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MICROBIOLOGIA CLINICA
Curso de Farmcia
FaculdadeMetropolitana de Anpolis
ProfTiago Lopes da Silva
30 de setembro de 2016
ANPOLIS-GO
2016
INTRODUO
No Reino Monera considera-se inclusos os organismos vivos procariontes, ou seja: sem
carioteca. Outras diferenas entre procariontes e eucariontes consistem nos primeiros
possurem um simples cromossomo, constitudo por uma nica molcula circular de DNA,
sendo o genoma organizado neste.
Bactrias so representadas por bactrias, cianobactrias, rickttsias (parasitas intracelulares
minsculos!) e micoplasmas (os menores organismos capazes de se autorreplicar). Quanto s
bactrias, a membrana plasmtica recoberta pela parede celular e, em algumas espcies, h
a presena de uma cpsula. A parede celular que auxilia na classificao das Bactrias, uma
vez que so responsveis pela suscetibilidade a doenas e colorao pelo mtodo de Gram. As
Gram-positivas so sensveis sulfa e possuem parede formada basicamente de uma s
camada, colorando de cor violeta na Colorao de Gram; as Gram-negativas so sensveis
penicilina, possuem parede formada de duas camadas e ficam com cor rosa ao serem coradas.
Essas ltimas so consideradas mais perigosas, uma vez que suas paredes so menos
permeveis a antibiticos.
Bactrias so organismos microscpicos formados por uma nica clula (unicelulares). Existem
bactrias por todo o planeta, seja na gua, no solo ou em habitats altamente hostis, como lixo
radioativo, em reas profundas da crosta terrestre ou no pH altamente cido do nosso
estmago. A maioria das bactrias no causa doenas, porm, um pequeno nmero
responsvel por infeces comuns na prtica clnica.
Cada bactria transmitida de uma maneira diferente. Doenas como meningite, tuberculose e
coqueluche so transmitidas atravs de secrees respiratrias, como tosse ou perdigotos.
Doenas sexualmente transmissveis, como a gonorreia e a sfilis so, como o prprio nome
diz, transmitidas pelo ato sexual. H ainda as bactrias adquiridas atravs de alimentos mal
conservados, causando intoxicao alimentar, como nos casos da Salmonela e da Shigella.
A maioria das bactrias so heterotrficas, isto , no conseguem produzir sua prpria comida
e precisam obt-la no ambiente ou em outros organismos. Existem tambm bactrias
autotrficas, que conseguem produzir sua prpria comida, geralmente por meio da
fotossntese.
O mtodo mais simples de classificao das bactrias atravs da sua forma. Existem 3
grandes grupos:
MICROBIOLOGIA CLINICA
I - Staphylococcus spp.
As bactrias Gram-positivas, especialmente os cocos, esto entre os microrganismos mais
freqentemente isolados de amostras biolgicas humanas em laboratrios de microbiologia.
A famlia Micrococcaceae inclui quatro gneros:
Planococcus;
Micrococcus;
Stomatococcus;
Staphylococcus.
O gnero Staphylococcus composto de 37 espcies, 17 delas podem ser isoladas de
amostras biolgicas humanas (Quadro 1).
Os estafilococos so geralmente encontrados na pele e mucosas do homem e de outros
animais. Muitas espcies so isoladas de partes especficas do corpo humano ou de certos
animais, por exemplo: S. auricularis encontrado como parte da microbiota humana do conduto
auditivo e S. hyicuscausando dermatite infecciosa em sunos. Os estafilococos so cocos
Gram-positivos, podem se apresentar isolados ou aos pares, em cadeias curtas ou agrupados.
O aspecto macroscpico da colnia em meio slido, presena de pigmento e hemlise em gar
sangue de carneiro so caractersticas auxiliares na identificao destes microrganismos. So
imveis, anaerbios facultativos, no formadores de esporos e produtores de catalase.
Rotineiramente, o teste da catalase utilizado para diferenciar os estafilococos (catalase
positiva) dos estreptococos (catalase negativa). Entretanto, existem relatos na literatura
de Staphylococcus aureus catalasenegativa relacionados a processos infecciosos, embora
raros, descritos em vrios pases, inclusive no Brasil. A catalase constitui um mecanismo de
defesa para a bactria contra clulas fagocitrias, porm no um fator essencial para a
sobrevivncia do S. aureus.
A identificao da espcie de estafilococos baseada em uma variedade de caractersticas
fenotpicas convencionais. As espcies mais importantes do ponto de vista clnico podem ser
identificadas com algumas provas especficas, como pigmentao da colnia, estafilocoagulase, fator clumping ou fator de agregao, prova da desoxiribonuclease, resistncia
novobiocina, fermentao do manitol, entre outras. A habilidade de coagular o plasma continua
sendo o critrio mais aceito e utilizado para identificar estafilococos patognicos associados
com infeces agudas, em geral, S. aureus em humanos e animais e S. intermedius e S.
hyicus em animais.
A acurcia dos sistemas comerciais disponveis (Vitek, MicroScan, Phoenix, API StaphIdent-System, Staph-Zym, API-Staph-Trac, Minitek e outros) para identificao das
espcies de estafilococos varia consideravelmente entre os estudos publicados. Atualmente,
mtodos de identificao por reao de cadeia de polimerase (PCR) so utilizados, apesar de
no estarem disponveis para a maioria dos laboratrios de rotina.
2. Importncia clnica
Os estafilococos esto entre os agentes mais freqentemente relacionados a enfermidades
humanas. Os processos infecciosos mais comuns incluem:
Pneumonias;
Bacteremias;
Infeces de pele e tecidos moles;
Infeces relacionadas ao uso de prteses e cateteres venosos;
Meningites.
A colonizao pode ser transitria ou persistente e pode se prolongar por longos perodos. Em
algumas populaes especficas, como usurios de drogas endovenosas, pacientes portadores
de diabetes mellitus, pacientes em uso de cateteres venosos de longa permanncia e
trabalhadores da rea da sade, este microrganismo mais freqentemente encontrado como
colonizante. Estes patgenos apresentam grande facilidade em se disseminar nos ambientes
intra e inter-hospitalares, pela facilidade de sobreviver no meio ambiente.
O grupo conhecido como estafilococos coagulase negativa freqentemente era considerado
como contaminante no material clnico; entretanto, nos ltimos quinze a vinte anos houve um
aumento na incidncia de infeces de corrente sangunea por estes agentes e
correlacionadas com aumento da mortalidade e morbidade. A espcie coagulase negativa mais
freqentemente isolada o Staphylococcusepidermidis, geralmente associadas ao uso de
materiais protticos e cateteres e so mais prevalentes em pacientes imunodeprimidos. A
segunda espcie mais prevalente o Staphylococcushaemolyticus relacionada a endocardites,
sepse, peritonite, entre outros quadros infecciosos. A espcie S. saprophyticus merece meno
especial por ser um patgeno bem documentado e a segunda causa mais freqente de cistites
em mulheres jovens.
Nos ltimos vinte anos, devido ao aumento da prevalncia de infeces causadas
por Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase negativa resistentes
oxacilina, elevou-se o uso de glicopeptdeos, em especial a vancomicina. O primeiro relato de
resistncia vancomicina emStaphylococcus coagulase negativa ocorreu em 1979, mas sem
grande repercusso devido baixa correlao com infeces clnicas. Para S. aureus, o
primeiro relato com resistncia intermediria vancomicina (VISA ou GISA) foi em 1997 no
Japo; desde ento vrios casos foram relatados no mundo inteiro, inclusive no Brasil. Em
todos estes casos os pacientes fizeram uso prolongado de vancomicina com presena de subpopulaesresistentes denominado VISA heterogneo.
Este fenmeno ocorre tambm in vitro, j que os glicopeptdeos exercem uma presso seletiva
que favorece o aparecimento de clones resistentes. Mais recentemente (2002), foram descritos
nos Estados Unidos os primeiros casos de infeco por Staphylococcus aureus resistentes
vancomicina (VRSA) obtida a partir da aquisio, por plasmdeo, do gene vanA de enterococos
resistente vancomicina. No Brasil, h descrio apenas de casos isolados com sensibilidade
intermediria vancomicina.
Recentemente, vrios relatos de infeces de pele e tecidos moles relacionadas a cepas de S.
aureus resistentes meticilina adquiridos na comunidade, denominados (CA-MRSA),
demonstraram caractersticas diferentes dos isolados de S. aureus resistentes meticilina
adquiridos no hospital (HA-MRSA). CA-MRSA apresenta-se mais sensvel a vrias classes de
antimicrobianos, principalmente aos no -lactmicos. Isto pode ser explicado pelo fato da
4. Identificao
Este item tem como objetivo a instruo para realizao dos principais testes manuais para
identificao da famlia Micrococcaceae. Porm, mtodos automatizados citados anteriormente
tambm podem ser utilizados.
Prova da catalase
Finalidade:
Verificar a presena da enzima catalase que decompe H2O2 em gua e O2 e, desta forma,
distinguir os grupos estafilococos e estreptococos.
Procedimento:
Com ala bacteriolgica, retirar uma colnia do meio de cultura (preferencialmente no retirar
colnias crescidas em gar sangue porque os fragmentos podem se misturar com as colnias
e produzir um resultado falso-positivo). Colocar a colnia sobre uma lmina de vidro e
adicionar uma gota de H2O2 a 3%.
Leitura:
Observar a formao de bolhas.
Interpretao:
Formao de bolhas indica ser a
famlia Microccocaceae (Ex.: Staphylococcus spp.,Micrococcus spp., Planococcus spp.,
Stomatococcus spp.);
Sem formao de bolhas indica ser a
famlia Streptococcacea (Ex.: Enterococcus spp.,Streptococcus spp., Aerococcus spp.,
Gemella spp., Leuconostoc spp., Lactococcus spp.)
Prova da coagulase
A Em tubo
Finalidade:
Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada, que,
reagindo com um fator plasmtico, forma um complexo que atua no fibrinognio do plasma
formando a fibrina.
Procedimento:
Colocar 0,5 mL de plasma em tubo de ensaio;
Adicionar uma alada de colnia diretamente no plasma de coelho com EDTA;
Incubar por 4 h a 352C em estufa ou banho-maria; caso no haja formao de cogulo,
incubar por 24 h.
Leitura:
Formao de cogulo observada pela inclinao suave.
Interpretao:
Formao de cogulo inteira ou parcial, identifica Staphylococcus aureus;
No h formao de cogulo, identifica Staphylococcus coagulase negativa.
B - Em lmina
Finalidade:
Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) ligada na superfcie da
parede celular, que reagindo com o fibrinognio do plasma, causa a coagulao do mesmo.
Procedimento:
Colocar 2 gotas de salina em uma lmina;
Emulsionar uma colnia isolada a ser testada;
Colocar uma gota de plasma e misturar.
No se recomenda realizar o teste a partir de um gar com grande concentrao de sal como,
por exemplo, o gar manitol.
Leitura:
Formao de grumos em 10 segundos.
Interpretao:
Formao de cogulo ou grumos, identifica Staphylococcus aureus;
No h formao de cogulo ou grumos, identifica Staphylococcus coagulase negativa.
Cloxacilina;
Dicloxacilina.
Quando um isolado for resistente oxacilina, deve ser considerado resistente a todas as
drogas desta classe.
Staphylococcus aureus resistente oxacilina denominado de ORSA (oxacillinresistant S.
aureus) ou MRSA (methicillinresistant S. aureus).
Trs mecanismos podem estar envolvidos na resistncia oxacilina, sendo que as
caractersticas fenotpicas so distintas e apresentadas no Quadro 4.
1. Introduo
As bactrias do gnero Streptococcus so capazes de causar diversas doenas nos seres
humanos. Dentre as mais freqentes esto as infeces do trato respiratrio, pele e tecidos
moles, endocardites, sepse e meningites. Streptococcuspneumoniae, o pneumococo, um dos
agentes que mais freqentemente causam doenas invasivas graves, como meningite e
bacteremia.
Os estreptococos, da famlia Streptococcaceae so caracterizados como cocos Gram-positivos,
anaerbios facultativos, no produtores de catalase e de citocromo-oxidase. Os estreptococos
com relevncia clnica so homofermentadores, sendo o cido ltico o produto final da
fermentao da glicose. Podem produzir hemolisinas, e os tipos de reao hemoltica em meio
slido contendo 5% de sangue de carneiro, descritos a seguir, tm sido utilizados na
classificao de estreptococos.
Os estreptococos requerem meios ricos para o crescimento in vitro e algumas cepas dependem
do CO2 para o seu isolamento a partir de material clnico (isolamento primrio). Em meios de
cultura slidos, as colnias de S. pneumoniae so lisas, pequenas, brilhantes, cncavas,
podendo exibir uma zona de depresso central causada por uma autlise parcial das clulas
bacterianas. Se o meio de cultura contiver sangue, principalmente de carneiro, as colnias
sero circundadas por um halo esverdeado de hemlise parcial ou hemlise alfa.
Figura 15 - -hemlise
Figura 16 - -hemlise
Figura 17 -
-hemlise
Pneumococos no possuem a enzima catalase a autlise pode ser aumentada pela adio de
sais biliares ao meio de cultura. Como so lisados facilmente por detergentes fracos, como a
bile, desoxicolato de sdio e optoquina, esta caracterstica til para distingui-los de outras
bactrias. As colnias de Streptococcus -hemolticos dos grupos A, C e G so relativamente
grandes quando comparadas com as colnias pontuais de outras cepas -hemolticas
(grupo S.milleri). Eventualmente colnias do S. pyogenes podem ser mucides.
Quanto s caractersticas das clulas, os pneumococos so Gram-positivos, com morfologia de
diplococos lanceolados, ou seja, com as extremidades em ponta de lana ou em chama de
vela. Medem 0,5 a 1,25 m de dimetro e dispem-se aos pares (diplococos), em razo de sua
diviso em apenas um plano, ou em cadeias curtas. So imveis (sem flagelos), no formam
esporos e podem possuir cpsula, o seu principal fator de patogenicidade. Podem perder a
caracterstica de Gram-positivos quando o cultivo ultrapassa a fase logartmica, perodo mais
ativo do crescimento bacteriano.
2. Importncia clnica
A quantidade desta bactria na nasofaringe geralmente limitada pela competio com os
outros componentes da microbiota local e pelos mecanismos inespecficos de defesa do
hospedeiro, como movimento muco-ciliar, tosse, coriza e reflexo epiglotal, os quais previnem a
penetrao do pneumococo atravs do epitlio do sistema respiratrio superior. De modo geral,
a aquisio do pneumococo na nasofaringe comea logo aps o nascimento, atinge a taxa
mxima nas crianas de pr-escola e diminui com o avanar da idade. Praticamente todas as
pessoas j foram colonizadas por esta bactria em algum estgio da vida. A taxa de isolamento
de pneumococos da nasofaringe de indivduos saudveis, isto a taxa de portadores, varia de
20% a 40% e o estado de portador mais freqente nos meses de inverno.
A pneumonia a mais freqente das doenas pneumoccicas, sendo considerada uma das
doenas mais incidentes e graves que acometem o homem. Atinge todas as faixas etrias,
principalmente crianas e idosos.
A bacteremia pneumoccica pode ocorrer em associao com uma simples faringite ou sepse
fulminante, com prpura e hemorragia da adrenal (sndrome de Waterhouse-Friderichsen). a
manifestao clnica mais freqente em crianas, que pode evoluir para meningite,
principalmente entre aquelas menores de dois anos de idade. Na maioria dos adultos com
bacteremia pneumoccica h associao com pneumonia.
A meningite pneumoccica a complicao mais comum decorrente de sinusite, mastoidite,
otite ou pneumonia. A meningite pneumoccica atinge percentuais bastante elevados de
letalidade (acima de 30%) alm de causar seqelas graves.
A otite mdia aguda est associada grande morbidade em crianas menores de cinco anos,
incluindo perda auditiva. Nos Estados Unidos da Amrica, a causa mais freqente das
consultas peditricas.
Menos freqentemente o pneumococo causa artrite sptica e peritonite. Geralmente migra para
a articulao durante a bacteremia de foco pulmonar, de meninges e de endocardite
bacteriana, ou para a cavidade peritoneal em associao com hepatopatias.
s vacinas j existentes (23-valente no conjugada e 7-valente conjugada) tm como antgeno
os sorotipos, 23 e 7 sorotipos, respectivamente, que mais freqentemente causam doena.
Como a distribuio destes sorotipos varia entre as regies geogrficas, faixas etrias e ao
longo do tempo, muito importante sob o ponto de vista epidemiolgico que se conheam os
sorotipos prevalentes.
Os estudos de avaliao da vacina conjugada indicam que protege contra doena
pneumoccica invasiva causada pelos sorotipos componentes da vacina. Alm da proteo,
reduz a taxa de colonizao ou de portadores, inclusive em outras faixas etrias, diminuindo
assim a disseminao da bactria e induzindo imunidade coletiva ou imunidade de rebanho.
3. Isolamento
Em doenas invasivas, o S. pneumoniae pode ser isolado de diferentes lquidos normalmente
estreis, como lquido cefalorraquidiano (LCR), sangue, lquidos pleural, asctico e sinovial, e
em secrees de abscessos, entre outros. Os meios de cultura apropriados so essenciais
para o sucesso do isolamento e caracterizao dos pneumococos e esto citados a seguir.
de cultura
Base para os meios de cultura:
As bases recomendadas para o isolamento e subseqente cultivo do pneumococo so meios
complexos, como Meller-Hinton (MH), Columbia, TrypticaseSoy (TS), Brain Heart
Infusion (BHI),Blood Agar Base (BAB). Quando slidos, contm gar. Devem ser acrescidos
de 5% ou 10% de sangue desfibrinado estril de carneiro, coelho ou cavalo.
gar chocolate:
Este meio rico e suporta as exigncias nutritivas para o isolamento de S. pneumoniae,
quando incubado em atmosfera de 5 - 7% CO2. Acrescenta-se base aquecida a 80 - 85C,
10% de sangue, freqentemente de cavalo. Distribuir em tubos ou frascos inclinado ou em
placas de Petri. Semear na sua superfcie. Tambm usado para conservao das bactrias
por tempo curto, em torno de uma semana. Pode ser utilizado para o transporte, para o envio
a outro laboratrio, de preferncia inclinado em frasco tipo penicilina bem vedado.
Meio para hemocultura:
Caldo preparado com TS ou BHI acrescido de 0,025% de sulfonato de polianetol de sdico
(SPS), um inibidor qumico e tambm anticoagulante. O frasco peditrico de hemocultura
deve conter 20 mL e o de adulto, 50 mL do meio. A diluio do sangue no caldo e a adio de
SPS geralmente bastam para neutralizar as propriedades bactericidas do sangue.
Comercialmente, h vrios meios de cultura para hemocultura, inclusive para os sistemas de
monitorizao contnua automatizados, e a boa qualidade essencial. A cada novo lote ou
marca, como para todos os meios, deve-se proceder a um controle de qualidade.
gar sangue:
Acrescentar o sangue base morna (45 - 50C) e distribuir em placas. Para a observao da
hemlise e alguns testes de identificao de S. pneumoniae, a recomendao que o sangue
seja de carneiro em Blood Agar Base.
Leite desnatado a 10 - 20% em gua:
Para estocar cepas a -20C ou -70C ou para liofiliz-las.
gar Meller-Hinton sangue de carneiro a 5%:
Recomendado para realizao dos testes de suscetibilidade aos antimicrobianos por difuso
em discos, mtodo de Bauer-Kirby, devido boa reprodutibilidade dos resultados e baixa
concentrao de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim, tetraciclina, timidina e timina.
Caldo Meller-Hinton com ajuste de ctions e 2,5 a 5% de sangue lisado de cavalo:
Caldo recomendado para os testes de suscetibilidade aos antimicrobianos pelo mtodo da
concentrao inibitria mnima, (CIM), pela boa reprodutibilidade dos resultados e baixa
concentrao de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim, tetraciclina, timidina e timina. A
concentrao final de Ca++ 20 - 25 mg/L e de Mg++, 10 a 12,5 mg/L.
A - Procedimentos para cultura de lquor (LCR)
A coleta do LCR deve ser feita em hospital por pessoal especializado e antes de se iniciar o
tratamento com antimicrobianos. Deve ser colhido com assepsia em dois tubos limpos e
estreis, bem vedados com tampa de borracha ou tubo de rosca. Um tubo destina-se aos
Cultura do LCR
Semear aproximadamente cinco gotas do LCR em meio de gar chocolate, de preferncia em
tubo (meio inclinado). Se o LCR tiver sido centrifugado, ressuspender o sedimento previamente
com 0,5 mL de meio de cultura;
Incubar por 24 h a 352C em condies de 5 a 7% de CO2. No havendo estufa com
CO2 incubar em jarra com vela;
A cultura de S. pneumoniae em gar chocolate cinza esverdeada, com visvel descolorao
do meio, que se torna esverdeado na rea do crescimento;
Caso no haja crescimento bacteriano aps 24 h de incubao, incubar por mais um dia antes
de liberar o laudo de cultura negativa.
3. Isolamento
B - Procedimento para cultura de sangue
Geralmente recomendam-se 2 a 3 coletas de sangue em perodos diferentes, sendo que a
primeira amostra deve ser colhida antes da administrao de antimicrobianos. Em crianas, o
nmero de amostras colhidas fica a critrio mdico. O sangue deve ser coletado antes do pico
febril, isto , durante a ascenso da febre, quando o nmero de bactrias viveis no sangue
maior.
Coleta:
Desinfetar a tampa de borracha do frasco de hemocultura com lcool 70% antes da inoculao
do sangue;
Realizar anti-sepsia do local da puno com lcool 70% para evitar a contaminao do sangue
com microrganismos da microbiota da pele;
O volume de sangue a coletar depende da idade do paciente. Se for criana, colhe-se 3 a 5
mL; se adulto, de 20 a 30 mL nas 24 h; em 2 ou 3 punes podendo ser coletadas no mesmo
momento e locais das punes diferentes;
Inocular imediatamente no frasco para hemocultura, homogeneizar;
Enviar ao laboratrio imediatamente, identificado adequadamente e incluindo a hora de coleta.
Procedimentos para cultura de lquido pleural
A coleta de lquido pleural um procedimento invasivo e deve ser realizada somente com
indicao mdica, por pessoal especializado, em ambiente hospitalar.
O fluido pleural pode ser semeado em gar chocolate ou gar sangue, seguindo os
procedimentos adotados na coleta e cultura de sangue. Tambm pode ser adotado o sistema
usado para hemocultivo, por ser mais sensvel que a cultura direta. Neste caso, inocular o
frasco e proceder exatamente conforme as recomendaes da hemocultura.
D - Coleta de outros materiais
Durante a coleta de qualquer amostra clnica, no permitir a contaminao com a microbiota
presente em mucosa ou pele.
Materiais como secreo de traquia e escarro no devem ser usados no diagnstico de
pneumonia, considerando que o S. pneumoniae pode colonizar a nasofaringe. Coleta de
secreo de ouvido mdio invasiva e contra-indicada, salvo avaliaes especiais. Secreo
de nasofaringe utilizada para identificao de portadores.
O isolamento de S. agalactiae do trato gastrointestinal e genital de gestantes uma importante
ferramenta para a preveno de infeco neonatal. Oswab vaginal e retal deve ser coletado
entre a 35 e 37 semana de gestao e inoculado em meio seletivo. O recomendado pelo
CDC a utilizao do caldo de Todd-Hewitt contendo 10 g de colistina e 15 g de cido
nalidxico por mL ou 8g de gentamicina e 15 g de cido nalidxico por mL. Este meio dever
ser incubado a temperatura ambiente por 18 a 24 h e, aps este perodo, semeado em gar
sangue. Incubar por 48 h a 352C em atmosfera com 5% de CO2 , realizando uma primeira
leitura aps 24 h de incubao.
4. Identificao
A identificao do pneumococo isolado em cultura baseada na morfologia bacteriana e
colorao de Gram, caractersticas do crescimento e reao hemoltica em placas de gar
sangue de carneiro a 5%, ausncia de catalase e lise em presena de optoquina e de
desoxicolato de sdio.
A partir do crescimento em gar chocolate, primo isolamento ou amostra transportada a outro
laboratrio:
Semear em gar sangue de carneiro 5% para obteno de colnias isoladas;
Efetuar picadas na superfcie do meio para observar a hemlise sensvel ao oxignio;
Incubar a 352C por 18 - 24 h;
dentificao sorolgica
Resistncia
Streptococcus pneumoniae
O S. pneumoniae no produz a enzima -lactamase. A resistncia do pneumococo penicilina
resultante de alteraes qumicas nos stios da parede celular, aos quais se ligam os betalactmicos. Os alvos especficos da ao da penicilina so protenas (PenicillinBindingProteins,
PBPs) que catalisam o estgio terminal da sntese de peptideoglicano, constituinte vital da
parede celular. Os pneumococos possuem seis PBPsimunologicamente distintas. A diminuio
da afinidade das PBPs penicilina pode envolver alterao em uma nica PBP ou em
diferentes PBPs ao mesmo tempo, levando a uma resistncia que se caracteriza por ser aditiva
ou progressiva. Alto nvel de resistncia requer alterao de muitos determinantes genticos, o
que suporta a teoria de eventos mltiplos de transformao sobre uma srie de mutaes
pontuais.
As alteraes dos alvos de atuao da penicilina so resultantes de mutaes cromossmicas,
as quais se disseminam rapidamente pelo processo de transformao gentica intra e
interespecfica. O pneumococo uma bactria naturalmente transformvel, permitindo a
disseminao dos genes de resistncia sem a necessidade de vetor ou contato fsico.
A resistncia do pneumococo a outros -lactmicos est diretamente correlacionada com o
nvel de resistncia penicilina. Esta resistncia cruzada entre as diferentes drogas desta
classe de antimicrobianos, inclusive s celalosporinas de terceira gerao, motivo de grande
preocupao em sade pblica.
Os testes de sensibilidade aos antimicrobianos so realizados em gar Meller-Hinton com
sangue de carneiro a 5% para a difuso em disco e caldo Meller-Hinton com ajuste de ctions
e 2,5% a 5% de hemolisado de cavalo 10% para os testes de concentrao inibitria mnima.
Devem seguir rigorosamente a metodologia e os critrios padronizados
pelo ClinicalandLaboratory Standards Institute (CLSI/NCCLS), que publica atualizaes anuais
do assunto.
Streptococcus -hemolticos
No h descrio de cepas de Streptococcus -hemolticos resistentes aos antimicrobianos lactmicos ou vancomicina. Entretanto, assim como S. pneumoniae, cepas
de Streptococcus -hemolticos resistentes aos macroldeos podem apresentar-se resistentes
clindamicina. Esta resistncia pode ser induzvel ou constitutiva. A resistncia induzvel
codificada pelo gene erm, resultando na metilao da poro 23S do RNAr, fentipo conhecido
II - Enterococcus spp.
1. Introduo
Enterococcus, desde 1984 passou a constituir um gnero e, juntamente com
os Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Abiotrophia, Globicatella eLeuconostoc, faz parte
do grupo dos cocos Gram-positivos agrupados em cadeia, anaerbios facultativos e catalase
negativa.
Estes microrganismos caracterizam-se tambm pela capacidade de crescimento a 10C e 45C
e em pH 9,6. Sobrevivem na concentrao de 6,5% de NaCl, a 60C por 30 minutos e tambm
fazem hidrlise da esculina na presena de 40% de sais de bile. Alm destas caractersticas,
diferenciam-se dos demais gneros pela hidrlise da pirrolidonil--naftilamida (PYR), que
ocorre na maior parte das espcies e tambm da leucina--naftilamida (LAP).
2. Importncia clnica
Os enterococos, alm de serem amplamente distribudos na natureza, fazem parte da
microbiota normal do ser humano, principalmente do trato gastrointestinal. Podem ser isolados
em indivduos saudveis em outras localizaes como pele, regio peri-anal, via hpato-biliar e
em secrees de orofaringe e vaginal.
Dentre as espcies descritas, os E. faecalis e E. faecium so os mais associados a
manifestaes clnicas. Outras espcies como E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans e E.
avium so clinicamente de menor importncia.
A associao deste gnero com endocardite bacteriana classicamente conhecida. Por outro
lado, denota-se atualmente o isolamento destas bactrias, em diversos stios, causando
infeces relacionadas assistncia sade, como:
Infeces do trato urinrio (ITU);
Infeces da corrente sangunea (ICS);
Infeces de stio cirrgico e intra-abdominais.
No trato urinrio, alm de infeco, podem representar colonizao ou bacteriria
assintomtica.
3. Isolamento
Os mtodos habitualmente padronizados para coleta de sangue, urina, amostras cirrgicas e
de outros stios so adequados na suspeita da existncia de enterococos.
Pelo fato de serem relativamente resistentes s condies ambientais, no existem
recomendaes especficas para o transporte destas amostras.
As diferentes espcies de enterococos multiplicam-se bem em gar Meller-Hinton acrescidos
ou no de sangue, ou ainda com outras bases comoBrain Heart Infusion (BHI) e outros meios
enriquecidos. O gar azida um exemplo de meio enriquecido bastante utilizado para o
isolamento destas bactrias, principalmente quando existe a possibilidade da amostra conter
concomitantemente bacilo Gram-negativo.
Em gar sangue, as colnias, aps 24 h de crescimento, tm aproximadamente 1 a 2 mm de
dimetro. Aproximadamente um tero dos Enterococcusfaecalis apresentam-se com betahemlise em gar contendo sangue humano, coelho ou cavalo, mas so no-hemolticas em
sangue de carneiro. As outras espcies so usualmente no-hemolticas.
Figura 4 - Laminocultivo para isolamento de VRE Figura 5 - Laminocultivo com crescimento de VRE
em meio cromognico
4. Identificao
O diagnstico do gnero Enterococcus spp., bem como das diferentes espcies, pode ser feito
em diversos nveis de complexidade.
Apesar de no haver caractersticas fenotpicas que diferenciem totalmente o
gnero Enterococcus de outros gneros relacionados, a presena de cocos Gram-positivos
dispostos aos pares ou em cadeias, catalase negativa com prova de PYR positiva, crescimento
em caldo de NaCl a 6,5% e hidrlise da esculina so provas presentes na maioria das espcies
do gnero Enterococcus. Com provas de PYR (Figura 6), hidrlise da esculina positiva (Figura
7) e crescimento em caldo de NaCl a 6,5% (Figura 8), so provas presentes na maioria das
espcies do gnero Enterococcus.
Figura 6 - PYR
Figura 7 - Bile-esculina
vancomicina, codificado pelo gene vanB; e o fentipo VanC, associado a baixo nvel de
resistncia no-induzvel vancomicina, codificado pelo gene vanC.
Os fentipos VanA e VanB so os mais relevantes clinicamente e freqentemente associados
com cepas de E. faecium e E. faecalis, enquanto que o fentipo VanC uma caracterstica
intrnseca do E. gallinarum e E. casseliflavus. A induo de resistncia nos fentipos VanA e
VanB pode ocorrer pelos prprios glicopeptdeos (vancomicina, teicoplanina, avoparcina e
ristocetina), como por agentes no-glicopeptdeos como a bacitracina e a polimixina B. Os
demais fentipos de VRE ocorrem raramente e so determinados pelos genes recentemente
descobertos: vanD, vanE e vanG.
A expresso destes genes leva sntese de precursores de peptideoglicanos (principal
componente da membrana celular) com terminao em D-Ala-D-lactato (vanA e vanB) ou DAla-D-Ser (vanC) ao invs do D-Ala-D-Ala, levando a uma menor afinidade do alvo pela
molcula de vancomicina e prejudicando a ao antimicrobiana desta droga. Estes genes esto
presentes em elementos genticos mveis e podem ser adquiridos por outras espcies
de Enterococcus ou diferentes gneros de bactrias, como descrito para o Staphylococcus
aureus resistente vancomicina (VRSA).
O gene vanA j havia sido transferido in vitro para outros microrganismos Gram-positivos,
incluindo S. aureus. Apesar de cepas de Staphylococcushaemolyticus resistentes
vancomicina j terem sido isoladas, a primeira infeco documentada por Staphylococcus
aureus resistente vancomicina (VRSA), com CIM de 128 g/mL, foi somente relatada em
junho de 2002. Tratava-se de um paciente diabtico, portador de doena renal crnica, no qual
o agente foi isolado de um swab de inciso de cateter e da ponta do cateter.
A emergncia de VRE ocorreu de forma repentina nos Estados Unidos e como um grande
problema de sade pblica. Segundo dados do Centers for
DiseaseControlandPrevention (CDC), esta resistncia aumentou de 0,3% em 1989, para 7,9%
em 1993; neste mesmo perodo em Unidades de Terapia Intensiva, a variao foi de menos de
1% para 13,6%. Atualmente, esto sendo reportadas taxas de 25,9% para isolados de
hemocultura.
O primeiro VRE no Brasil, e provavelmente tambm na Amrica do Sul, foi isolado em uma
criana com anemia aplstica, em agosto de 1996, em Curitiba. Esta cepa foi identificada
como Enterococcusfaecium e caracterizada por apresentar um elemento de resistncia
divergente do gene vanD. Apresentava alto nvel de resistncia vancomicina (CIM 256
g/mL), porm com sensibilidade teicoplanina (CIM 4 g/mL). Neste perodo, em So Paulo,
foi isolado em lquor um Enterococcusfaecium com fentipo VanA.
De particular interesse teraputico e epidemiolgico a resistncia aos glicopeptdeos. Os
primeiros relatos de cepas de Enterococcus resistentes vancomicina (VRE) ocorreram na
Inglaterra e Frana, em 1988.
As cepas de VRE so classificadas em 6 gentipos e fentipos, sendo trs deles de maior
freqncia: o fentipo VanA, associado a alto nvel de resistncia induzvel tanto vancomicina
(CIM 64 g/mL) quanto teicoplanina (CIM 16 g/mL), codificada pelo gene vanA; o
fentipo VanB, associado a variveis nveis de resistncia (moderado a alto) induzvel apenas
vancomicina, codificado pelo gene vanB; e o fentipo VanC, associado a baixo nvel de
resistncia no-induzvel vancomicina, codificado pelo gene vanC.
Os fentipos VanA e VanB so os mais relevantes clinicamente e freqentemente associados
com cepas de E. faecium e E. faecalis, enquanto que o fentipo VanC uma caracterstica
intrnseca do E. gallinarum e E. casseliflavus. A induo de resistncia nos fentipos VanA e
VanB pode ocorrer pelos prprios glicopeptdeos (vancomicina, teicoplanina, avoparcina e
Concluso
A resistncia aos aminoglicosdeos mediada por plasmdeos, tornando-se assim
problemtica, uma vez que pode ser transferida a outras bactrias. A colonizao ou infeco
por VRE tem sido associada a vrios fatores como: tempo de internao, doena de base
diabetes mellitus, insuficincia renal e comunitria.
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