PRACTICA DE LABORATORIO NRO.

01:
DETERMINACION DE PROTEINAS EN GELATINA MEDIANTE
ESPECTROSCOPIA UV

I.

INTRODUCCION:

La radiacin de absorcin ultravioleta o visible proviene de la excitacin de los

electrones enlazantes y como consecuencia, las longitudes de onda de los picos de
absorcin pueden correlacionarse con los tipos de enlace que existen en las especies de
estudio. La espectroscopia de absorcin molecular es por tanto valiosa para la
identificacin de los grupos funcionales de una molcula. Sin embargo, son ms
importantes las aplicaciones de la espectroscopia de absorcin ultravioleta y visible para
la determinacin cuantitativa de compuestos que contiene grupos absorbentes o tambin
llamados cromforos. De hecho la aplicacin ms generalizada de relevancia biolgica
es la medida de concentraciones de protenas, NADH y cidos nucleicos, porque en la
mayora de los casos hay una relacin directa y simple entre el nmero de molculas
presentes y la absorcin. No obstante en algunos casos, la absorcin depende
notablemente del entorno molecular; as los cambios en el espectro con cambios de
entorno pueden interpretarse en trminos de procesos tales como fusin de cidos
nucleicos, inte4raccion protenas- ligando (ensayos de actividad enzimtica, enzimacofactor, activador, inhibidor), etc. El espectro UV /V de un biopolmero es una huella
dactilar y como tal puede usarse en ocasiones para identificarlo. La gran utilidad de
tales medidas radica en la alta sensibilidad, la sencillez de la medida y el hecho de
hacerse en disolucin; aunque no es posible estas medidas en sistemas biolgicos, es
decir en vivo, tales como tejidos debido a que esta radiaciones fuertemente dispersada.

II.

OBJETIVOS:

Determinar la cantidad de protenas en una muestra de gelatina

comercial, aplicando el mtodo espectrofotomtrico en la regin
ultravioleta.

III.

FUNDAMENTO TEORICO:
Las protenas poseen una banda de absorcin en el UV entre 190 y 290 nm
debida fundamentalmente a la presencia de aminocidos aromticos
(tirosina, triptfano y fenilalanina). El mtodo se basa en la medicin de
absorbancia a 280 nm. Es un mtodo simple, rpido y no destructivo.
Espectrofotometra UV:
a) Absorbancia a 280 nm:
La mayor parte de las protenas poseen un pico de absorcin mxima a
280 nm. Los grupos responsables de tal caracterstica son los
aminocidos aromticos (Tirosina y Triptofano).
Las protenas poseen coeficientes de extincin molar (E280nm) que
puede variar de acuerdo a su composicin aminoacdica entre 0,4-1,5.
Como aproximacin se puede considerar que una unidad de absorbancia
se corresponde con una concentracin (C) de 1mg/ml de proteinas:

Si la solucion de protenas contiene DNA y/o RNA se introduce un error

en la medicin, dados que estos absorben a 280 nm.
b) Absorbancia de 205-210 nm:
A dicha longitud de onda absorve la unin peptdica, por lo tanto es un
mtodo mas sensible y no dependiente de los aminocidos que
componen la protena en estudio. La limitacin de esta tcnica esta dada
porque la mayora de los buffers utilizados tambin absorben a esa
longitud de onda.
Todos los atomos absorben en la regin ultravioleta (UV) ya que estos
fotones son bastante energticos para excitar a los electrones externos. Si la
frecuencia es lo bastante alta, se produce la fotoionizacin. La espectrometra
UV tambin se usa para la cuantificacin de protenas y la concentracin de
ADN , asi como para la proporcin de protenas y ADN en una solucin. En

las protenas se encuentran generalmente varios aminocidos, como el

triptfano, que absorven la luz en le rango de 280 nm. El ADN absorbe la luz
en el rango de 260 nm. Por esta razn, la proporcin de absorbancia 260/280
nm es un buen indicador general de la pureza relativa de una solucin en
trminos de estas dos macromolculas. Tambin pueden hacerse estimaciones
razonables de la concentracin de ADN o protenas aplicando la ley de Beer.
La espectrometra ultravioleta visible o espectrofotometra UV- vis implica
la espectroscopia de fotones en la regin de radiacin ultravioleta-visible.
Utiliza la luz en los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta UV) cercano y
el infrarrojo (IR) cercano.
En esta regin del espectro electromagntico, las molculas se someten a
transiciones electrnicas.
Esta tcnica es complementaria de la espectrometra de fluorescencia, que
trata con transiciones desde el estado excitado al estado basal, mientras que la
espectrometra de absorcin mide transiciones desde el estado basal al estado
excitado.

IV.

MATERIALES Y METODOS:
- Muestra de gelatina comercial

- suero albumina bovina

Tubos de ensayo de 10 ml

- balanza analtica

Espectrofotmetro

- pipetas automticas

Matraces aforados de 10 ml

- pipetas graduadas

- vasos de precipitacin

V.

Reactivos:
Agua destilada

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Preparacin de la muestra:
Pesar aproximadamente 1g de una gelatina comercial.
Disolvemos en un minimo volumen de agua caliente.
Dejar enfriar y llevar a 100 ml con agua destilada.
Tomar 1 ml de muestra.
Agregar 1ml de agua destilada.
Medir la absorbancia de dicha solucin a: 280 nm en un

espectrofotmetro UV visible.
Calcular la concentracin de protena en la muestra expresada en ppm a

partir de la curva de calibracin determinada.

CONSTRUCCION DE LA CURVA DE CALIBRACION
Preparar un padrn SAB (1000 ppm (1000 mg/L).
Tomar 1,2,3,4,5,6,7,8,9 y 10 ml de la solucin de protena estndar (1000

ppm)
Colocar cada volumen en distintos matraces aforados de 10 ml.
Tomar 2 ml de las soluciones finales y medir la absorbancia de dichas

soluciones a 280 nm en un espectrofotmetro UV-visible.

Construir una curva de calibracin graficando las absorbancias leidas a
280 nm vs. La concentracin de protena.

VI.

RESULTADOS:
Realizamos la curva de calibracin midiendo la absorbancia en el
espectrofotmetro.
Curva de calibracin 1000 ppm (1000 mg/L)

Numero

de Padrn

SAB H2O ml

Concentraci

Absorbancia

tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
blanco

(ml)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
---

n (mg)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
---

9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
--10,0

(280 nm)
0,1036
0,2412
0,3636
0,4763
0,6170

El valor obtenido en la muestra es 1,0538. Aunque en otro experimento

realizado con la misma muestra se obtuvo 0,5343.

Por regresin lineal tenemos los siguientes valores:

a: -0.01823
b: 0.063095
r: 0.99936
y=a+bx
y= -0.01823+0.063095
peso de la muestra: 1.0028 g
1.0057g/100ml
5 ml
A= 1.0538
A= 0.9741
A= y

Y= -0.01823+0.063095
0.9741= -0.01823+0.063095
0.9741+ 0.01823
X=
0.063095
X= 15.7275 mg
15.7275mg --------1.0028
x mg -------- 100 mg
x=1568.3585
x= 1.5683 g
VII.

DISCUSION DE RESULTADOS:

El cuadro mostrado nos brinda informacin sobre la informacin nutricional

de nuestra muestra que es gelatina royal sabor fresa, en la cual observamos
su contenido de protenas que es de 1g, y nuestro resultado en laboratorio fue
de 1.5683g, un resultado muy similar al del producto pero con una pequea
variacin. Este resultado pudo haber variado porque en el momento del
pesado de la muestra pudo haber un error ya que unas simples milsimas

generan cambios en los resultados. Pero en general obtuvimos los resultados

esperados.
VIII. CONCLUSIONES:

Logramos determinar la cantidad de protenas en una muestra de

gelatina

comercial

(gelatina

royal)

aplicando

en

mtodo

espectrofotomtrico en la regin UV, dando un resultado de 1.5683 g.

IX.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

http://www.iib.unsam.edu.ar/php/docencia/licenciatura/biotecnologia/

2009/QuiBiol/tp01.pdf
http://www.myfitnesspal.com/es/food/calories/136004315
http://www.bvsde.paho.org/texcom/cd045364/MCEcap3.pdf