Pontificia Universidad Catlica de Valparaso

Facultad de Ciencias Bsicas y Matemticas

Instituto de Biologa

LABORATORIO
ESTIMACIN DEL NMERO CELULAR Y VIABILIDAD CELULAR.
El nmero celular puede ser determinado por diferentes mtodos, dentro de los cuales
encontramos manuales y automatizados.
Dentro de los mtodos manuales podemos encontrar por ejemplo la determinacin del
nmero de clulas en los diferentes campos del microscopio y comparar este nmero con un
estndar conocido que ha sido determinado en una placa de cultivo de tejidos (conteo simple por
campo). Otro ejemplo de conteo manual es la utilizacin de un hemocitmetro, el cual permite
obtener un nmero estimativo del nmero celular por recuento directo. El conteo en hemocitmetro
es una forma directa de hacerlo utilizando el microscopio. Un ejemplo de ello, es la Cmara de
Neubauer, la que consiste en un portaobjeto grueso con una excavacin central, donde hay 16
cuadrados dibujados que slo son visibles al microscopio.
Dentro de los mtodos automatizados encontramos el contador Coulter, que se utiliza para
estimar el nmero de clulas que se encuentran presentes en una muestra, siendo su caracterstica
principal utilizarlo cuando el nmero celular es elevado (contador electrnico).
Existen diversos mtodos para determinar la viabilidad celular de una muestra. Uno de los
ms utilizados es el azul de tripn. Este es un coloide que difunde por la membrana de aquellas
clulas que estn muertas, tindola de color azul. Aquellas clulas que estn vivas no sern teidas
y por lo tanto, no presentarn el color al ser observadas al microscopio.
OBJETIVOS
Aprender a contar clulas a travs de un mtodo de recuento directo.
Comprender el fundamento de la tcnica del azul de tripn.
Profundizar sus conocimientos de conteo y viabilidad celular.
Reconocer y caracterizar clulas viables y no viables.
CONOCIMIENTOS PREVIOS
Caractersticas fisiolgicas en el metabolismo de levaduras.
Crecimiento sigmoideo. Etapas de crecimiento de una poblacin celular.
Palabras claves: Rango de tolerancia, cambio diuxico.
ACTIVIDAD PRCTICA
Preparacin de la cmara. Ponga un cubreobjetos sobre la excavacin central y deposite 10 ul de la
muestra entre los vidrios por capilaridad.
Observe al microscopio, inicialmente con el aumento menor para ubicar la cuadrcula y luego con
ms aumento para contar las clulas.
Elija los 4 cuadrantes de las esquinas y cuente las clulas presentes en 4 cuadros pequeos de cada
cuadrante y finalmente saque el promedio de estos conteos. En cuanto a las clulas que se
encuentran sobre los bordes, se cuentan slo las que estn sobre el borde superior y el lateral
izquierdo. De esta forma, se evita contar clulas ms de una vez.
Cada cuadro pequeo tiene un volumen de 0,1 ul, por lo tanto, si sabemos cuntas clulas
hay en ese volumen, basta multiplicar por 10.000 para obtener el total por ml.

Si la muestra est muy concentrada se dificulta el conteo. En este caso se debe diluir una
alcuota de la muestra, considerando el factor de dilucin al momento del clculo de clulas
por ml.
Fd

volumen total/Volumen de alcuota

Ejemplo: Si se tomaron 10 ul de la muestra y se diluyeron en 90 ul de agua

destilada, el factor de dilucin es 10 y si al contar los promedio de 7.5, el nmero total de
clulas por ml es: 7.5 x 10000 x 10.
VIABILIDAD CELULAR
A partir de un stock de levaduras prepare cuatro muestras:
Muestra A: Extraer del stock, y realizar la dilucin que se le indicar, posteriormente
llevarlas a 70 C por 15 minutos.
Muestra B: Extraer del stock, y realizar la dilucin que se le indicar, posteriormente
llevarlas a -20C por 15 minutos
Muestra C: Extraer del stock 20 ul de levaduras y resuspenderlas en etanol para que la
solucin tenga una concentracin final de 70%.
Muestra D: Extraer del stock 20 ul de levaduras y resuspenderlas en etanol para que la
solucin tenga una concentracin final de 35%.
Realizar una dilucin de la muestra: azul de tripan 1:1 en un tubo eppendorf. Agitar y dejar
incubar por 5 minutos
Homogeneizar con la micropipeta y tomar una alcuota de 10 ul, la cual ser transferida a un
hemocitmetro en donde se contar las clulas bajo el microscopio con un aumento de 100x
Contar el total de clulas en los cuatro cuadrados en las esquinas de cada cmara y luego
contar slo las clulas azules (clulas muertas).
Establecer el nmero total de clulas, las viables y las muertas.
Luego determinar el porcentaje de viabilidad de acuerdo a la siguiente frmula:
% de viabilidad = N Total de clulas por campo - N clulas teidas x100
N Total de clulas por campo

BIBLIOGRAFA
1
2

H. Lodish, A. Berk, L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore , J. Darnerll, 2002.

Biologa Celular y Molecular. Editorial Mdica Panamericana. Madrid-Espaa.

B. Albert, D. Bray, J. Lewis, 2000. Biologa Molecular de la Clula. Ediciones

Omega S.A., Barcelona.

Farmacologa Molecular: Receptores, transduccin de seales y activacin de
genes, 2000. Marcelo Kazanietz. Ed. Universidad Nacional de Quilmes Argentina.

1
2

De Robertis y De Robertis, 1991. Biologa Celular y Molecular. 11 Edicin, El

Ateneo, Buenos Aires.

J. Kurjan y B. Taylor, 1993. Signal Transduction. Academic Press Inc. N.Y.

Abbas Abul K., A. H. Lichtman & Pober J. Inmunologa Celular y Molecular. 4
Edicin, 2002. Ed. McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, Espaa