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UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR
FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA
OCTUBRE DE 2007
SAN SALVADOR, EL SALVADOR, CENTRO AMERICA
UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR
Rectora
Dra. Mara Isabel Rodrguez
Secretaria general
Licda. Alicia Margarita Rivas de Recinos
Decano
Lic. Salvador Castillo Arvalo
Secretaria
MSc. Miriam del Carmen Ramos de Aguilar
Coordinadora General
Lic. Mara Concepcin Odette Rauda Acevedo
Docente Director
MSc. Mara del Carmen de Medrano
INDICE
Resumen.
I INTRODUCCION.
xv
II OBJETIVOS.
17
18
18
19
20
21
28
31
34
37
38
40
42
44
IV DISEO METODOLGICO.
46
47
47
48
50
58
VII CONCLUSIONES.
209
VIII RECOMENDACIONES.
212
BIBLIOGRAFA.
GLOSARIO.
ANEXOS.
INDICE DE TABLAS
Tabla N
1.
45
2.
49
3.
51
4.
5.
6.
53
7.
52
54
55
8.
122
9.
123
128
136
144
147
153
156
INDICE DE FIGURAS
Figura N
1. Forma elipsoidal o esfrica denominados cocos.
22
23
23
25
26
28
30
31
35
36
37
38
42
51
52
53
54
55
72
72
77
78
78
78
84
95
114
115
119
130
133
134
135
138
140
141
143
160
161
162
163
163
164
164
165
165
166
166
167
167
168
168
169
169
170
170
171
171
172
172
173
173
174
64. E. coli.
174
174
175
175
176
176
177
178
179
180
181
182
10
183
184
185
186
187
188
188
189
189
190
190
191
191
192
192
193
193
194
194
195
195
196
11
196
197
198
199
200
200
201
201
202
107. Basidiomicetes.
202
203
203
204
204
205
206
206
207
207
208
12
INDICE DE ANEXOS
ANEXO N
1. Encuesta.
2. Interpretacin de resultados API Staph.
3. Interpretacin de resultados API Strep.
4. Interpretacin de resultados API 20 E.
5. Interpretacin de resultados API 20 NE.
6. Hoja de resultados API 20 E.
7. Hoja de resultados API 20 NE.
8. Hoja de resultados API Staph.
9. Hoja de resultados API Strep.
13
RESUMEN
La presente investigacin se desarrollo reuniendo tcnicas de identificacin y
aislamiento de bacterias y hongos de ms uso en el estudio de microbiologa
general. As como aquellas tcnicas de importancia actual como las
bioqumicas estandarizadas API y PETRIFILM. Esto se realiz con el objetivo
de servir como un apoyo bibliogrfico para ser utilizado por estudiantes en
las carreras relacionadas con la salud en la Universidad de El Salvador. Se
realiz una encuesta dirigida a estudiantes que han cursado la ctedra de
microbiologa general, las preguntas que se les realizaron fueron sobre el
conocimiento y manejo de las tcnicas microbiolgicas; cuyos resultados
sustentan la necesidad de la elaboracin de un documento que rena todas
estas tcnicas. Por lo que se presenta una coleccin de procedimientos para
la identificacin, manipulacin, proliferacin y aislamiento de bacterias y
hongos, en forma de una gua. Se concluye que este trabajo servir como un
recurso disponible para los estudiantes y profesionales de la Universidad de
El Salvador u otra persona interesada en la materia, por lo que se
recomienda
xvi 14
I. INTRODUCCION
La microbiologa es una rama de la biologa, de las ms estudiadas debido a
su importancia en el campo de la salud pblica. Existe una extensa gama de
anlisis o tcnicas bsicas para su estudio, que se encuentran dispersas en
diversas fuentes muchas veces poco compresibles. Es por eso que se vuelve
necesario, plasmar toda esta informacin en forma de un consolidado, que
recopile el conjunto de tcnicas bsicas tales como: tinciones bacterianas y
fngicas, identificacin y aislamiento de bacterias y hongos, preparacin y
tipo de medios de cultivo, pruebas bioqumicas IMVIC, as como las
innovadoras tcnicas estandarizadas API y PETRIFILMMTM. Todo lo anterior
se elabor en el presente trabajo con el fin de suplir las necesidades
existentes en la poblacin estudiantil y profesional en la Universidad de El
Salvador, en la obtencin de recursos didcticos de microbiologa general.
Debido a esto se realiz una encuesta de opinin a cierto nmero de
estudiantes que actualmente cursan carreras aplicadas a diversas reas de
la Salud y que en cierto nivel cursan la asignatura de Microbiologa General.
Las preguntas formuladas fueron relacionadas con el grado de conocimiento
que poseen los estudiantes sobre el manejo de las tcnicas microbiolgicas
bsicas, este diagnostico se realiz para corroborar la necesidad de la
elaboracin del presente manual, que se emplear para ser consultado y
como un apoyo didctico para estudiantes, profesionales y personas
interesadas en la materia.
15
II OBJETIVOS
16
2.0 OBJETIVOS
17
18
19
20
permanecer unidos unos a otros. Los que permanecen unidos en parejas tras
dividirse se llaman diplococos, aquellos que se dividen en dos planos y
forman grupos de cuatro se conocen como ttradas, los que se dividen por
tres planos y quedan divididos en grupos de ocho se llaman sarcinas y
aquellos que se dividen siguiendo planos al azar y forman racimos como los
de uva o anchas laminas son estafilococos (Fig. 1). Estas agrupaciones son
frecuentemente tiles para la identificacin de algunos cocos.
(5).
Los bacilos se dividen solamente a travs de su eje mas corto, de forma que
hay menos agrupamientos de bacilos que de cocos, los diplobacilos
aparecen en parejas tras la divisin y los estreptobacilos se presentan en
cadenas (Fig. 2).
El termino bacilo tiene dos significados en microbiologa, usado como hasta
ahora se refiere a la morfologa bacteriana, pero puede ser tambin el origen
de un nombre genrico, por ejemplo, la bacteria Bacillus anthracis es el
agente etiolgico del carbunco.
21
(5).
22
23
FILAMENTOS AXIALES
Las espiroquetas son un grupo de bacterias que poseen una estructura y
movilidad exclusivas. Una de las espiroquetas mejor conocidas es
Treponema pallidum, el agente etiolgico de la sfilis. Los filamentos axiales
poseen una estructura similar a los flagelos, emergen de ambos extremos de
la clula y la rodean en espiral por debajo de la vaina y estn anclados en un
extremo de la espiroqueta (Fig. 4).
24
25
la
26
27
28
29
MOHOS.
Estn formados por filamentos pluricelulares llamados hifas, que se renen
para formar un cuerpo o micelio. Las hifas pueden ser tabicadas, y se
denominan hifas septadas, o no presentar tabiques, y reciben el nombre de
hifas sifonadas. El micelio por lo general presenta un aspecto aterciopelado o
esponjoso (Fig. 8).
30
31
32
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante
forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras
celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales
inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos,
y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no
nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura
realmente existente.
3.3 Exmen de muestras al microscopio. (15)
Segn la manipulacin que se efecte sobre la muestra a observar y segn
los colorantes que se empleen durante el proceso, existen diferentes
modalidades de tincin, en el examen microscpico directo de las muestras
clnicas no se utiliza ningn tipo de colorante. Las muestras se extienden
directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observacin (Fig.
9). El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciacin de
sus elementos puede diluirse con igual volumen de solucin salina fisiolgica
estril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del
material.
Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de
parsitos intestinales, huevos y quistes de otros parsitos, larvas y gusanos
adultos, hifas de hongos, etc.
33
34
Fig. N 10: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china. (15)
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se
diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con
su propia constitucin qumica. Los ejemplos clsicos seran la tincin de
GRAM o la de Ziehl-Neelsen.
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes para la
microbiologa general y con el que el estudiante debe estar perfectamente
familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico
de rutina del laboratorio de microbiologa las referencias a la morfologa
celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos etc.) se basan
justamente en la tincin de Gram (Fig. 11).
35
36
37
38
39
40
41
42
St
aureus,
Estafilococos
Express,
Listeria
ambiental.
PETRIFILMMTM incrementa la eficiencia de los anlisis bacteriolgicos ya que
es rpido y sencillo de usar adems de ser especfico para cada grupo
bacteriano optimiza el nmero de los anlisis bacteriolgicos, entre sus
ventajas en el laboratorio es el ahorro de espacio, trabajo, tiempo y costos.
Las placas disponibles en el mercado actualmente son:
- Aerobios (AC).
- Bacterias acido lcticas (AC).
- Psicrfilos (AC).
43
MTM
METODO TRADICIONAL
44
IV DISEO METODOLGICO
45
46
47
NUMERO
Doctorado en Medicina
2500
876
630
142
363
4,809
48
49
Porcentaje
Femenino
Masculino
55
45
90
80
70
60
50
Femenino
40
Masculino
30
20
10
0
Se xo de los e s tudiante s
50
(%)
Tincin simple
54,44
Tincin de Gram.
48,88
Tcnicas de inoculacin
62,22
Descripcin de hongos
Mtodos de cuantificacin de
microorganismos
Preparacin de medios de cultivo
36,66
Otros
25,55
Ninguno.
13,33
36,66
44,44
Tincin simple
90
Tincin de Gram
80
Tecnicas de inoculacin
70
60
Descripcin de hongos
50
40
Cuantificacin de
Microorganismos
Preparacin de medios de
cultivo
Otros
30
20
10
0
Tcnicas microbiolgicas
Ninguno
51
(%)
Libros de Microbiologa
78,88
Internet
63,33
Tesis de la Facultad
28,88
Enciclopedias
16,66
Apuntes de clase
58,88
Otros
3,33
90
Libros de microbiologa
80
Tesis de la facultad
70
Internet
60
Enciclopedias
50
Apuntes de clases
40
Otros
30
20
10
0
Fuentes de informacin
52
Porcentaje (%)
Si
73,33 %
No
26,66 %
90
80
70
60
50
Si
40
No
30
20
10
0
53
(%)
74,44
41,11
38,88
Ninguno
5,55
Otros
90
Recopilacion de tecnicas,
aislamiento e identificacion de
microorganismos
Tecnicas de preparacin y uso de
medios de cultivo
80
70
60
50
40
30
20
Ninguno
10
0
Tcnicas propuestas para la gua
Otros
54
55
56
UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR
FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y CONTAMINACION AMBIENTAL
PRESENTADO POR:
HEYDI ARACELY BENAVIDES MARTINEZ
57
65
.
65
66
66
68
68
69
70
73
73
74
75
79
79
58
81
82
83
85
85
86
89
89
90
91
92
93
94
95
97
97
59
98
99
100
101
102
103
105
106
106
107
109
10. PRUEBAS Y TECNICAS DE IDENTIFICACION Y CUANTIFICACION DE BACTERIAS GRAM (+) Y GRAM (-).
113
113
113
114
116
117
60
120
122
129
129
130
132
132
133
134
136
139
140
141
61
143
148
149
154
158
158
160
163
163
174
178
62
188
188
190
197
199
199
206
63
1. INTRODUCCION
Esta gua esta diseada para ser utilizada por estudiantes que cursan la
asignatura de microbiologa general, introducindolos de forma gradual en la
observacin de las caractersticas morfolgicas, nutricionales de crecimiento
y control de microorganismos. Al mismo tiempo, la gua describe
procedimientos de cultivo, identificacin y manipulacin tanto de bacterias y
hongos a travs de tcnicas convencionales e innovadoras. Se pretende que
las tcnicas expuestas sirvan de base para su puesta en prctica en el
laboratorio de microbiologa.
2. OBJETIVO GENERAL
Que el estudiante se familiarice gradualmente con los procedimientos ms
utilizados en microbiologa general sobre: aislamiento, identificacin,
manipulacin y proliferacin de bacterias y hongos.
64
(15)
65
las
recomendaciones
del
fabricante
de
usar
disolventes
66
4.
TECNICAS
DE
PREPARACIN
DE
FROTIS
TINCIN
DE
BACTERIAS.
4.1 Tcnica de preparacin de frotis bacteriano.
(2)
67
68
MATERIALES Y EQUIPO:
Frotis.
Safranina.
Frasco lavador con agua destilada.
Microscopio de campo claro.
PROCEDIMIENTO:
El frotis se cubre con dos gotas de safranina durante 30 segundos a 1
minuto.
El exceso de colorante se elimina con lavado suave al agua corriente o
con la ayuda del frasco lavador conteniendo agua destilada.
Dejar secar al aire.
Observar al microscopio en objetivos 10X y 40X.
4.3 Tcnica de Tincin de Gram. (2)
Esta tcnica de tincin fue propuesta por el mdico dans Cristian Gram en
1884 y es una de la ms utilizada en bacteriologa que clasifica los cultivos
bacterianos en bacterias Gram (+) y bacterias Gram (-). La tcnica se
fundamenta en el hecho de que el colorante primario (Cristal violeta) tie por
igual a todas las bacterias, pero la combinacin con cristal violeta es ms
permanente en las bacterias Gram (+) que mostraran un color morado,
mientras que las bacterias Gram (-) mostraran un color rosado.
69
Luego de tener el frotis listo se puede realizar una tincin de Gram para
observar al microscopio de campo claro.
MATERIALES Y EQUIPO:
Frotis bacteriano reciente.
Cristal violeta.
Lugol.
Metanol.
Safranina.
Frasco lavador con agua destilada.
PROCEDIMIENTO:
Preparar un frotis bacteriano.
Colocar 2 gotas de cristal violeta en el frotis y dejarlo durante 30
segundos a 1 minuto.
A continuacin se lava cuidadosamente el frotis con agua destilada para
eliminar el exceso de colorante.
Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por
30 segundos.
Lavar cuidadosamente el frotis con agua.
Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que
escurra hasta que no fluya mas tintura.
Lavar con agua inmediatamente.
70
71
observaciones
microscpicas
de
los
mohos
levaduras
son
72
73
PROCEDIMIENTO:
El frotis se cubre con dos gotas de azul de metileno durante 30 segundos
a 1 minuto.
El exceso de colorante se elimina con lavado suave al agua corriente o
con la ayuda del frasco lavador conteniendo agua destilada.
Dejar secar al aire.
Observar en el microscopio con los objetivos 10X y 40X.
5.3 Tcnica de tincin de hongos: levaduras y mohos en montaje con
cinta adhesiva. (2)
Con esta tcnica se permite la observacin de estructuras especiales como
los conidiofros, conidias, esporangios y rizoides, de especial importancia
para la identificacin de hongos filamentosos en Microbiologa general.
MATERIALES Y EQUIPO:
Portaobjetos.
Cinta adhesiva.
Azul de lactofenol.
Mechero bunsen.
Cultivo fngico reciente.
74
PROCEDIMIENTO:
Colocar una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomndola
nicamente por los extremos
Cerca del mechero abrir la caja de Petri conteniendo la muestra del hongo
de inters y presionar ligeramente la cinta transparente sobre la periferia
de la colonia.
Ubicar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de
lactofenol, previamente colocada en el centro del portaobjetos.
La cinta funciona como cubreobjetos por lo que se debe aplanar lo mejor
posible, evitando la formacin de burbujas y sin alterar demasiado las
estructuras.
A continuacin se deja reposar durante 3-5 minutos y hacer las
observaciones en el microscopio con los objetivos 10X y 40X.
En las preparaciones es fcil observar estructuras especiales como
Conidiforos, Conidias, Esporangiforos, Esporangios y Rizoides (Fig. 21, 22,
23 y 24).
75
76
77
0.02 micras.
78
Pipetas estriles.
Placas de Petri estriles con almohadillas absorbentes.
Medios de cultivo MF ENDO.
Frascos estriles para el muestreo.
Nota: Se recomienda trabajar en cabina de flujo laminar o en su defecto
cerca del mechero bunsen.
PROCEDIMIENTO (16) :
Esterilizar el equipo de filtracin sin la membrana en papel aluminio por
medio del autoclave a 121 C x 15 minutos.
Ensamblar la unidad de filtracin colocando una membrana filtrante estril
sobre el soporte poroso, utilizando para ello pinzas previamente
esterilizadas.
Colocar la almohadilla en la placa de Petri, colocar 2 ml de medio de
cultivo MF ENDO (14) con una pipeta estril.
Vaciar el volumen de muestra elegido como ptimo segn el tipo de
muestra.
Si la muestra es de menos de 10 ml, se deber aadir por lo menos 20 ml
de agua de dilucin estril (agua desionizada y desmineralizada estril) al
recipiente superior antes de la filtracin y aplique el vaco.
Desconectar el vaco y enjuague el recipiente con 20-30 ml de agua de
dilucin estril.
79
80
PROCEDIMIENTO:
Se comprueba que el nivel de agua en el interior del autoclave sea el
adecuado (por encima de la rejilla del fondo).
Se conecta el aparato, accionando el interruptor de encendido.
Los tubos de ensayo se introducen en cestas de autoclave, que se cubren
con papel de aluminio.
Los matraces de cualquier capacidad se recubren en su parte superior
con un tapn de algodn y papel de aluminio.
Una vez introducido todo el material a esterilizar dentro del autoclave, se
cierra la tapa y la llave de purga automtica (si el aparato no dispone de
un sistema de purgado, se debe cerrar la llave de purga una vez que sale
un chorro uniforme de vapor de agua a travs del grifo de purgado).
Se selecciona la temperatura y el tiempo de esterilizacin.
Transcurrido el tiempo y una vez se compruebe que no existe
sobrepresin, se abrir la llave de purga y posteriormente la tapa del
aparato, sacando el material esterilizado.
81
82
83
84
85
MATERIALES Y EQUIPO:
Medio de cultivo elegido.
Balanza granataria.
Esptula.
Matraz Erlenmeyer de la capacidad adecuada.
Agua destilada.
Mechero Bunsen.
Soporte.
Malla de asbesto.
Placas de Petri estriles.
Tubos de ensayo con tapn de rosca estriles.
Autoclave 121 C por 15 minutos.
PROCEDIMIENTO:
Para la preparacin de medio de cultivo slido se pesa la cantidad
indicada en la vieta del frasco, colocndola en un matraz Erlenmeyer.
En un matraz Erlenmeyer se agrega la cantidad de agua destilada
indicada por la etiqueta del frasco para la preparacin de medio de cultivo
slido.
Esta mezcla se calienta con agitacin constante hasta que ebulle,
cuidando que no se proyecte.
86
87
88
PREPARACIN:
Disolver 22.5 g/l y esterilizar en autoclave (15 min 121 C). Verter el medio en
placas de Petri. pH 7.0
0.2 a 25 C.
INCUBACION:
Incubar a 30 C de 24 a 48 h en condiciones aerobias.
LECTURA:
Despus de la incubacin se observan colonias amarillentas, de aspecto
irregular, hmedo y mucoide.
8.2 Medio de cultivo Lauril Sulfato. (14)
Medio de cultivo liquido, selectivo para el ensayo previo de coliformes y para
el enriquecimiento selectivo de los mismos.
Debido a su elevada calidad nutritiva y al tampn de fosfatos que contiene
este medio de cultivo, se garantiza el rpido crecimiento y la intensa
formacin de gas, incluso en el caso de coliformes que fermenten lentamente
la lactosa. La formacin de gas puede detectarse con campanas de
fermentacin (Campanas de Durham). El contenido en laurilsulfato inhibe
notablemente el crecimiento de la flora acompaante indeseable.
COMPOSICIN (g/L):
Triptosa 20.0; lactosa 5.0; cloruro de sodio 5.0; laurilsulfato sal sdica 0.1;
hidrogenofosfato dipotsico 2.75; dihidrogenofosfato potsico 2.75.
89
PREPARACIN:
Disolver 35.5 g/L distribuir en tubos de ensayo provistos de campanas de
Durham y esterilizar en autoclave (15 min a 121 C) pH 6.8 + 0.2 a 25 C.
INCUBACIN:
Incubar a 35 C o 30 C de 24 a 48 h en condiciones aerobias.
LECTURA:
Esta se realiza observando la formacin de turbidez en el medio y la
formacin de gas o espuma en los tubos de Durham.
8.3 Medio de cultivo nutritivo. (14)
Medios de cultivo universal para el cultivo de microorganismos poco
exigentes.
COMPOSICIN (g/L):
Peptona de carne 5.0; extracto de carne 3.0; Agar Agar 12.0.
PREPARACIN:
Disolver 20.0 g/L (Agar nutritivo) 8 g/L para preparar caldo nutritivo y
esterilizar en autoclave (15 min a 121 C) el pH 7.0
0.2 a 25 C.
Las placas con medio de cultivo y el caldo preparados son claros e incoloros
hasta con una tonalidad amarillenta.
INCUBACIN:
Incubar a 35 C durante 24 - 48 h en condiciones aerobias.
90
LECTURA:
Las colonias que crecen en este medio de cultivo son redondas de bordes un
tanto irregulares y color amarillento o cremoso. En el caso del caldo se
observa turbidez en la composicin del medio cuando hay presencia de
microorganismos
8.4 Medio de cultivo EMB (Agar Eosina Azul de Metileno LactosaSacarosa).(14)
Este es un Agar selectivo para la demostracin y el aislamiento de
Enterobacteriaceas patgenas. Segn Holt Harris & Teague (1916), el
contenido en lactosa y sacarosa hace posible la distincin entre Salmonella
y
Shigella
lactosa-negativa
y sacarosa-negativa,
frente
la
flora
hidrogenofosfato dipotsico
2.0;
lactosa
5.0; Eosina
91
INCUBACIN:
Incubar por 24 horas a 37 C en condiciones aerobias.
LECTURA:
Las colonias trasparentes o de color mbar corresponden a Salmonella o
Shigella, aquellas colonias que presentan una consistencia mucosa, con el
centro pardo-grisceo a la luz transmitida pertenece a cepas de
Enterobacter o Klebsiella. Si las colonias son verdosas con una tonalidad
metlica a la luz reflejada con el centro azulado a la luz trasmitida pertenecen
a Escherichia coli.
8.5 Medio de cultivo MacConkey. (14)
Agar selectivo para el aislamiento de Salmonella, Shigella y bacterias
coliformes. Segn MacConkey (1905), las sales biliares y el cristal violeta
inhiben considerablemente la flora Gram (+). La lactosa junto con el indicador
pH rojo neutro, sirve para la comprobacin de la degradacin de dicho
azcar.
COMPOSICIN (g/L):
Peptona de casena 17.0; peptona de carne 3.0; cloruro de sodio 5.0; lactosa
10.0; mezcla de sales biliares 1.5; Rojo neutro 0.03; cristal violeta 0.001;
Agar Agar 13.5.
PREPARACIN:
Disolver 50 g/L, esterilizar en autoclave (15 min a 121 C) y verter en placas
de Petri, pH 7.1 + 0.2 a 25 C.
92
INCUBACIN:
Incubar a 37 C de 18 a 24 horas en condiciones aerobias.
LECTURA:
Las colonias lactosa (-) negativa son incoloras y las lactosa (-) positiva son
rojas con un halo turbio debido al descenso de pH provocado por los acidos
biliares.
Las colonias incoloras trasparentes son tpicas de cepas de Salmonella o
Shigella, las grandes rojas con halo turbio son tpicas de cepas de
Escherichia coli, aquellas colonias diminutas, de crecimiento aislado y
opacas son tpicas de cepas de Enterococos y Estafilococos.
8.6 Medio de cultivo Fluorocult LMX. (14)
Medios para la demostracin rpida de E. coli mediante fluorescencia. La
deteccin de la presencia de E. coli se efecta mediante fluorescencia al
iluminar con luz UV. Para confirmar el ensayo se utiliza como indicador la
formacin de gas debido a la fermentacin de la lactosa y el ensayo del indol
(Pba. Bioqumica) puede realizarse con la adicin de gotas del reactivo de
Kovacs, un anillo rojo indica prueba positiva.
COMPOSICIN (g/L):
Tryptosa 5.0; cloruro de sodio 5.0; sorbitol 1.0; tryptofano 1.0; Fosfato
dipotsico 2.7; Fosfato potsico 2.0; lauryl sulfato de sodio 0.1; 5 - bromo - 4
- cloro - 3 - galactopiranosido (X-GAL) 0.08; metil umbifenil glucoronido
(MUG) 0.05; isopropil galactopiranosido (IPTG) 0.1.
93
PREPARACIN:
Disolver 17g en un litro de agua destilada, hervir y distribuir en tubos con
tapn de rosca esterilizar en autoclave (15 min. 121 C) pH 6.8
0.2 a 25 C.
INOCULACIN:
37 C durante 24 h en condiciones aerobias.
LECTURA:
La fluorescencia se provoca mediante una lmpara UV (366 nm). Los tubos
que muestra fluorescencia azul claro corresponden a las de E. coli. Adems
el medio de cultivo permite realizar la prueba de presencia del indol con el
reactivo de Kovacs provocando la formacin de un anillo color rojo en los
tubos positivos (Fig. 26)
94
INCUBACIN:
Incubar a 35 C de 24 - 48 h en condiciones aerobias.
LECTURA:
El Staphylococcus aureus se caracteriza por presentar colonias negras
lustrosas, con un borde estrecho blanquecino rodeado por un halo claro, las
95
bacterias
exigentes,
como
Estreptococos,
Pneumococos,
Meningococos y otros.
PREPARACIN:
Disolver 52 g/litro para Agar o 37 g/litro para preparar caldo y esterilizar en
autoclave (15 min. a 121 C). pH 7.4 + 0.2 a 25 C.
Ambos medios de cultivo son ligeramente parduscos. El caldo tiene un
aspecto claro, mientras que el Agar puede presentar, a veces, opalescencia.
LECTURA:
Crecen colonias tpicas de bordes irregulares y de consistencia mucoide, y
en el caso del caldo la turbidez del medio indica la presencia de
microorganismos .
8.9 Medio de cultivo Czapek Dox. (14)
Agar selectivo para el cultivo de hongos y bacterias del suelo, segn Czapek
(1902 1903) y Dox (1910). Este medio de cultivo contiene sacarosa como
nica fuente de carbono y nitrato como nica fuente de nitrgeno. En este
96
medio, los hongos pueden crecer bien, en tanto que de la flora bacteriana
solo pueden desarrollarse las bacterias del suelo no exigentes.
COMPOSICIN (g/L):
Sacarosa 30.0, nitrato sdico 3.0; sulfato de magnesio 0.5; cloruro potsico
0.5; sulfato de hierro (II) 0.01; hidrogenofosfato dipotsico 1.0; Agar Agar
13.0.
PREPARACIN:
Disolver 48 g/L, esterilizar en autoclave (15 min. A 121 C) y verter en placas.
pH: 7.3 + 0.2 a 25 C las placas con medio de cultivo son ligeramente turbias.
INCUBACION:
Incubar de 1 a 2 semanas a 25 C. La temperatura ptima de incubacin
para Penicillium es de 20 a 25 C; para Aspergillus de 30 C y para
Candida de 28 C en condiciones aerobias.
LECTURA:
Los hongos filamentosos pueden presentar aspectos algodonosos y de
diversos colores dependiendo de la cepa, las levaduras crecen en forma de
colonias pegadas al medio y son hmedas.
8.10 Medio de cultivo PDA (Papa Dextrosa). (14)
Para el cultivo, aislamiento y determinacin del nmero de grmenes de
levaduras y mohos, a partir de alimentos y otros materiales. Los hidratos de
carbono y la infusin de patata (Beever y Bollard, 1970) favorecen el
crecimiento de levaduras y mohos. Debido al bajo valor de pH, la flora
97
colonias
presentan
aspecto
algodonoso
cuando
son
hongos
98
COMPOSICION (g/l):
Sodio azida 0.2; Extracto de carne 3.0; Peptona 10.0; cloruro de sodio 5.0;
Agar 15.0.
PREPARACION:
Suspender 33.2 g en un litro de agua destilada, calentar y agitar hasta
ebullicin y disolucin total y hervir durante 1 min. Esterilizar a 121 C
durante 15 min, dejar enfriar hasta 45 C y aadir aspticamente un 5 % de
sangre mezclar bien y distribuir pH 6.8 + 0.2 a 25 C.
INCUBACIN:
35 C por 24 h en condiciones aerobias.
LECTURA:
Staphylococcus
epidermidis
no
presentan
hemlisis,
Enterococos
99
COMPOSICION (g/L):
Extracto de levadura 2.5; Gelatina 30.0; Lactosa 2.0; D (-) manita 10.0;
Peptona de casena 10.0; Potasio hidrogeno fosfato 5.0; Cloruro de sodio
75.0; Agar 15.0.
PREPARACION:
Suspender 149 g de medio de cultivo en un litro de agua destilada, calentar y
agitar hasta ebullicin y hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121 C durante
15 minutos. Resuspender el precipitado agitando suavemente para evitar la
formacin de burbujas y distribuir en placas de Petri estriles pH 7.0 + 0.2 a
25 C.
INCUBACION:
35 C y 37 C durante 48 h en condiciones aerobias.
LECTURA:
Las colonias sospechosas de ser Staphylococcus patgenos aparecen de
color amarillo (produccin de pigmento).
8.13 Medio de cultivo EC. (14)
Se emplea para la diferenciacin y enumeracin de coliformes y E. coli en
aguas residuales, y otro tipo de muestras. La presencia de sales biliares
determina que se inhiba el crecimiento de las especies que forman esporas y
de Streptococos fecales. La lactosa favorece a los coliformes y el consumo
se pone de manifiesto por la presencia de gas.
100
COMPOSICIN (g/L):
Lactosa 5.0; Potasio di-hidrogeno fosfato 1.5; di-potasio hidrogeno fosfato
4.0; Sales biliares 1.0; Cloruro de sodio 5.0; Triptosa 20.0.
PREPARACIN:
Suspender 37.4 g en un litro de agua destilada, calentar y agitar hasta
dilucin total. Distribuir en tubos de ensayo con campanas de Durham y
esterilizar a 121 C durante 15 min. El caldo es de color claro amarillento, pH
6.9 + 0.2 a 25 C.
INCUBACIN:
Incubar a 37 C
101
102
MODO DE ACCIN:
La bilis y el verde brillante inhiben completamente el crecimiento de la flora
bacteriana indeseable. La fermentacin de lactosa con formacin de gas al
utilizar tubos con campanas de Durham, indica la presencia de Escherichia
coli y bacterias coliformes fecales. La presencia de otras bacterias no
coliformes en el medio de cultivo no produce gas en las campanas de
Durham.
COMPOSICIN:(g/L):
Peptona 10.0; lactosa 10.0; bilis seca 20.0; verde brillante 0.0133.
PREPARACIN:
Suspender 40 g/L de medio de cultivo en 1 litro de agua destilada, agitar para
disolver completamente. Llenar los tubos de ensayo con tapn de rosca
conteniendo tubos de Durham y esterilizar en autoclave (15 min. a 121 C).
pH 7.2 + 0.2 a 25 C.
El caldo preparado es claro y verde.
INCUBACIN:
Incubar a 24 - 48 h a 44 C en medio aerobio.
LECTURA:
La Escherichia coli presenta turbidez y presencia de gas al incubar los
tubos a 44 C.
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
PROCEDIMIENTO:
Transferir colonias sospechosas de Staphylococcus aureus a tubos
conteniendo caldo BHI (Caldo de Infusin Cerebro Corazn) y emulsionar
a fondo.
Incubar el caldo BHI a 35 C y a 18-24 h.
Agregar 0.5 ml de plasma de conejo reconstituida con EDTA a los tubos
conteniendo el caldo BHI
y posterior
114
115
PROCEDIMIENTO:
Pesar 10 g o 10 ml de muestra y diluir en frasco de dilucin con 90 ml de
buffer fosfato, mezclar durante 2 minutos.
Tomar con pipeta estril 1 ml de la muestra y colocarlas en 1 placa de
Agar Baird Parker, distribuyendo uniformemente el inoculo sobre la
superficie de la placa por rotacin de la placa con la mano.
Conservar las placas en la posicin horizontal hasta que el inoculo sea
absorbido por el Agar (cerca de 10 minutos en las placas correctamente
secadas).
Incubar las placas a 35 C por 45 + 48 h.
LECTURA:
Las placas con colonias tpicas de Staphylococcus aureus
que se
116
117
118
119
120
TEST
SUBSTRATOS
REACCIONES/ENZIMAS
0
GLU
FRU
MNE
MAL
LAC
TRE
MAN
XLT
MEL
Ninguno
D-glucosa
D-fructosa
D-manosa
Maltosa
Lactosa
D-trehalosa
D-Manitol
Xilitol
D-Melibiosa
Testigo negativo
NIT
Nitrato de potasio
Reduccin
nitritos
PAL
- naftil fosfato
Fosfatasa alcalina
VP
Piruvato de sodio
Produccion de acetil-metilcarbinol
RAF
XYL
SAC
MDG
NAG
Rafinosa
Xilosa
Sacarosa
Alfa-metil
D
glucosa
N - acetil-glucosa
Acidificacin
carbohidrato
ADH
URE
Arginina
Urea
Arginina dihidrolasa
Ureasa
NEGATIVO
POSITIVO
Rojo
------
Rojo
Amarillo
Testigo positivo
Acidificacin
carbohidrato
de
partir
nitratos
partir
del
del
NIT 1 + NIT 2 - 10 mn
Incoloro
Rojo
ZYM A + ZYM B - 10 mn
Amarillo
Violeta
VP 1 + VP 2 - 10 mn
Incolora
Violeta rosa
Rojo
Amarillo
Amarillo
Amarillo
Rojo
Rojo Violeta
121
Reactivo VP 15 ml
COMPOSICION QUIMICA
Agua desmineralizada
Cistina
0.5 g
Tristona
20.0 g
Cloruro de sodio
5g
Sulfito de Sodio
0.5 g
Rojo de fenol
0.17 g
1000 ml
Ninhidrina
7g
2-metoxi-etanol
100 ml
Hidroxido de potasio
40 g
Agua
100 ml
122
Tabla N 9. Continuacin.
Reactivo VP 25 ml
Reactivo ZYM A 8 ml
Reactivo ZYM B 8 ml
Alfa naftol
6g
Etanol
100 ml
Tris-hidroximetil-aminometano
25 g
HCl 37%
11 ml
10 g
Agua
100ml
Fast Blue BB
0.35 g
2-metoxi-etanol
100ml
123
PREPARACION DE LA MUESTRA:
Despus del aislamiento y verificacin de que la cepa a identificar
pertenece al gnero Streptococcus (tincin de Gram, Catalasa) anotar el
tipo de hemlisis que presenta y anotarlo en la hoja de identificacin API
como test N 21.
Tomar una colonia bien aislada y hacer una suspensin bien homognea
en 0.3 ml de agua destilada estril.
Inundar con la suspensin bacteriana una placa de Agar sangre.
Incubar 18 - 24 h a 35 37 C en anaerobiosis.
Los estreptococos B-hemolticos y los Enterococos forman colonias de
24 horas de incubacin. Para los otros estreptococos es preferible
analizar cepas de 48 horas.
Incubar a 18 h en anaerobiosis a 35 37 C.
Es preferible preparar 2 placas de cultivo cuando la cepa es susceptible
de ser un Pneumococo (para obtener crecimiento suficiente).
PREPARACION DE LA SUSPENSION BACTERIANA:
En 2 ml de agua destilada estril recoger la mayor cantidad de cultivo posible
con el fin de obtener una suspensin muy densa del cultivo.
124
125
126
REACCIONES/
RESULTADOS
EANZIMAS
VP
Piruvato
Produccin de
acetona
HIP
Hipurato
Hidrolisis
ESC
Esculina
PYRA
Pirrolidonil
2 naftilamina
NEGATIVO
POSITIVO
VP 1 + VP 2 hasta 10 mn
Incoloro
Rosa-Rojo
NIN hasta 10 mn
6-Bromo-2-Naftil
DPirrolidonilarilami
GAL
Incoloro
galactopiranosid
dasa
o
Naftol AS-BI
GUR
glucoronidasa
Incoloro
-D-glucoronato
2-Naftil- -D
GAL galactopiranosid Galactosidasa Incoloro o violeta palido
o
Violeta
Azul
Violeta
PAL
2-Naftil fosfato
Fosfatasa
alcalina
Violeta
LAP
L Leucina-2 naftil
Amida
Leucina
arilamidasa
Incoloro
Naranja
ADH
Arginina
Argninina
dihidrolasa
Amarillo
Rojo
4h
24h
RIB
Ribosa
Acidificacin
Rojo
Naranja/rojo
ARA
L- Arabinosa
Acidificacin
Rojo
Naranja/rojo
MAN
Manitol
Acidificacin
Rojo
Naranja/rojo
SOR
Sorbitol
Acidificacin
Rojo
Naranja/rojo
4h
Naranja/
Amarillo
Naranja/
Amarillo
Naranja/
Amarillo
Naranja/
Amarillo
24h
Amarillo
Amarillo
Amarillo
Amarillo
127
Lactosa
Acidificacin
Rojo
Naranja/rojo
TRE
Trehalosa
Acidificacin
Rojo
Naranja/rojo
INU
Inulina
Acidificacin
Rojo
Naranja/rojo
RAB
Rafinosa
Acidificacin
Rojo
Naranja/rojo
AMD
Almidon (2)
Acidificacin
Rojo
Naranja/rojo
GLYG
Glicgeno
Acidificacin
Rojo o Naranja
Naranja/
Amarillo
Amarillo
Naranja/
Amarillo
Amarillo
Naranja/ Amarillo
Naranja/
Amarillo
Amarillo
Naranja/
Amarillo
Amarillo
Amarillo
(1) En el caso de una segunda lectura a las 24 h, de incubacin, puede aparecer un deposito en las cpulas donde
se aadieron los reactivos ZYM A y ZYM . Este fenomeno es normal y no debe ser tenido en consideracin
(2) La acidificacin del almidon es con frecuencia menos fuerte que la de los otros azucares
150 ml
p-dimetilaminobenzaldehido
10 g
HCl
50 ml
128
129
130
131
132
PROCEDIMIENTO:
Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le aade unas gotas cuatro o cinco de
solucin indicadora de rojo de metilo. Se agita para homogenizar y se
observa la coloracin. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si
permanece amarillo.
Voges-Proskauer: A la otra porcin de cultivo se le aaden 0.6 ml del reactivo
A de Voges Proskauer (alfa-naftol 5% en etlico absoluto). El medio adquiere
un aspecto lechoso, y 0.2 ml del reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%).
Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente. Si la prueba es
positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violceo, ms o
menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es
negativa no aparece coloracin alguna (Fig. 32).
Fig. N 32: Prueba Voges Proskauer positiva (tubo izquierdo) y negativa (tubo
derecho). (6)
133
134
Bisel
K
AK
K
TSI
Fondo
A
A
A
Gas
++
H2 S
+
Urea
Indol
++
-
Rojo de
metilo
+
+
+
VP
Citrato
Movilidad
++
KA
A
A
A
+
+
+
-
-+
-+
-+
+
-+
+
+
+
-
-+
-+
-+
-+
-+
-+
-+
+-
+-
AK
+-
+-
K
K
A
A
-+
+
3+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
+
+
+-
135
MATERIALES Y EQUIPO:
Placas PETRIFILM estriles.
Pipetas estriles.
Frasco de dilucin estril.
Incubadora.
Cuenta colonias.
Aplicador PETRIFILM
PROCEDIMIENTO:
Pesar o pipetear la muestra en un contenedor estril adecuado (frasco de
dilucin).
Si es necesario, diluir la muestra en solucin salina estril (0.85 - 0.90%).
Mezclar u homogenizar la muestra, ajustar el pH de la muestra diluida
entre 6.6 y 7.2 (para productos cidos, usar NaOH 1 N, para productos
alcalinos usar HCl 1 N) auxilindose de papel pH o de un potencimetro.
Colocar la placa PETRIFILM en una superficie plana, levantar el film
superior.
Con una pipeta colocada de forma perpendicular a la placa de
PETRIFILM, colocar 1 ml de la muestra en el centro del film inferior.
Bajar el film superior con cuidado evitando introducir burbujas de aire, no
dejarlo caer.
136
Con la cara lisa hacia abajo, colocar el aplicador en el film superior sobre
el inoculo.
Con cuidado, ejercer presin sobre el aplicador para repartir el inoculo
sobre el rea circular antes de que se forme el gel.
No girar ni deslizar el aplicador.
Levantar el aplicador. Esperar al menos un minuto a que solidifique el gel.
INCUBACIN:
Se colocan las placas cara arriba en pilas de hasta 20 placas y luego el
tiempo de incubacin es 24 h a 35 C para la mayora de muestras.
LECTURA:
Las placas PETRIFILM pueden leerse con un contador de colonias estndar
o con otra lente de aumento iluminada (Fig. 34), para la cuantificacin de
bacterias seguir los mismos parmetros que para conteo de UFC en este
manual.
137
de
bacterias
homofermentativas,
las
colonias
con
gas
138
139
PROCEDIMIENTO:
Se sigue el mismo procedimiento que para PETRIFILM Coliformes en este
manual (10.2.7).
INCUBACIN:
32 35 C por 24 h
LECTURA:
Las colonias de E. coli se observan de color azul con gas (Fig. 36).
140
MATERIALES Y EQUIPO:
Placas PETRIFILM estriles.
Pipetas estriles.
Frasco de dilucin estril.
Incubadora.
Cuenta colonias.
PROCEDIMIENTO:
Se sigue el mismo procedimiento que para placas PETRIFILM Coliformes
en este manual (10.2.7).
INCUBACIN:
Se incuban bajo una temperatura de 35 37 C por 24 h.
LECTURA:
Colonias rojas con gas, colonias con zona amarilla y colonias rojas con zona
amarilla y gas, son tpicas de enterobacteriaceas patgenas y lactosa
negativa como Salmonella, Shigella y Yersinia (Fig. 37).
141
142
NMP
0
2.2
5.1
9.2
16.0
Indeterminado
MATERIALES Y EQUIPO:
Incubadora a 35 37 C + 0.5 C 44 + 0.5 C
Tubos con rosca preesterilizados conteniendo campanas de Durham
Gradillas para tubos
Pipetas estriles
Frascos estriles para muestreo
PROCEDIMIENTO:
El procedimiento se divide en las dos pruebas siguientes:
PRUEBA PRESUNTIVA: (16)
Ordene tres filas de cinco tubos con tapn de rosca y conteniendo una
campana de Durham por tubo cada uno, rotular para cinco tubos de la
143
(13)
en
144
(13)
para la confirmacin
145
5 de 1 ml
c/u
0
0
1
2
0
0
1
1
2
0
0
1
1
2
3
0
0
1
1
2
2
3
0
0
1
1
1
2
5 de 0.1
ml c/u
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
5
NMP
26
27
33
34
23
31
43
33
46
63
49
70
94
79
109
141
175
130
172
221
278
345
240
348
542
918
1609
> 2400
146
147
148
149
se llenar la
150
instrucciones:
Reincubar la galera 24 h 2h suplementarias sin volver a aadir reactivos.
Revelar los ensayos que precisan adicin de reactivos (como se explic
anteriormente).
INTERPRETACIN:
La identificacin se obtiene a partir del perfil numrico.
Determinacin del perfil numrico:
En la hoja de resultados, los test estn separados en grupos de tres y se
indica para cada uno un valor de 1, 2 o 4. Como la galera API 20 E comporta
20 ensayos sumando al anterior de cada grupo los valores que corresponden
a reacciones positivas, se obtiene un perfil numrico de 7 cifras (a la reaccin
de la oxidasa que constituye el test N 21 se le asigna el valor de 4 cuando
resulta positiva). Localizar el perfil numrico en la lista de los perfiles.
151
SUSTRATOS
REACCIONES
/ENZIMAS
ONPG
Ortonitrofenolgalactsido
B- galactosidasa
ADH
Arginina
LDC
Lisina
ODC
Ornitina
CIT
Citrato sodico
Utilizacin del
citrato
URE
Tiosulfato
sdico
Urea
Produccin de
H2S
Ureasa
TDA
Triptofano
Triptofano
desaminasa
H2S
Arginina
dehidrolasa
Lisina
descarboxilasa
Ornitina
descarboxilasa
IND
Triptofano
Produccin de
indol
VP
Piruvato sodico
Produccin de
Acetona
GEL
Gelatina de
Kohn
Gelatinasa
GLU
Glucosa
MAN
Manitol
INO
Inositol
SOR
Sorbitol
RHA
Samnosa
SAC
Sacarosa
MEL
Selibiosa
AMY
Amigdalina
Fermentacin/oxi
dacin (4)
Fermentacin/oxi
dacin(4)
Fermentacin/oxi
dacin(4)
Fermentacin/oxi
dacin(4)
Fermentacin/oxi
dacin(4)
Fermentacin/oxi
dacin(4)
Fermentacin/oxi
dacin(4)
Fermentacin/oxi
dacin(4)
RESULTADOS
NEGATIVO
POSITIVO
Incoloro
Amarillo(1)
Amarillo
Rojo/naranja (2)
Amarillo
Naranja(2)
Amarillo
Rojo/naranja(2)
Verde
Palido/amarill
o
Incoloro
grisaceo
Amarillo
Azulverde/azul(3)
Deposito negro
Rojo/Naranja(2)
TDA /inmediato
Amarillo
Marrn oscuro
TDA /inmediato
Amarillo
Marrn oscuro
JAMES inmediato o IND/2 min
James rosa
Incoloro verde
IND anillo
claro/amarillo
rojo(5)
No hay difusin
Difusin de
de pigmento
pigmento
negro
Negro
Azul/azul verdoso
Amarillo
Azul/azul verdoso
Amarillo
Azul/azul verdoso
Amarillo
Azul/azul verdoso
Amarillo
Azul/azul verdoso
Amarillo
Azul/azul verdoso
amarillo
Azul/azul verdoso
Amarillo
Azul/azul verdoso
Amarillo
152
Arabinosa
OX
Sobre de
papel filtro
NO3
NO2
MBO
MCC
OF
Fermentacin/oxi
dacin(4)
Citocromo
oxidasa
Produccin de
NO2 reduccin a
gas N2
Tubo GLU
APImicrosco
pia
MedioMacCo
nkey
Glucosa API
OF
Azul/azul verdoso
Amarillo
OX / 1-2 min.
Incoloro
Rosado/rojo
Rojo
Movilidad
Inmvil
Mvil
Crecimiento
Ausencia
Presencia
Cerrado
fermentacin
Verde
Amarillo
como
ejemplo
tenemos:
Pseudomona,
Acinetobacter,
153
PREPARACION DE LA GALERIA:
El equipo y los reactivos deben estar a temperatura ambiente.
Preparar una cmara de incubacin con su tapa correspondiente.
Repartir 5 ml de agua destilada estril en la cmara para tener una
atmsfera humedad.
PREPARACIN DE LA SUSPENSION BACTERIANA:
Con ayuda de un aplicador estril tomar las colonias seleccionadas.
Resuspender la colonia en un tubo que contenga 2 ml de agua destilada
estril hasta obtener una suspensin homognea.
INOCULACIN DE LA GALERIA API 20 NE:
Con ayuda de una pipeta estril tomar una alcuota de la suspensin
bacteriana y llenar los microtubos de la galera de izquierda a derecha
hasta el borde del menisco y hasta la prueba rotulada como PNPG.
Abrir una ampolla de AUX Mdium (Medio de cultivo especifico incluido
en la galera API) y transferir una alcuota de la suspensin bacteriana,
homogenizar perfectamente y llenar los microtubos restantes hasta la
cpula.
A las pruebas subrayadas, adicionar unas gotas de aceite mineral.
Colocar la tapa e incubar a 30 C durante 24 h.
154
SUBSTRATOS
REACCIONES/
ANZIMAS
Reduccin
de
nitratos a nitritos
NO3
Nitrato de potasio
Reduccin
de
nitratos a azoe
Formacin
indol
de
RESULTADOS
NEGATIVO
POSITIVO
NIT 1 + NIT 2/5 mn.
Incoloro
Zn /5mn
Rosa
James inmediato
Incoloro
verde
plido
Azul verde
TRP
Triptofano
GLU
Glucosa
ADH
Arginina
URE
Urea
Ureasa
Amarillo
ESC
Esculina
Hidrlisis(Bglucosidasa)
Amarillo
Fermentacin
Arginina
dehidrolasa
Rosa-rojo
Amarillo
Incoloro
Rosa
Amarillo
Naranja, rosa
rojo
Naranja rosa
rojo
Gris, marrn,
negro
155
Gelatina(con
china
tinta
p-nitro-fenil-BD
galactopiranosido
Glucosa
Arabinosa
Manosa
Manitol
N-acetilglucosamina
maltosa
Gluconato
Caprato
Adipato
Malato
Citrato
Fenil-acetato
Tetrametil-pfenilendiamina
Hidrlisis
proteasa
B- galactosidasa
Difusin del
pigmento
negro
Amarillo
Asimilacion
Asimilacin
Asimilacin
Asimilacin
Transparencia
transparencia
Transparencia
Transparencia
Turbidez
Turbidez
Turbidez
Turbidez
Asimilacin
Transparencia
Turbidez
Asimilacin
Asimilacin
Asimilacin
Asimilacin
Asimilacin
Asimilacin
Asimilacin
Citocromo
oxidasa
Transparencia
Transparencia
Transparencia
Transparencia
Transparencia
Transparencia
Transparencia
Turbidez
Turbidez
Turbidez
Turbidez
Turbidez
Turbidez
Turbidez
Incoloro
Violeta
156
157
158
(2).
159
Seque al aire
160
161
(+)
GRAM
(-)
PATOGENAS
UTILIZADAS
MICROBIOLOGA GENERAL.
13.1 Bacterias Gram (+)
EN
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
14.
ESQUEMATIZACIN
DE
TCNICAS
MICROBIOLOGICAS
177
178
Cultivo bacteriano
(2)
179
1 ml
1 ml
0.50 ml de
plasma de
conejo
Prueba negativa: No se
observa formacin de
coagulo despus de 6
horas.
Prueba positiva: se
observa la formacin
de un coagulo
180
181
182
183
Pesar 10 g de muestra o
10 ml de muestra,
agregar 90 ml de Buffer
fosfato y mezclar durante
2 minutos.
184
(3)
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
16.
ESQUEMATIZACIN
DE
TCNICAS
DE
IDENTIFICACIN
196
197
HONGOS
PATOGENOS
UTILIZADOS
EN
MICROBIOLOGA
GENERAL.
17.1 Morfologas microscpicas.
198
199
200
201
202
203
204
205
206
207
V CONCLUSIONES
208
5 CONCLUSIONES
209
210
VI RECOMENDACIONES
211
6.0 RECOMENDACIONES
212
BIBLIOGRAFIA
213
BIBLIOGRAFIA
214
8. JacKson G. F.D.A., 2005 Center for Food Safety & Applied Nutrition,
Microscopic examination of foods and care and use of the microscope
(en linea), consultado en Septiembre de 2006, disponible en:
rim/kwg/las/dav/cjm.
215
noviembre
2004,
disponible
en:
MEDFAR:ORG/ATLAS/
ATLAS.ASP
16. O.P.S. sa. Gua para la calidad del agua potable. Washington DC. 132
Pg.
17. Sampieri R. y otros, 1998, Metodologa de la Investigacin, 2 ed. McGrawhill, Mxico DF. 203-208 Pg.
216
en
Septiembre
de
2006,
Disponible
en
http//www.doctorfungus.org.
217
GLOSARIO
218
GLOSARIO
Agar-Agar(5): extrado de algas rojas (Ej. gelidium), del cual existen
versiones ms o menos purificadas, las ms puras estn enriquecidas con el
polisacrido agarosa; son las que se emplean para los medios de cultivo, con
objeto de evitar la introduccin de sustancias "contaminantes" inadvertidas
que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la
bacteria.
Anaerobiosis
(5):
(11):
219
Colonia
(5):
(11):
de
Microbiologa
(11):
Todo
Laboratorio
que
realice
220
Medio de Cultivo
(5):
(11):
(5):
221
Organismo
(5):
[H+] la
(5):
el cultivo de bacterias.
Toxina
(5):
222
ANEXOS
223
ANEXO 1
ENCUESTA
UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR
FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y CONTAMINACION AMBIENTAL
224
225
226
ANEXO 2
INTERPRETACIN DE RESULTADOS API STAPH
LISTA DE PERFILES
227
ANEXO 3
INTERPRETACION DE RESULTADOS API 20 STREP
LISTA DE PERFILES
ANEXO 4
INTERPRETACIN DE RESULTADOS API 20 E
LISTA DE PERFILES
228
229
ANEXO 5
INTERPRETACIN DE RESULTADOS API 20 NE
LISTA DE PERFILES
ANEXO 6
HOJA DE RESULTADOS API 20 E
230
ANEXO 7
HOJA DE RESULTADOS API 20 NE
231
ANEXO 8
HOJA DE RESULTADOS API STAPH
232
ANEXO 9
HOJA DE RESULTADOS API STREP
233