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Ingeniera Bioqumica
Materia: Microbiologa
Contenido:
Objetivo.............................................................................................................................3
Introduccin......................................................................................................................3
Materiales y Mtodos..5
Protocolos generales de esterilidad..5
Siembra y preparacin de muestras5
Por picadura o puncin...5
Por estra por agotamiento..5
Recoleccin de muestras..6
Disolucin de muestras ....6
Tinciones...6
Tincin diferencial de Gram....6
Tincin de Schaeffer-Fulton.7
Medios ....7
Agar nutritivo.7
Agar MRS..8
Agar ELLIKER..9
Pruebas..10
Agar triple azcar hierro: TSI...10
Citrato de Simmons...12
Medio MIO14
Medio MR-VP ..17
Reduccin de nitratos 18
Prueba de ureasa..21
Agar base sangre.....22
Agar E.M.B. ...23
1
OBJETIVO:
Aislar y caracterizar bacterias comprendidas dentro del grupo de las BAL.
INTRODUCCION:
Son ampliamente distribuidas en diferentes ecosistemas, adems de generarse a gran escala
procesos para la produccin comercial de alimentos fermentados, bebidas alcohlicas, ensilados,
levaduras para la produccin de cerveza, vinos y bacterias cido lcticas (BAL) para la utilizacin en
vegetales, fermentaciones crnicas, queso, mantequilla, yogurt, salchichas, ensilajes, olivos, uvas y
cereales como pan y cerveza, preservando y proporcionando propiedades sensoriales y nutricionales a
los productos alimenticios.
Las BAL desempean un papel importante en los procesos de fermentacin; ellas son muy
utilizadas en la industria alimentaria, no solamente por su habilidad para acidificar y por lo tanto
preservar alimentos de las esporas, sino tambin su implicacin en la textura, sabor, olor y desarrollo de
aroma de alimentos fermentados.
El conocimiento de cultivos lcticos se origin en el siglo XVIII, cuando agricultores de frica, Asia
y Europa observaron el comportamiento de la leche cruda en los meses clidos. La leche coagulaba y
bajo estas condiciones presentaba un sabor diferente, en ocasiones agradable, entonces los campesinos
fueron seleccionando las de mejor sabor para inocular la leche al da siguiente. Las BAL vivas pueden
estar contenidas en un grupo de microorganismos llamados cultivos lcticos o iniciadores, se emplean en
la industria lctea para la elaboracin de leches fermentadas, quesos, mantequilla y otros productos que
para su obtencin requieren ser fermentadas. Se distinguen tres clases de cultivos: el cultivo inicial, el
cultivo madre, y el cultivo usual. Los cultivos estrter son puros, a partir de estos, se prepara el cultivo
madre, luego del cultivo madre se desarrolla el cultivo usual para ser empleado directamente en
procesos fermentativos.
Son un grupo de bacterias relacionadas que producen cido lctico como el principal metabolito
o nico producto de fermentacin; son microorganismos nutricionalmente exigentes los cuales son
capaces de hidrolizar pptidos de la leche. La concentracin de aminocidos libres en leche son muy
limitados, as el crecimiento sostenido de BAL depende de la produccin de proteinasas, peptidasas y
sistema de transporte de aminocidos y pptidos especficos. Adems de producir el cido lctico, las
bacterias acidificantes, llamadas tambin bacterias iniciadoras, contribuyen al sabor, aroma, textura y el
valor nutricional de alimentos fermentados a travs de la produccin de exopolisacridos (EPS) y
modificacin protenas, lo anterior debido a su actividad metablica sobre protenas, azcares y lpidos,
3
contribuyendo a la digestibilidad de alimentos y preservacin del producto final. (Waldir E., Mojmir R., et
al, 2007)
Este grupo est compuesto de un nmero de gneros incluyendo lactococcus, lactobacillus,
enterococcus, streptococcus, leuconostoc, y pediococcus.
Para la presente investigacin se encontr con el gnero lactobacillus son bacilos Gram positivos,
estn ampliamente distribuidos en diversos mbitos tambin se encuentran en distintos alimentos (p.
ej., productos lcteos, granos, comidas) en gran parte debido a su amplia gama de capacidades
fermentativas. Algunas especies de Lactobacillus se agregan ahora a alimentos como prebiticos, tal vez
por sus efectos beneficiosos para la salud.
Las clulas individuales de especies de Lactobacillus a menudo son largas y delgadas, aunque
pueden observarse bacilos corineformes o cocobacilos ms pequeos. Algunas especies pueden
formar cadenas largas de bacilos. La mayora de las especies son inmviles; las raras especies mviles
tienen flagelos periticos. La mayora de las especies son aerobias facultativas, aunque algunas crecen
mejor en condiciones anaerobias o microaerofilas, sobre todo en el aislamiento primario.
Los lactobacilos se denominan as porque ms del 50% de los productos terminales de la
fermentacin de la glucosa es cido lctico; algunas especies pueden producir tambin cidos actico,
frmico y succnico, junto con CO2. Los lactobacilos son uniformemente catalasa negativos y oxidasa
negativos, no reducen nitrato, no producen indol ni H2S. No licuan la gelatina y no forman esporas
(koneman E, Winn W, et al, 2006).
MATERIALES Y MTODOS
Protocolos generales de esterilidad
Los materiales de cristal (cajas de Petri, pipetas, tubos de ensaye, etc.) y medios de cultivo deben
ser previamente esterilizados en la autoclave a 121C y una atmsfera durante 15 minutos.
Se deben mantener condiciones de asepsia y antisepsia en el lugar de trabajo, que ser en una
campana de flujo laminar, limpiando antes y despus de usar con alcohol etlico; se debe mantener un
mechero de bunsen encendido en el lugar mientras se est trabajando.
Siembra y preparacin de muestras
Por estra por agotamiento: Una vez listo el lugar de trabajo, el medio de cultivo
esterilizado se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada en el
mechero (hasta que tome un color rojo) el asa se enfra introducindola al medio de cultivo, se toma
material de un cultivo heterogneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estras (cita)
(Figura 1).
Por picadura o puncin: Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo
introduce en el tubo, con medio semislido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de
puncin, trayecto por el cual la retiraremos luego.( Jimenez Diaz M., 2011)
Recoleccin de muestras
En la obtencin de la muestra a trabajar, esta se recolecto en la comunidad de La Esperanza en
Tonila Jalisco con ms exactitud del potrero Pea con coordenadas de 192321.1N 1033107.8w, el
material utilizado fue esterilizado previamente.
Disolucin de muestras
Las disoluciones se realizan en tubos de ensayo estriles.
Se pesa un mililitro de leche bronca y se mezcla con nueve mililitros de agua destilada
-1
(dilucin 10 ).
De la dilucin obtenida, se toma un mililitro que se pasa a otro tubo con nueve mililitros
De esta segunda dilucin, se toma otro mililitro, el cual se vierte en un tercer tubo con
As se prosigue hasta conseguir una dilucin 10-4, 10-5 y 10-6. Y se hace lo mismo para la
Tinciones
Esta tincin se denomina as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en
1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos,
Gram-positivas y Gram-negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver
con carga elctrica, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).
Descrita en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min
con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 - 2 min. Y se lava de nuevo
con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de
6
contraste) durante 1 2 min. Lavar y secar. Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de
forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares
(Santambrosio E. et al, 2009).
Tincin de Schaeffer-Fulton
Las esporas son formas de resistencia bacteriana. Tienen forma esfrica u oval. Al microscopio
las esporas sin teir se observan como grnulos brillantes. Segn su localizacin se distinguen tres tipos
de esporas: Centrales, Subterminales, Terminales.
Material Necesario:
*
Cultivo
Safranina al 1% en agua.
portaobjetos.
Pasos:
Realizar el frotis
Cubrir el frotis con verde de malaquita
calentar 5 minutos a emisin de vapores
Enjuagar con agua de la llave
Cubrir con la Safranina dejar actuar 1 minuto
lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.
Se observaran Esporas teidas de verde y clulas vegetativas teidas de rosa. Observar la forma,
tamao relativo y posicin de la espora en la clula vegetativa (Morales Garca L, 2014)
Medios
Agar nutritivo
Instrucciones:
Pluripeptona
Extracto de carne
Cloruro de sodio
Agar 15
PH final: 7.3
Tabla 1. Agar Nutritivo
Incubacin:
En aerobiosis, a 35-37 C durante 24 horas.
Caractersticas del medio:
Medio preparado; mbar claro a medio ligeramente opalescente.
Agar MRS
Medio de cultivo apropiado para el aislamiento y recuento de lactobacilos y otras bacterias acido
lcticas a partir de muestras clnicas y alimentos (especialmente productos lcteos).
Fundamento: El Agar M.R.S fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe, y por su formulacin
permite el adecuado desarrollo de lactobacilos y otras bacterias cido lcticas. La proteosa peptona, el
extracto de carne, el extracto de levadura y la glucosa constituyen la fuente nutritiva ya que aportan
nitrgeno, carbono, vitaminas, y minerales. El monoleato de sorbitn, las sales de sodio, magnesio y
manganeso proveen cofactores para el crecimiento bacteriano y pueden inhibir el desarrollo de algunos
microorganismos. El citrato de amonio acta como agente inhibitorio del crecimiento de bacterias Gram
negativas. El agar es el agente solidificante (Britania, lab).
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Agar ELLIKER
Fundamento:
Prueba de productos lcteos para las bacterias del cido lctico facilita la
determinacin de los niveles de cido, la evaluacin de los fermentos lcticos y ayuda a controlar la
calidad de los quesos curados, leches cultivadas y no cultivada productos. El medio es preparado de
acuerdo con la frmula de Elliker, que tiene un pH ligeramente cido y contiene suficientes nutrientes
para mantener el crecimiento de estos microorganismos Gram- positivos. Gelatina, triptona y extracto
de levadura proporcionan los nutrientes esenciales para el crecimiento. Lactosa, sacarosa y dextrosa son
hidratos de carbono fermentables que proporcionan carbono y energa. El cido ascrbico proporciona
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condiciones cidas adecuadas. El cloruro de sodio suministra electrolitos esenciales para el transporte y
el equilibrio osmtico y acetato de sodio es el agente selectivo, la inhibicin de bacterias Gramnegativas y tambin acta como un sistema tampn (Conda, s.f)
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Cloruro de sodio 4
Extracto de levadura 5
Gelatina
2.50
Dextrosa
Lactosa
Sacarosa
PH final: 6.8
Tabla 3. Agar Elliker
Incubacin:
Inocular e incubar y 35 2 C durante 18 - 48 horas, a excepcin de Streptococcuscremoris que
se incuba a 30 2 C.
Caractersticas del medio:
El medio deshidratado debe ser homogneo de color mbar, de flujo libre y de color plido.
Pruebas
10
Instrucciones:
Extracto de carne 3
Pluripeptona 20
Cloruro de sodio 5
Lactosa 10
sacarosa 10
Glucosa 1
11
Siembra:
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie
del medio.
Incubacin:
A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis.
Resultados:
fermenta la glucosa.
de azcares.
produce gas.
azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de
utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con
la consiguiente produccin de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a
travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y
piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser
utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces
vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa(Britania, lab).
Instrucciones:
Citrato de sodio
Cloruro de sodio
Fosfato dipotsico
Suspender
24.2
del
medio
Fosfato monoamnico
Sulfato de magnesio
.2
Azul de bromotimol
.08
Agar
15
PH final: 69= .2
Tabla 5. Citrato de Simmons
Siembra:
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inculo ligero, usando un
ansa sin arrastrar el agar.
Incubacin:
A 35-37 C, durante 24-48 horas, en aerobiosis.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 das de incubacin.
Resultados:
13
Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano
Si se usa un inculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del
pico del verde al amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero
puede afectar la visualizacin azul de un resultado positivo.
Cuando se siembra una serie de pruebas bioqumicas a partir del mismo cultivo, se debe
esterilizar la aguja de inoculacin antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero.
Cualquier arrastre de materia orgnica puede originar resultados falsos positivos.
Para observar la actividad enzimtica se utiliza el agar almidn que es fundamental por el
contenido de almidn que se encuentra disponible, el cloruro de sodio encontrado en este agar es de
vital importancia pues la alfa-amilasa al ser metaloenzimas requieren de calcio para su estabilidad y su
actividad (Benavides, r.,& Hermida,s,a.2008).
Medio MIO
14
Instrucciones:
Dextrosa
Extracto de levadura
Peptona
10
Tripteina
10
Clorhidrato de L-ornitina
Agar
Purpura de bromocresol
.02
PH final: 6.5 .2
Siembra:
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por puncin profunda con
ansa recta.
Incubacin:
En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37 C.
Resultados:
1-Movilidad:
2-Ornitina decarboxilasa:
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Medio MR-VP
Instrucciones:
Pluripeptona
Glucosa
Fosfato dipotsico
PH final: 6.9.2
Siembra:
Por inoculacin directa, a partir del cultivo en estudio.
Incubacin:
17
Prueba del rojo de metilo: Aadir unas gotas de una solucin de rojo de metilo al 0.04%,
Prueba del VogesProskauer: Aadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etlico absoluto
y 0.2 ml de hidrxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a
temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.
Resultados:
a)
b)
Prueba de VogesProskauer:
Limitaciones:
En algunas cepas positivas para la prueba VP, pueden no desarrollar el color rojo en la superficie
mediante el revelado por la metodologa descripta anteriormente. En estos casos, se recomienda
calentar el medio de cultivo para favorecer el desarrollo de color rojo.
Caractersticas del medio:
Medio preparado: mbar claro, transparente sin precipitado.
Almacenamiento:
Reduccin de nitratos
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo para reducir los
nitratos a nitritos o gas nitrgeno libre, una caracterstica que a menudo tiene valor diferencial. La
reduccin de nitrato en nitrito y en gas nitrgeno tiene lugar generalmente en condiciones anaerbicas,
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en las cuales un organismo obtiene su oxigeno del nitrato. El oxgeno sirve como un aceptor de
hidrogeno.
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Instrucciones:
Extracto de carne
Peptona
Nitrato de potasio
PH final: 7.0 .2
Tabla 8. Reduccin de Nitratos
Siembra:
Difusin, inoculo denso.
Incubacin:
18 24 horas
Caractersticas del medio:
Lquido, color amarillento.
Almacenamiento:
35-37 C.
Reactivos adicionales, reactivo de griess: Adicionar directamente al tubo de reaccin en el
siguiente orden
SOLUCION A
cido Sulfanlico
8g
cido actico 5N
1000 ml
SOLUCION B
20
-Naftilamina
5g
cido actico 5N
1000 ml
Negativo: amarillo
Precauciones:
Una prueba negativa indica que los nitratos, no han sido reducidos o que han sido reducidos a
otros productos, como amoniaco, nitrgeno molecular, xido ntrico u xido nitroso e hidroxilamina.
Dado que los reactivos de prueba detectan solo nitritos, este ltimo proceso llevara a una lectura falsanegativa. Por ende es necesario agregar una pequea cantidad de polvo de zinc a todas las reacciones
negativas. Los iones zinc reducen nitratos a nitritos y la aparicin de color rojo despus de agregado el
zinc indica una reaccin positiva (Bailn, Lira, L, et al 2003).
Reaccin de la ureasa
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para hidrolizar la
urea, formando dos molculas de amonaco por la accin de la enzima ureasa produciendo un cambio de
color rojo en el medio. La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposicin
de los compuestos orgnicos (Bailn, Lira, L, et al 2003).
Instrucciones:
Extracto de levadura
0.1
Fosfato monopotsico
9.1
Fosfato monosdico
9.5
Urea
20
Azul de bromotimol
0.01
Instrucciones:
3.7
5ml (5%)
1.5
PH final: 7.3
Tabla 10. Agar base sangre
Siembra:
Por inoculacin directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo.
Incubacin:
El tiempo, temperatura y atmsfera de incubacin, dependern del microorganismo que se
quiera aislar. En nuestro caso de 35 a 37 C
Interpretacin de resultados:
Observar las caractersticas de las colonias. Para el medio de cultivo conteniendo sangre
observar las reacciones de hemolisis;
Hemolisis alfa: lisis parcial de los glbulos rojos. Se observa un halo de color verdoso
Hemolisis beta: lisis total de los glbulos rojos. Se observa un halo claro brillante
Hemolisis gamma: ausencia de lisis de los glbulos rojos. El medio de cultivo no presenta
Agar E.M.B.
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Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos
Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento:
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un
mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram
negativos. La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que
son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de metileno; stos ejercen un
efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichiacoli y
Citrobacterspp. presentan un caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen
centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio
permite el crecimiento de Candidaspp. Como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad
permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcusspp. Crece en este medio como
colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacterspp. y otras bacterias oxidativas
pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de
acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus
membranas. En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella
(Britania, lab).
Frmula(en gramos por litro):
Instrucciones:
Peptona
10
Lactosa
Sacarosa
Fosfato dipotsico
Agar
13.5
Eosina
.4
Azul de metileno
.065
agitando suavemente.
PH final: 7.2 .2
Tabla 11. Agar E.M.B.
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Siembra
En superficie, por estriado a partir de un inculo poco denso, para obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Incubacin
De 24 a 48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.
Caractersticas del medio:
Placas preparadas: color prpura.La esterilizacin del medio de cultivo reduce el azul de
metileno al color naranja. El color prpura se restaura por agitacin. La presencia de un precipitado en el
medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.
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fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o
prpura (Britania, lab).
Frmula(en gramos por litro):
Instrucciones:
Extracto de carne 1
Pluripeptona 10
d-manitol 10
Cloruro de sodio 75
Agar 15
Rojo de fenol .025
PH final: 7.4 .2
Tabla 12. Agar sal y manitol
Siembra:
Sembrar en superficie un inculo denso de la muestra por estra.
Incubacin:
De rutina: durante 18-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis. La American PublicHealthAssociation (A.P.H.A)
recomienda la incubacin durante 3 das a 32 C, en aerobiosis.
Caractersticas del medio:
Medio preparado rojo.
Resultados:
Microorganismos fermentadores de manitol colonias de color. Despus de la incubacin las
placas se examinan para detectar la presencia de colonias de estafilococos.
Las colonias que muestran una apariencia estndar de estafilococos deben ser sometidas a otras pruebas
de diferenciacin para confirmar su identidad (BectonDickinson, 2013).
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Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y
anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de
agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Fundamento:
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal
violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color
del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.(Britania, lab)
Siembra:
Incubacin
Durante 18-48 horas, a 35-37 C, en atmsfera aerbica.
Interpretacin de resultados:
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RESULTADOS:
Toma de muestra
Se recolectaron muestras de leche bronca el 1 de julio de 2016 y suero de queso el 30 de junio
de 2016 de la comunidad de La Esperanza en Tonila Jalisco con ms exactitud del potrero Pea con
coordenadas de 192321.1N 1033107.8w.
Se hicieron diluciones de la leche bronca desde 10-1 hasta 10-6 y se sembraron en agar nutritivo
por la tcnica extensin en placa las muestra de 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6, para la muestra de suero se
hicieron nuevamente diluciones desde 10-1 hasta 10-6 y esta vez se sembraron todas las muestras por la
misma tcnica anterior, previamente todo el material utilizado estaba esterilizado. Pasadas 24 horas se
extrajeron las cajas de la incubadora a 36C donde permanecieron despus de la siembra, esto para
proseguir con la prueba de tincin Gram acompaado de la tcnica de frotis; para la tincin Gram se
utilizaron colonias de microorganismos que tomamos de la muestra 10-6 (Figura 3) para el suero de
queso y 10-4 (Figura 4), 10-5 (Figura 5) y 10-6 (Figura 6) para la leche bronca (Santambrosio E. et al, 2009).
28
29
Todas las imgenes que se mencionaran se encuentran en la Figura 7. En las tinciones de las
colonias de suero de 10-6 (Imagen A, B y C) se observaron bacilos Gram positivos en la A los bacilos
observados eran muy pequeos sin embargo si se observaba su morfologa bacilar, en la B se pudieron
observar ms bacterias aglomeradas resaltando el color caracterstico de las Gram positivas y en la C se
observaron de manera ms dispersa.
En las tinciones de colonias de leche (Imagen C, D, E, F, G Y H) se observaron tambin en todas,
bacterias Gram positivas pero en la mayora de estas ya se pudieron observar de un tamao mayor como
en el caso de la E, F y G en la D se observaron de manera dispersa en la muestra y las de la G se
observaron aglomeraciones de bacterias pequeas en las que podra haber cocos o cocobacilos y bacilos;
tambin se observaron lo que se cree que pueden ser endosporas en algunas de las muestras de leche
para eso despus se proceder a hacer tincin de esporas.
30
se revisaron los resultados para los cultivos en el agar MRS con un crecimiento positivo pero solo
para ciertos cultivos, bacteria 2 y 4 que presentaron crecimiento inmediato y abundante, en estas
colonias con forma redonda de color blanco, con aspecto cremoso de bordes enteros siendo estas
caractersticas generales de BAL (Garca Ibarra J., 2007).
31
Se observ crecimiento bacteriano en todos los cultivos de nuevo con crecimiento abundante
para la bacteria 2 y 4, mientras que los cultivos restantes presentaron crecimiento ms lento.
Se hizo tincin de esporas (Morales G. L., 2014) (Figura 10) para las bacterias 2 y 4 del agar MRS
y, 3, 4, 5 y 6 del agar Elliker (CONDA lab.) con el objetivo de descartar la aparicin de estas en nuestra
muestras puesto que las bacterias acido lcticas no presentan esporas (Universidad pblica de navarra,
2008). Con resultados favorecedores ya que no observamos esporas en ninguna de nuestras muestras.
32
B2
B3
B4
B5
B6
B4M
Figura 10. Tincin de esporas
B5
B6
B5
B6
Figura 12. Tincin Gram
Se aislaron las bacterias B5 y B6 EN agar elliker (CONDA lab.), para trabajar solo sobre ellas y
realizar las pruebas bioqumicas correspondientes.
El medio E.M.B. (Figura 13) resulto positivo para la bacteria B6 y negativo para la B5. La prueba
era para confirmar la tincin Gram ya que las BAL son Gram positivas (Ortiz B., 2006) y este medio es
utilizado para el aislamiento selectivo de bacterias Gram negativas (Britania, lab).
34
B6
B5
Para asegurar los resultados de la prueba de E.M.B. se sembr la bacteria B6 en el medio Mac
Conkey y el resultado fue positivo. Por lo que se descart la bacteria, y solo se trabaj con la B5.
Figura 14. En la figura se muestra crecimiento de la bacteria B6 por lo que se confirma que es
Gram-negativa, notando un color incoloro de la colonia por lo que no fermenta lactosa.
35
36
Se realiz la prueba MIO (Britania, lab.) para la bacteria dio como resultado negativo para
movilidad e indol y negativo para ornitina (Figura 18).
La prueba del medio MR-VP (Rojo de Metilo y Voges-Proskauer) empleada para la presencia de
productos cidos, y evidenciar la presencia de productos finales neutros respectivamente (Britania lab).
Dio positivo para rojo de metilo, y negativo para Voges-Proskauer (Figura 19,20).
La prueba en el agra TSI, empleada para determina la capacidad de un organismo de atacar un
hidrato de carbono especfico incorporado en un medio decrecimiento bsico, con produccin o no de
gases, junto con la determinacin de posible cido sulfhdrico (Bailn, L.L et al, 2003), nos dio positivo
(Figura 21).
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DISCUSIN:
Para la identificacin del gnero de la bacteria aislada de las muestras se utiliz el mapa de
identificacin ABIS figura 25, en el que se busc segn la forma de las clulas que fueron bacillos y su
Gram que es positivo y con la tincin de Scheffer Fulton para la formacin de endosporas que se report
negativa o nula a la bacteria aislada, tambin con respecto a su respiracin celular son microaerfilos
porque son microorganismos que viven en presencia de niveles de oxgeno que estn bajo la
concentracin presente en el aire (<21 %) o tambin aerobios facultativos porque son microorganismos
que pueden vivir en ausencia de oxgeno o en su presencia (koneman E, Winn W, et al, 2006), con
respecto a la forma se observaron bacilos regulares y fueron catalasa negativo, no mviles segn los
resultados de las pruebas catalasa y movilidad, con lo cual nos lleva a los gneros Lactobacillus y
Erysipelothrix lo que llevo a basarse en la bibliografa para saber de qu nicho es aislado cada uno de los
gneros de estos microorganismos y segn las muestras de las que se obtuvo, pertenece al gnero
Lactobacillus (ABIS Encyclopedia, sf; Breed R, Murray E, Smith N, 1957).
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Genero Lactobacillus.
Bacilos o cocobacilos Gram positivos-, no formadoras de endosporas; metabolismo fermentativo,
obligatoriamente de azucares, al menos la mitad de finales de carbono producto es lactato; anaerobio
facultativo; gelatina no licuada, ni produccin de indol y no produce H2S, catalasa y oxidasa negativo;
requerimientos nutricionales complejos para los aminocidos, pptidos, derivados de cidos nucleicos,
vitaminas, sales, cidos grasos y carbohidratos; el crecimiento rango de temperatura 2-53 C; 5.5 a 6.2
pH ptimo. Se encuentra en los productos lcteos, alimentos, cerveza, el vino, las frutas, el agua, el suelo
y las aguas residuales; que son una parte de la flora normal en la boca, el tracto intestinal, y la vagina de
los seres humanos y muchos animales. No es patgeno o est restringido a las personas con una
enfermedad subyacente.
Con las pruebas reportadas hasta ahora se elabor una tabla comparativa, tabla. Con la que se
busc en Bergeys Manual of Determinative Bacteriology y en ABIS Encyclopedia la especie de la
bacteria con respecto a las caractersticas microscpicas, macroscopicas y pruebas bioqumicas en
comn y se obtuvieron los siguientes resultados con las siguientes especies posibles:
Tabla
PRUEBA
FORMA
TAMAO
GRAM
ESPORAS
CATALASA
MOVILIDAD
INDOL
ORNITINA
ALMIDON
ROJO DE
METILO
CITRATO
VOGESPROSKAWER
REDUCCIN
NITRATOS
EOSINA Y AZUL
DE METILENO
TSI
MEDIO MAC
CONKEY
B5 (lactobacillus sp)
(+)
Lactobacillus
plantarum
Subespecie plantarum
Bacilo
0.9 a 1.2 1 a 2 micras
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(variable)
(-)
(-)
(-)
(+) glucosa
(-)
(-)
Bacilo
0.8 2.57 micras
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
lactobacillus
leichmannii
Bacilo
0.6 2.0 a 4.0 micras
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
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UREASA
AGAR SANGRE
SAL Y MANITOL
(-)
Hemolisis gamma
(-)
Morfologa:
Bacilos Gram positivos con los extremos redondeados, rectos (0.9-1.2 x 1-2 micras) que se
encuentran aislados en pares o en cadenas cortas, inmviles y no forman esporas.
Caractersticas:
Anaerobios facultativos, colonias en la superficie son de 3 mm de ancho, elevado, liso, blanco y
ocasionalmente claro o amarillo obscuro.
El crecimiento ptimo de temperatura es de 30-35 grados Celsius puede crecer a 15 grados pero
no a 45.
Factores de crecimiento: pantotenato de calcio y niacina requerida, riboflavina generalmente no
se requiere.
Caractersticas bioqumicas:
Heterofermentativa facultativa.
Resultados positivos para la acidificacin de la leche, fermentacin de: amigdalina, celobiosa,
esculina, fructosa, galactosa, beta-gentibiosa, N-acetilglucosamina, cido glucosa, la glucosa (sin
produccin de gas), gluconato (con gas), lactosa, maltosa, manitol, manosa, melezitosa, melibiosa,
rafinosa, ribosa, salicina, sacarosa y trehalosa.
Resultados negativos para la hidrlisis de arginina, catalasa (puede producir una pseudocatalasa)
fermentacin de: adonitol, D-arabinosa, L-arabitol, eritritol, fucosa, inositol, inulina, 2-cetogluconato, 5cetogluconato, ramnosa, L-sorbitol, sorbosa y xilosa.
Fuente: productos lcteos, ensilado, verduras encurtidas, estircol de vaca, boca humana y
tracto intestinal, aguas residuales, etc.
Hbitat: Ampliamente distribuido en la naturaleza, particularmente en la fermentacin de
productos de plantas y animales. (ABIS Encyclopedia, sf; Breed R, Murray E, Smith N, 1957)
En conclusin:
La bacteria asilada de la muestra de leche bronca fue lactobacillus plantarum subespecie
plantarum determinado por la fermentacin de carbohidratos puesto que fermento glucosa y lactosa y
esta es una caracterstica de lactobacillus heterofermentativos facultativos y anaerobios facultativos, en
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