como o sistema de solvente ideal para a amostra, quanto de slica ser necessrio e o
tamanho da coluna a ser utilizada.
ESCOLHENDO O SISTEMA DE SOLVENTE
A cromatografia em coluna normalmente realizada com uma mistura de dois solventes como
fase mvel: um polar e outro apolar. Ocasionalmente um solvente pode ser utilizado ou a
mistura de trs solventes.
Para obter uma boa separao e, quando possvel, utilizar a menor quantidade de solvente
possvel, necessrio testar os potenciais sistemas de solventes antes de iniciar a coluna. Para
fazer isto, voc precisar realizar uma cromatografia em camada delgada testando esses
sistemas.

Prepare uma placa cromatogrfica de aproximadamente 2 cm x 7 cm, marque uma linha

aproximadamente 0,5 cm acima da base onde a amostra ser aplicada. O solvente deve ficar
abaixo desta linha de modo que a linha e o ponto da amostra no fiquem submersos e a amostra
seja diluda na fase mvel. Aplique a amostra sobre a linha com um capilar tocando a placa 2 ou
3 vezes por curtos perodos de tempo (< 1s), o ponto deve ter de 1 a 2 mm de dimetro. Coloque
a placa na cuba com o sistema de solventes, quando a frente do solvente atingir 0,5 a 1 cm do
topo remova a placa da cuba e deixe o solvente evaporar visualizando a placa pelo UV.
Voc pode determinar agora se foi obtida uma boa separao dos componentes da amostra com
o sistema testado. Mas o que uma boa separao?
O resultado final deve ser um sistema de solvente que mova o composto alvo cerca de 1/3 do
caminho total do solvente (Rf entre 0,25 e 0,35). Este Rf recomendado pois d tempo para a
amostra equilibrar na coluna e para que os componentes da amostras apresentem uma boa
resoluo. No use um sistema de solventes com um valor maior de Rf uma vez que uma
eluio rpida pode resultar em uma impureza sendo mascarada por outro ponto.

Assim como possvel ter um ponto com um Rf to alto, o oposto tambm verdadeiro se o
composto desejado um dos ltimos a elurem (baixo Rf). Quando o composto desejado tem
um baixo valor de Rf e as impurezas correm normalmente, voc pode se sentir tentado a utilizar
esse sistema de solventes para evitar a potencial contaminao que pode ocorrer com um
sistema de solventes que fornea uma Rf maior mas com uma separao pior. Isto normalmente
se provar ser um erro. Quanto mais tempo o composto passa na coluna maior a chance de se
degradar e menor quantidade do produto ser recuperada. Isolar um composto com baixo valor
de Rf tambm leva mais tempo e gasta mais solvente. Neste caso melhor atingir uma
separao no muito boa e usar mais slica.
Tendo encontrado o sistema que d a melhor separao deve-se observar a forma dos pontos. O
ideal que os pontos sejam circulares e distintos um do outro. Pontos com caudas na CCD
podem aparecer como bandas largas nas colunas e, possivelmente, sobrepondo outros
compostos da coluna. Se voc j tentou vrios sistemas de solvente e no foi capaz de encontrar
aquele com a melhor separao e os melhores formatos dos pontos no se preocupe, se a
separao entre os pontos for boa, ainda possvel obter uma boa separao na coluna.
Pode ser que mais de um sistema fornea a separao adequada entre os componentes, ou que
algum utilize um sistema que d uma separao adequada entre os componentes, mas no a
melhor. A deciso sobre qual sistema escolher tambm envolve outros dois fatores: preo e
ponto de ebulio.
Preo: se dois sistemas de solventes do uma boa separao, o mais barato deve ser utilizado. O
mais barato dos no-halogenados deve ser utilizado.
Ponto de ebulio: sempre escolha o solvente com o menor ponto de ebulio. Voc
econnomizar muito tempo e esforo, uma vez que solventes com elevado ponto de ebulio
levar mais tempo para evaporar e requer aquecimento ou presso reduzida.
ESCOLHENDO O TAMANHO DA COLUNA
Alguns argumentam que este o fator menos importante. No entanto, na prtica, a maioria das
pessoas ir escolher uma coluna que permita o preenchimento de 1/3 at metade da coluna com
slica, incluindo o reservatrio de solventes.

DE QUANTA SLICA EU PRECISO?

A quantidade de slica a ser usada depende da quantidade de amostra a ser separada. A razo
slica/amostra no precisa ser exata, mas precisa ser adequada para evitar perda de tempo e
recursos. Tambm aconselhvel escolher a quantidade de slica por peso e no por volume
uma vez que a densidade da slica varia com o tipo.
O outro fator que afeta a quantidade de slica de necessria a facilidade da separao, isto
determinado pela CCD. Quanto mais difcil a separao, maior ser a razo entre a massa de
slica e da amostra.

Numa coluna cromatogrfica tpica a fase estacionria colocada em uma coluna vertical de
vidro, enquanto a fase mvel colocada no topo da coluna e flui atravs da coluna por
gravidade ou presso externa. A qualidade da separao depende de uma variedade de fatores,
principalmente da ausncia de bolhas de ar na fase estacionria. Para prevenir a formao de
bolhas, o empacotamento correto da coluna importante.
Algumas colunas possuem uma camada de vidro sinterizado na extremidade inferior para evitar
a perda de fase estacionria pela torneira, enquanto outras no apresentam e preciso adicionar
l de vidro ou algodo. O pedao de algodo deve ser largo o suficiente para preencher a parte
inferior da coluna, mas no to grande que impea o fluxo. Um pedao de algodo do tamanho
do dedo mindinho deve ser suficiente para a maioria das colunas.
1. Posicione o pedao de algodo na parte mais estreita da coluna utilizando um basto de vidro.
2. Coloque a coluna num suporte fixo com a garra.
3. Adicione uma camada de areia at atingir o corpo principal da coluna (aproximadamente
2cm). Isto dar uma base regular para a fase estacionria e prevenir a concentrao e quebra
das bandas a medida que elas saem da coluna e so coletadas.

Existem diversos mtodos de preenchimento de coluna, um pode ser mais rpido ou fcil que
outro, todos os mtodos tm seus prs e contras e voc deve escolher seu preferido:
Opo 1: seco
1. Preencha a coluna com o solvente, abra a torneira para que uma quantidade passe pela areia e
pelo algodo removendo bolhas de ar.
2. Coloque um funil seco e limpo na extremidade superior da coluna e gentilmente adicione a
slica ao solvente, deixe a torneira aberta para drenar o solvente evitando sobrefluxo.
3. Deixe a fase estacionria se acomodar e gentilmente bata na coluna para que a slica se
empacote firmemente na coluna.
4. Deixe o solvente correr at que o nvel do solvente esteja no limite superior da fase

estacionria.

Opo 2: Mtodo da lama

1. Preencha a coluna at 1/3 com solvente.
2. Em um bquer mea a quantidade de slica.
3. Em um erlenmeyer mea o dobro de volume de solvente.
4. Adicione a slica ao solvente, pouco a pouco, homogeinizando. Use uma pipeta Pasteur para
misturar a lama.
5. Coloque ou pipete um pouco da lama na coluna. Permita o fluxo do solvente para prevenir
sobrefluxo.
6. Bata na coluna gentilmente para eliminar as bolhas e para que a slica se acomode.
7. Continue transferindo a lama para a coluna at que toda a slica tenha sido adicionada.

8. Limpe o interior da coluna pipetando um pouco de solvente.

9. Deixe o solvente correr at que o nvel do solvente esteja no limite superior da fase

estacionria.

APLICANDO A AMOSTRA
Para iniciar a coluna preciso aplicar a amostra diretamente no topo da coluna e permitir que
ela seja absorvida pela slica.
A aplicao da amostra pode ser feita com ela na forma lquida:
1. Dissolver a amostra na menor quantidade de solvente possvel. Um solvente levemente mais
polar que aquele escolhido para correr a coluna pode ser usado se isso ajuda na dissoluo da
amostra. Se voc precisa utilizar um solvente como diclorometano ou mais forte, o mtodo de
aplicao a seco pode ser mais aconselhvel.
2. Com uma pipeta ou seringa com a ponta fina aplique a amostra diretamente no topo da slica
com cuidado para no perturbar a superfcie. O ideal que a amostra esteja igualmente
distribuda pela superfcie formando uma banda horizontal fina.
3. Uma vez que toda amostra tenha sido aplicada abra a torneira at que o nvel do solvente
atinja o topo da slica.
4. Adicione com cuidado uma camada de areia (2 5 mm), isto prevenir que a superfcie da
slica seja deformada pela adio de solvente.
5. Use uma pipeta para adicionar mais solvente de maneira que o nvel de solvente fique
aproximadamente 10 mm acima do topo da areia.

6. Permita que o solvente escoe at que o nvel do solvente esteja de 1 a 2 mm acima da areia.
7. Repita os passos 5 e 6 uma ou duas vezes. Isto ir garantir que a amostra ser absorvida pela
slica.
8. Finalmente, adicione a quantidade de solvente desejada. Sua coluna est pronta para ser
iniciada.
Se a amostra pouco solvel no solvente que fornece a melhor separao possvel aplicar a
amostra seca na coluna:
1. Dissolva a amostra num solvente apropriado, transfira a amostra para um erlenemeyer.
2. Adicione slica amostra dissolvida, aproximadamente de 10 a 20 vezes a massa da amostra.
3. Agite gentilmente, de modo que toda a slica fique em suspenso com a soluo.
4. Gentilmente evapore o solvente utilizando um evaporador rotativo at que a slica esteja
completamente seca. Se estiver com aparncia de um leo adicione mais slica e repita o
procedimento.
5. Cuidadosamente adicione solvente a coluna, de modo que o nvel de solvente fique de 2 a 3
cm acima do topo da slica. Use uma pipeta para garantir que a superfcie da slica no seja
afetada.
6. Adicione a slica seca saturada com a amostra na coluna e permita que ela sedimente.
Certifique-se que o nvel de solvente esteja sempre acima do topo da slica e que no haja
bolhas de ar. A melhor maneira de fazer isso adicionar a slica aos poucos.
7. Siga os passos 4 a 8 do mtodo de adio da amostra dissolvida acima para garantir a
complete absoro da amostra na coluna.
IMPORTANTE: TENHA CERTEZA QUE VOC DISPE DE TEMPO SUFICIENTE PARA
REALIZAR A COLUNA ANTES DE APLICAR A AMOSTRA. A COLUNA NO DEVE
FICAR PARADA POR MAIS QUE CINCO MINUTOS UMA VEZ QUE A AMOSTRA
TENHA SIDO COLOCADA. NO PARE A COLUNA POR MAIS TEMPO QUE ISSO. UMA
VEZ INICIADA A COLUNA, PARADAS MAIORES QUE 1 MINUTO IRO CAUSAR UM
ALARGAMENTO DA BANDA E DEVE SER EVITADA. NO DEIXE UMA COLUNA
NO TERMINADA OVERNIGHT OU DURANTE ALMOO/LANCHE.
Para cada coluna h um fluxo timo para a coleta das fraes. Ajuste a torneira para controlar o
luxo. Se o fluxo muito lento, o processo de difuso levar a um alargamento da banda. Se o
fluxo muito rpido no haver tempo suficiente para o equilbrio e os compostos sero
forados a sair da coluna deixando uma longa cauda para trs. Para colunas de dimetro
pequeno o fluxo ideal menor que para colunas de dimetros maiores. Assim, colunas maiores
podem ser realizadas com fluxo maior que as menores.
De maneira nenhuma o nvel de solvente deve ficar abaixo do nvel de slica. O solvente deve
ser reposto regularmente e antes que a coluna possa ficar seca. Recoloque solvente quando a
camada de solvente esteja cerca de 2 cm acima da camada protetora de areia. Adicionando
solvente quando ainda existe solvente na coluna ajuda a minimizar os distrbios causados
superfcie da slica e a destruio de bandas presentes no topo da coluna.
Haver um volume morto de solvente onde nenhuma amostra estar presente. O tamanho do
volume morto depender do tamanho da coluna e dos compostos sendo separados, aps o
volume morto voc poder coletar as fraes. Normalmente o volume morto corresponde um

pouco mais da metade da altura da slica, voc pode marcar com uma caneta no reservatrio de
solventes o volume morto de solvente a ser coletado e depois iniciar a coletar as fraes.

Para colunas grandes as fraes coletadas podem ser um pouco maiores, entretanto, coletar
poucas fraes pode levar presena de duas bandas em uma nica frao, especialmente se as
bandas saem prximas da coluna ou se h cauda entre as bandas.