El cido hmico inhibe la formacin de autofagosomas

inducida por el VHB e induce la apoptosis en clulas Hep G2

transfectadas con VHB
ABSTRACT:
El virus de la hepatitis B (VHB) utiliza varios mecanismos para
sobrevivir en las clulas husped y una de las vas principales es la
formacin de autofagosomas. El cido hmico (HA), uno de los
componentes principales del campo mineral, es un alimento
medicinal de Ayurvedic, usado comnmente por la gente de las
regiones Himalaya de Nepal y de la India para las varias dolencias del
cuerpo. Nosotros planteamos la hiptesis de que el cido hmico
podra inducir la muerte celular e inhibir HBV inducida por la
autofagia en las clulas hepticas. La incubacin de clulas Hep
G2.2.1.5 (clulas HepG2 que expresan de forma estable HBV) con
cido hmico (100 M) inhibi tanto la proliferacin celular como la
formacin de autofagosomas de forma significativa, mientras que la
induccin de apoptosis se intensific. Western blot resultados
mostraron que el cido hmico en incubacin dio lugar a disminucin
de los niveles de beclin-1, SIRT-1 y c-myc, mientras que la caspasa-3
y -catenina, en su expresin fueron reguladas. Western blot
resultados mostraron que cido hmico inhibi significativamente la
expresin de HBx (3 veces con 50 M y 5 veces con 100 M) en
comparacin con las clulas de control. Cuando se incub cido
hmico con clulas Hep G2 transfectadas con HBx, se redujeron la
formacin de autofagosomas inducida por HBx y los niveles de beclin1. Estos datos mostraron que el cido hmico indujo la apoptosis e
inhibi la formacin y proliferacin de autofagosomas inducida por
HBV en clulas de hepatoma.
INTRODUCCIN:
La infeccin por el virus de la hepatitis B (VHB), una de las principales
causas del cncer de hgado, es responsable de las infecciones
crnicas, aproximadamente 350 millones de personas en todo el
mundo, (200 millones en China y 1,25 millones en Estados Unidos). La
infeccin por VHB puede persistir durante toda la vida del husped,
dando lugar a muchas consecuencias terribles en el hgado (por
ejemplo, fibrosis, cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC). Hasta la
fecha no hay ningn tratamiento disponible que pueda erradicar
completamente la infeccin viral en pacientes con HBV crnica.
Adefovir, lamivudina, telbivudina y entecavir son los frmacos
quimioteraputicos, que inhiben la replicacin vrica dirigindose a la
ADN polimerasa de HBV. Sin embargo, el tratamiento a largo plazo

con estos frmacos puede desarrollar un virus resistente a frmacos

que podra ser una condicin problemtica para los pacientes.
El VHB modula varios mecanismos intracelulares, como la autofagia,
para sobrevivir en el husped. Autofagia es un proceso catablico de
salvamiento en el cual las clulas eliminan las protenas y los
organelos daados para mantener las clulas en homeostasis. Se ha
informado que el VHB mejora la formacin de autofagia para su
soporte en replicacin en Hepatoma sin promover la degradacin de
los lisosomas. Pequeas protenas de superficie (HBsAg) y la protena
X de virus de hepatitis B (HBX) se requieren para inducir autofagia en
las clulas infectadas. La alteracin de la autofagia y la induccin de
la muerte celular en las clulas infectadas con VHB podran inhibir la
replicacin del virus y puede ser una propuesta teraputica contra
este virus.
El cido hmico (HA) es un material orgnico natural que contiene
cido y los grupos funcionales carboxi, fenol y OH, es un producto de
la descomposicin de residuos de plantas y / o animales por
microorganismos. El cido hmico ha demostrado poseer una serie de
aplicaciones medicinales tales como propiedades anticancergenas y
anti-inflamatorias. Adems, se ha informado de que los compuestos
hmicos son eficaces contra el Virus 1 del Herpes Simplex (HSV-1),
virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) y Citomegalovirus (CMV).
Mineral Pitch (MP, Shilajit) es una medicina hind de la medicina
ayurvdica de las regiones del Himalaya, de la India, Bhutn, Pakistn
y Nepal. La materia hmica es uno de los principales constituyentes
de MP, que se ha informado como un frmaco anti-inflamatorio y
antioxidante, pero son necesarios especficamente en ensayos para
garantizar la MP como un remedio de amplio espectro.
Recientemente, se ha reportado que la MP, recolectada en Nepal, es
eficaz contra HSV, citomegalovirus humano, virus sincitial respiratorio
humano, rotavirus humano y vesicular, virus de la estomatitis.
La investigacin de nuevos compuestos con propiedades antivirales
sigue siendo necesaria, ya que existe una enorme demanda de
productos rentables y adecuados para el tratamiento y el
aclaramiento del VHB. En este estudio, mostramos por primera vez
que el cido hmico posee propiedades anti-HBV, mediante la
inhibicin de la formacin de autofagosomas inducida por el VHB y la
induccin de apoptosis en las clulas que expresan el VHB.
RESULTADOS:
El cido hmico induce la apoptosis e inhibe la proliferacin
en clulas Hep G2.2.1.5. Estudios previos han demostrado que el
cido hmico posee actividades contra el cncer. En primer lugar, el

efecto del cido hmico sobre la proliferacin celular se determin

por MTT como se describe en materiales y mtodos. Los resultados
mostraron que la concentracin inhibitoria 50 (IC50) concentracin de
cido hmico era de 100 M y la proliferacin fue significativamente
inhibida a 38% y 48% con 50 y 100 M concentraciones de cido
hmico, respectivamente (Figura 1A). Las concentraciones muy bajas
de cido hmico (10 y 20 M) no tenan ningunos efectos
significativos. Por lo tanto, para todos los experimentos tanto 50 y
100 M concentraciones se utiliz incubacin de cido hmico con
clulas Hep G2.2.1.5 que aument la induccin de la apoptosis de una
manera dependiente de la dosis (15,8% y 38,3% en cido hmico 50
y 100 u M respectivamente, la Fig. 1B, C). Tambin se realiz un
ensayo de formacin de colonias y el nmero de colonias de las
clulas se redujo con el aumento de las concentraciones de cido
hmico (Fig. 1D).

Figura 1. (A) Las clulas Hep G2.2.1.5 se cultivaron con diferentes

concentraciones de cido hmico (10, 20, 50 y 100 M) durante 24
horas y el ensayo de proliferacin celular se realiz mediante ensayo
MTT para comprobar la viabilidad celular (n = 3; P <0,05).
(B) La induccin de la apoptosis por cido hmico se midi en clulas
Hep G2.2.1.5 incubando con 50 y se muestran 100 M de cido
hmico usado el ensayo TUNEL y el cuadro representativo de 3
experimentos.
(C) El total de clulas positivas se cont en al menos 10 diferentes
campos de alta potencia y se presenta el promedio.
(N = 3; * p & lt; 0,05).

(D) El ensayo de formacin de colonias se realiz en placas de 60 mm

con 50 100 M de cido hmico (n = 3).
El cido hmico induce la muerte celular a travs de la
activacin de caspasa-3.
Se cultivaron clulas Hep G2.2.1.5 con diferentes concentraciones de
cido hmico (50 y 100 M) durante 24 horas. Se aisl la protena
celular total, se estim y se aadieron 40 ug /pocillo. Se cargaron en
los geles de SDS-PAGE y se determin la expresin de c-myc, SIRT-1,
-catenina y -actina.
Los resultados mostraron que tanto c-myc y SIRT-1 fueron
significativamente inhibidos, mientras que los niveles de -catenina
fueron regulados hacia arriba (Fig. 2A). La caspasa-3 clivada tambin
se determin usando transferencias de Western y se encontr que los
niveles fueron aumentados con cido hmico en tratamiento (Fig. 2A].
Las intensidades de banda se determinaron utilizando el software
Image J y los datos se presentan en la Fig. 2B, C. Estos resultados
indican que el cido hmico induce la apoptosis e inhibe la
proliferacin celular.

Figura 2. (A) Se aisl protena celular total de las clulas Hep G2.2.1.5
tratadas con cido hmico (50 y 100 M) y Western blots se
realizaron para c-myc, SIRT-1, -catenina y cliv caspasa 3. En todos
los experimentos -actina Se utiliz como control interno. La imagen
mostrada es un representante de 3 experimentos. Cle. Caspasa Cleaved Caspasa 3. (B, C) Las intensidades de banda se cuantificaron
usando el software Image J y se presentan los datos. (N = 3; * P
<0,05, ** p <0,01).

El cido hmico inhibe la formacin de autofagosomas en las

clulas infectadas por el VHB.
Recientemente hemos demostrado que MP induce la apoptosis a
travs de la regulacin de miARN-22 en huh 7 cells. Anteriormente,
tambin habamos mostrado que HBx induce la formacin de
autofagosomas en las clulas hepticas. Por lo tanto, para comprobar
si el cido hmico inhibe la formacin de autofagosomas en clulas
hepticas, se cultivaron clulas Hep G2.2.1.5 (clulas que expresan
de manera estable el VHB) en placas de 6 pocillos y autofagosomas
Se realiz el ensayo de formacin. Los resultados indicaron
claramente que la adicin de cido hmico inhiba el autofagosoma
en estas clulas (figura 3A). Las clulas se contaron en al menos 10
campos diferentes de alta potencia, promediados y cuantificado y
encontr que hubo una reduccin significativa en el nmero de
autofagosoma en estas clulas (figura 3B). Beclin-1 es una de las
protenas clave implicadas en la induccin de la apoptosis. Por lo
tanto, la expresin se determin con beclin-1 y se encontr que haba
una inhibicin significativa de beclin-1 en clulas tratadas con cido
hmico (50 y 100 M) y la densitometra se realiz utilizando el
software de imagen J y hubo una inhibicin de 48% y 83% de Beclin1(Fig. 3D).

Figura 3. (A) La formacin de autofagosomas se midi cultivando

clulas con o sin cido hmico (50 y 100 M) durante 24 horas. La

imagen es un representante de 3 experimentos.
(B) Se contaron las clulas positivas en al menos 10 diferentes
campos de alta potencia y promediados y trazados. (N = 3; ** p & lt;
0,01).
(C) Western blot para beclin - 1 y
clulas Hep G2.2.1.5.

beta - actina se realizaron en

(D) Las intensidades de imagen de la expresin de beclin-1 y -actina

fueron cuantificados utilizando el software Image J y se present el
promedio. Las clulas de control no tratadas se tomaron como 1. (N =
3; * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01).

El cido hmico inhibe la expresin de la protena HBx en las

clulas Hep G2.2.1.5. Nuestro estudio anterior haba demostrado
que HBx indujo la expresin de beclin-1 en clulas hepticas y la
inhibicin de HBx dio como resultado la inhibicin de la autofagia en
estas clulas. Por lo tanto, queremos probar si el cido hmico inhibe
la autofagia a travs de la inhibicin de HBx en las clulas hepticas.
Los datos de expresin de la protena mostraron que la incubacin de
cido hmico (50 y 100 M) con Hep G2.2.1.5 clulas result en una
inhibicin significativa de la expresin de la protena HBx (Figura 4A).
Los datos de tres experimentos diferentes se cuantificaron utilizando
el software Image J y se presentan en la Fig. 4B.

Figura 4. (A) Se cultivaron clulas Hep G2.2.1.5 con o sin cido

hmico (50 y 100 M) y Western blots para HBx y beta - actina.
(B) Las intensidades de banda fueron cuantificadas y presentadas a
partir de 3 experimentos (n = 3; * p <0,01).

El cido hmico inhibe el ADN del HBV y el HBsAg en las

clulas Hep G2.2.1.5.
La capacidad del cido hmico de inhibir el ADN del VHB y HBsAg en
clulas Hep G2.2.1.5 se determin por PCR en tiempo real y ELISA,
respectivamente. Los datos mostraron que hubo una inhibicin
significativa del ADN del VHB a 34,6% y 12% en comparacin con las
clulas Hep G2.2.1.5 de control en clulas tratadas con 50 y 100 M
de cido hmico, respectivamente (Figura 5A). Se realiz ELISA
cualitativo para la presencia de HBsAg en los sobrenadantes del
cultivo celular. La incubacin de clulas con 50 y 100 M de cido
hmico dio lugar a una importante inhibicin de HBsAg (Fig. 5B). Las
muestras con valores de relacin <1 se consideraron negativas y con
valores de relacin> 1 fueron considerados positivos. El porcentaje de
inhibicin se determin sobre la base de la muestra: valor de corte.
Hubo un 23% y 80,83% de inhibicin de HBsAg se observ con la
incubacin de 50 y 100 M de cido hmico con Hep G2.2.1.5,
respectivamente.

Figura 5. Se incubaron clulas Hep G2.2.1.5 con concentraciones de

cido hmico de 50 y 100 M durante 24 horas. (A) El ADN del VHB se
determin mediante reaccin PCR en tiempo real (n = 3; * p <0,05, **
p <0,01).
(B) Los niveles de HBsAg fueron Medido usando el kit de ELISA como
se describe en materiales y mtodos (n = 3; * p <0,05, ** p <0,01).
Los valores de relacin <1 se consideraron negativos y con valores de
relacin> 1 se consideraron positivos.
El cido hmico inhibe la formacin de autofagosomas
inducida por HBx en las clulas Hep G2.
A continuacin, para confirmar estos hallazgos, las clulas Hep G2 se
transfectaron con plsmido que contena HBx y luego se incubaron
con 50 de 100 M de cido hmico. Despus de 24 horas, se
aislaron las clulas para el ensayo de formacin de autofagosomas o
Western blots para sealizacin de molculas. En todos estos
experimentos, los 50 M de cido hmico no dio lugar a ningn
cambio significativo. Los resultados mostraron que HBx indujo la
formacin de autofagosomas, mientras que la adicin de 100 M de
cido hmico inhibi la formacin de autofagosomas en estas clulas

(Figura 6A). Estos resultados se cuantificaron en al menos 10

diferentes campos de alta potencia y los valores medios se presentan
en la Fig. 6B. A continuacin, la expresin de beclin-1 fue determinada
en clulas que expresan en exceso HBx con o sin la adicin de cido
hmico. Se produjo un aumento significativo Beclin-1 en clulas
transfectadas con HBx, que se inhibi en clulas tratadas con cido
hmico (Figura 6C).
A continuacin, se determin la expresin de c-myc y SIRT-1 en
clulas Hep G2 que expresan protena HBx con o sin cido hmico. Se
observ un aumento significativo en la expresin de las protenas cmyc y SIRT 1 en la expresin de HBx, mientras que la incubacin de
estas clulas junto con 100 M de cido hmico inhibi la expresin
(Figura 7A]. En todos estos experimentos de transferencia Western se
us -actina como control interno. Estos resultados se confirmaron
cuantificando las intensidades usando el software Image J (Fig. 7B).

Figura 6. (A) Se transfectaron clulas Hep G2 con HBx seguido de

incubacin con cido hmico (100 M) durante 24 horas. La
formacin de autofagosomas se midi como se describe en
materiales y mtodos.
(B) Al menos 10 puntos altos diferentes se contaron los campos de
potencia, se promediaron las clulas positivas y se calcul el cambio
de pliegue respecto al control (N = 3; * p <0,05 en comparacin con
HBx, ** p <0,01 en comparacin con el control). (C) Se realizaron
transferencias de Western en el Beclin-1 aislada de las clulas Hep G2
incubadas con HBx (50 o 100 M) transfectadas. Carril 1, control;

Carril 2, clulas transfectadas con vectores vacos; Carril 3, clulas

transfectadas con HBx; Carril 4, HBx transfectadas y cido hmico (50
u M) Clulas incubadas; y las clulas incubadas en el carril 5, HBx
transfectadas y cido hmico (100 M). El vector vaco se us como
control de transfeccin en todos los experimentos. Se us -actina
como control interno (n = 3)

Figura 7. (A) Las clulas Hep G2 se transfectaron con HBx y se

incubaron con cido hmico (50 100 \ mu M). Western Blots se
realizaron para C-myc y SIRT-1 de la protena celular total. Carril 1,
control; Carril 2, vector vaco con clulas transfectadas; Carril 3,
clulas transfectadas con HBx; Carril 4, clulas HBx transfectadas y
cido hmico (50 u M) incubadas; y Carril 5, clulas HBx
transfectadas y cido hmico (100 u M) incubadas. El vector vaco se
utiliz como control de transfeccin en todos los experimentos. Se
us -actina como control interno (n = 3). (B) Las intensidades de
banda se cuantificaron usando el software de imagen J y el promedio
de 3 experimentos se representan como un cambio de veces (* p
<0,05 en comparacin con el control; # P <0,05 en comparacin con
las clulas transfectadas con HBx).