CONCEITOS DE

BIOLOGIA MOLECULAR

Jorge Mondego

Biologia Molecular

Genome

Transcriptome

The OME-Era

Proteome

Metabolome

- Entendimento da fisiologia e reproduo de microorganismos

- Entendimento dos mecanismos de replicao, transcrio e traduo
- Enzimas de restrio
- Plasmdeos
- Purificao de protenas e Enzimologia
- Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Transcriptase reversa e RT-PCR
- Sequenciamento
- Fluorforos
- Automao

Plasmdeos

Cromossomo bacteriano

Plasmdeos

DNA extracromossmico capaz de se replicar independentemente da

replicao cromossomal
- Resistncia a antibiticos
- Produo de toxinas
- Conjugao (transmisso de material gentico entre as bactrias)
- Origem de replicao prpria

Transferncia horizontal de genes

Conjugao
Transmisso de material gentico
entre as bactrias

Transferncia de material gentico

entre reinos
Agrobacterium tumefaciens

Transformao
Competncia Habilidade de uma
clula receber DNA extracelular
vindo do meio ambiente.
-Natural: Bactrias adquirem DNA do
meio para nutrio, reproduo e
reparo de seu DNA, atravs de
mecanismo de transporte
membranar.
- Artificial: Uso de procedimentos de
laboratrio que tornam as clulas
passveis de serem transformadas.

Transduo

Fagos vrus que infectam bactrias

Enzimas de restrio (endonucleases)

Daniel Nathans, Werner Arber, Hamilton Smith - 1978

Sistema de modificao - restrio

- Enzimas bacterianas que reconhecem e clivam DNA invasor
- Reconhecimento de seqncia palindrmica de DNA exgeno
- Seqncias bacterianas equivalentes so metiladas

Seqncia palindrmica

5'-GTATAC-3'
||||||
3'-CATATG-5'

Pontas coesivas
Cohesive ends

Pontas cegas
Blunt ends

Manipulao dos plasmdeos e a tecnologia do DNA recombinante

Stio de
clonagem

Resistncia
a antibiticos

Origem de replicao

Clonagem em vetores
-Plasmdeo digerido com enzimas
-Gene especfico ligado no plasmdeo,
replicado em diversas cpias

Transformao

Choque trmico
Choque osmtico

Shuttle vectors
Plasmdeos que se propagam em
duas espcies

-Transformao de plantas, leveduras, fungos filamentosos e clulas animais

Bacterifagos

Fagos como vetor

Vetores

Tamanho do inserto

Plasmdeos de alta cpia

010 kb

Bacterifago (insero)

010 kb

Bacteriophage (substituio)

923 kb

Cosmdeos

3044 kb

Bacterifago P1

70100 kb

BAC (cromossomos artificiais de bactrias)

at 300 kb

YAC (cromossomos artificiais de leveduras)

0.22.0 Mb

PCR - A REVOLUO DA TAQ

Kari Mullis 1985

Premio Nobel de qumica -1993

PCR 1

PCR 2

95C

Tm
72C

n Ciclos de PCR

PCR Otimizao da reao

- Concentrao dos reagentes
Tris-HCl pH 8,8 (20 mM)
KCl (10-50 mM)
MgCl2 (1 a 4 mM) Menos Mg mais especificidade
Glicerol (menos que 5%)
dNTPs (200 a 10 M Menos dNTP - mais especificidade)
Taq (1 unidade)
-Condies dos ciclos
Etapa de denaturao inicial (1-3 min a 95C)
Etapa de denaturao (30 seg a 2 min a 95C)
Etapa de anelamento
Etapa de extenso (30 seg a 1min e 30 seg a 70-75C)
- Desenhos dos primers

Caractersticas desejveis em um Primer

Temperatura de melting (Tm) na faixa de 50 C a 65 C.
Tamanho de 15 a 28 pares de bases
Ausncia da capacidade de dimerizao.
Ausncia significativa da formao de grampos (>3 bp)
Inexistncia de stios secundrios de anelamento dos
primers.
Temperaturas de anelamento de primers formando um
par devem ser prximas

Comprimento
- Quanto maior o comprimento do primer, maior a
possibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma que
maiores sero as temperaturas de melting e anelamento.
- De uma forma geral, o comprimento do primer no deve ser
inferior a 15 bases para assegurar a unicidade.
- A existncia desta faixa est baseada no fato de se buscar
unique primers que apresentem temperatura de anelamento
dentro da faixa considerada como a mais adequada.

Temperatura de Melting (TM)

- a temperatura na qual metade das fitas de DNA est na
forma de fitas simples e a outra metade na
forma de dupla hlice.
- Tm dependente da composio do DNA, de modo que
aumento do contedo de G+C no DNA gera um
incremento na Tm ocasionado pelo maior nmero de
ligaes de H.
Temperatura de Anelamento
a temperatura na qual os primers se pareiam ao
DNA molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm .
T anneal = Tm_primer 4C

Estringncia no Anelamento do Primer

- A estringncia determina a especificidade no produto de
DNA a ser amplificado.
- T anneal o fator mais significante que afeta a estringncia
no anelamento do primer.
-T anneal :
Muito baixa = menor estringncia = primer pareia em qualquer
lugar.
muito alta = maior estringncia = primer pode no parear.

Estrutura interna do primer

- Evitar essas estruturas...

..Pode-se utilizar primers com estas

estruturas se estas forem formadas
a uma temperatura em torno de 30C
menor que a Tm

atgatagaggctctcgaagctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaa
MIEALEAEVTRRTLEFDTCK
gtcgtcgctctcccaatggtataa
VVALPMV*

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

5- atgatagaggctctcgaagctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaagtcgtcgctctcccaatg
3- tactatctccgagagcttcgactccactggtcctcttgcgagctcaaactgtgcacatttcagcagcgagagggttac
gtataa 3
catatt 5

5- atgatagaggctctcgaag 3 5- ttataccattgggagagcg 3

TRANSCRIPTASE REVERSA e A QUEBRA DO PARADIGMA

DNA

RNA

Protena

Quebra do paradigma

RT REVOLUTION

PRIMERS UTILIZADOS

Oligo(dT)15-25
-Somente mRNA
Hexmeros randmicos
- Anelamento em regies aleatrias
Primer especfico do gene
- Amplificao somente do gene alvo

Bibliotecas

Expressed Sequence Tags (ESTs)

Extrair RNA de diferentes
tecidos/condies
cDNA

5 EST

3 EST

Clonar em vetor

Bibliotecas

Full-Lenght cDNA

Northern Eletrnico

Controle

Tratado

Extrao de RNA e
sntese de cDNA

sequenciamento

sequenciamento
Sequncia consenso

clusterizao
tratado
controle =

2x

Biblioteca subtrativa
RNA Pools
Treated

Control
Driver

1-cDNA synthesis
2-cDNA digestion with 4 cutter
enzyme

Tester

Adaptors 3-Adaptor ligation to tester

sample

Driver

No amplificated
Eliminated

Driver and
Tester

Linear
Amplification
Eliminated

Tester
4-Tester/ driver
hybridization

Exponential
Amplification
Enriched
Tester

5-PCR with primers that

anneal specifically to
adaptor previously ligated
to tester sample

6-Enrichment of cDNA
library in genes
preferentially expressed
in tester sample

Fluorforos e molecular beacons

Cianinas
Emisso fluorescente - 570 nm
(regio do verde do espectro de luz)

Emisso fluorescente - 670 nm

(regio do verde do espectro de luz)

Emisso fluorescente - 522 nm

(regio do verde do espectro de luz)

SYBR GREEN

molecular beacons

Loop complementar a seqncia alvo

PCR Quantidade X Qualidade

Anlise Qualitativa
Visa detectar a presena ou no do gene
Anlise Quantitativa
Visa detectar a quantidade (expresso) do gene na
amostra

Difcil diferenciar 10 cpias de 50 cpias em

gel de agarose

Deteco do PCR
tradicional

Deteco do Real
Time PCR

SYBR green assay

SYBR se liga a DNA dupla fita e

fluoresce. Durante o processo
de amplificao, a fluorescncia vai
aumentando, tornando mais fcil
a quantificao de DNA

Taq Man
Sonda anela no gene alvo

Polimerase desloca reprter

liberao de fluorescncia verde

Polimerase desloca quencher

www.appliedbiosystems.com

Desenho de primers real time

Juno xon - ntron
TTGTTCGAAGACTGGAAaCAACAGGTCGTCAGGCAGCAT
AACGAGTACAGGGCCCGTTATGGTGCACCCAACCTGTCC
TGGAGCGATGCTCTGTACCCGGATACTGCTCGATATGCC
GGACAGTGCAAGTTCcAACACAGGTATGACACGTCGTTG
GTTCGTCGACATGTAAGGGTACTGACGACACATTCAAAG
CAACAGTGGCGGCAAGTACGGCGAAAACTTGGCTGCTG
GTACTGGAAACGCCTATGGTTTCTCGAGCGGCTTGAAGT
CGTGGATGGATGAAGCTTGTATGTCTAC

http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/primer_genscript.cgi

Clonagem de genomas
DNA genmico
Quebrar em pedaos
aleatrios ~2000pb
(shotgun)
reads
clonar em vetor

sequenciamento

Reconstruo do DNA original a partir do

fragmentos (clusterizao)

reads
Sequncia consenso
(DNA original)

A reconstruo feita a partir de sobreposio dos fragmentos

Shotgun de pedaos do genoma

Quebrar em pedaos
aleatoriamente desde
50Kpb at 300Kpb

DNA genmico

Clonar em BACs e
sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento

~800 bp

~800 bp

Quebrar em pedaos de
2000pb
clonar em vetor e sequenciar
os fragmentos

Primer Walking
Vector

Primer

Clone to sequence

Sequence

New
Primer

Sequence

Repeat

Sempre desenhar o primer de forma que a sequncia amplificada tenha

sobreposio com a anterior (tipicamente 100 pb de sobreposio)

anelamento dos primers

denaturao

TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC

O programa PHRED l o chromatograma identificando e

dando uma nota para cada base que forma a sequncia :
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40 ...

- A identificao dos picos feita atravs de uma

transformada de fourier do sinal
- A nota ligada com a resoluo entre os picos vizinhos e a
altura do background

Analisando o cromatograma
Regio de qualidade alta

Picos bem definidos e grandes.

Linha de base boa.
Distncia entre picos anterior e posterior constante.

Regio de qualidade mdia poucas ambigidades

Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho mdio.

Linha de base boa a razovel.
Distncia entre picos anterior e posterior razovel.

Regio de qualidade baixa baixa confiabilidade

Picos mal definidos e de tamanho pequeno.

Linha de base confusa.
Distncia entre picos anterior e posterior inconstante.

Pirosequenciamento
Roche (454) GS FLX sequencer

http://www.454.com/

Fita simples

Cmera de
CCD

Reao de
degradao

Shotgun do genoma inteiro

DNA genmico

Quebrar em pedaos
aleatrios ~2000pb
(shotgun)

Ligao do
adaptador e
separao em fita
simples

- O adaptador permite que o DNA se ligue em grnulos

minsculos (dimetro de 28 mm). Apenas um DNA
ligado em cada grnulo
- Os grnulos so envolvidos em gotas de leo que
contm todos os reagentes necessrios para amplificar o
DNA
- Cada gota contendo o grnulo mantida isolada para
evitar contaminao e consegue produzir 10 milhes de
cpias numa reao de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reao de pirosequenciamento
produz 1011 molculas de ATP gerando mais de 109
ftons, num comprimento de onda de 560 nm, e num
perodo de 3-4 segundos. Facilmente detectado por uma
cmera de CCD

O sequenciador 454

Cmara de fluxo
contendo as
amostras e as
fibras pticas
(1,6 milhes/slide)
Cmera de
CCD

Computador

Bombeamento
de fludos

Pirograma

Linearidade mantida at homopolmeros de 8 nt

Illumina/Solexa Genome Analyzer

Sequenciamento por sntese + clustering PCR

http://www.illumina.com/

- O adaptador permite que o DNA se ligue a uma placa na

superfcie dos canais de fluxo
- PCR em fase slida permite que as molculas
resultantes de uma PCR fiquem prximas. Ciclo
repetido vrias vezes
- Adio de polimerase, primers e de nucleotdeos,
marcados por fluorforos, com o 3OH inativado adio
de um nucleotdeo por vez. Aps incorporao, h a
deteco do fluorforo, reverte-se a inativao do 3OH e
e retira-se o fluorforo. Ciclo se repete.

Applied Biosystems SOLiDTM

Sequencer

http://www.appliedbiosystems.com.br/site/abhome.jsp

- O adaptador ligado ao DNA e a grnulos magnticos.

Ocorre PCR em emulso e as fitas de DNA so
depositadas numa placa
- Ligao de primer universal n ao adaptador e de ligos
degenerados (7 bases) marcados contendo duas
primeiras bases fixas.
- Ocorre deteco do sinal, clivagem das duas ltimas
bases e adio de novos ligos
- Ao fim de n rounds, a fita resultante liberada e h a
ligao de um novo primer universal, (agora n-1). Ciclo se
repete mais trs vezes (at n-4).

Sanger vs Novas tecnologias

SANGER

Depende de clonagem em
bactria (2 semanas de
trabalho)

Novas tecnologias
No h clonagem

1 milho de pb em 24 horas

Milhes de bp em menos de 4
horas

Reads de ~700 bp

Reads de 200 a 25 pb

Clones de fita dupla

permitem seqenciamento
em ambas direes (facilita
orientao e montagem)
6 meses de sequenciamento,
24 horas por dia, para
sequenciar o genoma de um
fungo

Fragmentos fita simples no

permitem seqenciamento em
ambas direes. Aplicao da
tcnica de paired-end
24 horas para sequenciar o
genoma de um fungo

Concluso : a unio faz a fora

Novas Tecnologias
454

Solexa

SoliD

Sequencing
chemistry

Pyrosequencing

Polymerase-based sequencingby-synthesis

Ligation-based
sequencing

Amplification
approach

Emulsion PCR

Bridge amplification

Emulsion PCR

Paired
ends/separation

Yes/3 kb

Yes/200 bp

Yes/3 kb

Mb/run

100 Mb

1300 Mb

3000 Mb

Time/run (paired
ends)

7h

4 days

5 days

Read length

250 bp

3240 bp

35 bp

Cost per run

(total directa)

$8439

$8950

$17 447

Cost per Mb

$84.39

$5.97

$5.81