ANALGESIK KEGIATAN DARI GLUCAN POLISAKARIDA YANG DIISOLASI DARI

AGARICUS BLAZEI MURILL

Sebuah polisakarida larut air dan selektif endapan pecahan (F1, F2, dan F3) diisolasi dari ekstrak
air panas dari tubuh buah dari Agaricus blazei Murril dikenal sebagai Agaricus brasiliensis untuk
mengevaluasi aktivitas analgesik dari bahan pada tikus Swiss. Bahan terisolasi dan fraksinya
yang ditandai dengan Cosy dua dimensi dan HMQC spektrum sebagai - (1 6) -- (1 4)
polisakarida -glukan-terikat-protein dibentuk terutama oleh - (1 6) glucan . Polisakarida
glukan-protein dan fraksinya dianalisis dalam kaitannya dengan isi elemen protein, karbohidrat,
dan mineral. Analisis kompleks glukan-protein mengungkapkan kandungan karbohidrat total
36,95% dan kadar protein terkonjugasi dari 17,24%. Unsur-unsur mineral yang ditemukan dalam
proporsi yang lebih besar adalah K, Na, Ca, P, dan Zn. Aktivitas analgesik bioassay dari - (1
6) -- (1 4) -glukan polisakarida terikat-protein dan fraksinya pada tikus Swiss menunjukkan
efek yang signifikan.
PENDAHULUAN
Beberapa spesies jamur telah disajikan kegiatan biologis yang menarik. Yim et al. [1]
menunjukkan bahwa Pleurotus porrigens jamur ditemukan memiliki aktivitas antioksidan oleh
beberapa tes metodologi seperti DPPH, ABTS, FRAP, dan TPC. Polisakarida yang diisolasi dari
jamur telah terbukti induser efektif NO sintesis dalam makrofag [2, 3]. Carbonero et al.
mempelajari -glukan dari Pleurotus sajor- caju yang diaktifkan RAW 264.7 makrofag dan
menginduksi sintesis NO dan sitokin proinflamasi TNF dan IL-1, menunjukkan bahwa glukan dari P. Sajor-caju memiliki efek imunostimulan [4]. Baru-baru ini, Suseem et al. telah
melaporkan aktivitas analgesik kuat dari Pleurotus ekstrak jamur eous pada tikus Swiss, yang
dimediasi melalui mekanisme penghambatan perifer dan sentral [5]. Jamur Agaricus blazei
Murill adalah spesies jamur dari Basidiomycetes keluarga. Hal ini terjadi secara alami di Hutan
Atlantik di pegunungan negara Sa~o Paulo, Brasil tenggara. Tubuh buah dihargai tidak hanya
karena rasa dan tekstur, tetapi juga untuk karakteristik gizi [6]. Agaricus menyajikan komposisi
kaya nutrisi dan miskin di kalori dan lemak [6]. Beberapa kegiatan yang menarik telah diamati
untuk Agaricus blazei. Telah terbukti mengurangi tingkat kolesterol darah, melindungi terhadap
penyakit koroner [7], dan untuk mengurangi tingkat glukosa dalam darah [8]. Selain itu,
menyajikan isi yang signifikan dari protein, mineral, dan serat seperti kitin [6]. Komposisi media
tubuh buah kering mengandung 35-45% protein dan 38-48% karbohidrat merupakan terutama
oleh polisakarida [9, 10]. Agaricus serta spesies lain dari jamur di hadiah umum 6-7% serat, 57% abu, 3-4% lemak (termasuk asam lemak tak jenuh ganda), juga vitamin C, E, H, K, dan B
kompleks, fosfolipid , dan lektin [6, 10]. konstituen lainnya dengan nilai gizi dan terapi seperti
Na, K, Ca, Fe, Mg, Mn, dan mineral Cu telah diidentifikasi dalam beberapa jamur dalam jumlah
mulai dari 5 sampai 7% [11]. Ada juga hubungan elemen-dependent dengan asal geografis dari
jamur [12, 13]. Di sisi lain, beberapa elemen mengkatalisis reaksi pada sel-membran.
tingkat. Ini mungkin sebuah jalan untuk memahami aksi polisakarida dan / atau kompleks
glikoprotein. Karakteristik biofunctional dari Agaricus telah terkait dengan kehadiran konstituen
seperti homo dan heteroglucans dengan konfigurasi spesifik jenis - (1 6 dan 1 3) dan - (1
6 dan 1 4) dan / atau glikoprotein kompleks [10, 14]. Beberapa peneliti juga mengaitkan
kegiatan farmakologi obatan untuk kehadiran glikoprotein [9, 15] dan ketergantungan kegiatan
ini pada keberadaan protein-polisakarida obligasi struktural [9]. Namun, yang lain menganggap

bahwa kegiatan ini terkait dengan kehadiran glukan, terutama -glukan [16]. Untuk saat ini, tidak
ada konsensus pada subjek. Selain - dan -glukan, kelompok lain dari polisakarida juga
disajikan kegiatan terapi: polimer mannose terikat peptida (mannoproteins) dan glucosamines Nasetil (chitin) [17] dan juga polisakarida terdiri dari fucose, arabinose, dan rhamnose [ 18, 19].
Beberapa karbohidrat tersebut diidentifikasi dalam polisakarida diisolasi dari Coriolus versicolor,
sebuah Basidiomycete. Hal ini menyajikan ikatan glikosidik ketik - (1 4) dan - (1 3)
[19]. Karakteristik struktural dari polisakarida telah umum dijelaskan oleh penelitian NMR yang
dapat memberikan konfigurasi stereokimia, khusus konfigurasi anomeric [20].
Agaricus telah ditunjukkan untuk menyajikan potensi farmakologi obatan yang signifikan dalam
pengobatan penyakit seperti diabetes, hepatitis, lupus, dan asma [21, 22], serta aktivitas anti
kanker yang penting, leukemia termasuk [23, 24]. Komponen aktif tampaknya memainkan
peranan penting dalam fungsi makrofag meningkat dan resistensi terhadap banyak bakteri, virus,
jamur, dan infeksi oleh parasit, selain stimulasi spesifik kekebalan tubuh [25, 26]. Dalam
pekerjaan kami sebelumnya [27], telah ditunjukkan bahwa pemberian sebagian kecil dari - (1
6) -- (1 4) -glucan- protein polisakarida kompleks yang diekstrak dari A. brasiliensis
menunjukkan in vivo antitumor kuat efek. Tes aktivitas antivirus dari ekstrak air dan etanol dari
- (1 6) - fraksi glukan-protein menunjukkan aktivitas pada tahap awal replikasi virus polio
tipe 1 [25]. Selain itu, efek tective pro dari - (1 6) kompleks -glukan-protein terhadap
kerusakan DNA kimiawi di limfosit manusia juga ditunjukkan [26]. Penelitian ini berkaitan
dengan evaluasi aktivitas analgesik dari fraksi polisakarida terisolasi dari A. blasei. fraksi terkait
ditandai struktural dengan spektroskopi NMR. Komposisi, dengan mengacu pada isi protein,
karbohidrat, dan mineral dianalisis. Bertujuan untuk mengevaluasi aktivitas analgesik naik
polisakarida terisolasi, beberapa tes awal yang dilakukan mengenai efek analgesik pada tikus
Swiss. Sejauh yang kami tahu, prestasi ini ditunjukkan oleh efek analgesik dari Agaricus blazei
adalah hasil baru.
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. Jamur Asal. Jamur yang tumbuh di Suzano kota, SP, Brazil. bahan baku yang ramah
diberikan oleh Guinish Importaca~o e Exportaca~o de Produtos Aliment'cios Ltda.
2.2. Ekstraksi Larut Air Polisakarida. Ekstraksi dan isolasi polisakarida dilakukan seperti yang
dijelaskan secara rinci dalam pekerjaan sebelumnya oleh Gonzaga [27]. Ini termasuk persiapan
dari 5% (w / v) dari jamur di suling pemanas air di 100C selama 5 jam, dan pengajuan untuk
sentrifugasi. Filtrat dengan pH 5.0 dinetralkan dengan larutan NaOH encer. 0,1% (w / v) NaCl /
volume filtrat ditambahkan untuk menginduksi curah hujan lebih lanjut dalam media etanol
dengan menambahkan larutan 5: 1 (v / v) etanol / filtrat. Endapan diisolasi dengan sentrifugasi,
dan hidrogen peroksida (30%) digunakan sebagai 1: 1 etanol: solusi peroksida untuk
memperjelas materi, dan kemudian, itu diserahkan kepada curah hujan baru menggunakan
prosedur yang sama. Endapan dicuci dengan etanol, dan aseton dan dikeringkan dalam mandi
pasir di 40C. Setelah dilarutkan dalam air dengan pengadukan selama 48 jam pada 40C,
larutan disentrifugasi, dan endapan padat tetap telah dihapus. Filtrat disampaikan kepada
liofilisasi. sampel dikeringkan kemudian diserahkan kepada prosedur yang sama dijelaskan
mulai dari pelarutan sampai memperoleh tiga menjatuhkan hujan selektif, maka, F1, F2, dan F3.
Sebuah flowchart sederhana dari tahap disajikan pada Gambar 1. bahan terisolasi dan fraksi yang
ditandai dengan spektroskopi NMR untuk menjelaskan struktur dan khusus konfigurasi tertentu
dan digunakan untuk mengevaluasi aktivitas analgesik pada tikus Swiss. Sebuah prosedur lebih
lanjut dari isolasi dan identifikasi -glukan dilakukan menurut metode yang dijelaskan oleh

Yoshioka et al. [28] dan akan dipublikasikan dalam publikasi yang akan datang.
2.3. Karakterisasi struktur Menggunakan Nuklir onance Res- Magnetic (NMR). Cosy dua
dimensi dan spektrum HMQC NMR di polisakarida D2O-terlarut diperoleh dalam model Bruker
Avance DRX-500 di 70C. Sampel diukur dengan 4,4-dimetil-4-silapentane-1-sulfonat asam
(DSS) sebagai standar internal.
2.4. Karbohidrat dan Protein Analisis. Total kandungan karbohidrat untuk polisakarida terisolasi
dan fraksi F1, F2, dan F3 diukur dengan metode spektrofotometri fenol-H2SO4 [29]
menggunakan glukosa sebagai standar. Spektrofotometer UV-Vis HP 8453 dengan detektor diode
array yang digunakan untuk pengukuran absorbansi. Jenis monosakarida perjalanan ini
diidentifikasi oleh senyawa alditol-asetat yang terbentuk dalam proses setelah hidrolisis,
pengurangan, dan acety- reaksi lation sesuai dengan metode yang sebelumnya dilaporkan [30].
Alditol-asetat dari sampel standar monosakarida glukosa, ramnose, fucose, arabinosa, xilosa,
manosa, dan galaktosa siap untuk perbandingan. Pengukuran dilakukan di Hewlett Packard
kromatografi, Model 5890 A, seri II dengan detektor ionisasi nyala dilengkapi dengan J & W
DB-225 (0,25 mm nomor pembayar 30 m) kolom. Nitrogen pada 2 mL / menit digunakan
sebagai gas pembawa dan aseton digunakan sebagai eluen. Kandungan protein polisakarida
terisolasi dan F1, F2, dan fraksi F3 ditentukan dengan metode Hartree [31]. protein bebas
diselidiki dengan metode Bradford [32].
2.5. Mineral Analisis Elemen oleh ICP-AES. jumlah dikenal (~0.1 G) dari sampel ditimbang
dalam tabung Teflon ditambahkan dengan.

Gambar 1: Flowchart langkah ekstraksi, isolasi, pemurnian, dan fraksinasi dari polisakarida.

3 mL HNO3 / H2O2 3: 1 v / v, dan dipanaskan sampai 110C untuk 03:30 h

di blok digester. Setelah pendinginan tabung, sampel yang dipindahkan ke tabung Falcon dan
diencerkan ke volume akhir 20 mL. solusi multielement standar disiapkan di Falcon tabung dari
solusi unsur mineral standar Ca, Mg, K, Na, Si, Al, Ti, Bi, V, Cd, Cu, Zn, Fe, Pb, dan P. The
solusi standar dan sampel disuntik dalam sistem operasi dengan kekuatan frekuensi radio 1350
W dengan argon sebagai nebulizing gas, gas pembangkit plasma, dan pendinginan gas di 0.80 L /
menit, 1,8 L / min, dan 15 L / min, masing-masing. Unsur-unsur mineral sampel dihitung dengan
software WinLab32.
2.6. Analgesik Activity Assay. Aktivitas analgesik dari polisakarida - terisolasi (1 6) -kompleks (1 4) -glukan-protein dan tiga fraksi dievaluasi dengan metode writhings perut yang
disebabkan oleh asam asetat 0,6%. Tes ini dilakukan seperti yang dijelaskan untuk tikus [33] dan
kemudian diadaptasi ke tikus [34]. mencit Swiss dengan berat antara 20 dan 25 g digunakan
dalam kelompok 06 hewan. Setiap kelompok pra-perawatan dengan solusi polisakarida dengan
pemberian intraperitoneal (IP) pada rasio 20 dan 40 mg / hewan kg. Setelah 30 menit, hewanhewan itu disuntik dengan agen algesic (larutan asam asetat (0,6%)) pada rasio
0,1 mL / 10 g hewan. Setelah 10 menit, perilaku kelompok yang berbeda diamati selama 20
menit dan diklasifikasikan menurut untuk jumlah writhings (kontraksi dari otot-otot perut
bersama dengan perpanjangan kaki hinder). Efek analgesik dari sampel diukur dengan
penghambatan persen menggeliat perut. Kelompok kontrol disuntik dengan air suling (0,1 mL /
10 g hewan) sebagai kontrol positif. Penghambatan persen menggeliat perut dihitung dengan
persamaan berikut:
% Penghambatan menggeliat perut

mana XCGT adalah menggeliat rata-rata kelompok uji dan XCGC adalah menggeliat rata-rata
kelompok kontrol.
3.Hasil
3.1. Dua-Dimensi NMR Struktural Analisis Cosy dan HMQC dari Larut Air Terisolasi
Polisakarida. Dua Cosy spektrum dimensi dan HMQC (Gambar 2 dan 3, resp.) Dari polisakarida
terisolasi dan fraksi yang digunakan untuk mengkonfirmasi atribusi dalam studi dicatat oleh 13C
Spektrum NMR dan 1H NMR satu dimensi yang dilaporkan dalam pekerjaan kami sebelumnya
[35] yang bersukaria karakteristik struktural utama dari polisakarida. The Cosy dan HMQC Data
mendukung bukti pertama didirikan pada kertas sebelumnya [35] bahwa larut dalam air
polisakarida terisolasi dari blazei Agaricus dibudidayakan di Brasil, sebagai yang dibentuk dari
- (1 6) dan - (1 4) glucan kompleks protein terikat,
Tabel 1: Massa molar dari fraksi dengan GPC dan protein konten dari polisakarida dan fraksi.

Tabel 2: Konsentrasi elemen yang diidentifikasi dalam polisakarida terisolasi oleh

ICP-AES.

yang konfigurasi (1 6) dominan. The acteristic char- kimia 13C NMR pergeseran diamati
pada: 103.0; 73,1; 75,6; 69.5; 74,9; dan 68,88 telah dikaitkan dengan C1-C6 dari cincin glikosida
relatif terhadap - (1 6). Untuk - (1 4), yang representativeshifts adalah: 99,8; 71,5; 75,3;
78,7; 71.2; dan 60,1. 1H NMR menunjukkan pergeseran di wilayah 3,3-4,0 ppm dikaitkan
dengan karbon proton (C2-C6) dari cincin glikosida [36]. Pergeseran kimia dari hidrogen
anomeric diamati di wilayah 4-6 ppm. Kegandaan tercatat sebesar 4,1 dan 4,2 ppm merupakan
ciri khas dari - (1 6) konfigurasi dan orang-orang di wilayah 4,9-5,6 ppm mewakili
konfigurasi [10]. Konfigurasi - (1 4) diwakili oleh pergeseran 5,3 ppm. Puncak dicatat

dalam interval 0,8-3,0 ppm dikaitkan dengan kelompok protein proton sebagai kelompok N-CH3
dan N-H yang terjadi disekitar 2,78 ppm dan di wilayah 0,5-3,0 ppm, masing-masing [37].
Glukan dari konfigurasi yang sama juga diisolasi dari Astraeus hygrometricus dibudidayakan di
India [38].
Data NMR tambahan dicatat untuk sampel -glucan terisolasi dalam prosedur 2.3 (data tidak
ditampilkan) dan intensitas puncak yang tercatat mengenai glukan - (1 6) menunjukkan
bahwa itu adalah komponen utama dalam konstitusi polisakarida terisolasi. spektrum yang sama
1H dan 13C NMR diterbitkan untuk -glukan terisolasi dari Agaricus blazei tumbuh di Jepang
[9].
3.2. Penentuan Jumlah Karbohidrat dan Protein. Kandungan karbohidrat total - terisolasi (1
6) dan - (1 4) glukan terikat kompleks protein polisakarida adalah 36,95%. Dominasi mutlak
glukosa diamati ditandai dengan kehadiran turunan asetat glukosa pada kromatogram [26].
Mengingat kompleks.
Tabel 3: aktivitas Analgesik untuk polisakarida dimurnikan dan fraksi terisolasi.

konstitusi sampel yang dianalisis, kuantifikasi tidak dianggap. Analisis blazei Agaricus tumbuh
di Jepang [10] mengungkapkan isi di urutan 38-45%. Fraksi diisolasi dari tubuh buah edodes
Lentinus disajikan isi karbohidrat 74,9-99,2%, yang menunjukkan isi konstituen beragam untuk
spesies yang berbeda [39]. Dalam spesies HHB dan edodes Lentinus dari India, kandungan
protein sekitar 16 dan 23% dengan kadar asam amino dari 34 dan 39% [40].
Pengurangan kandungan karbohidrat diamati dalam urutan fraksi diperoleh, F1 (39,58%), F2
(33,84%), dan F3 (15,62%) seperti yang diamati pada Tabel 1. Para penulis yang sama
dilaporkan pengurangan band karbohidrat karakteristik fraksi dari F1 ke F3 oleh spektroskopi
FTIR [35], sehingga menguatkan perilaku yang dijelaskan dalam karya ini untuk pengurangan isi
karbohidrat dan peningkatan isi protein dengan curah hujan berikutnya dari fraksi. perilaku yang
diharapkan sebagai metode fraksinasi berdasarkan curah hujan massa molar selektif. Pada
gilirannya, diamati bahwa kenaikan kadar protein dalam urutan pemisahan fraksi (Tabel 1).
Rupanya, kandungan protein lebih kecil dalam molekul yang lebih besar, yang memicu pertama,
atau mungkin protein yang dikeluarkan dari fraksi pertama oleh beberapa proses selektif [35].
3.3. Penentuan Logam Kation dengan ICP-AES. The elemen yang diidentifikasi dalam
polisakarida terisolasi disajikan pada Tabel 2. Isi paling signifikan dalam ug / g yang P
(23.024,90), K (12.571,60), dan Na (4550,10). Komposisi mineral diturunkan menjadi penting
bagi gizi manusia. Unsur-unsur seperti Na dan K menyajikan kekuatan besar dan mobilitas ion
dan mungkin terkait dengan mekanisme aksi polisakarida. Selain itu, itu adalah pentingnya
fundamental yang ada logam berat yang terdeteksi. Sebagai kandungan mineral jamur terkait

dengan kawasan pertumbuhan, itu adalah umum untuk mengamati variasi dalam isi mineral
jamur dari asal yang berbeda. Namun, terlepas dari asal, rupanya kalium (K) dan fosfor (P)
adalah elemen utama di sebagian besar jamur [12, 13, 41]. Di antara spesies yang paling diteliti
adalah Basidiomycetes dan Ascomycetes, yang mencakup jamur yang paling dimakan seperti
Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus, dan edodes Lentinus, selain Agaricus blazei.
3.4. Analgesik Activity Assay. Mengingat persen inhibisi dari menggeliat perut (Tabel 3), dapat
diamati bahwa aktivitas analgesik signifikan untuk semua sampel yang diuji. Dosis 20 mg / kg
disajikan tindakan analgesik yang efektif.
Perut induksi menggeliat didasarkan pada suntikan stimulan kimia kuat seperti asam asetat untuk
memberikan jangka pendek respon algesic. Penghambatan respon tive nocicep- oleh obat-obatan
seperti antihistamin, hypotensors, dan orang-orang yang mempengaruhi sistem saraf pusat
merender model tidak spesifik dan menguntungkan [42]. asam asetat tidak mengikat reseptor
nosiseptif peritoneal langsung. Dengan cara ini, induksi nyeri terjadi melalui pembebasan zat
endogen seperti prostaglandin, yang membangkitkan ujung saraf dan menghasilkan peradangan
akut di daerah peritoneal [43]. Aktivitas analgesik beberapa polisakarida alga sulfat diteliti
dengan metode yang sama, dan nilai-nilai menulis penghambatan 63-93% dicatat [44]. Dalam
upaya untuk berhubungan peningkatan tindakan analgesik untuk beberapa properti, dapat
dianggap bahwa peningkatan respon analgesik (F1 dan F3) lebih besar untuk fraksi dengan
kandungan protein yang lebih besar. Sebaliknya, dalam awal NMR tion characteriza- dari fraksi
oleh penulis yang sama [35], ia mengamati bahwa dari tiga fraksi F3 adalah terkaya di -glukan
(1 6), yang dilaporkan dalam literatur sebagai memiliki tanggapan farmakologis yang paling
efektif dibandingkan dengan kegiatan antitumoral dan immunosuppressing antara lain [10, 38,
45]. Suseem et al. [5] mengamati aktivitas antinociceptive oleh P. eous. Mereka menganggap
bahwa penurunan yang signifikan dalam asetat-asam diinduksi writhes (efek analgesik) mungkin
melalui anisms mech- pusat yang melibatkan sistem reseptor atau perifer dimediasi melalui
penghambatan sintesis dan pelepasan prostaglandin, leukotrien, dan zat endogen lainnya yang
terlibat dalam peradangan dan rasa sakit. Yang dapat dianggap sebagai mekanisme kerja untuk
Agaricus blazei Murill.
4. Kesimpulan
Tubuh buah dari Agaricus blazei Murill menunjukkan kaya akan protein dan unsur-unsur mineral
(terutama K, P, dan Ca). Kompleks glikoprotein yang diisolasi dari Agaricus blazei Murill
didasari terutama dari -glukan (1 6), kandungan protein
17,24%, dan jumlah kandungan karbohidrat 36,95%. Mineral utama hadir (K, P, Na, dan Ca)
bersama dengan konstituen lainnya menunjukkan bahwa jamur ini adalah nutrisi yang berharga.
Selain itu, uji aktivitas analgesik memberi hasil yang menjanjikan pada tikus dengan nilai
menggeliat penghambatan perut antara 85,95 dan 91,26%. Tanggapan analgesik yang terbaik
adalah bahwa dari fraksi dengan kandungan protein terbesar bersama dengan jumlah terbesar
dari -glukan (1 6). Hasil ini mendukung bukti bahwa aktivitas farmakologi dipamerkan oleh
polisakarida Agaricus terutama terkait dengan keberadaan
beta-glukan.

jamur kering
10 g / 200 mL air (5%)
Pemanasan (100 C / 5 h)
Sentrifugasi (6000 rpm / 5 menit)
Larut residu Filtrat
Netralisasi
Penambahan NaCl 1% (m / v)
Ppt. dalam etanol (1: 5 v / v)
Sentrifugasi
Klarifikasi (H2 O2 / etanol 1: 1 v / v)
Mengendapkan
2a ppt. dalam etanol
Sentrifugasi (6000 rpm / 10 menit)
Cuci dan pengeringan (45-50 C)
polisakarida terisolasi
Solubilisasi di H2 O
Pemanasan
Sentrifugasi
bagian yang tidak larut
cair tetap
Lyophilization
polisakarida Purificated
Solubilisasi di H2 O (1% m / v)
Penambahan etanol sampai larutan menjadi keruh
Pemanasan (~50 C) / didinginkan
Sentrifugasi (6000 rpm / 20 menit) / pengeringan (40 C)

cair tetap
Endapan (1a fraksi F1)
Reprodution prosedur mulai dari penambahan etanol
cair tetap
2a fraksi (F2) dan fraksi 3a (F3)
Gambar 1: Flowchart langkah ekstraksi, isolasi, pemurnian, dan fraksinasi dari polisakarida.

Dried mushroom
10 g/200 mL water (5%)
Heating (100 C/5 h)
Centrifugation (6000 rpm/5 min)

Insoluble residue

Filtrate

Neutralization
Addition of NaCl 1% (m/v)
Ppt. in ethanol (1:5 v/v)
Centrifugation
Clarification (H2 O2 /ethanol 1:1 v/v)
Precipitate
2a ppt. in ethanol
Centrifugation (6000 rpm/10 min)
Washing and drying (4550 C)
Isolated polysaccharides
Solubilization in H2 O
Heating
Centrifugation

Insoluble portion

Remained liquid
Lyophilization

Purificated polysaccharides
Solubilization in H2 O (1% m/v)
Addition of ethanol until the solution became turbid
Heating (50 C)/cooled
Centrifugation (6000 rpm/20 min)/drying (40 C)

Remained liquid

Precipitate (1a fraction F1)

Reprodution of procedure starting from addition of ethanol

Remained liquid

2a fraction (F2) and 3a fraction (F3)

Figure 1: Flowchart of the extraction, isolation, purification, and fractionation steps of the
polysaccharides.