Mycobacterium leprae specific genomic target in the promoter

region of probable 4-alpha-glucanotransferase (ML1545) gene with

potential sensitivity for polymerase chain reaction based
diagnosis of leprosy
Target genomik spesifik dari Mycobacterium leprae pada daerah yang mungkin promotor dari gen 4alpha-glucanotransferase (ML1545) dengan sensitivitas potensial terhadap reaksi rantai polymerase
berdasarkan diagnosis lepra
With the absence of an effective diagnostic tool for leprosy, cases with negative
bacteriological index and limited clinical manifestations often pose diagnostic
challenges. In this study, we investigated the utility of a novel Mycobacterium
leprae specific 112-bp DNA sequence in the promoter region of probable 4-alphaglucanotransferase (pseudogene, ML1545) for polymerase chain reaction (PCR)
based diagnosis of leprosy in comparison to that of the RLEP gene. DNA was
extracted from slit skin scrapings of 180 newly diagnosed untreated leprosy cases
that were classified as per Ridley Jopling classifications and bacte- riological index
(BI). Primers were designed using Primer Blast 3.0 and PCR was performed with
annealing temperatures of 61 C for ML1545 and 58 C for the RLEP gene using
conventional gradient PCR. The results indicated a significant increase in PCR
positivity of ML1545 when compared to RLEP across the study groups (164/180
[91.11%] were positive for ML1545 whereas 114/180 (63.33%) were positive for
RLEP [p < .0001, z = 6.3]). Among 58 leprosy cases with negative BI, 28 (48.28%)
were positive for RLEP and 48 (82.76%) were positive for ML1545 (p = .0001, z =
3.8). Of the 42 borderline tuberculoid leprosy cases, 23 (54.76%) were positive for
RLEP whereas 37 (88.09%) were positive for ML1545 (p < .0001, z = 3.9).
Increase in PCR positivity for ML1545 was also noted in lepromatous leprosy and
BI-positive groups. ML1545 can be a potential gene target for PCR-based diagnosis
of leprosy especially in cases where clinical manifestations were minimal.
Abstrak
Dengan kekurangan dari keektifan alat diagnostik untuk lepra, kasus dengan indeks
bakteriologis negatif dan manifestasi klinis yang terbatas sering menimbulkan tantangan
diagnostik. Dalam penelitian ini kami meneliti kegunaan baru dari rantaian DNA 112-bp
spesifik Mycobacterium lepra pada daerah yang mungkin promotor dari gen 4 alpha
glucotransferase (pseudogene ml145) untuk reaksi rantai polymerase (PCR) berdasarkan
diagnosis lepra dalam perbandingan dengan gen RLEP. DNA diekstraki dari celah kerokan
kulit pada 180 diagnosis baru kasus lepra yang tidak ditatalaksana yang diklasifikasikan
sebagai klasifikasi ridley jopling dan indeks bakteri (BI). Primer dirancang menggunakan
primer blast 3.0 dan PCR dilakukan proses penguatan dengan temperature 61 derajat celcius
untuk ML1545 dan 58 derajat celcius untuk gen RLEP menggunakan PCR gradient
konvensional. Hasil mengindikasikan peningkatan signifikan dalam PCR yang positif pada
ML1545 bila dibandingkan
dengan RLEP pada seluruh kelompok penelitian
(164/180[91,11%]) positif untuk ML1545 sedangkan 114/180 (63,33%) positif untuk RLEP
(p< .0001, z= 6.3). Diantara 58 kasus lepra dengan indeks bakteri negatif, 28 (48,28%) positif
untuk RLEP dan 48 (82,76%) positif untuk ML1545 (p= .0001, z= 3.8). dari 42 kasus lepra
tuberkuloid borderline, 23 (54,76%) positif untuk RLEP sedangkan 37 (88.09%) positif untuk
ML1545 (p< .0001, z=3.9). Peningkatan dalam PCR positif dari ML145 juga dicatat di lepra
lepramatosa dan kelompok indeks bakteri positif. ML1545 juga bisa menjadi target gen

potensial untuk PCR berdasarkan diagnosis pada lepra khususnya dalam kasus dimana
manifisestasi klinis minimal.

Leprosy, a debilitating disease of the skin and peripheral nerves, continues to remain as a
constant peril with approx- imately 135,752 cases from India alone in 2013 [1]. Mycobacterium leprae, the causative organism for this disease, has a long incubation period of 37
years during which the bacteria remain dormant or multiply in the Schwann cells of the
neuronal myelin and manifest a spectrum of clinical outcomes [2]. These outcomes can
range from a self-limiting, cell- mediated immunity predominant tuberculoid pole (TT)
with minimal bacillary load in the skin and nerves to a more sys- temic, humoral-immunity
predominant lepromatous pole with high bacillary load. These polar forms are interspersed
by three intermediary unstable borderline forms in which the diagnosis of the disease is
often based on clinical manifestations and histopathological features [3]. These clinical
signs are very minimal and often confounding in the TT and BT forms and hence pose
diagnostic challenges. World Health Organization (WHO) has introduced a more
convenient field based classification called the multibacillary (MB) leprosy with greater
than five skin lesions and pauci- bacillary (PB) leprosy with less than five skin lesions [4].

Pendahuluan
Lepra suatu penyakit yang melemahkan pada kulit dan saraf sekelilingnya, berlanjut sebagai bahaya
konstan dengan sekitar 135.752 kasus di India sendiri pada tahun 2013. Mycobacterium leprae,
organisme penyebab dari penyakit ini, memiliki periode inkubasi yang panjang 3 - 7 tahun di mana
bakteri tetap aktif atau berkembang biak di dalam sel-sel Schwann dari myelin neuronal dan
menunjukan gambaran pada hasil klinis . Hasil ini dapat berkisar dari self limiting, imunitas mediasi
sel utama polar tuberkuloid dengan muatan basiler minimal dalam kulit dan saraf sampai lebih
sistemik, imunitas humoral utama polar lepramatosa dengan muatan basiler tinggi . bentuk bentuk
polar ini menyebar dalam tiga perantara bentuk borderline yang tidak stabil (borderline tuberculoid
[BT], midborderline, dan borderline lepramatous) pada setiap penyakit yang didiagnosis lebih sering
berdasarkan manifestasi klinis dan ciri ciri histopatologi . Tanda-tanda klinis ini sangat minim dan
sering mengacaukan dalam bentuk TT dan BT dan karenanya menimbulkan tantangan diagnostik.
WHO memperkenalkan klasifikasi yang lebih mudah yang dinamakan lepra multibasiler dengan lebih
banyak dari 5 lesi pada kulit dan lepra Pauci Basiler dengan kurang dari 5 lesi pada kulit.

During the incubation phase between the infection and manifestation of clinical symptoms,
the disease may remain subclinical and chronically progress to a systemic phase which
predisposes nerve damage and subsequent deformities [5]. Therefore, it is important to
diagnose the disease early in a subclinical state in order to treat it rapidly and prevent
deformities. In this context, an early diagnostic test has long been desired for leprosy [6]. To
date, there is no specific screening test and/or assay that aids in early diagnosis of leprosy
with substantial sensitivity and specificity [7]. While the bacteriological index (BI)
determination in the slit skin smears and histopathological examination of the skin biopsy
sections remained as clinical and pathological methods for determination of bacillary load,
the sensitivity of these tests is limited to the few microscopic sections being examined.
Detection of M. leprae gene targets (RLEP, 16SrRNA, SodA, Ag85A, PRA, etc.) in the DNA

extracted from the skin biopsies and peripheral blood samples of leprosy patients
comparatively presented higher sensitivity especially in the indeterminate, TT, and BT forms
where the BI remains negative due to low bacterial counts [8,9]. However, some of these
gene targets have questionable specificity
Selama masa inkubasi di antara infeksi dan gambaran tanda klinis, penyakit ini bisa tetap subklinis
dan secara berkesinambungan berkembang ke fase sistemik yang mana mempengaruhi kerusakan
saraf dan kemudian cacat. Oleh karena itu, sangat penting untuk mendiagnosis penyakit di awal pada
keadaan subklinis supaya dapat diobati dengan cepat dan mencegah kecacatan. Dalam konteks ini,
pemeriksaan diagnosis awal telah lama diinginkan untuk lepra. Saat ini, tidak ada test penyaringan
spesifik dan atau assay yang membantu dalam diagnosis awal pada lepra dengan sensifitas dan
spesifitas yang besar. Semantara penentuan indeks bakteri (IB) dalam apusan celah kulit dan
pemeriksaan histopalogi pada bagian biopsi kulit tetap sebagai metode klinis dan patologis untuk
penentuan muatan basiler, Sensifitas pada test ini adalah terbatas untuk beberapa bagian mikroskop
yang diperiksa. Deteksi dari target gen M. leprae (RLEP, 16SrRNA, SodA, Ag85A, PRA, dll) dalam
ekstrak DNA yang berasal dari biopsi kulit dan sampel darah perifer pada pasien lepra relative
menyajikan sensifitas lebih tinggi terutama pada bentuk Indeterminate, TT, dan BT dimana IB tetap
negatif karena jumlah bakteri rendah. Bagaimanapun beberapa dari target gen memiliki spesifitas
yang dipertanyakan.
To date, the known gene target that remains specific to M. leprae genome is the RLEP
gene [10], which is a repetitive element in the genome of M. leprae [11]. Real-time
polymerase chain reaction (PCR) based detection using RLEP PCR assays could detect
70% of PB leprosy in which the BI is negative [12]. However, simple conventional
nested PCR assay with a 129-bp fragment could detect only 55.5% of the BI negative PB
cases [13]. While it was reported that RLEP real-time PCR assay can detect M. leprae
DNA in as little as 8 fg (indicating 3 bacterial cells per sample, taking a 3.2-mbp genome
into calculation), the 129-bp fragment missed on identifying 3050% of the BI negative
PB cases when used in a conven- tional PCR [14]. Hence there is a need for
identification of specific and sensitive M. leprae gene targets that aid in diagno- sis of
leprosy cases with negative BI or very minimal bacillary load using simple conventional
PCR.
Saat ini, target gen yang diketahui yang tetap spesifik untuk genom M. Leprae adalah RLEP gen.
yang merupakan elemen berulang dalam genom pada M. lepra. Real time reaksi rantai polymerase
berdasarkan deteksi menggunakan RLEP PCR assay dapat mendeteksi 70 persen lepra PB yang
mana IB adalah negatif. Bagaimanapun konvensional sederhana PCR assay bersarang dengan
fragmen 129-bp yang hanya dapat dideteksi 55.5 persen pada kasus PB dengan IB negatif.
Sementara telah dilaporkan bahwa RLEP real time PCR assay dapat mendeteksi DNA M.lepra dalam
waktu 8 fg (diindikasikan 3 sel bakteri per sampel, pengambilan genom 3.2 mbp kedalam
perhitungan), fragmen 129-bp terjawab pada identifikasi 30-50% IB yang negatif pada kasus PB jika
menggunakan PCR konvensional. Kerenanya ada kebutuhan untuk identikasi pada spesifitas dan
sensifitas target gen M. lepra yang membantu dalam diagnosis kasus lepra dengan IB yang negative
atau muatan basiler yang minimal menggunakan PCR konvensional sederhana.
In this study, we examined M. leprae specific and unique DNA sequences in
pseudogenes and identified a 112-bp sequence in the promoter region of ML1545
(probable 4-alpha-glucanotransferase [pseudogene]) which possess sub- stantial specificity.
Further, we investigated the utility of this gene sequence as a target for PCR-based
detection of M. leprae DNA in the clinical isolates of leprosy patients. The PCR positivity
was compared to that of RLEP to determine the sensitivity in detection of M. leprae DNA

in leprosy cases across the spectrum of the disease.

Pada penelitian ini, kami memeriksa mycobacterium leprae secara spesifik dan rantaian dna khusus
dalam pseudogen dan diidentifikasi suatu rantaian 112-bp di daerah promotor dari ML1545
(kemungkinan 4 alpha glucanotransferase (pseudogene)) yang memiliki kekhususan substansial.
Selanjutnya kami meneliti kegunaan pada rantaian gen ini sebagai target dari deteksi berdasarkan
PCR pada DNA M. leprae dalam isolasi klinis pada pasien lepra. Hasil positif pada PCR dibandingkan
dengan RLEP untuk menentukan sensifitas dalam deteksi DNA M. leprae pada kasus leprae yang
menjelaskan gambaran dari penyakit tersebut.

Materials and methods

1

Study patients

A total of 180 newly diagnosed untreated leprosy cases from the Dermatology Outpatient
Department of Schieffelin Insti- tute of Health-Research and Leprosy Center, Karigiri in
Vel- lore, Tamil Nadu, India, were enrolled in the study following the institutional ethical
guidelines. An informed and written consent for participation was obtained from all the
patients before enrolling in the study, following the ethical guidelines laid down by the
Indian Council of Medical Research. All procedures conducted in the study were in
accordance with the guidelines of the Institutional Ethics Committee of Schieffelin
Institute of Health-Research and Leprosy Center and with the ethical standards as laid
down in the 1964 Declaration of Helsinki and its later amendments or comparable ethical
standards. All the cases were examined by a clinician/leprolo- gist and clinical,
demographic, and histopathological details were recorded at diagnosis (Table 1). In
addition, six healthy individuals who reside in a low endemic area and without any direct
contacts with active leprosy cases, were enrolled as controls. DNA extracted from
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis, and Mycobacterium phlei was used as a
technical control to ascertain the specificity of ML1545.
Material dan Metode
1.1 studi pasien
Sebanyak 180 diagnosis baru kasus lepra yang tidak ditatalaksana dari bagian Dermatologi
Rawat Jalan Departemen Schieffelin Institut Penelitian Kesehatan dan pusat Kusta , Karigiri di
Vellore, Tamil Nadu, India, yang terdaftar dalam penelitian ini mengikuti panduan etika lembaga.
Pemberitahuan dan persetujuan tertulis untuk partisipan diperoleh dari semua pasien sebelum
mendaftar dalam penelitian ini, mengikuti pedoman etika yang ditetapkan oleh dewan riset
kesehatan india. semua prosedur dilakukan dalam penelitian ini adalah sesuai dengan pedoman
dari Komite Etika Kelembagaan Schieffelin Institut Penelitian Kesehatan dan pusat Kusta dan
dengan standar etika sebagaimana ditetapkan dalam Deklarasi Helsinki 1964 dan belakangan
diamandemen atau disamakan dengan standar etika. Semua kasus diperiksa oleh dokter/
leprologist dan klinis, demografis, dan perincian histopatological tercatat di diagnosis (Tabel 1).
Sebagai tambahan 6 individu yang sehat yang tinggal di dalam daerah endemic yang rendah dan

tanpa ada kontak langsung dengan kasus lepra yang aktif, dimasukan sebagai control. Ekstrak
DNA dari mycobacterium tuberculosis, mycobacterium smegmatis, dan mycobacterium phlei
digunakan sebagai control teknis untuk memastikan spesifitas dari ML1545
Sample types
Part of the 5 mm 5 mm excisional skin biopsy that was collected for routine
histopathological examination was used for the experiments in the current study. Ridley
Jopling classifi- cation and BI were recorded at diagnosis for all the participants. The
clinical characteristics of the participants were represented in Table 1.
Tipe Sample
Bagian dari 5mmx 5mm biopsi kulit yang di eksisi di kumpulkan untuk pemeriksaan
histopathology rutin yang digunakan untuk eksperimen pada penelitian sekarang.
Klasifikasi ridley jopling dan IB tercatat pada diagnosis untuk semua peserta.
Karakteristik klinis dari peserta dilaporkan pada tabel 1.
DNA extraction
DNA was extracted from skin biopsy specimens following the lysis protocol which was
reported earlier, with minor modifications [15]. Briefly, 25 mg of tissue was thoroughly
homogenized using a manual homogenizer and homogenate was added to 1 mL of 1X
phosphate buffer saline and centrifuged at 8000 rpm for 10 min at 4 C. The pellet was
dried for 1 h at 50 C on a dry block incubator and was later used in the lysis protocol. Two
hundred microliters of lysis buffer (containing 100 mM Tris buffer at pH 8.5, 1 mg/mL
proteinase K, and 0.05% Tween 20) was added to the homogenate in a 1.5-mL micro- centrifuge
tube, vortexed thoroughly, and incubated at 60 C for 16 h in a water bath (Cole-Parmer
Polystat Inc., Chicago, IL, USA). Post incubation, proteinase K was deactivated at 95 C
for 15 min. Later the lysate was allowed to cool to room temperature and DNA was eluted using
phenol chloroform extraction. DNeasy Kit (Cat No: 69504; Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)
was used in some samples where the tissue content was apparently low. DNA extraction from
cultures of M. tuber- culosis, M. Smegmatis, and M. phlei was also performed using the same
protocol.
Ekstrasi DNA
Dna di ekstrasi dari specimen biopsi kulit mengikuti lisis protocol yang dilaporkan
sebelumnya,dengan modifikasi minor. Dengan singkat, 25 mg dari jaringan , dibuat sampai sejenis
menggunakan homogenizer manual dan zat homogen ditambahkan 1ml dari 1x larutan penyangga
phosphate dan di centrifugal pada 8000 rpm selama 10 menit pada 4 derajat celcius. Pil dikeringkan
selama satu jam pada 50 derajat celcius pada incubator blok kering yang sebelumnya digunakan
dalam protocol lisis. Dua ratus microliter dari penyangga lisis (berisi 100 mM penyangga Tris pada
pH 8,5, 1mg/ml proteinase K dan 0.05% tween 20). Dicampurkan pada zat homogeny dalam 1,5 mL
mikro tabung centrifugal. Dan di inkubasi pada 60 derajat celcius selama 16 jam dalam air mandi .
setelah inkubasi, proteinase K dinonaktifkan pada 95 derajat selama 15 menit. Kemudian lisat itu
dibiarkan dingin sampai suhu kamar dan DNA dielusi menggunakan ekstraksi fenol kloroform.
Kotak DNeasy digunakan dalam beberapa sampel dimana saat konten jaringan kelihatannya rendah.
Ekstrasi DNA dari kultur M. Tuberkulosis, M Smegmatis dan M. Phlei juga dilakukan
menggunakan protocol yang sama.

Selection of the gene target (ML1545) and primer design

A sequential search of M. leprae specific DNA sequences in pseudogenes was performed using
National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST) and PatricBRC Portal (https://www.pa- tricbrc.org). A set of eight genes that include
ML1127, ML2110, ML2211, ML0203, ML0307, ML1545, ML2177, and ML0466 were
identified to harbor sequences that remain specific for M. leprae genome. However, upon
further analysis of these individual sequences using NCBI BLAST with various database
search parameters like NCBI Genomes (chromo- somes) and Reference genomic
sequences within Mycobacteria and Mycobacteriaceae, a DNA sequence that traverses the
promoter region of probable 4-alpha-glucanotransferase (ML1545) gene was chosen as it
remained highly specific to the genome. Primers were designed while maintaining the
specificity using Primer BLAST version 3 from NCBI. The sequence for the forward
primer is 50 -GTCCTCCGTCTTGCTG ACTG-30 and for the reverse primer is 50CATACCGGCCA TATTGCGTC-30. The designed primers were obtained com- mercially
from Eurofins Scientific Inc., Germany. The PCR amplifications with these primers were
compared with those of the RLEP whose primers were taken from the earlier reports [16].
Seleksi dari gen target (ML1545) dan rancangan primer
Pencarian percontohan dari rangkaian DNA spesifik M. lepra dalam pseudogen dilakukan dengan
menggunakan National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment
Search Tool (BLAST) dan portal PatricBRC Portal (https://www.pa- tricbrc.org). kumpulan dari
8 gen yang termasuk ML1127, ML2110, ML2211, ML0203, ML0307, ML1545, ML2177, dan
ML0466, diidentifikasi untuk mempunyai urutan spesifik yang tetap untuk genom M. lepra.
Namun, setelah analisis lebih lanjut pada rangkaian individual menggunakan NCBI
BLAST dengan berbagai database parameter pencarian seperti Genom NCBI
(kromosom) dan rangkaian referensi genom dalam Mycobacteria dan Mycobactericiae,
rangkaian DNA yang melewati daerah promotor pada gen yang disangka 4-alphaglucanotransferase (ML1545) dipilih karena tetap sangat spesifik terhadap genom. Primer
dirancang dengan tetap menjaga kekhususan menggunakan PRIMER BLAST versi 3 dari
dan untuk primer
NCBI. Rangkain untuk primer depan adalah 50 -GTCCTCCGTCTTGCTG ACTG-30
kebalikan adalah 50-CATACCGGCCA TATTGCGTC-30 rancangan primer diperoleh secara komersial dari Eurofins Scientific
Inc., Jerman. Pengerasn PCR dengan primer ini dibandingkan dengan RLEP yang primernya
sudah diambil dari laporan sebelumnya.

PCR conditions and cycling parameters

The PCR amplifications were performed in PTC-150 MiniCycler (MJ Research, MA,
USA). A 20-lL reaction mix was prepared using 1.25 units of AmpliTaq Gold DNA
polymerase with Buffer I (N8080240: Life Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA), 0.35

mM of each kind of deoxynucleotides, 0.25 mM MgCl 2,

0.25 lM each of forward and reverse primers, and 2 ng of DNA. The reaction
conditions included an initial denaturation of 95 C for 7 min, one cycle of 94 C for 2
min, 61 C for 2 min, and 72 C for 2 min. This was followed by 40 cycles of 94 C for
30 s, 61 C for 30 s, and 72 C for 45 s. The reaction was terminated with a final extension
of 72 C for 10 min and the tubes were cooled to 25 C for 10 min. The amplicons were
electrophoresed on a 2% agarose gel and gel images were captured using gel documentation
system coupled with a UV camera. PCR-based amplification of the RLEP gene target was
performed as described earlier [16]. DNA extracted from
M. leprae strain Br4923 (Courtesy: BEI Resources, catalog num- ber: NR-19351) was used
as a positive control in the experiments.
Kondisi PCR dan Putaran Parameter
Pengerasan PCR dilakukan dalam PTC 150 Minicycler (MJ Research, MA, USA). Sebuah reaksi
campuran 20-IL disiapkan menggunakan 1.25 unit dari Polymerase DNA Gold AmpliTaq dengan
Penyangga 1 (N8080240: Life Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA), 0.35mM dari masing
masing deoksinukleusida, 0.25mM MgCl, O.25 IM setiap primer maju dan mundur, dan
2ng dari DNA. Kondisi reaksi termasuk sebuah denaturasi awal pada 95 derajat celcius
untuk 10 menit , satu putaran pada 94 derajat celcius selama 2 menit, 61 derajat celcius
selama 2 menit, dan 72 derajat celcius selama 2 menit. Ini diikuti oleh 40 putaran pada 94
derajat celcius untuk 30 detik, 61 derajat celcius selama 30 detik, dan 72 derajat celcius
Selma 45 detik. Reaksi diakhiri dengan akhir perpanjangan pada 72 derajat celcius selama
10 menit dan tabung didinginkan pada 25 derajat celcius selama 10 menit. Amplikon
dielektrophoresis pada gel agarose 2% dan gambaran gel ditangkap menggunakan system
dokumentasi gel ditambah dengan kamera UV. Pengerasan berdasarkan PCR pada target
gen RLEP dilakukan berdasarkan penjelasan sebelumnya. Ekstrak DNA yang berasal dari
M.leprae turunan Br4923 digunakan sebagai control yang positif dalam percobaan ini.
1.1. PCR conditions for other Mycobacteria
DNA was extracted from pure cultures of M. tuberculosis (pro- vided by Department
of Microbiology, CMC Vellore, Tamil Nadu, India), M. Smegmatis, and M. phlei.
ML1545 and RLEP genes were amplified using the above mentioned PCR
conditions. The presence of DNA in the samples was confirmed through the
amplification of the rpoB gene region in all three species using specific primers
and PCR conditions.
Kondisi PCR pada Mycobakteria lainnya
DNA yang diekstrak berasal dari kultur murni M. tuberculosis (disediakan oleh Departemen
Mikrobiologi, CMC Vellore, Tamil Nadu, India), M. smegmatis, dan M. Phlei. ML1545 dan gen
RLEP diperkuat dengan menggunakan kondisi PCR yang disebutkan diatas. Adanya DNA dalam
sampel sudah dikonfirmasi melalui pengerasan pada bagian gen rpob di dalam tiga spesies
menggunakan primer spesifik dan kondisi PCR.
1.1. Statistical analysis
Statistical analysis of the data was performed using GraphPad Prism 6 software (GraphPad
Software, Inc. CA, USA). Z test of proportions was used to compare the PCR positivity
between the two gene targets. An association with p < 0.05 is consid- ered statistically
significant.
Analisis Statistik
Analisis statistic pada data dilakukan menggunakan GraphPad Prism 6 software (GraphPad

Software, Inc. CA, USA). Uji Z proporsi digunakan untuk membandingkan PCR yang
positif diantara dua target gen. hubungan antara p< 0.005 dianggap signifikan secara
statistik.

Result
1.1. PCR and sequence determination of 112-bp fragment flanking the promoter region of ML1545
The PCR amplification of ML1545 revealed a 112-bp fragment (Fig. 1) whose sequence was
confirmed through Sanger DNA sequencing. BLAST alignment with the known genomic
repository of NCBI (Gen Bank Accession: FM211192) for M. leprae BR4923 and M.
leprae TN strains revealed that the
sequence spans nucleotide positions 18681371868248 in the BR4923 strain and 187412
187523 in the TN strain (Fig. 2). This sequence was chosen owing to its specificity to M.
leprae and the absence of this sequence in other mycobacteria.
Hasil
PCR dan Rangkaian Penentuan dari Fragmen 112-bp mengapit daerah promoter ML1545
Pengerasan PCR pada ML1545 memperlihatkan fragmen 112-bp (gambar 1) yang
rangkaiannya dikonfirmasi melalui rangkaian DNA sanger. Penjajaran BLAST dengan
tempat penyimpanan genom yang diketahui oleh NCBI untuk M. lepra BR4923 dan M. lepra
turunan TN mengungkapkan bahwa rangkain masa posisi nukleosida 18681371868248
dalam turunan BR4923 dan turunan TN (gambar 2). Rangkaian ini dipilih disebabkan oleh
kekhususan pada M. lepra dan ketiadaan rangkaian ini pada micobakteria lain.
Comparison of PCR positivity between ML1545 and RLEP
Comparative assessment of PCR positivity among the leprosy patients revealed that
164/180 (91.11%) were positive for ML1545 when compared with 114/180 (63.33%) for
the RLEP (p < .0001, z = 6.3). Of the 180 samples, 108 (60.00%) samples were positive
for both of the gene targets, 10 (5.56%) samples were negative for both ML1545 and
RLEP, 56 (31.11%) samples were positive for ML1545 and negative for RLEP, and
six (3.33%) samples were negative for ML1545 and positive for the RLEP (p < .0001, z =
7.1; Table 2). Of the ML1545 positive and RLEP negative samples (n = 56), 24 (42.85%)
samples had a negative BI, 6 (10.71%) were cases of PB leprosy, 17 (30.35%) were
cases of BT and indeterminate leprosy, and 9 (16.07%) were cases with other clinical
forms of leprosy.
Perbandingan pada PCR yang positif diantara ML1545 dan RLEP
Perbandingan penilaian pada PCR yang positif antara pasien lepra yaitu 164/180 (91.11%)
positif pada ML1545 saat dibandingkan dengan 114/180 (63.33%) untuk RLEP (p < .0001, z
= 6.3). Dari 180 sampel, 108 (60.00%) sampel, sampel positif untuk kedua target gen, 10
(5.56%) sampel adalah negative untuk kedua ML1545 dan RLEP, 56 (31.11%) sampel
adalah positif untuk ML1545 dan negative pada RLEP, dan 6 sampel negative pada ML1545
dan positif pada RLEP (p < .0001, z = 7.1; Tabel 2). Dari sampel ML1545 yang positif dan
RLEP yang negative (n =56), 24 (42,85%) sampel negative terhadap IB, 6 (10.71%) adalah kasus
lepra PB, 17 (30,35%) adalah kasus dari BT dan lepra intermediate, dan 9 (16,07%) adalah kasus
dengan bentuk klinis lain dari lepra.

3 Comparison of PCR positivity of ML1545 and RLEP across various clinical forms in leprosy
Attribution of PCR positivity of ML1545 and RLEP to various clinical forms in leprosy as
classified according to WHO regi- men of MDT, RJ classification, and BI revealed that 103
(63.58%) of 162 MB leprosy cases were positive for RLEP and 150/162 (92.59%) were
positive for ML1545 (p = .0001, z = 6.0). Of the 42 BT leprosy cases, 23 (54.76%) were
positive for RLEP whereas 37 (88.09%) were positive for ML1545 (p = .0006, z = 3.4).
In the lepromatous pole group, 52 (72.22%) out of the 72 samples were positive for RLEP
whereas 69 (95.83%) were positive for ML1545 (p = .0002, z = 3.7). Importantly, among
the 58 leprosy cases with negative BI, 28 (48.28%) were positive for RLEP and 48
(82.76%) were positive for ML1545 (p = .0001, z = 3.8). In the BI positive groups, among
122 leprosy cases, 86 (70.49%) were positive for RLEP whereas 116 (95.08%) were
positive for ML1545 (p < .0001, z = 5.1). These results indi- cate that ML1545 has
statistically significant higher PCR posi- tivity in various clinical forms of leprosy when
compared with RLEP using conventional gradient PCR. Comparisons within other groups
were not detailed due to low sample numbers in each group; however, they were
represented in Table 3. These observations provide a preliminary lead to the utility of
ML1545 as a PCR target for diagnosis of leprosy, especially among leprosy cases with low
bacillary load.
Perbandingan pada PCR yang positif pada Ml1545 dan RLEP diberbagai bentuk klinis pada
Lepra
Penyebab dari PCR yang positif pada ML1545 dan RLEP diberbagai bentuk klinis pada lepra
diklasifikasikan berdasarkan regimen who pada MDT, klasifikasi RJ, dan IB mengungkapkan
bahwa 103 (63.58%) kasus lepra MB adalah positif pada RLEP dan 150/162 (92.59%) positif
pada ML1545 (p = .0001, z = 6.0). dari 42 kasus lepra BT, 23 (54.76%) adalah positif
untuk RLEP sedangkan 37 (88.09%) adalah positif pada ML1545 (p = .0006, z = 3.4).
pada kelompok polar leprmatosa, 52 (72.22%) diluar dari 72 sampel adalah positif untuk
RLWP sedangkan 69 (95.83%) adalah positif untuk Ml1545 (p = .0002, z = 3.7). yang
terpenting, diantara 58 kasus lepra dengan IB negative, 28 (48.28%) adalah positif pada
RLEP dan 48 (82.76%) adalah positif pada Ml1545 (p = .0001, z = 3.8). pada kelompok
IB yang positif, diantara 122 kasus lepra, 86 (70.49%) adalah positif pada RLEP
sedangkan 116 (95.08%) adalah positif pada ML1545 (p < .0001, z = 5.1). hasil ini

mengindikasikan bahwa Ml1545 memiliki signifikan statistik yang lebih pada PCR yang
positif dalam berbagai bentuk klinis pada lepra jika dibandingkan dengan RLEP
menggunakan PCR gradient konvensional. Perbandingan diantara kelompok lain tidak
terperinci karena jumlah sampel yang rendah pada setiap kelompok, bagaimanapun
mereka diwakili pada tabel 3. Observasi ini menyediakan tuntunan awal untuk kegunaan
pada Ml1545 sebagai target PCR untuk diagnosis lepra, khususnya diantara kasus lepra
dengan muatan basiler yang rendah.
4

PCR assessments in control groups and other mycobacterial species

Our results indicated that six nonendemic healthy controls were PCR negative for RLEP or
ML1545. Specificity assess- ments with DNA extracted from M. tuberculosis, M. smegmatis,
and M. phlei revealed that all three species were negative for PCR with RLEP as well as
ML1545. Presence of bacterial DNA in the samples was determined using PCR for rpoB
gene region of all three species which indicated positive PCR results. These control
experiments indicate that RLEP as well as ML1545 are specific for M. leprae and do not
show any cross amplification with other mycobacterial species
Penilaian PCR pada grup control dan spesien bakteri lainnya
Hasil kami mengindikasikan bahwa6 kontrol sehat non endemic adalah PCR yang negative
pada RLEP dan ML1545. Penilaian khusus dengan ekstrak DNA dari M. tuberculosis, M
smegmatis, M phlei mengungkapkan bahwa ketiga spesies adalah negative untuk PCR dengan
RLEP begitu juga dengan ML1545. Adanya DNA bakteri dalam sampel ditentukan menggunakan
PCR untuk daerag gen rpob pada ketiga spesies yang mana mengindikasi hasil PCR yang
positif. Percobaan kontrol ini mengindikasi bahwa RLEP sama baiknya dengan Ml1545 dan
spesifik untuk M. leprae dan tidak menunjukan adanya amplifikasi silang pada mikroba lain.
2

Discussion
Diagnosis of leprosy has always remained a challenging task for clinicians and
dermatologists because the disease follows an immunological spectrum wherein TT and
BT forms are often misdiagnosed due to the lack of clear and evident clinical
manifestations, especially in a setting where histopathological examination is not
available. PCR has proved to be a great support in diagnosis of TT and PB leprosy
where the BI is negative. In the past 20 years, PCR has been definitively used in
detecting M. leprae DNA in clinical specimens of vari- ous types, including slit skin
scrapings, nerves, nasal swabs, oral swabs, ocular lesions, urine, and blood [1822].
Diagnosis lepra selalu tetap tugas yang menantang untuk dokter dan dermatologis karena
penyakit ini diikuti gambaran imunologi dimana bentuk TT dan BT yang paling sering salah
didiagnosis karena kurangnya manifestasi klinis yang jelas dan nyata, khususnya dalam keadaan
dimana pemeriksaan histopatologi tidak tersedia. PCR telah terbukti menjadi dukungan yang
besar pada diagnosis lepra TT dan PB dimana hasil IB adalah negative. Dalam 20 tahun terakhir ,
PCR sangat menentukan kegunaan dalam mendeteksi DNA M. lepra dalam specimen klinis
berbagai tipe, termasuk kerokan celah kulit, saraf, apusan hidung, apusan mulut, lesi mata, urin,
dan darah.

Various M. leprae gene targets have been chosen and analyzed for their sensitivity and
specificity in a diagnostic setting. A 530-bp gene encoding a proline-rich antigen [23] was
used in the detection process and later genes like Ag85B [9], sodA, and 16SrRNA [12]
have also been analyzed for their utility in diagnosis. Identification of RLEP, a repetitive
sequence of M. leprae which demonstrated higher sensitivity and specificity than earlier

reported gene targets, enabled detection of low levels of M. leprae DNA [24]. Donoghue
et al. [10] first reported the amplification of the 129-bp fragment of the RLEP gene using
nested PCR in DNA extracted from skin biopsies of leprosy cases. It has been noted that
conventional RLEP PCR indicated a 3050% positivity in leprosy cases with negative
BI and around 80% in cases with acid fast bacilli in the smears [25]. The quantitative PCR
with RLEP revealed 87.1% sensitiv- ity [26] and the application of RLEP real-time PCR
assays has enabled the detection of 75% of PB leprosy cases [14]. While the target
remained highly specific for M. leprae, the sensitiv- ity values in patient groups especially
in TT and BT forms of the disease remained moderate. Although real-time quantita- tive
PCR using RLEP assays proved useful, their application is limited due to costs associated
with the assays. Hence, in endemic countries and in resource limited field and patient
settings, a gene target that can demonstrate at least 8090% sensitivity for M. leprae DNA
using conventional gradient PCR is important for confirmatory diagnosis especially in
cases with low bacillary load and where diagnosis is difficult.
Berbagai target gen M. leprae sudah dipilih dan di analisis untuk sensifitas dan spesifitas
dalam tata cara diagnosis. Gen 530-bp mengkode antigen kaya proline digunakan dalam
mendeteksi prosen dan gen kemudian seperti Ag85B, soda, dan 16SrRNA yang juga
dianalisis untuk kegunaanya dalam diagnosis. Identifikasi pada RLEP, sebuah rangkaian
ulangan pada M. lepra yang menunjukan sensifitas dan spesifitas lebih besar dari gen
target yang dilaporkan sebelumnya, memungkinkan deteksi pada level rendah DNA M.
Lepra. Laporan pertama kali pada amplifikasi fragmen 129-bp pada gen RLEP
menggunakan PCR yang bersarang dalam ektrasi DNA yang berasal dari biopsy kulit
kasus lepra. Telah dicatatbahwa konvensional RLEP PCR mengindikasi 30-50% positif
dalam kasus lepra dengan IB negative dan kira-kira 80% kasus dengan basil tahan asam
pada smear. Kuantitatif PCR dengan RLEP menunjukan 87.1% sensitifitas dan aplikasi
pada RLEPreal time PCR assays memungkinkan deteksi pada 75 % kasus lepra PB.
Sementara target tetap sangat spesifik untuk M. lepra. Nilai sensifitas pada kelompok
pasien terutama dengan bentuk TT dan BT pada penyakit ini tetap moderat. Meskipun
realtime PCR kauntitatif menngunakan aasays RLEP terbukti berguna, aplikasi mereke
terbatas Karen biaya berhubungan dengan assays. Karena itu, Negara endemic dan sumber
bidang yang terbatasdan keadaan pasien, target gen dapat menunjukan paling banyak 8090% sensifitas dari DNA M.Lepra menggunakan PCR gradient konvensional adalah
penting untuk mengkonfirmasi diagnosis terutama pada kasus muatan basiler yang rendah
dan dimana diagnosis sangat sulit.

selain itu, spesifitas pada pengerasan gen RLEP menggunakan PCR konvensional tidak
begitu cukup. Gen RLEP juga harus mengawetkan rantaian yang meningkatkan
kemungkinanan adanya rantaian homologous pada genome mikrobacteria lain.

We reported for the first time about the utility of ML1545 for PCR-based diagnosis of
leprosy with conventional PCR. This novel target was able to determine 82% of leprosy
cases with negative BI, demonstrating a higher sensitivity in cases with low bacillary load.
The target remained highly specific for M. leprae as noted from the BLAST results with the
ampli- con sequence and also from the PCR amplifications in three other related
mycobacterial species. The results indicate only a preliminary assessment of this M. leprae
specific gene target in clinical samples using conventional PCR; however, there is scope for
further assessments that include determination of mRNA expression levels of the target
across various study groups. An assay which is similar to that of the RLEP real- time PCR
assay can be developed for ML1545 to determine the sensitivity limit of this gene target in
detecting M. leprae DNA extracted from various tissue sources of leprosy patients. Also,
the utility of this specific target has not been investigated in contacts of leprosy cases.
Further studies in this area may provide insights into the utility of ML1545 in determining
subclinical infection in leprosy, owing to its higher sensitivity.
Kami melaporkan untuk pertama kali tentang kegunaan dari ML1545 dari berdasarkan
PCR diagnosis pada lepra dengan PCR konvensional. Target baru ini bias menemukan
82% kasus lepra dengan IB yang negative, yang menunjukan sensitifitas lebih pada kasus
dengan muatan basiler yang rendah. Targer tetap sangat spesifik pada M.lepra yang dicata
dari hasil BLAST dengan rantaian amplikon dan juga dari pengerasan PCR dalam ketiga
hubungan lainnya pada tiga spesies. Hasil ini hanya mengindikasikan penilaian awal dari
target gen spesifik M. lepra dalam sampel klinis menggunakan PCR konvensional.
Bagaimanapun, terdapat jangkauan untuk penilaian lebih lanjutyang termasuk menentukan
level tanda pada mRNA pada target yang menjelaskan pada beberepa kelompok
penelitian. Assay yang hampir mirip dengan RLEP real- time PCR assay akan dapat
berkembang untuk ML1545 dalam penentuan batas sensifitas pada gen target ini dalam
deteksi ekstrak DNA M. lepra yang berasal dari beberapa sumber jaringan pada pasien
lepra. Juga, kegunaan target spesifik ini belum diselidiki dalam kontak pada kasus lepra.
Lebih lanjut, penelitian-penelitian pada wiliyah ini akan memberikan wawasan sampai
kegunaan dari ML1545 dalam penentuan infeksi subklinis pada lepra, disebabkan oleh ini
sangat sensitive.
In conclusion, ML1545 can be a potential gene target for PCR-based diagnosis of
leprosy especially in leprosy cases with low bacillary load and negative BI and in cases that
are in the TT and BT forms. The target may prove useful in a basic diagnostic laboratory
where conventional PCR machines are available.
Kesimpulannya, Ml1545 bisa menjadi potensial target gen untuk PCR berdasarkan
diagnosis lepra khususnya kasus lepra dengan ,uatan basiler rendah dan IB yang negative
dan dalam kasus yang memiliki bentuk TT dan BT. Target dapat membuktikan kegunaan
laboratorium diagnostic dasar demana mesin PCR konvensional tersedia.