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Cuando los macrfagos alveolares derivados de SPF-gato se infectaron con una mezcla
de FIPV y MAb 6-4-2, los niveles de ARNm intracelular de TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF
aumentaron (Figura 6).
Discusin: Los neutrfilos son importantes para la defensa del husped frente a los
patgenos. La infeccin viral generalmente reduce el nmero de neutrfilos. Se considera
que la transferencia de neutrfilos de la sangre perifrica a tejidos marginales, la
destruccin de neutrfilos debido al exceso de produccin de anticuerpos y la muerte
celular directa causada por infeccin viral son las causas de la neutropenia. En el virus de
la inmunodeficiencia humana y las infecciones por parvovirus canino, se ha sugerido un
recuento reducido de neutrfilos para permitir una infeccin bacteriana grave. El virus de
la inmunodeficiencia felina y las infecciones por el virus de la panleucopenia felina
tambin afectan a las clulas del estroma en la mdula sea, lo que conduce a una
disminucin de la produccin de neutrfilos. En contraste, el coronavirus del sndrome
respiratorio agudo severo (SARS), que pertenece a la misma familia que la FIPV, tambin
puede causar neutrofilia. La neutrofilia tambin ha sido reportada en gatos con FIP.
Paltrinieri inform de que las citoquinas acelerar la entrega de neutrfilos a las lesiones
inflamadas, prolongando as la vida til de los neutrfilos circulantes. Tambin inform de
que la apoptosis de los neutrfilos se retrasa por las citoquinas, lo que aumenta la vida de
los neutrfilos en las lesiones. Es probable que la neutrofilia en gatos con PIF se asocie
con la infiltracin de neutrfilos en lesiones granulomatosas. Sin embargo, parece que no
existe una teora establecida para explicar la infiltracin de neutrfilos en lesiones
granulomatosas en gatos con FIP.
En los seres humanos, la vida til de los neutrfilos es corta. Cuando se aislan neutrfilos
de sangre perifrica y se cultivan in vitro, se induce la apoptosis y aproximadamente la
mitad de las clulas mueren en 24 h. Cuando los neutrfilos aislados de sangre perifrica
de gatos SPF se cultivaron durante 24 h, ms del 60% muri, lo que sugiere que los
neutrfilos felinos tambin mueren debido a la apoptosis, similar a los neutrfilos
humanos. Adems, la cocultura con especmenes de gatos FIP aument la tasa de
supervivencia de los neutrfilos, lo que sugiere que la produccin de factores implicados
en la supervivencia de los neutrfilos se incrementa en los gatos FIP, y estos factores
actan sobre los neutrfilos y prolongan su vida til.
Los niveles de mRNA de TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF aumentaron en macrfagos de
gatos FIP. Estos niveles de mRNA de citoquina tambin estaban elevados en macrfagos
infectados con FIPV y MAb 6-4-2, aclarando la presencia de factores de supervivencia de
neutrfilos en el sobrenadante de cultivo de macrfagos. Se sugiri que: (1) los
macrfagos infectados con FIPV liberan TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF en respuesta a la
replicacin del virus, y (2) estas citocinas actan sobre los neutrfilos y prolongan su
supervivencia. Anteriormente se inform de que FIPV-macrfagos infectados producido
TNFalpha y B-clulas de diferenciacin / factores de supervivencia, y estos factores
pueden haber estado involucrados en linfopenia e hipergammaglobulinemia. Kipar et al.
Sugirieron que los monocitos infectados con FIPV estn implicados en la lesin de clulas
endoteliales vasculares felinas. Las citoquinas y mediadores qumicos producidos por
macrfagos / monocitos infectados con FIPV pueden desempear un papel importante en
la patognesis de FIP en gatos. TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF son citoquinas que inhiben la
apoptosis de los neutrfilos. Estas citocinas son secretadas por macrfagos y clulas T.
Cuando estas citocinas actan sobre los neutrfilos, el nivel intracelular de protena
inhibidora de la apoptosis aumenta, mientras que el nivel de protena promotora de la
apoptosis disminuye, prolongando la supervivencia de los neutrfilos. En las
enfermedades inflamatorias, como la fibrosis qustica y la enfermedad de Kawasaki, el
estado patolgico se agrava a medida que el tiempo de supervivencia de los neutrfilos se
prolonga. Adems, el agravamiento patolgico de las enfermedades inflamatorias est
asociado con proteasa y especies reactivas de oxgeno producidas por neutrfilos. Estos
mediadores tambin pueden producirse en exceso y agravar las lesiones granulomatosas
en gatos FIP. Ahora estamos progresando con estudios sobre la expresin de la apoptosis
inhibidor y promotor de protenas en neutrfilos de FIP gatos.
El aumento de la produccin de catepsina B en los macrfagos por la elastasa producida
por neutrfilos ha sido reportado, mientras que la FIPV requiere catepsina B invaden las
clulas, lo que sugiere que los neutrfilos tambin estn involucrados en un mecanismo
de mejora de la replicacin viral, diferente de la mejora dependiente de anticuerpos
(ADE), en la infeccin por FIPV. Addie et al. Informaron que la re-infeccin por FCoV de
los gatos domsticos con anticuerpos anti-FCoV positivos podra no resultar en el
desarrollo de ADE. La participacin de los neutrfilos en el aumento de la produccin de
FIPV en los macrfagos y la influencia de los macrfagos en la supervivencia de los
neutrfilos debe investigarse ms.
La produccin de virus y la expresin de mRNA de TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF se
mejoraron marcadamente en macrfagos infectados con FIPV y MAb 6-4-2 en
comparacin con macrfagos infectados con el virus solo. Utilizamos la
inmunofluorescencia para detectar el antgeno FIPV: el 10-20% de las clulas fueron
positivas cuando los macrfagos alveolares derivados de SPF fueron infectados con FIPV
y MAb 6-4-2, mientras que el 1-2% de las clulas fueron positivas cuando los macrfagos
alveolares fueron infectados con FIPV. Parece que el aumento del nmero de macrfagos
infectados por virus conduce a la sobreexpresin del ARNm asociado al factor de
supervivencia de los neutrfilos en los macrfagos.
En gatos con FIP, el virus puede ser detectado en macrfagos de lesiones
granulomatosas. Para dilucidar el mecanismo de la infiltracin de neutrfilos en lesiones
granulomatosas, se usaron macrfagos alveolares, que se pueden recoger fcilmente en
nmeros apropiados. Adems, los macrfagos alveolares pueden cultivarse sin
tratamiento de activacin, a diferencia de los monocitos.
En este estudio, hemos demostrado que los macrfagos infectados por el virus
sobreproducir neutrfilos supervivencia factores, y estos factores actan sobre neutrfilos
y regular su supervivencia. Estas observaciones sugieren que la produccin sostenida de
factores de supervivencia de neutrfilos por macrfagos durante la infeccin por FCoV es
suficiente para la supervivencia de neutrfilos y contribuye al desarrollo de lesiones
granulomatosas. Estos hallazgos pueden ser importantes para elucidar la patognesis de
FIP.
Fig. 1: Recuento de neutrfilos en la sangre de los gatos SPF y FIP. Las lneas
horizontales representan la mediana de cada grupo. Secuencias de cebadores de PCR
para GAPDH felino, TNF-alfa, GM-CSF, G-CSF y FCoV N.
Fig.2: Tasa de supervivencia de neutrfilos en SPF y FIP gatos. Los neutrfilos de gatos
SPF (10610 ml) se cultivaron a 37C durante 24 horas en medio y la viabilidad celular se
evalu mediante el ensayo WST-8.
Fig. 3: Tasa de supervivencia de neutrfilos en especmenes de gatos SPF y FIP. Los
neutrfilos de gatos SPF (1 ^ {9} 106 ml ^ {- 1}) se cultivaron a 37C durante 24 h en
presencia del plasma de gatos SPF y FIP y ascitis de gatos FIP. La viabilidad celular se
evalu mediante el ensayo WST-8. N = 7, ** P \ 0,01.
Fig.4: TNF-alfa, GM-CSF y G-CSF mRNA y FCoV N niveles de expresin de genes en los
macrfagos de SPF y FIP gatos. Los macrfagos alveolares (2 9 106 clulas) se
recogieron de SPF y FIP gatos, y TNF-, GM-CSF y G-CSF mRNA y FCoV N expresin
fue detectada por RT-PCR. TNF-, GM-CSF, y G-CSF ARNm y FCoV N niveles de
expresin gnica se analizaron cuantitativamente en trminos de la densidad relativa valor
de mRNA para el hogar de genes GAPDH. N = 7, ND no detectado.
Fig. 5: El sobrenadante de cultivo de macrfagos infectados con FIPV promueve la
supervivencia de neutrfilos. Se cultivaron macrfagos alveolares derivados de SPF (2 9
106 clulas) con medio solo, FIPV, o FIPV y MAb 6-4-2. El sobrenadante de cultivo se
recogi despus de 72 h. El ttulo de virus en el sobrenadante del cultivo se midi
mediante el mtodo de ensayo en placa (a la izquierda). Los neutrfilos de gatos SPF (1 ^
{9} 106 ml-1) se cultivaron a 37C durante 24 h en presencia de cada sobrenadante de
cultivo (dilucin final de 1: 5) y la viabilidad celular se evalu mediante el ensayo WST-8
derecho). N = 6. ND no detectado.
FIG. 6 Relacin entre la expresin de mRNA de TNF-, GM-CSF y G-CSF y la replicacin
de FIPV en macrfagos. Se cultivaron macrfagos alveolares catados por SPF (2 9 106
clulas) con medio solo, FIPV, o FIPV y MAb 6-4-2. Las clulas se recogieron a 0 h (como
control) y 72 h. Los niveles de expresin de ARNm intracelular de TNF-alfa, GM-CSF y GCSF se midieron mediante RT-PCR. TNF-alfa, GM-CSF, y G-CSF ARNm se analizaron
cuantitativamente en trminos de la densidad relativa valor de mRNA para el hogar de
genes GAPDH. N = 6.