EXTRACCIN DE ADN DE HONGOS

FILAMENTOSOS

Los hongos poseen un genoma complejo

consistente en:

ADN nuclear (n ADN)

ADN mitocondrial (mt ADN)

en algunos casos ADN plasmdico

EXTRACCIN DE ADN DE HONGOS

FILAMENTOSOS

Extraccin de ADN mitocondrial

Pasos ms importantes: No necesita tratamiento con fenol, ni la
utilizacin de bis-bencimida.
1.- Lisis de la pared: Zymoliasa, 37C.
2.- Rotura de la membrana celular: Buffer de lisis, 4C.
Centrifugar a 15.000g.
3.- Purificacin de mitocondrias: Ultracentrifugacin en
gradiente de sacarosa. Extraccin de las mitocondrias.
Centrifugar 40.000 g.
4.- Rotura de la membrana mitocondrial: SDS, Proteinasa
K, 37C, 3horas. Centrifugar a 17.000 g, 4C.
5.- Extraccin y precipitacin del ADN mitocondrial.
Isopropanol, etanol.

PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN

DE HONGOS FILAMENTOSOS
Etapa microbiolgica
1. - Se inocula 100 ml de Medio de cultivo lquido con conidios y se
incuba en agitacin orbital (150 rpm) a 28C durante el tiempo
necesario.

2. - El micelio se recoge sobre un filtro de nylon (200 mm de dimetro

de poro) y se seca con la ayuda de papel absorbente hasta eliminar la
humedad. Una vez seco, se aplana formando una capa lo ms fina
posible y se liofiliza para desecarlo completamente.

PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN

DE HONGOS FILAMENTOSOS
Etapa biologa molecular
Lisis de la pared celular y la membrana plasmtica

3. - Se pesan 0,06 g del micelio liofilizado dentro de un tubo eppendorf

y se tritura con la ayuda de un clip de metal. Es muy importante que
se consiga una trituracin adecuada, pues el rendimiento de la
extraccin depende del grado de fragmentacin del micelio.

4. - Se aaden 600 l de Solucin de Lisis y se incuba en un bao a

65C durante una hora.

PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN

DE HONGOS FILAMENTOSOS
Digestin y/o precipitacin de protenas (purificacin)
5. - Se aade igual volumen de fenol/cloroformo/isoamlico (500
l ) y se agita hasta que se mezclan todas las fases. Una vez mezcladas
las fases, se centrifuga durante 15 min. a 12000 rpm.
6. - Se recoge la fase acuosa (arriba) en un eppendorf limpio, y se le
aade Acetato potsico 5M y ClNa 4M hasta conseguir una
concentracin final de 1.8 M y 1 M respectivamente. Luego se deja en
hielo durante 30 min.
7. - Se centrifuga 10 min. a 12000 rpm para precipitar restos de
protenas. Y se recoge el sobrenadante en un tubo eppendorf limpio.

PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN

DE HONGOS FILAMENTOSOS
Extraccin y Precipitacin del ADN con
solventes orgnicos (concentracin)
8. - El DNA se precipita con 0.54 volmenes de isopropanol. Si el
rendimiento en ADN es alto, ste precipita en forma de ovillo y se
puede extraer con una punta estril.
9. - El DNA recogido se pasa a un nuevo tubo eppendorf al que se
aade 500 l de etanol al 70%.
10. - Centrifugar 5 min. a 12000 rpm. Descartar el sobrenadante.
11. - Secar al vaco.
12. - Resuspender el pellet en 200 l de Solucin TE. Guardar en la
heladera al menos 2 horas para que se resuspenda el DNA. Luego
conservarlo a 20C.

PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN

DE HONGOS FILAMENTOSOS

El mayor problema que presenta la obtencin de ADN

total de especies fngicas es la rotura y, sobre todo, la
eliminacin de las estructuras que forman parte de la
pared celular de los hongos. Es importante disponer de un
micelio joven donde estas estructuras estn en menor
proporcin. Adems una vez obtenido el DNA es
importante eliminar el RNA si lo que queremos es hacer
RFLPs de mtDNA.

PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN

DE HONGOS FILAMENTOSOS
9.- Se preparan tubos eppendorf nuevos con 400 l de agua

estril. Se recoge el ovillo y se resuspende en el agua.

10.- Se aaden 3 l de RNAsa (500 mg/ml) y se ponen en un
bao de agua a 37C durante 30 min. para eliminar el RNA de la
extraccin.
11.- Se aaden 2 volmenes de etanol absoluto (100%) y se
centrifuga 10 min. a 12000 rpm.
12. - Secar al vaco.
13. - Resuspender el pellet en 200 l de Solucin TE. Guardar
en la heladera al menos 2 horas para que se resuspenda el
DNA. Luego conservarlo a 20C.

Minipreparacin rpida de ADN para PCR.

(Tcnica de Liu y col. 2000)

Cultivar los hongos en medio de cultivo por 7 das a 28oC.

Una pequea porcin del micelio se rasp del cultivo, se coloc en un
tubo eppendorf de 1,5 ml conteniendo 500 l de solucin amortiguadora
de extraccin, tratando de disgregar el micelio con la punta de un clip
flameado.

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Agregar 150 l de KAc 3 M (pH= 4,8). Centrifugar por 2 minutos a
10000 rpm.

Agregar al sobrenadante un volumen igual de isopropanol. Centrifugar
2 minutos a 10000 rpm.

Lavar el precipitado con etanol al 70%. Centrifugar 1 minuto a 10000
rpm. Eliminar el sobrenadante, secar el pellet por 10 minutos a 37oC.

Resuspender el ADN en 50 l de agua desionizada ultrapura estril.
Guardar a 20oC.