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INSTITUTO DE MACROMOLCULAS PROFESSORA ELOISA MANO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO


IMA - UFRJ

CROMATOGRAFIA
DE
PERMEAO EM GEL
Ricardo Cunha Michel
LAFIQ
sala J-210
3938-7228
rmichel@ima.ufrj.br
IMA CT / UFRJ
Ricardo C. Michel
v. 2015

ou
CROMATOGRAFIA DE
EXCLUSO POR TAMANHO
O experimento de GPC / SEC
O princpio da tcnica
Determinao relativa de Massa Molar
Preciso e Exatido da tcnica
O problema da relao entre massa molar e volume hidrodinmico
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Cromatografia
Separar Reduzir a entropia
Mtodos cromatogrficos, de uma forma geral,
- permitem a separao, quantificao e identificao de espcies qumicas;
- separam os componentes de uma mistura pela distribuio destes
componentes em duas fases que se encontram em contato, uma fase mvel e
outra fase estacionria;
- durante a passagem da fase mvel pela estacionria, os componentes da
mistura so seletivamente retidos pela fase estacionria, o que resulta em
migraes diferenciais destes componentes.
- a reteno seletiva pode operar por mecanismos entrpicos ou entlpicos.

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Cromatografia
Permeao em Gel ou Excluso por Tamanho
A Cromatografia de Permeao em Gel
uma tcnica na qual existe um suporte fixo,
um gel,
que NO a fase estacionria, mas que a contm.
Alm disto,
espera-se que no haja interaes
entre os componentes da amostra a separar e o suporte fixo,
de modo que todo o processo cromatogrfico
deve se dar apenas
devido ao tamanho dos componentes da mistura.
Este aspecto desta tcnica cromatogrfica justifica
seu outro nome:
Cromatografia de Excluso por Tamanho
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Cromatografia de Excluso por Tamanho


SEC
Tambm conhecida por
GPC, cromatografia de permeao em gel, ou
GFC, cromatografia de filtrao em gel, ou
cromatografia em peneira molecular de difuso restrita.
Permite obter a
distribuio de Massa Molar,
bem como os valores relativos de
Massa Molar Numrica Mdia (Mn) e de
Massa Molar Ponderal Mdia (Mw).
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Cromatografia de Excluso por Tamanho


Esquema Bsico do Aparelho

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Cromatografia de Excluso por Tamanho


Esquema Bsico do Aparelho
processamento
de dados
seringa
garrafa
contendo a
fase mvel

'loop'
detector

coluna

bomba isocrtica
ou de gradiente
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injetor

descarte
ou reuso

Cromatografia de Excluso por Tamanho


Esquema Bsico do Aparelho
processamento
de dados
seringa
garrafa
contendo a
fase mvel

'loop'
detector

coluna

bomba isocrtica
ou de gradiente
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injetor

descarte
ou reuso

Cromatografia de Excluso por Tamanho


Como a Coluna de Separao?
A coluna consiste de um tubo metlico recheado de pequenas
esferas de polmero reticulado.

Obs.: esta foto apenas


representa os poros das
partculas que recheiam
a coluna, sendo, de fato,
imensamente maiores
do que os poros reais.
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Cromatografia de Excluso por Tamanho


Ao da Coluna de Separao

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Cromatografia de Excluso por Tamanho


Qual o princpio desta cromatografia?

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Cromatografia de Excluso por Tamanho


Descries do Princpio de Funcionamento

Um dos modos de descrever como a separao ocorre:


as molculas pequenas o bastante para entrarem nos poros da
resina, ao longo da coluna, so momentaneamente removidas do
fluxo principal de solvente (excluso), necessitando de mais
tempo para atravessar a coluna.

Outro modo de descrever este processo :


as molculas que so pequenas o bastante para entrar nos poros
da coluna tm acesso a um volume maior da mesma.
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Como Calcular Massa Molar?


Massa Molar e sua Distribuio
n=0 : Mn

Concentrao (g/mL)

Mx =

Ci Mi
Ci M i

n1

n=2 : Mz
n=3 : Mz+1

PD = Mw/Mn
Massa Molar (g/mol)

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n=1 : Mw

Como Calcular Massa Molar?

tenso eltrica (volts)

Como a curva obtida no experimento de GPC?

tempo (minutos)
ou
volume (mL)

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Como Calcular Massa Molar?

tenso eltrica (volts)

Como a curva obtida no experimento de GPC?

tempo (minutos)
ou
volume (mL)

Precisamos obter da curva:


valores relativos a Massa Molar
e
valores relativos a concentrao,
para cada frao eluda atravs da coluna.
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Como Calcular Massa Molar?


Como a curva obtida no experimento de GPC?

n=0 : Mn

Concentrao (g/mL)

tenso eltrica (volts)

Mx =

tempo (minutos)
ou
volume (mL)

Precisamos obter da curva:


valores relativos a Massa Molar
e
valores relativos a concentrao,
para cada frao eluda atravs da coluna.
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Ci M i
i
C i M i n1
i

n=1 : Mw
n=2 : Mz
n=3 : Mz+1

PD = Mw/Mn
Massa Molar (g/mol)

volume de eluio massa molar


(curva de calibrao)
concentrao
em cada volume de eluio
(detectores de concentrao)

Curva de Calibrao
Injeo de padres
M1, V1

Padres para GPC


so amostras polimricas com
distribuio estreita e conhecida de massa
molar.

M2, V2

As diferentes amostras de padro, cada


qual com um diferente valor de massa
molar, possuem a mesma relao entre
massa molar e volume hidrodinmico.

volume de eluio em ml

volume de eluio em ml

M3, V3
volume de eluio em ml

M4, V4
volume de eluio em ml
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Assim, quanto maior a massa molar,


maior o volume hidrodinmico e mais
cedo esta amostra deixa a coluna.
Os padres de M.M. conhecida so
injetados para que se obtenha o volume
de eluio de cada um deles neste
equipamento, coluna, solvente e
temperatura.

Curva de Calibrao
Bsica: volume de eluio versus massa
M1, V1

Com os pares de pontos log(Mi) e Vi traa-se um


grfico e calcula-se a melhor reta, cujos parmetros
so a e b. Isto , y = a + b.x

log M i =ab.V e

volume de eluio em ml

log (Mw)

M2, V2
volume de eluio em ml

M3, V3
volume de eluio em ml

M4, V4
volume de eluio em ml
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volume de eluio em ml

A massa molar de qualquer amostra que tenha a


mesma relao entre massa e volume hidrodinmico
que os padres e que deixe a coluna aps Ve dada
por:

M i =10

ab.V e

Curva de Calibrao
Tempo de Eluio versus Volume de Eluio
Se medimos, de fato,
o TEMPO de eluio,
por qu fazemos as contas usando
o VOLUME de eluio?
Porque a curva passa a ser
independente da vazo empregada!

Vei vazo. t ei
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Clculo de Massa Molar

Concentrao (g/mL)

O que falta?

Falta obter Ci

Volume de reteno massa molar

OK!
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Como Calcular Massa Molar?


Sensores de Concentrao
Os dois sensores principais utilizados para a medida da
concentrao das alquotas fracionadas da amostra principal so:
Detector de ndice de Refrao (RI)
Detecta a diferena de ndice de refrao entre a soluo e o
solvente empregado. Esta diferena funo da concentrao da
amostra.
Detector de UltraVioleta (UV)
(Photodiode Array Detector - Matriz de Foto-diodos)
Detecta a quantidade de luz ultra violeta absorvida em um ou
vrios comprimentos de onda. Sendo conhecida a absorvncia e
os parmetros da clula, esta quantidade proporcional a
concentrao da amostra.
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Sensores de Concentrao
Matriz de Foto-diodos
alquota proveniente da coluna
Clula de fluxo

Grade de difrao

Fonte de UV
O sinal em cada foto-diodo funo
da absoro da amostra na faixa de
Matriz de Foto-diodos
comprimentos de onda detectados
por este foto-diodo especfico.
PC
ADC
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Sensores de Concentrao
Refratmetro Diferencial
A deflexo do feixe de luz
funo da diferena entre
o ndice de refrao da amostra
e o ndice de refrao do
solvente empregado.

Detectores

alquota
proveniente
da coluna
Fonte de luz
de comprimento de onda conhecido
(branca, em alguns modelos)
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Concentrao necessria
ou um valor proporcional a concentrao
Estes sensores de concentrao geram um sinal eltrico, em Volts,
cujo valor proporcional concentrao da alquota:
Sinal (V) C ou seja:

C = k.Sinal (V)

C i = .si

Assim, as equaes para clculo de massa molar mdia podem ser


descritas em termos do sinal eltrico gerado, sem a necessidade de
se calibrar os sensores de concentrao para obter os valores das
constantes .
Mx

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n
C
M
i i

Ci M

n 1
i

n
n

.
s
M

.
s
M
i i i i
Mx
n 1
n 1

.
s
M

.
s
M
i i
i i

n
s
M
i i

n 1
s
M
i i

Medida em SEC
Resumo
1) As colunas separam a amostra de acordo com os volumes
hidrodinmicos das molculas presentes;
2) A amostra separada passa pelo detector de concentrao, o qual gera um
sinal de tenso proporcional a concentrao da amostra;
3) Da curva obtida de
sinal proporcional concentrao versus volume de eluio
converte-se os valores de volume de eluio em valores de Massa Molar,
utilizando a curva de calibrao previamente obtida;
4) Com a nova curva de
sinal proporcional concentrao versus massa molar
so calculados os valores de
Massa Molar Mdia Numrica,
Massa Molar Mdia Ponderal e
dispersidade
de acordo com as equaes mostradas.
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Clculo dos Valores de Massa Molar


Preparao da curva obtida

Tipicamente,
utiliza-se uma
reta para fazer
este ajuste.
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Agora a curva est


pronta para ser
analisada, gerando os
valores de Massa
Molar.
massa molar

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Clculo da Massa Molar e Polidisperso

Concentrao (g/mL)

Mx =

C i M in
i
C i M i n1
i

n=1 : Mw
n=2 : Mz
n=3 : Mz+1

PD = Mw/Mn

Massa Molar (g/mol)


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n=0 : Mn

Clculo Automatizado
Exemplo em BASIC - primeira parte
INI:
DEFDBL A-Z
CLS
rem A curva de calibracao
INPUT "Entre com a inclinacao (b) ";R8
PRINT
INPUT "Entre com a intersecao (a) ";R9
PRINT
INPUT "Entre com intervalo de volume ";nit
rem nit eh constante para simplificar o trabalho do usuario - os valores de volume de eluicao nao precisariam ser
igualmente espacados
PRINT
PRINT
VE:
rem os valores da rotina estatistica sao calculados durante a leitura dos dados a partir do teclado
Q=0:R3=0#:R5=0#:R6=0#:R7=0#:N=0
PRINT"Press. <ENTER>":LINE INPUT S$:CLS
INPUT "Entre com o volume de eluicao Ve para o primeiro valor de intensidade Hi <-1 p/ novas incl e interc> ", R7
IF R7=-1 then GOTO INI
PRINT : PRINT
PRINT "Entre com os valores de Hi, seguidos de <RETURN>.<-1 indica fim dos dados>"
rem os valores de hi ja tiveram a linha de base subtraida
PRINT
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Clculo Automatizado
Exemplo em BASIC - segunda parte
entr:
N = N + 1: INPUT X: PRINT "

"; CHR$(30); "<---"; N; CHR$(167);" Hi"

rem truquezinho grafico meio ultrapassado, este do chr$30 - S funciona em DOS


IF X = -1 THEN goto RES
'rotina estatistica
Q = R7 * R8 + R9
R3 = R3 + X
R5 = R5 + X * EXP(Q)
R6 = R6 + X / EXP(Q)
R7 = R7 + nit
goto entr
RES:
PRINT : PRINT "Mw = "; INT(R5 / R3)
PRINT "Mn = "; INT(R3 / R6)
PRINT "Mw/Mn = "; INT((R5 / R3) / (R3 / R6) * 100) / 100
goto VE

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Programa desenvolvido no IMA para clculo de M.M. por GPC

Massas Molares Mdias obtidas por GPC


So valores relativos e no absolutos!

Os valores de massa molar obtidos para uma dada distribuio


so calculados a partir de uma curva de calibrao,
obtida para amostras padro.
Assim,
os valores de massa molar obtidos so ditos serem
valores relativos.

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Preciso e Exatido
na tcnica de GPC

..

preciso:
(repetitividade)
melhor do que 5%

exatido ou acurcia:
(concordncia com o valor verdadeiro)
em torno de 10%
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O problema da calibrao
Relao entre massa molar e volume hidrodinmico
M1, V1
volume de eluio em ml

Uma amostra com a mesma massa do padro 2,


porm de um polmero mais rgido, ser mais
aberta, isto , ter um volume hidrodinmico
maior e sair mais cedo da coluna. De acordo
com esta curva de calibrao, ser como se a
amostra tivesse uma massa molar maior do que
sua massa real.

M2, V2
ln (Mw)

volume de eluio em ml

M3, V3
volume de eluio em ml

M4, V4
volume de eluio em ml
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volume de eluio em ml

MASSA MOLAR
E
VOLUME HIDRODINMICO
Massa Molar versus Volume Hidrodinmico
Fatores que afetam o Volume Hidrodinmico
Conformao e Configurao
(Rigidez, Ramificaes etc.)
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Volume Hidrodinmico e Massa Molar


Em SEC a separao se d por Volume Hidrodinmico

De fato, a tcnica de SEC


no separa as molculas de acordo com suas massas molares,
mas de acordo com o volume hidrodinmico que apresentam.
Assim,
a curva de calibrao obtida
s vlida
para amostras que possuam
a mesma relao entre massa molar e volume hidrodinmico
que aquela apresentada pelos padres empregados.
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Volume Hidrodinmico e Massa Molar


O que Volume Hidrodinmico?

O Volume Hidrodinmico indica


quo grande o novelo em soluo.
O volume hidrodinmico no informa
sobre a distribuio de massa no interior do novelo.
Para uma dada amostra,
quanto maior for sua massa molar,
maior ser seu volume hidrodinmico.
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Volume Hidrodinmico e Massa Molar


Fatores que afetam esta relao

Os fatores que afetam a relao entre Vh e M.M. so:


Configurao da cadeia polimrica
Conformao da cadeia polimrica
Interao entre o polmero e o solvente
Temperatura

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Volume Hidrodinmico e Massa Molar


exemplos
Mesmo valor de massa molar,
mas diferentes valores de volume hidrodinmico
cadeia mais
aberta,
maior Vh

Mesmo valor de volume hidrodinmico,


mas massas molares distintas:

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cadeia mais
fechada,
menor Vh

Massa Molar Relativa...


...quer dizer mais do que se imagina!
Quando se usa um padro de massa molar
que no possui a mesma relao
entre Vh e MM que o polmero-problema,
ento
a massa molar obtida ser relativa tambm ao tipo de padro usado:
relativa por ter sido calculada com o uso de padres de massa molar e
relativa ao tipo de padro usado!

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O que realmente significa quando se diz que


a amostra apresenta certo valor de Massa Molar?
Quando se diz:
A massa do polmero-problema foi calculada usando padres de PS,
obtendo-se o valor de 100.000 g/mol.
ou:
A massa do polmero-problema foi calculada em 100.000 g/mol em relao a
padres de PS.
...na verdade o que se quer transmitir :
O polmero-problema apresenta o mesmo volume hidrodinmico que PS de
massa molar igual a 100.000 g/mol.
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Curvas de Calibrao
Calibrao com Padres de Distribuio Estreita de Massa Molar
Calibrao com Amostras de Distribuio Larga de Massa Molar
Calibrao Universal
Quando cada tipo de calibrao mais eficaz
Tcnicas Absolutas em GPC

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Calibrao com Padres de Distribuio Estreita

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Calibrao com Padres de Distribuio Estreita


Injeo de padres
M1, V1

Padres para GPC


so amostras polimricas com
distribuio estreita e conhecida de massa
molar.

M2, V2

As diferentes amostras de padro, cada


qual com um diferente valor de massa
molar, possuem a mesma relao entre
massa molar e volume hidrodinmico.

volume de eluio em ml

volume de eluio em ml

M3, V3
volume de eluio em ml

M4, V4
volume de eluio em ml
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Assim, quanto maior a massa molar,


maior o volume hidrodinmico e mais
cedo esta amostra deixa a coluna.
Os padres de M.M. conhecida so
injetados para que se obtenha o volume
de eluio de cada um deles neste
equipamento, coluna, solvente e
temperatura.

Curva de Calibrao
Bsica: volume de eluio versus massa
M1, V1

Com os pares de pontos log(Mi) e Vi traa-se um


grfico e calcula-se a melhor reta, cujos parmetros
so a e b. Isto , y = a + b.x

log M i =ab.V e

volume de eluio em ml

log (Mw)

M2, V2
volume de eluio em ml

M3, V3
volume de eluio em ml

M4, V4
volume de eluio em ml
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volume de eluio em ml

A massa molar de qualquer amostra que tenha a


mesma relao entre massa e volume hidrodinmico
que os padres e que deixe a coluna aps Ve dada
por:

M i =10

ab.V e

Curva de Calibrao
Relao entre Massa Molar e Volume de Eluio
Ajuste Polinomial
log (Mi)

linear

log M i =ab.V e

quadrtico (2a ordem)


2

log M i =ab.V e c.V e


Volume de Eluio

cbico (3a ordem)


2

log M i =ab.V e c.V e d.V e


Alguns fabricantes de colunas sugerem que se use polinomiais de 5 a ordem!!!
Isto por qu a distribuio de volume dos poros no recheio da coluna no linear!
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Curva de Calibrao
Limites de Excluso

Ve V0 KVP
Ve = volume de eluio
V0 = volume intersticial
Vp = volume dos poros
K = coeficiente de
distribuio do soluto
O pico em (A) indica algum
tipo de repulso entre as
molculas do polmero
(excluso inica).
V0
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VP

V0+VP

-O pico em (C)
indica adsoro
do polmero
pelo material
da coluna.
-O modo como
este polmero
elui poderia ser
representado
pela curva
indicada em
(B) (interaes
hidrofbicas ou
hidroflicas).

Curva de Calibrao
Alguns Exemplos

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Curva de Calibrao
Ateno aos limites da curva! No extrapolar!
Sempre observar com ateno os picos em torno
de Vo e de Vo+Vp !
Uma amostra com molculas que ultrapassem os
limites de eluio da coluna poder se apresentar
da seguinte forma:
Parece bimodal, no?
Mas no ! Vejam:

Todas as molculas maiores do que o limite de excluso sairo juntas da


coluna, isto , sero acumuladas no volume de eluio V o, parecendo constituir
um pico. O mesmo tipo de problema pode ocorrer com molculas menores do
que o limite da coluna, as quais sairo em torno de Vo+Vp.
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Curva de Calibrao
Padres Comuns

Padres para GPC orgnico:


poli(metaacrilato de metila)
poli(isoprenos)
polibutadienos
poli(THF)
Padres para GPC aquoso:
poli(etileno glicol)
poli(xido de etileno)
pululanas
Polidisperso usual: < 1,1
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Calibrao com Amostras de Distribuio Larga

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Calibrao com Amostras de Distribuio Larga


Injeo de padres
Nesta tcnica,
para se realizar a anlise de uma dada amostra-problema, injeta-se na coluna
um padro de distribuio larga e de massa molar conhecida. Este padro
pode ser comercial ou, se possvel, do mesmo polmero sendo analisado.
A curva de distribuio obtida para este padro, na mesma coluna e
condies na qual se analisar a amostra-problema.
De posse desta curva de distribuio e dos valores conhecidos de M w e de Mn
para o padro, calcula-se por um mtodo iterativo a curva de calibrao que
ser empregada para a anlise das amostras-problema.
conveniente empregar pelo menos dois padres ao usar esta tcnica. Os
pontos da curva de calibrao correspondem a M n e a Mw de cada um dos
padres empregados.
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Calibrao Universal

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Calibrao Universal
em duas formas diferentes
Existem duas formas de realizar a Calibrao Universal:
A primeira delas a calibrao universal clssica, para a qual se utiliza um
viscosmetro em linha com o sistema de GPC. Em um mesmo volume de
eluio, as amostras problema e padro apresentaro um mesmo volume
hidrodinmico e, portanto, um mesmo valor para o produto [].M. Uma vez
dispondo deste produto para o padro, basta medir a [] da amostra problema
em cada alquota e calcular seu valor de M.
Caso o equipamento no disponha de um viscosmetro em linha, pode
ser usada a segunda forma de construo da calibrao universal. Esta
forma combina os princpios da calibrao universal com a equao de
Mark-Houwink-Sakurada. Neste caso, obtm-se M da amostra-problema em
relao a uma curva construda com padres de distribuio estreita. Este
valor de M , ento, corrigido, usando-se para tal os valores de K e de a da
amostra problema e do padro.
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Calibrao Universal
Para sistemas com viscosmetro em linha
- Polmeros com o mesmo volume hidrodinmico (VH) eluiro no mesmo volume de
eluio;
- A interao do polmero com o solvente ir se refletir no valor de viscosidade
intrnseca, [];
- Segundo Einstein

VH . M V

Assim,

[]1.M1 = []2.M2

- Medindo o valor de [] para padres de massa molar conhecida, e verificando seus


volumes de eluio, pode-se traar a curva log([].M) versus volume de eluio a qual
consistir na curva de calibrao para este polmero.
- Mede-se Ve para cada alquota da amostra-problema e obtm-se da curva de calibrao
seu valor de [].M. Divide-se este valor por [] medido no viscosmetro para esta
alquota e obtm-se M da alquota.
- As curvas de calibrao para uma grande variedade de polmeros orgnicos so
sobreponveis, por isto o nome Calibrao Universal.
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Calibrao Universal

log([].M)

curvas para vrios polmeros em uma mesma coluna

volume de eluio
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Esta imagem pode ter Direitos Autorais

Calibrao Universal
Para sistemas sem viscosmetro em linha
Do princpio de calibrao universal:

[ 1 ]. M 1=[ 2 ]. M 2

Substitui-se [] pelo valor da equao


de Mark-Houwink-Sakurada:

[ ]=K.M a

Desta forma se obtm:

Isolando M1 nesta equao:

1a1

K1 . M 1

1a 2

=K 2 . M 2

1
2 1 a1

K
M 1i =
K1

.M

1 a 2
1 a 1
2i

M2 obtido para a amostra-problema a partir do Ve e de uma curva de calibrao


com padres de distribuio estreita. Se forem conhecidos 'K' e 'a' para as
amostras padro e problema, obtm-se M1, o valor corrigido de massa.
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Curva de Calibrao Universal


e a equao de Mark-Houwink-Sakurada

log([].M)

Curva de Calibrao Universal


log([].M) versus Ve

volume de eluio

log([])

Mark-Houwink

log k
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Estas imagens podem ter Direitos Autorais

log [] versus log M


[] = KMa

a
log (M)

a a inclinao e
log(K) a interseo
da curva mostrada

Tcnicas Absolutas em GPC


Descrio sucinta
Espalhamento
de Luz
Esttico
SLS

Osmometria
de Membrana

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Mi

RTci
i

Cromatografia de Excluso por Tamanho


Esquema Bsico do Aparelho

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Cromatografia de Excluso por Tamanho


Esquema Bsico do Aparelho

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As Colunas
Recheios
Definio de termos
Escolha das colunas
Eficincia, seletividade e resoluo
Contribuies para o alargamento dos picos
Condies timas de anlise
Contaminao, entupimento, controle de presso
Proteo das colunas
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Colunas de GPC
Recheios
Caractersticas desejadas:
Inrcia qumica, estabilidade nas condies desejadas de pH e temperatura,
reduzida interao com a amostra etc.
Recheios comuns de colunas para gua:
Gis de dextrana (ex.: Sephadex da Pharmacia)
Gis de poliacrilamida (ex.: Bio-Gel da Bio-Rad)
Glicose-Divinilbenzeno
Gis de gar, agarose, Sepharose etc. (para GPC em baixa presso)
Recheios comuns de colunas para solventes orgnicos:
Divinilbenzeno
Divinilbenzeno sulfonado
Poliestireno-Divinil benzeno
Poli(meta acrilato de metila)
Os recheios podem ser melhor escolhidos se for conhecida a aplicao
especfica que se deseja para o equipamento.
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Curva de Calibrao
Alguns Exemplos

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Escolha da Coluna de Separao

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Escolha da Coluna de Separao


de acordo com sua Curva de Calibrao
Neste exemplo,
a coluna 2
separa melhor
as amostras A, B e C.
Deseja-se que
pequenas variaes de VH
nas amostras
levem a grandes variaes no
volume de eluio de seus picos.
Assim, deve-se escolher sempre
as colunas de separao
cuja curva de calibrao
apresente a MENOR inclinao
na faixa de massa molar
das amostras de interesse.
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Escolha da Coluna de Separao

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Escolha da Coluna de Separao


observar as sugestes dos fabricantes

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Qualidade da Separao - RESOLUO


O que ? do que depende?
Alta resoluo significa
boa seletividade (grande mudana em Ve para pequenas mudanas em R H)
e grande eficincia (pequeno alargamento de bandas - pequeno W).

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Seletividade
O que ?
Seletividade a habilidade de separar os picos entre si.
Em GPC uma boa seletividade significa que a coluna capaz de levar a uma
grande mudana no volume de eluio para pequenas mudanas no raio
hidrodinmico das amostras.

baixa seletividade

grande seletividade

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Seletividade
Como medir?
A seletividade pode ser medida pela separao relativa entre os picos de
interesse:

t R1 t 0

t R 2 t0

A seletividade pode ser melhorada alterando-se o coeficiente de distribuio.


Para uma dada coluna, isto se consegue atravs de mudanas no solvente.
Isto justifica o uso de bombas-gradiente.
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Eficincia
O que ?
Eficincia est relacionada com a faixa de valores de volume de eluio que
correspondem a um mesmo valor de volume hidrodinmico, isto , eficincia
est relacionada ao alargamento dos picos.
Grande eficincia significa que os picos so estreitos.
Uma medida de eficincia o nmero de pratos tericos de uma dada coluna,
que relaciona a largura do pico com o tempo que a amostra ficou retida na
coluna.

alta
eficincia
baixa
eficincia
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A eficincia pode ser


controlada alterando-se a
vazo da fase mvel e
evitando irregularidades na
mesma.

Verificando a Eficincia
Nmero de Pratos Tericos
2

t R1
N =5,54 .
w 1 /2

Quanto maior o comprimento da


coluna, maior o nmero de
pratos tericos, mas maior ser a
presso.

Altura Equivalente a um prato terico (HETP)


HETP = comprimento da coluna / N

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Para indicar a eficincia em uma


dada coluna, de forma
independente de seu
comprimento, indica-se a altura
equivalente de um prato terico,
HETP.

Eficincia de Separao
Alargamento de Bandas Fora da Coluna
Todos os tubos, clulas de fluxo e conectores pelos quais as fraes eludas
passaro contribuem para o alargamento das bandas!

Para reduzir este efeito de alargamento:


* usar tubos com dimetro interno reduzido;
* usar conectores sem volume morto;
* usar clulas dos detectores que no diluam ou misturem zonas separadas;
* as fraes coletadas devem ser de volume reduzido, para preservar a
separao obtida.

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Eficincia, Seletividade e Resoluo


Relao entre os termos
Resoluo
OK ?

eficincia
boa

eficincia
ruim

OK!

OK!

OK!

NO!

seletividade
boa

seletividade
ruim

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Alargamento da Curva
Difuso

Difuso ao longo do
comprimento da
coluna.

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Alargamento da Curva
em funo da Vazo

Transferncia de massa
para dentro e para fora
dos poros do recheio.

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Alargamento da Curva
Os Efeitos Principais

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Alargamento da Curva
Efeitos Combinados - Condies timas de anlise

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Alargamento da Curva
Efeitos Combinados - em funo do tamanho molecular

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Como escolher uma coluna


(ou conjunto de colunas) para GPC ?
Para a seleo de uma coluna de GPC,
necessrio conhecer o tipo de polmero que ser analisado.
Sero anlises de rotina (sempre os mesmos polmeros),
como em controle de qualidade?
ou
Sero anlises variadas,
como em um centro de pesquisas?

Quanto mais informaes, melhor,


porm as informaes bsicas so:

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Como escolher uma coluna


(ou conjunto de colunas) para GPC ?
Qual o polmero?
Em quais solventes solvel?
Em quais condies ocorre esta solubilizao?
(pH, concentrao salina, temperatura, presena de etanol ou DMSO etc.)
Qual a faixa de massa molar esperada para estas anlises?
Existem informaes sobre quais colunas, solventes e temperaturas
outros laboratrios utilizam para realizar estas anlises?
(ou sugestes dos prprios fabricantes das colunas?)
A partir destas informaes, os passos para a escolha da coluna so:
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Como escolher uma coluna


(ou conjunto de colunas) para GPC ?
* Procurar colunas que operem com a 'classe' de solventes necessrios
para as anlises de interesse: solventes orgnicos ou aquosos.
* Dentre estas colunas, procurar por aquelas que suportem as condies de anlise
(pH, temperatura, concentrao salina, presena de outros solventes).
* Do subconjunto j selecionado,
rejeitar aquelas colunas cujo recheio possa interagir com a amostra-problema.
* Entre as colunas sobrantes,
selecionar aquelas que apresentem a melhor separao das amostras-problema
na faixa de valores de massa molar de interesse, isto ,
colunas cuja curva de calibrao nominal cubra toda a faixa desejada,
apresentado uma inclinao o mais prxima possvel de 45 graus.
* Dentre estas, selecionar as colunas com o maior nmero de pratos tericos,
isto , com a melhor resoluo e eficincia.
* Comparar a lista de colunas selecionadas com aquelas indicadas na literatura.
* Verificar preos; prazos de entrega; necessidade e disponibilidade de pr-colunas etc.
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importante notar que algumas das figuras ou tabelas utilizadas neste material podem ter
restries para uso no acadmico, por questes de copyright, de deciso de seus proprietrios,
sendo usadas aqui de acordo com as condies de "fair use".
O material, figuras e tabelas de minha autoria podem ser usados para finalidades didticas,
usando a seguinte forma de citao:
Ricardo Cunha Michel; Mtodos Fsicos Aplicados a Polmeros (MMP-712); Anotaes de
aula; Instituto de Macromolculas Professora Eloisa Mano, IMA/UFRJ, Rio de Janeiro, 2015.
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FIM
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