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ALEXANDRE SANTOS DAVI

MICROBIOLOGIA CLINICA

Curso de Farmcia
FaculdadeMetropolitana de Anpolis
ProfTiago Lopes da Silva
30 de setembro de 2016

ANPOLIS-GO
2016

INTRODUO
No Reino Monera considera-se inclusos os organismos vivos procariontes, ou seja: sem
carioteca. Outras diferenas entre procariontes e eucariontes consistem nos primeiros
possurem um simples cromossomo, constitudo por uma nica molcula circular de DNA,
sendo o genoma organizado neste.
Bactrias so representadas por bactrias, cianobactrias, rickttsias (parasitas intracelulares
minsculos!) e micoplasmas (os menores organismos capazes de se autorreplicar). Quanto s
bactrias, a membrana plasmtica recoberta pela parede celular e, em algumas espcies, h
a presena de uma cpsula. A parede celular que auxilia na classificao das Bactrias, uma
vez que so responsveis pela suscetibilidade a doenas e colorao pelo mtodo de Gram. As
Gram-positivas so sensveis sulfa e possuem parede formada basicamente de uma s
camada, colorando de cor violeta na Colorao de Gram; as Gram-negativas so sensveis
penicilina, possuem parede formada de duas camadas e ficam com cor rosa ao serem coradas.
Essas ltimas so consideradas mais perigosas, uma vez que suas paredes so menos
permeveis a antibiticos.
Bactrias so organismos microscpicos formados por uma nica clula (unicelulares). Existem
bactrias por todo o planeta, seja na gua, no solo ou em habitats altamente hostis, como lixo
radioativo, em reas profundas da crosta terrestre ou no pH altamente cido do nosso
estmago. A maioria das bactrias no causa doenas, porm, um pequeno nmero
responsvel por infeces comuns na prtica clnica.
Cada bactria transmitida de uma maneira diferente. Doenas como meningite, tuberculose e
coqueluche so transmitidas atravs de secrees respiratrias, como tosse ou perdigotos.
Doenas sexualmente transmissveis, como a gonorreia e a sfilis so, como o prprio nome
diz, transmitidas pelo ato sexual. H ainda as bactrias adquiridas atravs de alimentos mal
conservados, causando intoxicao alimentar, como nos casos da Salmonela e da Shigella.
A maioria das bactrias so heterotrficas, isto , no conseguem produzir sua prpria comida
e precisam obt-la no ambiente ou em outros organismos. Existem tambm bactrias
autotrficas, que conseguem produzir sua prpria comida, geralmente por meio da
fotossntese.
O mtodo mais simples de classificao das bactrias atravs da sua forma. Existem 3
grandes grupos:

MICROBIOLOGIA CLINICA

I - Staphylococcus spp.
As bactrias Gram-positivas, especialmente os cocos, esto entre os microrganismos mais
freqentemente isolados de amostras biolgicas humanas em laboratrios de microbiologia.
A famlia Micrococcaceae inclui quatro gneros:
Planococcus;
Micrococcus;
Stomatococcus;
Staphylococcus.
O gnero Staphylococcus composto de 37 espcies, 17 delas podem ser isoladas de
amostras biolgicas humanas (Quadro 1).
Os estafilococos so geralmente encontrados na pele e mucosas do homem e de outros
animais. Muitas espcies so isoladas de partes especficas do corpo humano ou de certos
animais, por exemplo: S. auricularis encontrado como parte da microbiota humana do conduto
auditivo e S. hyicuscausando dermatite infecciosa em sunos. Os estafilococos so cocos
Gram-positivos, podem se apresentar isolados ou aos pares, em cadeias curtas ou agrupados.
O aspecto macroscpico da colnia em meio slido, presena de pigmento e hemlise em gar
sangue de carneiro so caractersticas auxiliares na identificao destes microrganismos. So
imveis, anaerbios facultativos, no formadores de esporos e produtores de catalase.
Rotineiramente, o teste da catalase utilizado para diferenciar os estafilococos (catalase
positiva) dos estreptococos (catalase negativa). Entretanto, existem relatos na literatura
de Staphylococcus aureus catalasenegativa relacionados a processos infecciosos, embora
raros, descritos em vrios pases, inclusive no Brasil. A catalase constitui um mecanismo de

defesa para a bactria contra clulas fagocitrias, porm no um fator essencial para a
sobrevivncia do S. aureus.
A identificao da espcie de estafilococos baseada em uma variedade de caractersticas
fenotpicas convencionais. As espcies mais importantes do ponto de vista clnico podem ser
identificadas com algumas provas especficas, como pigmentao da colnia, estafilocoagulase, fator clumping ou fator de agregao, prova da desoxiribonuclease, resistncia
novobiocina, fermentao do manitol, entre outras. A habilidade de coagular o plasma continua
sendo o critrio mais aceito e utilizado para identificar estafilococos patognicos associados
com infeces agudas, em geral, S. aureus em humanos e animais e S. intermedius e S.
hyicus em animais.
A acurcia dos sistemas comerciais disponveis (Vitek, MicroScan, Phoenix, API StaphIdent-System, Staph-Zym, API-Staph-Trac, Minitek e outros) para identificao das
espcies de estafilococos varia consideravelmente entre os estudos publicados. Atualmente,
mtodos de identificao por reao de cadeia de polimerase (PCR) so utilizados, apesar de
no estarem disponveis para a maioria dos laboratrios de rotina.

2. Importncia clnica
Os estafilococos esto entre os agentes mais freqentemente relacionados a enfermidades
humanas. Os processos infecciosos mais comuns incluem:
Pneumonias;
Bacteremias;
Infeces de pele e tecidos moles;
Infeces relacionadas ao uso de prteses e cateteres venosos;
Meningites.
A colonizao pode ser transitria ou persistente e pode se prolongar por longos perodos. Em
algumas populaes especficas, como usurios de drogas endovenosas, pacientes portadores
de diabetes mellitus, pacientes em uso de cateteres venosos de longa permanncia e
trabalhadores da rea da sade, este microrganismo mais freqentemente encontrado como
colonizante. Estes patgenos apresentam grande facilidade em se disseminar nos ambientes
intra e inter-hospitalares, pela facilidade de sobreviver no meio ambiente.
O grupo conhecido como estafilococos coagulase negativa freqentemente era considerado
como contaminante no material clnico; entretanto, nos ltimos quinze a vinte anos houve um
aumento na incidncia de infeces de corrente sangunea por estes agentes e
correlacionadas com aumento da mortalidade e morbidade. A espcie coagulase negativa mais
freqentemente isolada o Staphylococcusepidermidis, geralmente associadas ao uso de
materiais protticos e cateteres e so mais prevalentes em pacientes imunodeprimidos. A
segunda espcie mais prevalente o Staphylococcushaemolyticus relacionada a endocardites,
sepse, peritonite, entre outros quadros infecciosos. A espcie S. saprophyticus merece meno
especial por ser um patgeno bem documentado e a segunda causa mais freqente de cistites
em mulheres jovens.
Nos ltimos vinte anos, devido ao aumento da prevalncia de infeces causadas
por Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase negativa resistentes
oxacilina, elevou-se o uso de glicopeptdeos, em especial a vancomicina. O primeiro relato de
resistncia vancomicina emStaphylococcus coagulase negativa ocorreu em 1979, mas sem
grande repercusso devido baixa correlao com infeces clnicas. Para S. aureus, o
primeiro relato com resistncia intermediria vancomicina (VISA ou GISA) foi em 1997 no
Japo; desde ento vrios casos foram relatados no mundo inteiro, inclusive no Brasil. Em
todos estes casos os pacientes fizeram uso prolongado de vancomicina com presena de subpopulaesresistentes denominado VISA heterogneo.
Este fenmeno ocorre tambm in vitro, j que os glicopeptdeos exercem uma presso seletiva
que favorece o aparecimento de clones resistentes. Mais recentemente (2002), foram descritos
nos Estados Unidos os primeiros casos de infeco por Staphylococcus aureus resistentes
vancomicina (VRSA) obtida a partir da aquisio, por plasmdeo, do gene vanA de enterococos
resistente vancomicina. No Brasil, h descrio apenas de casos isolados com sensibilidade
intermediria vancomicina.
Recentemente, vrios relatos de infeces de pele e tecidos moles relacionadas a cepas de S.
aureus resistentes meticilina adquiridos na comunidade, denominados (CA-MRSA),
demonstraram caractersticas diferentes dos isolados de S. aureus resistentes meticilina
adquiridos no hospital (HA-MRSA). CA-MRSA apresenta-se mais sensvel a vrias classes de
antimicrobianos, principalmente aos no -lactmicos. Isto pode ser explicado pelo fato da

resistncia oxacilina estar relacionada ao cassete cromossmico IV (SCCmec), que menor


que os encontrados nos isolados hospitalares (HA-MRSA), que so os SCCmec tipos I, II ou III.
Outro ponto a presena da toxina PantonValentineLeucocidine (PVL) nos CA-MRSA, que
capaz de induzir a destruio de leuccitos humanos e causar grande dano tecidual, sendo
considerado um fator de virulncia relacionada com infeces de pele, tecidos moles e
pneumonia necrotizante grave.
3. Isolamento
A identificao dos estafilococos
baseia-se na morfologia apresentada
no Gram obtido, preferencialmente,
em meios lquidos, onde apresenta
forma de cocos isolados, aos pares ou
agrupados em forma de cachos de
uva, com 0,5 a 1,0 m de dimetro,
como pode ser observado na Figura 1.

Figura 1 - Colorao de Gram: cocos isolados, aos pares e


agrupados

A identificao inicial presuntiva parte


de uma placa de gar sangue de
carneiro, que deve ser incubada em
5% de tenso de CO2 (mtodo da
vela ou estufa de CO2 ).

As espcies de Micrococcus e de Staphylococcus produzem colnias caractersticas em gar


sangue de carneiro. Os micrococos em geral crescem mais lentamente, e com freqncia so
necessrias 48 h de incubao antes que a morfologia tpica das colnias possa ser
diferenciada. Aps este perodo, as colnias de micrococos tm de 1,0 a 2,0 mm de dimetro,
so opacas, marcadamente convexas com borda contnua e algumas cepas produzem
pigmento amarelado, rosado, alaranjado ou bronzeado, outras esbranquiadas ou branco-osso.
As colnias de estafilococos so geralmente de crescimento mais rpido, com 1,0 a 2,0 mm de
dimetro aps 24 h de incubao, so usualmente lisas, butirosas e convexas, com borda
contnua e colorao branco-porcelana ou cinzas, conforme observado na Figura 2.
As colnias de S. aureus podem ter pigmento amarelo ou amarelo-alaranjado, podendo
apresentar hemlise. A colorao amarelada no S. aureusaparece mais pronunciada aps
incubao de 72 h em temperatura ambiente.

O teste mais importante na identificao dos


estafilococos a prova da coagulase, que
divide os estafilococos em duas categorias:
Staphylococcus coagulase negativa (SCN);
Staphylococcus aureus.

Figura 2 - Colnias de Staphylococcus coagulase


negativa

4. Identificao
Este item tem como objetivo a instruo para realizao dos principais testes manuais para
identificao da famlia Micrococcaceae. Porm, mtodos automatizados citados anteriormente
tambm podem ser utilizados.
Prova da catalase
Finalidade:
Verificar a presena da enzima catalase que decompe H2O2 em gua e O2 e, desta forma,
distinguir os grupos estafilococos e estreptococos.
Procedimento:
Com ala bacteriolgica, retirar uma colnia do meio de cultura (preferencialmente no retirar
colnias crescidas em gar sangue porque os fragmentos podem se misturar com as colnias
e produzir um resultado falso-positivo). Colocar a colnia sobre uma lmina de vidro e
adicionar uma gota de H2O2 a 3%.
Leitura:
Observar a formao de bolhas.
Interpretao:
Formao de bolhas indica ser a
famlia Microccocaceae (Ex.: Staphylococcus spp.,Micrococcus spp., Planococcus spp.,
Stomatococcus spp.);
Sem formao de bolhas indica ser a
famlia Streptococcacea (Ex.: Enterococcus spp.,Streptococcus spp., Aerococcus spp.,
Gemella spp., Leuconostoc spp., Lactococcus spp.)

Prova da coagulase
A Em tubo
Finalidade:
Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada, que,

reagindo com um fator plasmtico, forma um complexo que atua no fibrinognio do plasma
formando a fibrina.
Procedimento:
Colocar 0,5 mL de plasma em tubo de ensaio;
Adicionar uma alada de colnia diretamente no plasma de coelho com EDTA;
Incubar por 4 h a 352C em estufa ou banho-maria; caso no haja formao de cogulo,
incubar por 24 h.
Leitura:
Formao de cogulo observada pela inclinao suave.
Interpretao:
Formao de cogulo inteira ou parcial, identifica Staphylococcus aureus;
No h formao de cogulo, identifica Staphylococcus coagulase negativa.
B - Em lmina
Finalidade:
Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) ligada na superfcie da
parede celular, que reagindo com o fibrinognio do plasma, causa a coagulao do mesmo.
Procedimento:
Colocar 2 gotas de salina em uma lmina;
Emulsionar uma colnia isolada a ser testada;
Colocar uma gota de plasma e misturar.
No se recomenda realizar o teste a partir de um gar com grande concentrao de sal como,
por exemplo, o gar manitol.
Leitura:
Formao de grumos em 10 segundos.
Interpretao:
Formao de cogulo ou grumos, identifica Staphylococcus aureus;
No h formao de cogulo ou grumos, identifica Staphylococcus coagulase negativa.

Teste da DNase com HCl 1N


Finalidade:
Verificar se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada o cido
nuclico (DNA).
Procedimento:
Fazer um inculo denso de forma circular em uma pequena parte do meio;
Incubar a 352C por 18 - 24 h. (A placa pode ser inoculada com vrias cepas);
Decorrido o perodo de incubao, no momento da leitura colocar o HCl 1N de maneira que
cubra as colnias, aguardar 30 segundos.
Leitura:
Formao de um halo transparente ao redor do crescimento bacteriano.
Interpretao:
Formao de halo transparente, identifica Staphylococcus aureus;
Ausncia de formao de halo transparente, identificaStaphylococcus coagulase negativa,
conforme observado na Figura 3.

Figura 3 - Teste de DNase com HCl 1N

Os estafilococos so os microrganismos isolados com maior freqncia nos laboratrios


clnicos, principalmente os coagulase-negativa; portanto, decises quanto ao custo-benefcio
de at onde chegar com a identificao so muito importantes.
O mtodo convencional trabalhoso, requer muito tempo para realizao e no adequado
para ser implantado como procedimento de rotina nos laboratrios clnicos.
A identificao completa at espcies, utilizando-se um sistema comercial ou procedimento
manual de referncia, deve ser reservada para isolados clinicamente significativos,
hemoculturas, cateter endovenoso, amostras de stios estreis ou quando o mesmo
estafilococo coagulase-negativa for isolado repetidas vezes. A deciso de realizar a
identificao mais detalhada deve ser tomada considerando cada caso e com a participao do
laboratrio e dos mdicos assistentes.
5. Armazenamento
A manuteno de microrganismos aps seu isolamento no laboratrio importante tanto para
testes complementares como para futuros estudos epidemiolgicos, educacionais, pesquisa
clnica ou encaminhamento para laboratrios de referncia nacionais e internacionais, mas
deve ser feito com critrios pr-definidos, evitando-se armazenamento inteis.

importante que o mtodo de estocagem permita conservao das caractersticas genotpica e


fenotpicas de cada microrganismo.
Os estafilococos podem ser estocados em glicerol ou skimmilk, em freezer em temperatura -70
a -96C por mais de 5 anos, em congelador a -20C por 1 a 3 anos.
Recomenda-se documentar o histrico da cepa com os dados importantes, tais como:
Data do isolado;
Stio;
Nome do paciente;
Principais resistncias encontradas.
6. Resistncia
Resistncia penicilina
A resistncia dos estafilococos penicilina comeou a ser descrita poucos anos aps o
advento e uso de penicilina e est relacionada produo de uma enzima predominantemente
extracelular denominada penicilinase. Na dcada de 1950, esta ocorrncia era freqente nos
isolados nosocomiais limitando o uso da penicilina na prtica clnica. Esta enzima sintetizada
pelos estafilococos aps exposio aos beta-lactmicos, que hidrolisa o anel beta-lactmico e
inativa o antimicrobiano. Esta enzima codificada pelo gene blaZ, sendo regulada por dois
genes regulatrios: blaR1 (antirrepressor) e blaI (repressor).
Resistncia oxacilina
O principal mecanismo de resistncia est relacionado alterao do stio de ao dos betalactmicos, ou seja, alterao das protenas ligadoras de penicilinas denominadas PBPs. As
PBPs so enzimas importantes na sntese da parede bacteriana. A presena de enzima
alterada, denominada PBP2a ou PBP2, leva a baixa afinidade da oxacilina pelo local de
ligao na parede celular da bactria com conseqente inatividade. Estas alteraes so
codificadas pelo gene mecA, que faz parte de um elemento gentico mvel encontrado em
todos os isolados com este tipo de resistncia, denominado cassete estafiloccico do
cromossomo mec (SCCmec). Este elemento genmico composto pelo complexo do
gene mec, que codifica resistncia oxacilina, e pelo complexo do gene ccr, que codifica
recombinases responsveis pela sua mobilidade e podem conter outros genes de resistncia
para outros agentes antimicrobianos.
A deteco laboratorial desta resistncia denominada clssica pode ser prejudicada se as
condies do teste no forem rigorosamente padronizadas. Os pontos crticos mais importantes
so: tempo de incubao de 24 horas, temperatura de incubao de 30 a 35C e ajustes do
meio de cultura com a adio de cloreto de sdio a 4%. A expresso da resistncia clssica
tambm pode apresentar variao entre homognea (todas as colnias expressam resistncia)
e heterognea (apenas parte das colnias expressam resistncia), desta maneira dificultando a
interpretao do teste de sensibilidade.
A oxacilina a droga representante deste grupo por ser a mais resistente degradao e a
mais sensvel para deteco de heterorresistncia.
Dentro desta classe de drogas, temos tambm:
Meticilina;
Nafcilina;

Cloxacilina;
Dicloxacilina.
Quando um isolado for resistente oxacilina, deve ser considerado resistente a todas as
drogas desta classe.
Staphylococcus aureus resistente oxacilina denominado de ORSA (oxacillinresistant S.
aureus) ou MRSA (methicillinresistant S. aureus).
Trs mecanismos podem estar envolvidos na resistncia oxacilina, sendo que as
caractersticas fenotpicas so distintas e apresentadas no Quadro 4.

Resistncia aos glicopeptdeos


A resistncia aos glicopeptdeos pode ser expressa por dois diferentes fentipos:
VISA (S. aureus com resistncia intermediria vancomicina);
VRSA (S. aureus resistente vancomicina).
Os mtodos laboratoriais mais utilizados, disco difuso e
automao, no so capazes de detectar esta resistncia.
So recomendados testes de triagem com gar Brain Heart Infusion (BHI) acrescido de 6g/mL
de vancomicina e 4% de NaCl e mtodos quantitativos com determinao da concentrao
inibitria mnima (CIM) por microdiluio em caldo, diluio em gar ou Etest. Os isolados
suspeitos devem ser enviados para laboratrios de referncia, sendo importante conservar a
bactria original sem muitos repiques e rpido congelamento. Nestes casos, a retirada da
presso seletiva do antimicrobiano em repiques sucessivos em meios de cultura sem
antimicrobiano levar a diminuio da CIM com insucesso nos testes confirmatrios
posteriores.
VISA ou GISA (GlycopeptideIntermediate S. aureus):
A ao do glicopeptdeo inibir a sntese da parede bacteriana (peptideoglicano) por interao
com seu precursor D-alanil-D-alanina. O fentipo VISA est relacionado com o espessamento
da parede bacteriana, impossibilitando a ao do glicopeptdeo devido captura de suas
molculas que ficam retidas na parede bacteriana e comprometem a eficcia teraputica deste
agente. Semelhante oxacilina, apresenta estgio inicial de resistncia, denominado
heterorresistncia, com presena de sub-populaes resistentes para este antimicrobiano. O
significado clnico dos isolados com heterorresistncia ainda no est comprovado. Os isolados

so considerados sensveis, intermedirios ou resistentes aos glicopeptdeos conforme os


pontos de corte estabelecidos pelo ClinicalLaboratory Standard Institute (CLSI), que a
referncia adotada no Brasil, sendo divulgada e disponibilizada pela ANVISA a partir de 2005.
O mecanismo de resistncia est relacionado as caractersticas especficas de crescimento e
multiplicao bacteriana. Dentre estas caractersticas, temos:
Aumento da produo de monmeros de murena (precursores do peptideoglicano);
Maior quantidade de resduos livres de D-alanil-D-alanina ou debris da parede bacteriana
liberados para o meio extra-celular;
Elevada atividade autoltica;
Aumento da produo e expresso da PBP2a.
A maioria dos isolados VISA descritos no mundo possui alteraes na estrutura da parede
celular, que apresenta-se espessa e irregular quando analisada pela microscopia eletrnica.
VRSA ou GRSA (Glycopeptideresistant S. aureus):
Estes isolados apresentam resistncia completa aos glicopeptdeos. O mecanismo deste
fentipo de resistncia est relacionado aquisio por conjugao, pelo S. aureus, de um
plasmdeo ou transposon carreador do gene vanA proveniente do Enterococcusfaecalis,
resistente aos glicopeptdeos. Felizmente este evento raro, porm medidas para deteco
desta resistncia devem ser implantadas pelos laboratrios de microbiologia.
Resistncia aos macroldeos, lincosaminas e estreptogramina B (MLSB)
Estas classes de antimicrobianos, apesar de diferentes, apresentam mecanismo de ao
similar, atuando na ligao do ribossomo e inibio da sntese protica. A resistncia do S.
aureus a estes agentes est relacionada a trs mecanismos:
Modificaes no alvo de ligao no ribossomo codificado pelo gene ermA ou ermC conferindo
resistncia cruzada aos macroldeos, lincosamidas e estreptogramina B (fentipo MLSB);
Efluxo ativo codificado pelo gene mrsA que confere resistncia aos macroldeos e
estreptogramina B;
Inativao da droga.
A resistncia MLSB pode ser constitutiva ou induzvel, dependendo da exposio aos
macroldeos. Na expresso constitutiva, a resistncia eritromicina e clindamicina detectada
no antibiograma. Na forma induzvel, pode apresentar resistncia eritromicina e falsa
sensibilidade clindamicina. A deteco da resistncia induzvel pode se feita pelo chamado Dteste, pelo mtodo de disco aproximao. Descrio dos fentipos de resistncia e resultados
do D-teste est apresentada no Quadro 5.

III - Streptococcus spp.

1. Introduo
As bactrias do gnero Streptococcus so capazes de causar diversas doenas nos seres
humanos. Dentre as mais freqentes esto as infeces do trato respiratrio, pele e tecidos
moles, endocardites, sepse e meningites. Streptococcuspneumoniae, o pneumococo, um dos
agentes que mais freqentemente causam doenas invasivas graves, como meningite e
bacteremia.
Os estreptococos, da famlia Streptococcaceae so caracterizados como cocos Gram-positivos,
anaerbios facultativos, no produtores de catalase e de citocromo-oxidase. Os estreptococos
com relevncia clnica so homofermentadores, sendo o cido ltico o produto final da
fermentao da glicose. Podem produzir hemolisinas, e os tipos de reao hemoltica em meio
slido contendo 5% de sangue de carneiro, descritos a seguir, tm sido utilizados na
classificao de estreptococos.
Os estreptococos requerem meios ricos para o crescimento in vitro e algumas cepas dependem
do CO2 para o seu isolamento a partir de material clnico (isolamento primrio). Em meios de
cultura slidos, as colnias de S. pneumoniae so lisas, pequenas, brilhantes, cncavas,
podendo exibir uma zona de depresso central causada por uma autlise parcial das clulas
bacterianas. Se o meio de cultura contiver sangue, principalmente de carneiro, as colnias
sero circundadas por um halo esverdeado de hemlise parcial ou hemlise alfa.

Figura 15 - -hemlise

Figura 16 - -hemlise

Figura 17 -

-hemlise

Pneumococos no possuem a enzima catalase a autlise pode ser aumentada pela adio de
sais biliares ao meio de cultura. Como so lisados facilmente por detergentes fracos, como a
bile, desoxicolato de sdio e optoquina, esta caracterstica til para distingui-los de outras
bactrias. As colnias de Streptococcus -hemolticos dos grupos A, C e G so relativamente
grandes quando comparadas com as colnias pontuais de outras cepas -hemolticas
(grupo S.milleri). Eventualmente colnias do S. pyogenes podem ser mucides.
Quanto s caractersticas das clulas, os pneumococos so Gram-positivos, com morfologia de
diplococos lanceolados, ou seja, com as extremidades em ponta de lana ou em chama de
vela. Medem 0,5 a 1,25 m de dimetro e dispem-se aos pares (diplococos), em razo de sua
diviso em apenas um plano, ou em cadeias curtas. So imveis (sem flagelos), no formam
esporos e podem possuir cpsula, o seu principal fator de patogenicidade. Podem perder a
caracterstica de Gram-positivos quando o cultivo ultrapassa a fase logartmica, perodo mais
ativo do crescimento bacteriano.

A cpsula de polissacardeo que envolve externamente o pneumococo seu constituinte mais


importante, sob vrios aspectos. O polissacardeo capsular (PS) um determinante essencial
para a antigenicidade do pneumococo, e sua diversidade bioqumica induz respostas
imunolgicas especficas, nas quais se baseia a classificao dos pneumococos em tipos. A
diversidade antignica do PS de S. pneumoniae responsvel pela diferenciao desta nica
espcie em pelo menos 91 sorotipos.
A cpsula o principal fator de virulncia destas bactrias, protegendo-as da fagocitose e do
reconhecimento pelo sistema imunolgico, assim permitindo a sua sobrevivncia, multiplicao
e disseminao para vrios rgos. A virulncia e o poder de invaso do pneumococo variam
entre os sorotipos e entre cepas de um mesmo sorotipo, dependendo da quantidade de PS
produzido. Apesar do grande nmero de sorotipos, cerca de 23 deles so os responsveis pela
maioria das doenas pneumoccicas em todo o mundo.

2. Importncia clnica
A quantidade desta bactria na nasofaringe geralmente limitada pela competio com os
outros componentes da microbiota local e pelos mecanismos inespecficos de defesa do
hospedeiro, como movimento muco-ciliar, tosse, coriza e reflexo epiglotal, os quais previnem a
penetrao do pneumococo atravs do epitlio do sistema respiratrio superior. De modo geral,
a aquisio do pneumococo na nasofaringe comea logo aps o nascimento, atinge a taxa
mxima nas crianas de pr-escola e diminui com o avanar da idade. Praticamente todas as
pessoas j foram colonizadas por esta bactria em algum estgio da vida. A taxa de isolamento
de pneumococos da nasofaringe de indivduos saudveis, isto a taxa de portadores, varia de
20% a 40% e o estado de portador mais freqente nos meses de inverno.
A pneumonia a mais freqente das doenas pneumoccicas, sendo considerada uma das
doenas mais incidentes e graves que acometem o homem. Atinge todas as faixas etrias,
principalmente crianas e idosos.
A bacteremia pneumoccica pode ocorrer em associao com uma simples faringite ou sepse
fulminante, com prpura e hemorragia da adrenal (sndrome de Waterhouse-Friderichsen). a
manifestao clnica mais freqente em crianas, que pode evoluir para meningite,
principalmente entre aquelas menores de dois anos de idade. Na maioria dos adultos com
bacteremia pneumoccica h associao com pneumonia.
A meningite pneumoccica a complicao mais comum decorrente de sinusite, mastoidite,
otite ou pneumonia. A meningite pneumoccica atinge percentuais bastante elevados de
letalidade (acima de 30%) alm de causar seqelas graves.

A otite mdia aguda est associada grande morbidade em crianas menores de cinco anos,
incluindo perda auditiva. Nos Estados Unidos da Amrica, a causa mais freqente das
consultas peditricas.
Menos freqentemente o pneumococo causa artrite sptica e peritonite. Geralmente migra para
a articulao durante a bacteremia de foco pulmonar, de meninges e de endocardite
bacteriana, ou para a cavidade peritoneal em associao com hepatopatias.
s vacinas j existentes (23-valente no conjugada e 7-valente conjugada) tm como antgeno
os sorotipos, 23 e 7 sorotipos, respectivamente, que mais freqentemente causam doena.
Como a distribuio destes sorotipos varia entre as regies geogrficas, faixas etrias e ao
longo do tempo, muito importante sob o ponto de vista epidemiolgico que se conheam os
sorotipos prevalentes.
Os estudos de avaliao da vacina conjugada indicam que protege contra doena
pneumoccica invasiva causada pelos sorotipos componentes da vacina. Alm da proteo,
reduz a taxa de colonizao ou de portadores, inclusive em outras faixas etrias, diminuindo
assim a disseminao da bactria e induzindo imunidade coletiva ou imunidade de rebanho.

3. Isolamento
Em doenas invasivas, o S. pneumoniae pode ser isolado de diferentes lquidos normalmente
estreis, como lquido cefalorraquidiano (LCR), sangue, lquidos pleural, asctico e sinovial, e
em secrees de abscessos, entre outros. Os meios de cultura apropriados so essenciais
para o sucesso do isolamento e caracterizao dos pneumococos e esto citados a seguir.

de cultura
Base para os meios de cultura:
As bases recomendadas para o isolamento e subseqente cultivo do pneumococo so meios
complexos, como Meller-Hinton (MH), Columbia, TrypticaseSoy (TS), Brain Heart
Infusion (BHI),Blood Agar Base (BAB). Quando slidos, contm gar. Devem ser acrescidos
de 5% ou 10% de sangue desfibrinado estril de carneiro, coelho ou cavalo.
gar chocolate:
Este meio rico e suporta as exigncias nutritivas para o isolamento de S. pneumoniae,
quando incubado em atmosfera de 5 - 7% CO2. Acrescenta-se base aquecida a 80 - 85C,
10% de sangue, freqentemente de cavalo. Distribuir em tubos ou frascos inclinado ou em
placas de Petri. Semear na sua superfcie. Tambm usado para conservao das bactrias
por tempo curto, em torno de uma semana. Pode ser utilizado para o transporte, para o envio
a outro laboratrio, de preferncia inclinado em frasco tipo penicilina bem vedado.
Meio para hemocultura:
Caldo preparado com TS ou BHI acrescido de 0,025% de sulfonato de polianetol de sdico
(SPS), um inibidor qumico e tambm anticoagulante. O frasco peditrico de hemocultura
deve conter 20 mL e o de adulto, 50 mL do meio. A diluio do sangue no caldo e a adio de
SPS geralmente bastam para neutralizar as propriedades bactericidas do sangue.
Comercialmente, h vrios meios de cultura para hemocultura, inclusive para os sistemas de
monitorizao contnua automatizados, e a boa qualidade essencial. A cada novo lote ou
marca, como para todos os meios, deve-se proceder a um controle de qualidade.
gar sangue:
Acrescentar o sangue base morna (45 - 50C) e distribuir em placas. Para a observao da
hemlise e alguns testes de identificao de S. pneumoniae, a recomendao que o sangue
seja de carneiro em Blood Agar Base.
Leite desnatado a 10 - 20% em gua:
Para estocar cepas a -20C ou -70C ou para liofiliz-las.
gar Meller-Hinton sangue de carneiro a 5%:
Recomendado para realizao dos testes de suscetibilidade aos antimicrobianos por difuso
em discos, mtodo de Bauer-Kirby, devido boa reprodutibilidade dos resultados e baixa
concentrao de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim, tetraciclina, timidina e timina.
Caldo Meller-Hinton com ajuste de ctions e 2,5 a 5% de sangue lisado de cavalo:
Caldo recomendado para os testes de suscetibilidade aos antimicrobianos pelo mtodo da
concentrao inibitria mnima, (CIM), pela boa reprodutibilidade dos resultados e baixa
concentrao de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim, tetraciclina, timidina e timina. A
concentrao final de Ca++ 20 - 25 mg/L e de Mg++, 10 a 12,5 mg/L.
A - Procedimentos para cultura de lquor (LCR)
A coleta do LCR deve ser feita em hospital por pessoal especializado e antes de se iniciar o
tratamento com antimicrobianos. Deve ser colhido com assepsia em dois tubos limpos e
estreis, bem vedados com tampa de borracha ou tubo de rosca. Um tubo destina-se aos

exames microbiolgicos e o outro citoqumica, sendo de preferncia o segundo tubo coletado


encaminhado para setor de microbiologia. A amostra clnica deve ser encaminhada
imediatamente ao laboratrio, ou no prazo mximo de 3 h, sempre em temperatura ambiente.
Para o transporte, acondicion-la bem, seguindo as normas vigentes de biossegurana. Nunca
refrigerar o LCR quando este se destinar cultura. Ver guia para coleta de exames para o
diagnstico das meningites (Quadro 7).
Exame direto do LCR
Preparar esfregao do LCR em lmina de vidro e cor-lo pelo Gram;
A presena de diplococos Gram-positivos (DGP) com as extremidades livres lanceoladas (em
formato chama de vela) ou em pequenas cadeias sugestiva de pneumococo;
Liberar o laudo da bacterioscopia o mais rpido possvel; no aguardar o resultado da cultura.

Cultura do LCR
Semear aproximadamente cinco gotas do LCR em meio de gar chocolate, de preferncia em
tubo (meio inclinado). Se o LCR tiver sido centrifugado, ressuspender o sedimento previamente
com 0,5 mL de meio de cultura;
Incubar por 24 h a 352C em condies de 5 a 7% de CO2. No havendo estufa com
CO2 incubar em jarra com vela;
A cultura de S. pneumoniae em gar chocolate cinza esverdeada, com visvel descolorao
do meio, que se torna esverdeado na rea do crescimento;
Caso no haja crescimento bacteriano aps 24 h de incubao, incubar por mais um dia antes
de liberar o laudo de cultura negativa.
3. Isolamento
B - Procedimento para cultura de sangue
Geralmente recomendam-se 2 a 3 coletas de sangue em perodos diferentes, sendo que a
primeira amostra deve ser colhida antes da administrao de antimicrobianos. Em crianas, o
nmero de amostras colhidas fica a critrio mdico. O sangue deve ser coletado antes do pico
febril, isto , durante a ascenso da febre, quando o nmero de bactrias viveis no sangue
maior.
Coleta:
Desinfetar a tampa de borracha do frasco de hemocultura com lcool 70% antes da inoculao
do sangue;

Realizar anti-sepsia do local da puno com lcool 70% para evitar a contaminao do sangue
com microrganismos da microbiota da pele;
O volume de sangue a coletar depende da idade do paciente. Se for criana, colhe-se 3 a 5
mL; se adulto, de 20 a 30 mL nas 24 h; em 2 ou 3 punes podendo ser coletadas no mesmo
momento e locais das punes diferentes;
Inocular imediatamente no frasco para hemocultura, homogeneizar;
Enviar ao laboratrio imediatamente, identificado adequadamente e incluindo a hora de coleta.
Procedimentos para cultura de lquido pleural
A coleta de lquido pleural um procedimento invasivo e deve ser realizada somente com
indicao mdica, por pessoal especializado, em ambiente hospitalar.
O fluido pleural pode ser semeado em gar chocolate ou gar sangue, seguindo os
procedimentos adotados na coleta e cultura de sangue. Tambm pode ser adotado o sistema
usado para hemocultivo, por ser mais sensvel que a cultura direta. Neste caso, inocular o
frasco e proceder exatamente conforme as recomendaes da hemocultura.
D - Coleta de outros materiais
Durante a coleta de qualquer amostra clnica, no permitir a contaminao com a microbiota
presente em mucosa ou pele.
Materiais como secreo de traquia e escarro no devem ser usados no diagnstico de
pneumonia, considerando que o S. pneumoniae pode colonizar a nasofaringe. Coleta de
secreo de ouvido mdio invasiva e contra-indicada, salvo avaliaes especiais. Secreo
de nasofaringe utilizada para identificao de portadores.
O isolamento de S. agalactiae do trato gastrointestinal e genital de gestantes uma importante
ferramenta para a preveno de infeco neonatal. Oswab vaginal e retal deve ser coletado
entre a 35 e 37 semana de gestao e inoculado em meio seletivo. O recomendado pelo
CDC a utilizao do caldo de Todd-Hewitt contendo 10 g de colistina e 15 g de cido
nalidxico por mL ou 8g de gentamicina e 15 g de cido nalidxico por mL. Este meio dever
ser incubado a temperatura ambiente por 18 a 24 h e, aps este perodo, semeado em gar
sangue. Incubar por 48 h a 352C em atmosfera com 5% de CO2 , realizando uma primeira
leitura aps 24 h de incubao.
4. Identificao
A identificao do pneumococo isolado em cultura baseada na morfologia bacteriana e
colorao de Gram, caractersticas do crescimento e reao hemoltica em placas de gar
sangue de carneiro a 5%, ausncia de catalase e lise em presena de optoquina e de
desoxicolato de sdio.
A partir do crescimento em gar chocolate, primo isolamento ou amostra transportada a outro
laboratrio:
Semear em gar sangue de carneiro 5% para obteno de colnias isoladas;
Efetuar picadas na superfcie do meio para observar a hemlise sensvel ao oxignio;
Incubar a 352C por 18 - 24 h;

Observar as caractersticas do crescimento: as colnias devem ser lisas, pequenas, brilhantes,


acinzentadas, elevadas, podendo apresentar concavidade central, rodeadas por halo de
hemlise parcial, com aspecto esverdeado. Um esfregao corado pelo Gram dever confirmar
as caractersticas de diplococos com pontas em forma de lana, Gram-positivos;

Figura 18 - Colnias de S. pneumoniae


Repicar colnia bem isolada para gar chocolate 10% e incubar a 352C por 18 - 24 horas;
Preparar esfregao e cor-lo pelo Gram para verificar a pureza da cultura;
Proceder s provas de identificao (optoquina e solubilidade em bile). A prova da catalase
deve ser feita para caracterizar o gnero.

Deteco direta de Streptococcus -hemolticos


A deteco direta de antgenos estreptoccicos tem sido utilizada para identificao
de Streptococcus do grupo A em amostras de orofaringe. A sensibilidade do teste depende no
apenas do mtodo utilizado, mas tambm da quantidade de Streptococcus spp. presente na
amostra. Este teste apresenta excelente especificidade, apesar de raramente detectar a
presena de outros Streptococcus do grupo A que no o S. pyogenes, isto , um teste falso
positivo.
A amostra coletada atravs de um swab e inoculada em uma soluo de extrao. Aps um
pequeno perodo de incubao, a suspenso de antgenos detectada por mtodos de
aglutinao, enzima imunoensaios ou outros mtodos. Falso negativo podem ocorrer em
amostras contendo pequenas quantidades de Streptococcus spp., portanto testes negativos
devem ser seguidos de cultura microbiolgica.
Testes rpidos para deteco de antgenos de Streptococcus do grupo B em amostras do trato
urogenital tambm esto disponveis comercialmente, porm no apresentam a sensibilidade
necessria para a deteco de baixos nveis de colonizao e no so recomendados para a
pesquisa destes agentes em gestantes.

dentificao sorolgica

Permite identificar os sorotipos de pneumococo. Sua importncia exclusivamente


epidemiolgica e no clnica. Por essa razo, deve ser realizada apenas nos laboratrios de
referncia, conforme recomendao mundial. O mtodo clssico chama-se reao
de Neufeld ou de Quellung. Consiste na reao entre a bactria na fase log do crescimento e
anti-soros especficos para as diferentes cpsulas do pneumococo. Como existem muitos
sorotipos, so feitos pools de anti-soros para uma triagem inicial, em um sistema semelhante a
um tabuleiro de xadrez. Por este mtodo, se o resultado for sorogrupo(s), utilizam-se soros
adicionais especficos at se identificar o sorotipo.
A reao visualizada em microscpio tico, com leo de imerso e aumento de 1000X, aps
se adicionar a um pequeno esfregao da cultura em lmina de vidro, uma gota do anti-soro e
uma gota de soluo de azul de metileno a 0,3%. Aps cobrir com lamnula, observar a
presena de bactrias com cpsulas aumentadas, com refringncia modificada, como resultado
da reao entre o PS e o anti-soro especfico. A visualizao exige preparo do tcnico. Devem
ser usados anti-soros produzidos pelo StatensSerumInstitute, Copenhague, Dinamarca.
5. Armazenamento
O S. pneumoniae uma bactria sensvel s condies ambientais, portanto necessrio
tomar cuidado quanto sua conservao e ao transporte entre laboratrios. A melhor forma de
se garantir a viabilidade durante um perodo curto de armazenamento (em torno de uma
semana) o crescimento em gar chocolate inclinado em tubos com tampa de rosca em
temperatura ambiente. O pneumococo no sobrevive bem em meios lquidos e em meio de
isolamento primrio, sobrevive somente por 3 a 5 dias. O melhor modo de se manter a bactria
por perodo prolongado liofiliz-la ou congel-la.

Resistncia
Streptococcus pneumoniae
O S. pneumoniae no produz a enzima -lactamase. A resistncia do pneumococo penicilina
resultante de alteraes qumicas nos stios da parede celular, aos quais se ligam os betalactmicos. Os alvos especficos da ao da penicilina so protenas (PenicillinBindingProteins,
PBPs) que catalisam o estgio terminal da sntese de peptideoglicano, constituinte vital da
parede celular. Os pneumococos possuem seis PBPsimunologicamente distintas. A diminuio
da afinidade das PBPs penicilina pode envolver alterao em uma nica PBP ou em
diferentes PBPs ao mesmo tempo, levando a uma resistncia que se caracteriza por ser aditiva
ou progressiva. Alto nvel de resistncia requer alterao de muitos determinantes genticos, o
que suporta a teoria de eventos mltiplos de transformao sobre uma srie de mutaes
pontuais.
As alteraes dos alvos de atuao da penicilina so resultantes de mutaes cromossmicas,
as quais se disseminam rapidamente pelo processo de transformao gentica intra e
interespecfica. O pneumococo uma bactria naturalmente transformvel, permitindo a
disseminao dos genes de resistncia sem a necessidade de vetor ou contato fsico.
A resistncia do pneumococo a outros -lactmicos est diretamente correlacionada com o
nvel de resistncia penicilina. Esta resistncia cruzada entre as diferentes drogas desta
classe de antimicrobianos, inclusive s celalosporinas de terceira gerao, motivo de grande
preocupao em sade pblica.
Os testes de sensibilidade aos antimicrobianos so realizados em gar Meller-Hinton com
sangue de carneiro a 5% para a difuso em disco e caldo Meller-Hinton com ajuste de ctions
e 2,5% a 5% de hemolisado de cavalo 10% para os testes de concentrao inibitria mnima.
Devem seguir rigorosamente a metodologia e os critrios padronizados
pelo ClinicalandLaboratory Standards Institute (CLSI/NCCLS), que publica atualizaes anuais
do assunto.
Streptococcus -hemolticos
No h descrio de cepas de Streptococcus -hemolticos resistentes aos antimicrobianos lactmicos ou vancomicina. Entretanto, assim como S. pneumoniae, cepas
de Streptococcus -hemolticos resistentes aos macroldeos podem apresentar-se resistentes
clindamicina. Esta resistncia pode ser induzvel ou constitutiva. A resistncia induzvel
codificada pelo gene erm, resultando na metilao da poro 23S do RNAr, fentipo conhecido

como MLSB (macroldeos, lincosamina e estreptogramina b) e a resistncia constitutiva ocorre


pela presena do gene mef, atravs de um mecanismo de efluxo.

II - Enterococcus spp.
1. Introduo
Enterococcus, desde 1984 passou a constituir um gnero e, juntamente com
os Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Abiotrophia, Globicatella eLeuconostoc, faz parte
do grupo dos cocos Gram-positivos agrupados em cadeia, anaerbios facultativos e catalase
negativa.
Estes microrganismos caracterizam-se tambm pela capacidade de crescimento a 10C e 45C
e em pH 9,6. Sobrevivem na concentrao de 6,5% de NaCl, a 60C por 30 minutos e tambm
fazem hidrlise da esculina na presena de 40% de sais de bile. Alm destas caractersticas,
diferenciam-se dos demais gneros pela hidrlise da pirrolidonil--naftilamida (PYR), que
ocorre na maior parte das espcies e tambm da leucina--naftilamida (LAP).
2. Importncia clnica
Os enterococos, alm de serem amplamente distribudos na natureza, fazem parte da
microbiota normal do ser humano, principalmente do trato gastrointestinal. Podem ser isolados
em indivduos saudveis em outras localizaes como pele, regio peri-anal, via hpato-biliar e
em secrees de orofaringe e vaginal.
Dentre as espcies descritas, os E. faecalis e E. faecium so os mais associados a
manifestaes clnicas. Outras espcies como E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans e E.
avium so clinicamente de menor importncia.
A associao deste gnero com endocardite bacteriana classicamente conhecida. Por outro
lado, denota-se atualmente o isolamento destas bactrias, em diversos stios, causando
infeces relacionadas assistncia sade, como:
Infeces do trato urinrio (ITU);
Infeces da corrente sangunea (ICS);
Infeces de stio cirrgico e intra-abdominais.
No trato urinrio, alm de infeco, podem representar colonizao ou bacteriria
assintomtica.
3. Isolamento
Os mtodos habitualmente padronizados para coleta de sangue, urina, amostras cirrgicas e
de outros stios so adequados na suspeita da existncia de enterococos.
Pelo fato de serem relativamente resistentes s condies ambientais, no existem
recomendaes especficas para o transporte destas amostras.
As diferentes espcies de enterococos multiplicam-se bem em gar Meller-Hinton acrescidos
ou no de sangue, ou ainda com outras bases comoBrain Heart Infusion (BHI) e outros meios
enriquecidos. O gar azida um exemplo de meio enriquecido bastante utilizado para o
isolamento destas bactrias, principalmente quando existe a possibilidade da amostra conter
concomitantemente bacilo Gram-negativo.
Em gar sangue, as colnias, aps 24 h de crescimento, tm aproximadamente 1 a 2 mm de
dimetro. Aproximadamente um tero dos Enterococcusfaecalis apresentam-se com betahemlise em gar contendo sangue humano, coelho ou cavalo, mas so no-hemolticas em
sangue de carneiro. As outras espcies so usualmente no-hemolticas.

A temperatura adequada de crescimento de 352C e, apesar de algumas cepas crescerem


melhor em concentraes aumentadas de CO2 no existe necessidade de atmosfera especial.
O uso de meios cromognicos uma opo, uma vez que pode haver liberao do resultado
com mais agilidade e ainda permite maior facilidade de isolamento em amostras no puras.
Quando se pretende identificar portadores de Enterococcus spp. resistentes vancomicina
(VRE), as amostras indicadas so aquelas obtidas atravs de coleta de swab anal, swab perianal (mtodo de triagem recomendado pelo Centers for DiseaseControlandPrevention (CDC)
ou fezes. A sensibilidade, do mtodo, est relacionada com a densidade de microrganismos
encontrados nas fezes.
Comercialmente em nosso meio, temos tambm o VREBAC (PROBAC do Brasil), Figura
4 que um laminocultivo que apresenta na face mais larga meio de azida com aztreonam (10
g/mL), polimixina-B (75 g/mL) e anfotericina-B (10 g/mL); a face posterior composta de
uma lmina que possui gar azida com aztreonam, polimixina-B e anfotericina-B nas mesmas
concentraes anteriores acrescido de vancomicina (6 g/mL) e outra lmina que incorpora
estes mesmos antimicrobianos em meio cromognico (Chromagar Orientation).
Na Figura 5, observa-se o laminocultivo com crescimento bacteriano em meio cromognico. O
enterococo isolado, se apresenta na colorao azul e a suplementao com antimicrobiano,
permite confirmar tratar-se de VRE.

Figura 4 - Laminocultivo para isolamento de VRE Figura 5 - Laminocultivo com crescimento de VRE
em meio cromognico

4. Identificao
O diagnstico do gnero Enterococcus spp., bem como das diferentes espcies, pode ser feito
em diversos nveis de complexidade.
Apesar de no haver caractersticas fenotpicas que diferenciem totalmente o
gnero Enterococcus de outros gneros relacionados, a presena de cocos Gram-positivos
dispostos aos pares ou em cadeias, catalase negativa com prova de PYR positiva, crescimento
em caldo de NaCl a 6,5% e hidrlise da esculina so provas presentes na maioria das espcies
do gnero Enterococcus. Com provas de PYR (Figura 6), hidrlise da esculina positiva (Figura
7) e crescimento em caldo de NaCl a 6,5% (Figura 8), so provas presentes na maioria das
espcies do gnero Enterococcus.

Figura 6 - PYR

Figura 7 - Bile-esculina

Figura 8 - Prova de crescimento


em meio com NaCl 6,5%

A produo de cido a partir de metil-a-D-glucopiranosdeo (MGP) auxilia na diferenciao


do E. faecium, E. gallinarum e E. casseliflavus. Considerando que para fins de controle e
preveno de infeces, as espcies de E. faecium e E. faecalis necessitam rapidamente ser
distinguidas deE. gallinarum e E. casseliflavus, a fermentao da xilose outro teste de valor.
Apesar de todos os enterococos fermentarem a xilose, pelo fato de os E. gallinarum possurem
a enzima pr-formada, a reao para esta espcie ocorre com maior rapidez, permitindo leitura
em duas horas.
Do ponto de vista prtico, o nico problema que estas
provas no so comercialmente disponveis no Brasil.

Alguns testes comerciais, baseados


em caractersticas bioqumicas, tm
utilizao para o diagnstico e
identificao das espcies dos
enterococos como o API 20 STREP
(bioMrieux), o sistema BD
BBL Crystal (Becton Dickinson
Cockeysville) e identificao de
enterococos (PROBAC do Brasil).
Como observado na Figura 14.

Figura 14 - Enterococcusfaecium, arginina+, arabinose+,


sorbitol-, motilidade- e manitol+
Os mtodos automatizados tambm so usualmente utilizados para a identificao e deteco
rpida da resistncia antimicrobiana dos enterococos. Dentre os mais utilizados destacam-se o
Vitek system e Vitek (bioMerieux), MicroScan (Siemens) e Phoenix (BD).
O desempenho dos mtodos automatizados vem sendo constantemente observado, incluindo
diversas alteraes nos painis e cartes, alm de adaptaes no software. A acurcia tem-se
mostrado melhor para E. faecalis, oferecendo maior dificuldade para E. faecium e outras
espcies.
Para deteco de resistncia, podem ser utilizados os mtodos manuais qualitativos (discodifuso) e quantitativos com micro ou macrodiluio. Do ponto de vista de rotina diria no
laboratrio de microbiologia, uma opo a metodologia epsilomtrica do E-test (AB Biodisk,
Solna, Sweden).
A concordncia de deteco de resistncia vancomicina pelos mtodos automatizados
melhor para o fentipo VanA, a exemplo de outras metodologias.
Por fim, as metodologias moleculares tambm so utilizadas tanto para diagnstico de VRE
direto da amostra, bem como para caracterizao genotpica da bactria
Resistncia
A resistncia antimicrobiana apresentada pelo Enterococcus pode ser classificada em
intrnseca ou adquirida. A resistncia intrnseca, naturalmente presente no cromossomo da
maioria ou em uma das espcies de Enterococcus, tem como principal exemplo a classe de
aminoglicosdeos e -lactmicos. As cefalosporinas so um grupo de antimicrobianos lactmicos que no tm ao sobre os Enterococcus, devido produo de protenas ligadoras
de penicilina de baixa afinidade a estes antimicrobianos (PBP5). Outra forma mais rara
atravs da produo de lactamases, cuja produo constitutiva, de baixo nvel e inculo
dependente, ao contrrio do observado no gnero Staphylococcus.
Portanto, a associao de um aminoglicosdeo com -lactmico deve ser realizada para
tratamento de infeces graves (endocardite, meningite) quando no h indicao de
resistncia de alto nvel no antibiograma.
A resistncia gentamicina e estreptomicina ocorre por diferentes mecanismos, sendo
necessrio testar ambas as drogas no antibiograma. A resistncia gentamicina ocorre pela
presena da enzima 2 - fosfotransferase - 61 - acetiltransferase que confere resistncia
tambm tobramicina, amicacina, netilmicina e kanamicina. Portanto, a gentamicina
preditora de resistncia para os aminoglicosdeos exceto para estreptomicina. A resistncia a
este antimicrobiano conferida pela presena da enzima estreptomicina adeniltransferase,
sendo que esta cepa mantm sensibilidade gentamicina.
De particular interesse teraputico e epidemiolgico a resistncia aos glicopeptdeos. Os
primeiros relatos de cepas de Enterococcus resistentes vancomicina (VRE) ocorreram na
Inglaterra e Frana, em 1988.
As cepas de VRE so classificadas em 6 gentipos e fentipos, sendo trs deles de maior
freqncia: o fentipo VanA, associado a alto nvel de resistncia induzvel tanto vancomicina
(CIM 64 g/mL) quanto teicoplanina (CIM 16 g/mL), codificada pelo gene vanA; o
fentipo VanB, associado a variveis nveis de resistncia (moderado a alto) induzvel apenas

vancomicina, codificado pelo gene vanB; e o fentipo VanC, associado a baixo nvel de
resistncia no-induzvel vancomicina, codificado pelo gene vanC.
Os fentipos VanA e VanB so os mais relevantes clinicamente e freqentemente associados
com cepas de E. faecium e E. faecalis, enquanto que o fentipo VanC uma caracterstica
intrnseca do E. gallinarum e E. casseliflavus. A induo de resistncia nos fentipos VanA e
VanB pode ocorrer pelos prprios glicopeptdeos (vancomicina, teicoplanina, avoparcina e
ristocetina), como por agentes no-glicopeptdeos como a bacitracina e a polimixina B. Os
demais fentipos de VRE ocorrem raramente e so determinados pelos genes recentemente
descobertos: vanD, vanE e vanG.
A expresso destes genes leva sntese de precursores de peptideoglicanos (principal
componente da membrana celular) com terminao em D-Ala-D-lactato (vanA e vanB) ou DAla-D-Ser (vanC) ao invs do D-Ala-D-Ala, levando a uma menor afinidade do alvo pela
molcula de vancomicina e prejudicando a ao antimicrobiana desta droga. Estes genes esto
presentes em elementos genticos mveis e podem ser adquiridos por outras espcies
de Enterococcus ou diferentes gneros de bactrias, como descrito para o Staphylococcus
aureus resistente vancomicina (VRSA).
O gene vanA j havia sido transferido in vitro para outros microrganismos Gram-positivos,
incluindo S. aureus. Apesar de cepas de Staphylococcushaemolyticus resistentes
vancomicina j terem sido isoladas, a primeira infeco documentada por Staphylococcus
aureus resistente vancomicina (VRSA), com CIM de 128 g/mL, foi somente relatada em
junho de 2002. Tratava-se de um paciente diabtico, portador de doena renal crnica, no qual
o agente foi isolado de um swab de inciso de cateter e da ponta do cateter.
A emergncia de VRE ocorreu de forma repentina nos Estados Unidos e como um grande
problema de sade pblica. Segundo dados do Centers for
DiseaseControlandPrevention (CDC), esta resistncia aumentou de 0,3% em 1989, para 7,9%
em 1993; neste mesmo perodo em Unidades de Terapia Intensiva, a variao foi de menos de
1% para 13,6%. Atualmente, esto sendo reportadas taxas de 25,9% para isolados de
hemocultura.
O primeiro VRE no Brasil, e provavelmente tambm na Amrica do Sul, foi isolado em uma
criana com anemia aplstica, em agosto de 1996, em Curitiba. Esta cepa foi identificada
como Enterococcusfaecium e caracterizada por apresentar um elemento de resistncia
divergente do gene vanD. Apresentava alto nvel de resistncia vancomicina (CIM 256
g/mL), porm com sensibilidade teicoplanina (CIM 4 g/mL). Neste perodo, em So Paulo,
foi isolado em lquor um Enterococcusfaecium com fentipo VanA.
De particular interesse teraputico e epidemiolgico a resistncia aos glicopeptdeos. Os
primeiros relatos de cepas de Enterococcus resistentes vancomicina (VRE) ocorreram na
Inglaterra e Frana, em 1988.
As cepas de VRE so classificadas em 6 gentipos e fentipos, sendo trs deles de maior
freqncia: o fentipo VanA, associado a alto nvel de resistncia induzvel tanto vancomicina
(CIM 64 g/mL) quanto teicoplanina (CIM 16 g/mL), codificada pelo gene vanA; o
fentipo VanB, associado a variveis nveis de resistncia (moderado a alto) induzvel apenas
vancomicina, codificado pelo gene vanB; e o fentipo VanC, associado a baixo nvel de
resistncia no-induzvel vancomicina, codificado pelo gene vanC.
Os fentipos VanA e VanB so os mais relevantes clinicamente e freqentemente associados
com cepas de E. faecium e E. faecalis, enquanto que o fentipo VanC uma caracterstica
intrnseca do E. gallinarum e E. casseliflavus. A induo de resistncia nos fentipos VanA e
VanB pode ocorrer pelos prprios glicopeptdeos (vancomicina, teicoplanina, avoparcina e

ristocetina), como por agentes no-glicopeptdeos como a bacitracina e a polimixina B. Os


demais fentipos de VRE ocorrem raramente e so determinados pelos genes recentemente
descobertos: vanD, vanE e vanG.
A expresso destes genes leva sntese de precursores de peptideoglicanos (principal
componente da membrana celular) com terminao em D-Ala-D-lactato (vanA e vanB) ou DAla-D-Ser (vanC) ao invs do D-Ala-D-Ala, levando a uma menor afinidade do alvo pela
molcula de vancomicina e prejudicando a ao antimicrobiana desta droga. Estes genes esto
presentes em elementos genticos mveis e podem ser adquiridos por outras espcies
de Enterococcus ou diferentes gneros de bactrias, como descrito para o Staphylococcus
aureus resistente vancomicina (VRSA).
O gene vanA j havia sido transferido in vitro para outros microrganismos Gram-positivos,
incluindo S. aureus. Apesar de cepas de Staphylococcushaemolyticus resistentes
vancomicina j terem sido isoladas, a primeira infeco documentada por Staphylococcus
aureus resistente vancomicina (VRSA), com CIM de 128 g/mL, foi somente relatada em
junho de 2002. Tratava-se de um paciente diabtico, portador de doena renal crnica, no qual
o agente foi isolado de um swab de inciso de cateter e da ponta do cateter.
A emergncia de VRE ocorreu de forma repentina nos Estados Unidos e como um grande
problema de sade pblica. Segundo dados do Centers for
DiseaseControlandPrevention (CDC), esta resistncia aumentou de 0,3% em 1989, para 7,9%
em 1993; neste mesmo perodo em Unidades de Terapia Intensiva, a variao foi de menos de
1% para 13,6%. Atualmente, esto sendo reportadas taxas de 25,9% para isolados de
hemocultura.
O primeiro VRE no Brasil, e provavelmente tambm na Amrica do Sul, foi isolado em uma
criana com anemia aplstica, em agosto de 1996, em Curitiba. Esta cepa foi identificada
como Enterococcusfaecium e caracterizada por apresentar um elemento de resistncia
divergente do gene vanD. Apresentava alto nvel de resistncia vancomicina (CIM 256
g/mL), porm com sensibilidade teicoplanina (CIM 4 g/mL). Neste perodo, em So Paulo,
foi isolado em lquor um Enterococcusfaecium com fentipo VanA.
importante ressaltar que cepas de VRE no so rotineiramente isoladas na maioria dos
centros mdicos de nosso pas, e a preveno e o controle da sua disseminao so as armas
mais importantes para venc-las. Portanto, necessrio que o laboratrio de microbiologia
esteja atento e capacitado para detect-las.

Concluso
A resistncia aos aminoglicosdeos mediada por plasmdeos, tornando-se assim
problemtica, uma vez que pode ser transferida a outras bactrias. A colonizao ou infeco
por VRE tem sido associada a vrios fatores como: tempo de internao, doena de base
diabetes mellitus, insuficincia renal e comunitria.

Bibliografia:
1. Appelbaum PC, Bozdogan B. Vancomycinresistance in Staphylococcus aureus. ClinLab Med.
2004 ; 24: 381-402.
2. Del Alamo L, Azevedo PA, Strob AJ, Rodriguez-Lopez DV, Monteiro J, Andrade SS, Pignatari
ACC, Gales AC. An outbreak of catalase-negative meticillin-resistant Staphylococcus aureus. J
Hosp Infect. 2007; 65: 226-30.
3. Deresinski, S. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: anevolutionary, epidemiologic,
andtherapeuticodyssey. Clin Infect Dis. 2005; 40: 56273.http://www.journals.uchicago.edu/doi/pdf/10.1086/427701
4. Diekema DJ, Pfaller MA, Schmitz FJ, Smayevsky J, Bell J, Jones RN, Beach M.
Surveyofinfectionsdueto Staphylococcus species:
Frequencyofoccurrenceandantimicrobialsusceptibilityofisolatescollected in the United States,
Canada, LatinAmerica, Europe, andthe Western Pacific Region for the SENTRY
AntimicrobialSurveillanceProgram, 19971999. Clin Infect Dis. 2001; 32: S11432.http://www.journals.uchicago.edu/doi/pdf/10.1086/320184
5. Kloss WE & Bannerman TL. Staphylococcus and Micrococcus. In: Manual of clinical
microbiology. Editor in Chief Murray PR. 9th ed. Washington: ASM Press; 2007.