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Extraccin de RNAm

La solucin de limpieza es 0.1M NaOH 0.5M SDS./ o RNase Away


Buffer TE modificado (cc menor de EDTA, Kit PureLink RNA Mini Kit Ambion) para
Lizozima
10 mM Tris-ClH 0.1 mM EDTA pH 8.0 en agua MQ estril
Se prepara 10X Tubo estril Falcon
100 mM Tris-ClH
121, 1 mg en 10 ml MQ: 1ro disolver en 8ml y ajustar pH a 8.0 con ClH, llevar a 10 ml
Agregar 20 ul de EDTA 0.5M
Esterilizar (2 veces y se puede guardar)

Lizozima 1 mg/ml Tubo estril Falcon EN EL MOMENTO


Esptula esterilizada en Estufa limpiar con RNase Away
Pesar lizozima en tubo libre de RNase (papel de Al esterilizado en Estufa
5 mg en 5 ml de TE (05 ml madre 10X mas 4.5 ml MQ)

Centrifuga en Camara Fria


1.5 ml fase exponencial (DO450nm = 0,3) 1 tubo de centrfuga preenfriado
Cloroformo e isopropanol frios Heladera Etanol freezer.

PROTOCOLO
1) OBTENCIN DE PELLETS BACTERIANOS
A partir de 1 Cultivo ON de Sm K279a en TSB (sembrar lo ms tarde posible)
inocular: 100 ul en 5 ml de TSB en tubos que entren en el Espectrofot. temprano
por la maana. En 4h-5h llega a DO 0.3. Fase exponencial!!
Pasar 1.5 ml de cultivo (con pipeta descartable estril) a 1 tubo de centrfuga,
centrifugar durante 3 min y descartar el sobrenadante. (En estos eppendorf de 1.5ml
qued retenido sobrenadante junto al pellet y no fue removido con tip)

2) TRATAMIENTO CON LISOZIMA 1 mg/ml en TE modificado (menos EDTA)


recin preparado

Los pellets bacterianos fueron resuspendidos en 100 l de Lisozima 1 mg/ml


(SIGMA) (con tip con filtro), incubados 1 hora a 37C (en la estufa)

Centrifugar 1 min y descartar el sobrenadante.

3) EXTRACCIN DEL ARN utilizando TRIZOL Reagent (Invitrogen) TODO CON


TIP C/FILTRO

pellet + 1 ml TRIZOL mezclar pipeteando, 5 min a TA

Aadir 200 l de cloroformo FRIO al pellet celular. Tapar y agitar A MANO


vigorosamente por 15 seg. En este paso se separa la solucin en una fase
acuosa donde permanece el ARN y una fase orgnica.
Incubar 10 min a TA.

Centrifugar 15 min a 12.000 g a 4C.


Lower red phenol-chloroform phase, an interphase, and a colorless upper
aqueous phase. RNA remains exclusively in the aqueous phase. The upper
aqueous phase is ~50% of the total volume (400 ul) (pudimos tomar 650ul)

Inclinar el tubo a 45 y pipetear la fase acuosa (superior, alrededor de 400 l) a


un tubo nuevo y agregar 500 l de alcohol isoproplico FRIO. (al agregarlo
notamos que la solucin se volvi turbia). Mezclar por inversin. Este reactivo
se adiciona para lograr la precipitacin y recuperacin del ARN.
Incubar 10 min a TA.

Centrifugar 10 mim a 4C.

Eliminar el sobrenadante por inversin inclinando el tubo del lado donde no se


ve el gel de RNA

Resuspender el pellet (RNA) con 1 ml de etanol 75% FRIO, mezclar bien con
VORTEX y llevar a -20C durante 24hs.
Para 10 ml de etanol 75%: 7.81 ml de ol 96 + 2.19 ml MQ
C1V1 = C2V2
para llegar a 75 sera:
(96*)(1 L) = (75)(V2)
V2 = 1.28 Litros
Es decir, faltan 0.28 L de agua (280 mililitros) para completar 1.28 litros de
alcohol al 75
* si es absoluto, recalcular

Al otro dia centrifugar 5 min. a 4C.

Eliminar el sobrenadante por inversin y dejar secar el pellet (RNA) evitando


deshidratacin total (por inversin sobre papel absorbente). It is important
not to let the RNA pellet dry completely as this will greatly decrease its
solubility.

Disolver el RNA en 40 l de agua MQ estril by pipetting up and down


Alicuotar y conservar a -70C (Cepario)

5 ul para correr en gel, otra de 5 ul para realizar dos mediciones en el


Nanodrop, y el resto son todas alcuotas de 10 ul.
Congelar-descongelar se degrada.
Corremos el gel con 5 ul de RNA resuspendido en 3 ul de loading buffer
En el nanodrop usamos 2 ul de RNA (y lo medimos por duplicado, por eso la
alicuota que usamos es de 5ul).
Chequeo de la integridad del RNA por electroforesis en gel de
agarosa
1. Tratar la cuba de electroforesis 1 h con NaOH 0.5M (preparar 10g
en 500 ml en el momento con H20 miliQ esterilizada 2 veces).
2. Enjuagar 6 veces con H20 MiliQ estril para RT-PCR.
3. Preparar en el momento 400 ml de TAE 1X con agua MQ estril (8
ml TAE 50X + 392 ml de H2O).No reutilizar!!!
4. Pesar 0.6 g de agarosa y disolver en 40 ml de TAE (Agarosa
1.5%). En recipiente estril libre de RNasa.
5. Calentar en microondas hasta que se disuelva la agarosa
completamente.
6. Dejar enfriar hasta aprox. 60C.

7. Agregar 2 l de Bromuro de Etidio.


8. Armar la cuba con el peine sobre el contenedor. (Previamente
limpiar bien el peine y la cuba con etanol 100%).
9. Volcar la agarosa en la cuba cuidando que no se formen burbujas y
dejar que gelifique.
10.
Preparacin de las muestras: diluir el RNA en caso de que
est muy concentrado. Sembrar 5 l, con 3 l de Loading
Buffer. USAR TIPS ESTRILES!!! Si es posible, incluir un control
positivo: una muestra cuya integridad ya fue probada (para
descartar que se degrade durante la corrida).
11.
Correr el gel a 100V por 20 min. Con mayores tiempos de
corrida se puede degradar el RNA.
12.
Observar el gel en transiluminador de luz UV, escanear la
imagen.
13.
Cuantificar las bandas por densitometra, calcular el ndice
23S:16S. Idealmente la banda del RNA 23S debe ser el doble
de intensa que la del 16S, y con mucha menor intensidad del 5S.

1 y 2 : RNA OK! Relacin 23S:16S aprox. 2:1 (28S:18S para


eucariotas).
3: RNA parcialmente degradado (barrido, mancha debajo de las
bandas).
4: RNA altamente degradado.
5: Contaminacin con DNA genmico.
4)

DETERMINACIN

DE

CONCENTRACIN:

(A230,

A260,

A280)

usando

NanoDrop 1000 EspectroPhotometer


Para la cuantificacin total del ARN obtenido se debe realizar una lectura en un
espectrofotmetro a una longitud de onda de 260 y 280. Una relacin A260/A280
mayor a 1.65 nos indica una pureza correcta de la muestra.
Cuantificacin de cidos nucleicos (E)
- La concentracin de ARN fue cuantificada midiendo la absorbancia a 230, 260 and
280 nm (A230, A260, A280) usando NanoDrop 1000 EspectroPhotometer (Thermo
Scientific).

Pureza (A260/A280, A260/A230 ) (D)


- Una relacin A260/A280 = 1,82,1 fue indicativa de buena pureza (baja
contaminacin con protenas).
- Una relacin A260/A230 > 1 fue indicativa de buena pureza (baja contaminacin con
isotiocianato de guanidina,parece que est en el Trizol).