TCNICAS BSICAS DE

MORFOLOGIA VEGETAL
A morfologia vegetal, ao estudar a forma descrevendo as relaes
espaciais dos elementos estruturais, utiliza-se de recursos diversos, tais como: lupa
para a anlise de rgos (escala em cm ou mm), microscpio fotnico para a
observao de sistemas, tecidos e clulas (escala em m), e microscpio eletrnico
para o estudo de organelas celulares (escala em ) . Para que o material possa ser
visualizado ao microscpio deve ser processado segundo microtcnicas vegetais.

MICROTCNICA VEGETAL
O material a ser observado ao microscpio deve ser fino e transparente,
de modo a permitir a passagem de luz. Pode ser preparado a fresco, indicado para
estruturas delicadas ou muito hidratadas e para testes histoqumicos; ou pode ser
fixado, o que detm os processos vitais de autlise. As amostras so fragmentadas
e diafanizadas, ou seccionadas mo livre ou por micrtomo (de deslize, rotativo,
ultramicrtomo etc.), obtendo-se preparaes temporrias, semipermanentes ou
permanentes.

CORTES HISTOLGICOS
CORTES MO LIVRE
uma tcnica simples e rpida, que requer certa habilidade manual
para obteno de cortes finos, executando-se como se segue :
selecionar parte adequada do vegetal e apar-la segundo o sentido do corte
(transversal ou longitudinal);
quando material muito rgido, reidrat-lo ou ferv-lo em gua;
quando muito delicado, inclu-lo em suporte (isopor, cortia, medula de embaba
ou sabugueiro etc.);

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segurar o material com uma das mos e com a outra seccion-lo com navalha ou
lmina cortante nova;
receber os cortes em vidro-de-relgio contendo gua;
selecionar os mais delgados, transportando-os com pincel ou estilete;
se necessrio, diafanizar com soluo de cloral hidratado a 60% ou de hipoclorito
de sdio a 20%;
lavar os cortes com gua;
cor-los com reagentes ou corantes adequados;
para preparao temporria, confeccionar as lminas utilizando como meio de
montagem gua ou soluo de etanol a 30%, cobrindo com lamnula;
para preparao semipermanente, confeccionar as lminas com soluo de
glicerina a 60% ou gelatina glicerinada, cobri-las com lamnula e lutar com esmalte
incolor;
para preparao permanente, desidratar progressivamente os cortes em srie
etanlica (50, 70, 90, 100 e novamente 100%) e diafanizar em srie etanol-xillica
(3:1, 1:1, 1:3 e xilol puro); montar as lminas com blsamo-do-canad ou resina
sinttica.

CORTES EM MICRTOMO
O micrtomo permite que se obtenham cortes com espessura definida, a
partir de material rgido ou, quando frgil, infiltrado em suporte adequado.

micrtomo de deslize secciona o material em cortes individuais, enquanto que o

rotatrio possibilita a formao de uma fita, com cortes sequenciais.
O preparo das amostras para seccionamento geralmente envolve
fixao, desidratao, infiltrao e emblocamento.

Fixao
O processo de fixao procura preservar a estrutura celular, sem alterar
a qumica da clula. Os fixadores so agentes fsicos (calor, frio, dessecamento) ou

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qumicos, sendo que estes ltimos, coagulam ou precipitam protenas celulares e

endurecem os tecidos.
Os fixadores qumicos podem ser simples ou misturas. Os primeiros
so geralmente solues aquosas de uma nica substncia, como :
etanol a 70% - precipita as protenas e os cidos nucleicos e dissolve os lipdios;
cido actico a 5% - precipita as nucleoprotenas e difunde-se com facilidade;
acetona - poderoso solvente de lipdios e preservante de enzimas;
tetrxido de smio - forte oxidante, muito voltil e irritante;
formalina ou formaldedo a 40% - endurece os tecidos, embora no dissolva os
lipdios.

Entre os segundos - as misturas - diversas substncias tm

demonstrado poder de fixao superior, a saber :
FAA 50 ou 70 - compe-se de formalina, cido actico e lcool etlico. O etanol
produz retrao do protoplasma, no entanto o cido actico o expande; o lcool e a
formalina endurecem os tecidos, enquanto o cido os amacia;
FPA - modificao do fixador anterior, onde o cido actico substitudo pelo cido
propinico;
Nawaschin - no causa endurecimento nem retrao do material, porm possui
pequena penetrao.

O tempo para que ocorra fixao varivel, dependendo do fixador

escolhido, do volume da pea a ser fixada e da resistncia da mesma penetrao
dos reagentes. Exemplificando, material delicado, como folhas membranceas, pode
ser fixado em 12h, enquanto que ramos lenhosos podem necessitar de 7 dias.
Depois de fixado, o material estocado em soluo de etanol a 70% indefinidamente.

Desidratao
A desidratao remove a gua dos tecidos fixados e endurecidos, para
que a matriz possa penetrar nas clulas e tornar o material resistente ao impacto do
micrtomo. O mtodo de desidratao mais comum emprega srie etanlica, onde o

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material passa sucessivamente por solues cada vez mais concentradas de etanol
(50, 70, 90, 100 e 100%), por um tempo determinado.

Infiltrao
Quando a matriz escolhida insolvel em etanol, este deve ser
substitudo gradualmente por um solvente onde a mesma seja solvel, para que
possa penetrar no interior da clula.

No caso da matriz ser parafina, aps

desidratao, o material passa por srie etanol-xillica (3:1, 1:1, 1:3, xilol puro), o que
o torna apto a receber a matriz. Procede-se substituio gradativa do xilol pela
parafina, adicionando-se parafina fundida em estufa ao solvente e descartando-se
metade da mistura, repetidamente aps tempo adequado.
Frequentemente, a matriz de escolha a parafina, por ser menos
onerosa e apresentar bons resultados. Entretanto, pode-se optar por :
paraplast - mistura de parafina altamente purificada com polmeros plsticos e
dimetilsulfxido, que permite melhor penetrao e infiltrao (aderncia);
celoidina - nitrato de celulose, que se solubiliza em mistura de lcool e ter, em
ambiente anidro;
metacrilato - historresina ou metacrilato glicol diestearato, solvel em gua e usado
para materiais duros.

Incluso ou emblocamento
O material devidamente infiltrado colocado em um molde (caixinha de
papel ou de plstico), que preenchido pela matriz, de modo a formar um pequeno
bloco. Este aparado e pode ser encaixado no micrtomo para ser seccionado.

Seccionamento em micrtomo
O bloco devidamente aparado colocado sobre suporte, fixado no
micrtomo e seccionado. A fita formada ou os cortes individuais so apoiados em
fundo escuro para facilitar a visualizao.

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Distenso dos cortes

Os cortes so aderidos a lminas histolgicas, geralmente utilizando-se
dos adesivos de Haupt ou Bissing.

Essas lminas so colocadas em placa

aquecedora at distenso dos cortes (ficam translcidos) e depois levadas estufa

para secar.

Desparafinizao e diafanizao
As lminas so retiradas da estufa e imersas em xilol para retirada da
parafina (matriz).

So coradas, usualmente por meio de reidratao, soluo de

corante e desidratao, como se segue : srie etanol-xillica (1:3, 1:1, 3:1 e etanol a
100%), srie etanlica descendente (100, 90, 70 e 50%), colorao com soluo de
corante a 50% em etanol, srie etanlica ascendente (50, 70, 90, 100 e 100%) e srie
etanol-xillica (3:1, 1:1, 1:3 e xilol puro). O xilol favorece a transparncia dos cortes.

Montagem
lamnula adiciona-se o meio de montagem (blsamo-do-canad,
euparal ou resinas sintticas: Harlecco, Permount etc.) e esta sobreposta na lmina,
deixando secar.

DISSOCIAO DE ELEMENTOS CELULARES

CELULARES
Os cortes histolgicos apresentam as estruturas bidimensionalmente.
Para se obter uma viso tridimensional, os elementos celulares devem estar isolados,
mediante tcnica de dissociao ou macerao. Essa tcnica consiste na separao
mecnica e qumica das clulas, por meio de reagentes que desintegram a lamela
mdia. Vrios mtodos podem ser aplicados, tais como :
mtodo de Jeffrey - mistura de cido ntrico a 10% e cido crmico a 10%,
na proporo de 1:1;
mtodo de Foster - mistura de etanol a 70% e cido clordrico concentrado
(3:1);

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mtodo de Franklin - mistura de gua oxigenada 20 vol. e cido actico

glacial (1:1).

DIAFANIZAO OU CLARIFICAO
A tcnica de tornar semitransparentes peas vegetais de tamanhos
variados, geralmente laminares, denominada de diafanizao ou clarificao.
Basicamente consiste na dissoluo do contedo celular, restando apenas a parede
celular, o que se presta eficientemente para o estudo da nervao foliar.
Os reagentes empregados para diafanizao comumente so solues
aquosas de hidrxido de sdio a 5-20%, cloral hidratado a 30-60% ou hipoclorito de
sdio a 10-20%. Para se confeccionar lminas permanentes, o material diafanizado
corado, desidratado em srie etanlica e etanol-xillica e montado com blsamo ou
resina, entre lmina e lamnula.

PREPARO DE SOLUES
Fixadores
Nawaschin
cido crmico a 1%
cido actico glacial
formalina

75ml
5ml
20ml

F A A 50 (ou 70 )
formalina
cido actico glacial
lcool etlico a 50% (ou 70%)

5ml
5ml
90ml

Craft III
cido crmico a 1%
cido actico a 10%
formalina
gua destilada

30ml
20ml
10ml
40ml

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Corantes e reagentes
Sudan IV
Sudan IV
etanol a 80%
glicerina

5g
100ml
10ml

Lugol
iodo
iodeto de potssio
gua destilada

1g
3g
300ml

Cloreto de zinco iodado

cloreto de zinco
iodo
iodeto de potssio
gua destilada

30g
0,9g
5g
14ml

Floroglucinol clordrico
etanol a 95%
cido clordrico
floroglucinol
gua destilada

100ml
25ml
1g
25ml

Sulfato frrico
sulfato frrico
formalina
gua destilada

10g
5ml
100ml

Cloreto frrico
cloreto frrico
carbonato de clcio
gua destilada

10g
traos
100ml

Azul de astra
azul de astra
cido tartrico
gua destilada

0,5g
2g
100ml

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Fucsina bsica
fucsina bsica
etanol a 50%

0,5g
100ml

Safranina
safranina
1g
etanol a 95%
100ml
* no momento do uso, diluir em gua destilada (1:1).

Adesivos
Adesivo de Haupt
gelatina
fenol
glicerina
gua destilada

1g
2g
15g
100ml

Adesivo de Bissing
formalina
adesivo de Haupt
gua destilada

6ml
1,4ml
194ml

Meio de montagem
Gelatina glicerinada de Kaiser
glicerina
gelatina
fenol
gua destilada

70ml
10g
1,4g
60ml

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BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
BERLYN, G.P. & MIKSCHE, J.P. Botanical microtechnique and cytochemistry.
Ames: Iowa Sate University Press, 1976.
BUCHERL, W. Tcnica microscpica. 3.ed. So Paulo: Polgono, 1962.
FOSTER, A.S. Practical plant anatomy. 2.ed. Princeton: D. Van Nostrand, 1949.
FRANKLIN, G.L. Preparation of thin sections of synthetic resins and wood-resin
composites, and a new macerating method for wood. Nature, London, v. 155,
n. 3924, p. 51, 1945.
JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York: McGraw-Hill Book, 1940.
ROESER, K.R. Die Nadel der Schwarzkiefer-Massenprodukt und Kunstwerk der
Natur. Mikrokosmos, Stuttgart, v. 61, n. 2, p. 33-36, 1962.
SASS, J.E. Botanical microtechnique. 2.ed. Ames: Iowa State College Press,
1951.