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PONTIFICIA UNIVERSIDAD
CATLICA DEL PER
Escuela de Graduados
ESTUDIOQUMICOYDEACTIVIDAD
ANTIOXIDANTEENLepechiniameyenii(Walp.)
MAGISTER EN QUMICA
LIMA PER
2004
A mi madre ejemplo
de perseverancia
y
trabajo.
A la memoria de mi padre
con quien hubiera querido
compartir este logro.
A mis hermanos y
sobrinos que me apoyaron
siempre.
Agradecimientos
Mi especial agradecimiento a:
La Dra. Olga Lock Sing por su invalorable apoyo, enseanzas y
por la Asesora brindada en la realizacin del presente trabajo.
Al Dr. Jan Kopeck, Embajador de la Repblica Checa en el
Per, por darme la oportunidad de viajar a su pas lo que contribuy
al desarrollo del presente trabajo de investigacin,
al Dr. Vclav
NDICE
I.
INTRODUCCIN
II. GENERALIDADES
2.1
2.2
..
GNERO LEPECHINIA ..
2.1.1
Distribucin y ubicacin
2.1.2
2.1.3
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ..
2.2.1
Radicales libres
2.2.2
Antioxidantes
2.2.3
12
EVALUACIN
VEGETALES
3.2
DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE
53
14
ESPECIES
14
3.1.1
Muestras vegetales
14
3.1.2
14
3.1.3
15
3.1.4
15
ESTUDIO
Lepechinia
meyenii (Walp.)
19
3.2.1
Material vegetal
19
3.2.2
Tratamiento de la muestra
20
3.2.3
21
a.
21
b.
Obtencin de fracciones
21
c.
23
d.
23
e.
f.
24
2.2.4
52
71
a.
71
b.
71
IV. DISCUSIN ..
4.1
DE
ESPECIES VEGETALES
4.2
DEL
76
53
..
76
79
CONCLUSIONES
94
VI. BIBLIOGRAFA .
96
VII. ANEXOS ..
100
V.
NDICE DE TABLAS
Tabla
Pg.
1.
2.
3.
4.
16
5.
17
6.
7.
8.
21
10.
19
9.
18
23
25
11.
51
12.
13.
14.
53
70
70
NDICE DE FIGURAS
Fig.
Pg.
1.
2.
10
3.
11
4.
22
5.
compuestos
26
6.
30
7.
33
8.
36
9.
37
10.
38
11.
39
12.
40
13.
41
14.
42
15.
43
16.
44
17.
45
18.
46
19.
47
20.
48
21.
50
22.
54
23.
55
24.
56
25.
57
26.
58
27.
59
28.
60
29.
61
30.
62
31.
63
32.
64
33.
34.
65
66
35.
68
36.
69
37.
73
38.
39.
74
75
40.
77
41.
77
42.
78
43.
85
ANEXOS
44.
100
45.
101
46.
102
47.
103
48.
104
49.
105
50.
106
51.
107
52.
108
53.
109
RESUMEN
ESTUDIO QUMICO Y DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN Lepechinia meyenii
(Walp).
Autor:
Patricia Cecilia Castillo Romero
Asesora: Olga Lock Sing
Escuela de Post Grado. Maestra en Qumica
I. INTRODUCCIN
El presente trabajo constituye un aporte al estudio de actividad antioxidante
en plantas que se viene realizando en el Laboratorio de Qumica Orgnica de la
Pontificia Universidad Catlica del Per.
En la actualidad se estn realizando numerosas investigaciones en busca de
antioxidantes naturales con la finalidad de ser usados en la industria de alimentos,
cosmticos y en la atencin de la salud para prevenir, aliviar y/o curar procesos
degenerativos, como consecuencia de la presencia de radicales libres en nuestro
organismo.
La regin andina y amaznica de nuestro pas posee una variada flora y
dentro de ella, muchas especies con reconocida actividad benfica para la salud. En
el afn de contribuir a la bsqueda de fuentes de antioxidantes naturales se
seleccionaron plantas procedentes de estas regiones con el objetivo de determinar las
especies vegetales que presentan mayor actividad antioxidante.
Se trabaj con 62 extractos etanlicos procedentes de 53 especies vegetales,
despus de una evaluacin de sus actividades antioxidantes y en concordancia con la
disponibilidad del material vegetal, se eligi a la especie Lepechinia meyenii (Walp.)
para el estudio que constituye la tesis Estudio qumico y de actividad antioxidante
en Lepechinia meyenii (Walp.) cuyo objetivo especfico fue separar e identificar el
(los) compuesto(s) responsable de la actividad antioxidante.
La primera parte de esta tarea, obtencin y evaluacin de la actividad
antioxidante de extractos etanlicos, se realiz en el laboratorio de Qumica Orgnica
de la Universidad Catlica del Per. La separacin de metabolitos secundarios con
actividad antioxidante se realiz en el Laboratorio de Productos Naturales, Facultad
de Farmacia de la Universidad de Veterinaria y Ciencias Farmacuticas-Brno,
Repblica Checa.
II. GENERALIDADES
2.1
Tabla 1:
HART (1983)
EULEPECHINIA
THYRSIFLORAE
LEPECHINIA
GLOMERATAE
CALYCINAE
CAMPANULATAE
ESPECIOSAE
PARVIFLORAE
SALVIAEFOLIAE
PARVIFLORAE
ESPECIE
LUGAR DE PROCEDENCIA
L.
shiedeana
(SCHLECHTD)
VATKE
L. tomentosa (BENTH) EPL
L. caulescens (ORT) EPL
L. meyenii (WALP) EPL
L. rufocampii EPL
L. glomerata EPL
L. calycina (BENTH) EPL
L. fragans (GREENE) EPL
L. ganderi (EPL)
L. cardiophylla EPL
L. mexicana (SCHAUER) EPL
L. chamaedryoides (BALBIS) EPL
Mxico
California (USA)
California (USA)
California (USA)
California (USA)
Mxico
Chile
Per
Chile
Brasil
Per
Bolivia
Per, Bolivia, Argentina
Repblica Dominicana. Hawai (USA)
Venezuela, Colombia
L codon EPL
Per
Bolivia
Colombia
Colombia
Bolivia, Argentina
Bolivia, Per
Venezuela, Colombia
Ecuador, Per, Bolivia
Colombia
Ecuador, Per
Ecuador
Colombia, Ecuador
Ecuador
Per
Per
Ecuador
Colombia
Rica,
15
Tabla 2:
LEPECHINIA
L. bullata
CLASE DE
COMPUESTOS
diterpenquinonas
abietano
(royleanona
Referencias
horminona)
diterpenos (cido)
triterpenos
flavonoides
L. caulescens
TIPO DE ESTRUCTURA
abietano
ursano, lupano, oleanano,
flavona: salvigenina
diterpenos
abietano
triterpenos
ursano,
esteroides
lupano,
oleanano,
L. chamaedryoides
triterpenos
ursano, lupano,oleanano
triterpenos
oleanano
diterpenos
pimarano
diterpenos
abietano
diterpenos
abietano
diterpenos
abietano
diterpenos
abietano
flavonoides
artemetina, santina
L. glomerata
L. hastata
L. meyenii
10
L. urbaniana
Tabla 3:
Lepechinia
nombre comn
L. bullata
sesquiterpeno
espiroserquiterpeno
premnaspirodieno
L. calycina
1,8 cineol
canfor
3-careno
canfeno
-pineno
-cariofileno
L. caulescens
betnica
L. chamaedryoides
salvia
L. floribunda
salvia morada
L. graveolens
salvia blanca
L. meyenii
pasa salvia
Venezuela
19,7
17,5
17,4
7,8
3,0
5,7
borneol
canfor
p-cimeno
-pineno
- pineno
canfeno
- felandreno
t - cadinol
- cariofileno
espatulenol
limoneno
- cadineno
- 3-careno
borneol
- cariofileno
ledylacetato
aromadendreno
viridifloral
- humuleno
13,0
10,4
10,3
6,4
6,0
5,9
5,3
21,4
15,1
16,9
5,5
4,3
3,2
- cariofileno
1,8 cineol
linalilacetato
limoneno
canfeno
linalool
20,0
15,0
14,0
12,0
9,0
8,0
Guaiol
30,0
15,0
9,0
3,0
3,0
2,0
2,0
ledol
3 - careno
- pineno
- felandreno
- terpineno
16,3
21,4
11,3
11,1
9,5
- pineno
cis - pinocanfeno
-3 - careno
trans-pinocanfona
canfor
- cariofileno
26,6
25,1
6,1
4,0
3,8
3,7
L. especiosa
bornilacetato
limoneno
canfor
borneol
-pineno
-pineno
sesquiterpeno
19,1
18,2
6,5
6,1
2,2
2,2
45,5
L. urbaniana
rucilla
3- careno
- copaeno
- candineno
- felandreno
- cadineno
32,6
13,8
12,5
4,5
3,4
L. schiedeana
salvia negra
Referencia
11
Santo Domingo
limoneno + 1,8-cineol
felandreno
timol
- pineno
- pineno
linalool
terpineol
L. salviae
salvia
Procedencia
USA (California)
12
Mxico
Chile
13
14
Argentina
Argentina
Per (Puno)
15
Chile
16
Colombia
17
18
Costa Rica
Brasil
19
Republica Dominicana
Fig. 1.
aureus,
Staphylococcus
epidermidis,
Bacillus
Candida
albicans y
Trichophyton
mentagrophytes)20,21.
Usos
Las hojas son usadas en la medicina popular contra el dolor de
estmago, como digestivo, para el tratamiento de fiebre tifoidea, ciclo
menstrual irregular, reumatismo, malaria y como un desinfectante para
evitar la tuberculosis1,8,15. En el Callejn de Huaylas, entre Caraz y
Huaraz y en la Regin de los Libertadores Wari, los pobladores la
usan como infusin de planta entera sola o combinada con culn y
organo blanco para el tratamiento de diarreas, clicos, afecciones
hepticas y como aperitivo20.
2.2
ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE
en
numerosas
reacciones
de
gran
relevancia
22
biolgica .
Los reactantes ms importantes en la bioqumica de los radicales
libres en las clulas aerbicas son el oxgeno y sus radicales
derivados, los que son conocidos como especies reactivas de oxgeno
.-
Antioxidantes
Los antioxidantes son sustancias que retardan el comienzo o
disminuyen la velocidad de oxidacin de los materiales oxidables25.
Bajo condiciones fisiolgicas, el organismo puede prevenir el dao
producido por las especies oxidantes, a travs de mecanismos de
proteccin que incluye elevar los niveles intracelulares de defensas
antioxidantes.
Los principales procesos relacionados con la formacin de radicales
libres en el organismo, se resumen en la Fig. 2; indicndose tambin
los puntos en los que es posible la interferencia mediante el empleo de
agentes antioxidantes.
As tenemos dentro de los agentes antioxidantes.
a. Antioxidantes preventivos, como los agentes quelantes, los que
actan atrapando a los cationes metlicos que intervienen en la
descomposicin del perxido de hidrgeno a radical hidroxilo;
evitando as la formacin de estos ltimos. En este grupo estn la
penicilamina, el EDTA y el profrmaco dexrazoxano. Tambin
estn incluidas las enzimas antioxidantes, las que actan
degradando al perxido de hidrgeno como la glutation
peroxidasa, catalasa y frmacos que las mimetizan constituidos
por ciertos complejos metlicos como los
derivados del
Antioxidantes Preventivos
Agentes que
absorben
en UV
O2
E nzimas
antioxidantes
SOD
O2
A gentes quelantes
OH
H2 O2
H2O
O2 + 2H
Lpidos
Lesin
Fe +2
M-O-H
Fe+3
ADN
Antioxidantes que
detienen fase de
propagacin
(captadores de radicales
libres: fenoles)
O2
H 2O
M-H
cidos grasos
poliinsa turado
(fosfolpido)
Protenas
PEROXIDACIN
LIPDICA
M-O-O
Radical
perxido
Lesin de
membranas
M-O
HO
M-O-O-H
Hidrope rxido
Antioxidantes
estabilizadores de
membrana
(Lazaroides)
M-H
Ac. grasos
po liinsaturados
Metales
Fe
+3
Fe
+2
M=
Antioxidantes
Preventivos
Fig. 2.
R
HC=CH
HC
HC=CH
RCOOH
10
Agentes preventivos
Dexrazoxano
Ebselen
SC 55858
M 40470
Agentes scavengers
BHT
Flavonoide
BHA
Lignano: Cinamofilina
cido cafeico
Resveratrol
U-74006F (Tirilazad)
Fig. 3.
11
caractersticas
importantes,
la
presencia
de
el
mtodo
de
neutralizacin
del
radical
libre
2,2-
12
DPPH
La solucin del reactivo de DPPH es de color violeta y presenta una
absorbancia a 517 nm. La reaccin consiste en la sustraccin de un
tomo de hidrgeno proveniente de un donador (compuesto puro o
extracto) por el radical libre DPPH, desarrollando un cambio del color
violeta a amarillo a medida que disminuye la concentracin del radical
libre; el que se lee en el espectrofotmetro despus de veinte a treinta
minutos de reaccin28.29.
La reaccin entre la sustancia a evaluar (HA) y el DPPH es la siguiente:
DPPH
(VIOLETA) +
HA
DPPH-H (AMARILLO) + A
( Am Ab) 100
AA% = 100 -
Acontrol
Donde:
AA%
Am
= Absorbancia de la muestra
Ab
A control
13
utiliz
el
mtodo
de
neutralizacin
del
radical
libre
Clasificacin
de
los
extractos
etanlicos
segn
actividad
antioxidante
Los extractos se clasificaron en cuatro grupos: G-I (0-25 %), G-II
(25,1-50 %), G-III (50,1-75 %) y G-IV (75 % a +), dependiendo de los
resultados de su actividad antioxidante (a la concentracin de 10
g/mL) determinado por el mtodo de neutralizacin del radical libre
DPPH ya descrito. Los resultados de la clasificacin se muestran en la
Tabla 5.
3.1.4 Determinacin de la concentracin efectiva media (EC50)
Se determin la concentracin efectiva media de aquellos extractos
cuya actividad fue mayor a 25 % frente al DPPH. Para este ensayo se
tuvo en cuenta la concentracin (g/mL) en que cada extracto
manifest su actividad antioxidante y a partir de este dato se
prepararon las diluciones ensayadas para determinar la concentracin
efectiva media, tal como se detalla en la Tabla 6. La Concentracin
Efectiva Media, EC50, se determina por anlisis de regresin lineal (%
de actividad vs concentracin) de los extractos clasificados en los
grupos II, III y IV. Los resultados se indican en la Tabla 7.
A fin de comparar los valores del EC50 de los extractos ensayados se
determin la EC50 para la rutina.
15
Tabla 4:
Muestras
(Cdigos)
% Actividad Antioxidante
Muestras
(Cdigos)
% Actividad Antioxidante
10 g/mL
50 g/mL
10 g/mL
50 g/mL
M 02
3,93
15,38
M13590
3,18
15,29
M 04
8,77
38,25
M13591
5,47
10,86
M 06
6,04
25,29
M13592
9,63
44,25
M 07
22,83
85,24
M13594
3,64
16,49
M 09
12,76
64,50
M13596
5,07
14,47
M 21
20,53
80,07
M13597
11,23
14,63
M 22
36,50
91,10
M13598
18,54
26,13
M 23
25,49
87,54
M13600
3,82
11,73
M 48
24,39
88,29
M13601
2,83
12,14
M 49
12,15
56,19
M13602
3,76
13,98
M 51
1,35
16,63
M13603
1,14
7,72
M 58
9,09
42,10
M13604
5,29
23,61
M 59
4,64
17,97
M13605
6,08
41,82
M 60
9,08
41,63
M13624
0,46
6,83
R1
6,36
28,70
M13625
2,20
21,70
R2
15,27
57,71
M13626
22,11
87,83
R3
16,35
85,83
M13627
10,46
47,82
R4
0,91
25,25
M13628
69,14
95,47
R5
42,96
92,24
M13629
10,33
36,69
R6
18,61
74,31
M13630
6,69
35,90
R7
23,62
89,47
M13631
2,62
3,60
R8
8,35
38,39
M13639
83,96
94,73
R9
23,92
89,92
M13648
0,19
12,68
R 10
0,4
6,54
M13656
15,41
67,02
R 11
41,84
95,23
M13657
41,21
91,84
R 12
1,16
15,49
M13658
41,49
90,90
R 13
10,43
66,40
M13660
0,30
5,93
R 14
3,17
20,53
M13661
2,58
19,52
R 15
1,44
14,84
M13662
61,82
92,43
R 16
6,26
15,79
M13664
0,00
12,64
Rutina
70,61
90,76
M13665
0,00
12,76
Quercetina
93,92
93,50
M13686
2,66
8,16
BHA
74,18
93,05
16
Tabla 5:
Grupo
Cdigo
Muestra
% AA
Cdigo
Muestra
% AA
Cdigo
Muestra
% AA
Cdigo
Muestra
% AA
13664
0,00
13686
2,66
R-16
6,26
R-2
15,27
13665
0,00
13601
2,83
R-1
6,36
13656
15,41
13668
0,19
R-14
3,17
13630
6,69
R-3
16,35
13660
0,30
13590
3,18
R-8
8,35
13598
18,54
R-10
0,40
13594
3,64
M-04
8,77
R-6
18,61
13624
0,46
13602
3,76
M-60
9,08
M-21
20,53
R-4
0,91
13600
3,82
M-58
9,09
13626
22,11
(0-25%)
13603
1,14
02
3,93
13592
9,63
M-07
22,83
R-12
1,16
59
4,64
13629
10,33
R-7
23,62
R-15
1,14
13596
5,07
R-13
10,43
R-9
23,92
M-51
1,35
13604
5,29
13627
10,46
M-48
24,39
M13625
2,20
13591
5,47
13597
11,23
13661
2,58
06
6,04
M-49
12,15
13631
2,62
13605
6,58
M-109
12,76
M23
25,49
M22
36,50
13657
41,21
II
13658
41,49
(25,1-50%)
R - 11
41,89
R-5
42,96
III
13662
61,82
(50,1 75%)
13628
69,14
13639
83,96
IV
(75,1% a +)
17
Tabla 6:
Concentraciones versus actividad antioxidante de los extractos elegidos para hallar EC50
2 g/mL
4 g/mL
6 g/mL
8 g/mL
10 g/mL
12 g/mL
16 g/mL
18 g/mL
24 g/mL
30 g/mL
M13639
25,34
38,98
57,68
70,68
83,68
96,68
-----
-----
-----
-----
M13628
19,82
32,52
45,22
53,63
62,04
70,45
-----
-----
-----
-----
M13662
13,01
24,76
36,52
46,2
55,88
68,85
85,14
93,64
-----
-----
R-5
-----
27,4
29,42
31,44
-----
41,42
53,92
60,22
-----
-----
R-11
7,49
13,12
18,75
24,37
31,11
37,08
48,72
54,1
70,24
-----
M13658
8,56
15,72
22,88
30,05
37,14
44,23
56,4
62,42
80,18
-----
M13657
3,46
11,27
19,08
26,89
34,7
40,04
50,71
56,4
69,64
-----
M-22
8,48
16,88
25,28
33,68
42,08
48,06
60,01
65,98
73,95
-----
M-23
3,23
-----
12,8
-----
22,37
-----
33,98
37,85
49,46
61,08
Rutina
7,28
24,96
42,.64
61,07
73,78
86,01
-----
-----
-----
-----
18
Tabla 7:
3.2
DEL
Muestras Cdigo
r2
EC50
M13639
11,793
7,1971
0,9960
5,31
M13628
12,268
5,0017
0,9887
7,54
M13662
5,1345
5,0385
0,9960
8,90
M-22
7,2054
3,0955
0,9653
13,82
M13658
3,3993
3,2699
0,9978
14,25
R-5
14,832
2,4192
0,9731
14,54
M13657
1,0404
3,0283
0,9851
16,17
R-11
1,7836
2,8893
0,9993
16,69
M-23
0,5717
2,045
0,9979
24,17
Rutina
-6,564
7,9791
0,9930
7,09
Lepechinia
meyenii (Walp.)
Para la bsqueda de metabolitos secundarios con actividad antioxidante se
eligi una especie vegetal que se encuentre dentro de los grupos II, III o IV y
que permita su recoleccin en cantidad suficiente. Estos criterios
determinaron que el trabajo se realice con R-5; que es una planta andina de
nombre cientfico Lepechinia meyenii (Walp.).
3.2.1
Material vegetal
Lepechinia meyenii (Walp.) (planta entera) fue recolectada a 3000
msnm en la quebrada de Llaca, provincia de Huaraz, departamento de
Ancash, en el mes de Julio del 2002.
19
Plantae
Divisin
Angiospermae
Clase
Dicotyledoneae
Sub Clase
Sympetalae (metaclamydeae)
Orden
Tubiflorales
Familia
Labiatae
Gnero
Lepechinia
Especie
Sinonimia botnica
Sphacele
meyenii
(Walp.),
Stachys
meyenii (Walp.)
Nombres comunes
L)
se
20
Tabla 8:
Metabolitos Secundarios
Taninos
Resultado
Reaccin de Gelatina
Reaccin de FeCl3
Nafto y antraquinonas
Reaccin de Borntrger
Mayer
Wagner
Dragendorff
Flavonoides
Shinoda
Leucoantocianidina y catequinas
Reaccin de Rosenheim
Alcaloides
b.
Obtencin de fracciones
142 g del extracto etanlico fue fraccionado segn el esquema
mostrado en la Fig. 4.
21
Fase Orgnica
Fase Acuosa
Emulsin CH2Cl2 / Aq
+
conc. a de vol.
filtracin
CH2Cl2 2 vol.
Fase Orgnica
Slido
F. MeOH
conc. a sequedad
particin
MeOH 90/hex
conc.
suspensin
(liq. lechoso)
conc.a sequedad
Fase Orgnica
conc. a
sequedad
PEA1
Fase Acuosa
conc. a
sequedad
PEA2
Slido
amarillo verdoso
F.Hex
conc.
(P y T red.)
Fase Acuosa
Fase Orgnica
conc. a sequedad
particin
MeOH 90/hex
PEO1
particin
AcOEt
PEE1A
PEE1B
PEO3
Slido
PEO2A
PEE2
F MeOH
PEO2B
Fig. 4.
22
c.
Tabla 9:
Extracto Etanlico y
Actividad Antioxidante
10 g/mL
50 g/mL
sus Fracciones
Porcentaje
Peso (g)
Etanlico
100
142
39,25
94,10
PE01
0,02
0,03
60,84
96,29
PE02A
34,70
49,28
15,76
68,84
PE02B
2,08
2,96
23,48
93,11
PE03
24,60
34,93
9,62
43,90
PEE1A
0,38
0,54
0,00
15,99
PEE1B
0,53
0,75
8,66
41,33
PEE2
3,04
4,32
4,11
20,75
PEA1
6,97
9,91
90,36
96,24
PEA2
27,66
39,28
15,99
38,45
23
e.
24
Tabla 10 :
Fraccin
PEO1
PEO2A
PEO2B
13,12 (293); 18,35 (528); 14,32 (117); 22,32 (116); 23,37 (43)
PEO3
PEE1A
PEE1B
PEE2
PEA1
PEA2
2,41 (140); 9,05 (27,57); 9,62 (92,4) ; 13,33 (635,8); 18,28 (18,3)
___
18,27 (25); 23,37 (176); 26,22 (105); 26,41 (196); 38,42 (92,7)
e.1
cristalino,
denominado
PEO1,
soluble
en
diclorometano y metanol.
25
10
15
20
25
30
35
min
7,19 min
7,35 min
*DAD1, 7.353 (4.3 mAU, - ) Ref=7.253 & 7.418 of LEPE0006.D
mAU
mAU
mAU
4
0.7
1.2
3.5
0.6
0.8
2.5
0.5
0.4
0.2
0.4
0.1
0.2
0
-0.1
200
0.6
0.3
1.5
1
0.5
250
300
350
400
450
500
550 nm
200
250
300
350
400
450
500
550
200
nm
250
300
350
400
450
500
550
7,96 min
9,03 min
9,56 min
mAU
3.5
mAU
mAU
3.5
0.8
2.5
2.5
1.5
1.5
0.5
0.5
200
250
300
350
400
450
500
Fig. 5.
550
nm
nm
0.6
0.4
0.2
0
250
300
350
400
450
500
nm
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650 nm
26
Continuacin
9,77 min
13,11 min
13,97 min
mAU
175
mAU
150
0.6
125
0.5
100
0.4
0.7
0.3
75
0.2
50
0.2
0.1
25
0
200
250
300
350
400
450
500
550
600
-0.1
200
nm
250
300
14,33 min
350
400
450
500
550
200
nm
250
14,47 min
300
350
400
450
500
550 nm
15,48 min
*DAD1, 15.482 (5.8 mAU, - ) Ref=15.338 & 15.701 of LEPE0006.D
mAU
mAU
mAU
1.75
1.5
1.25
0.75
0.5
0.25
0
0
200
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
200
250
300
16,08 min
350
400
450
500
550
600
nm
200
17,45 min
mAU
20
40
15
30
10
20
20
10
60
40
250
300
350
400
450
500
550
nm
200
350
400
450
500
550
nm
mAU
80
300
18,15 min
mAU
200
250
0
250
300
350
400
450
500
550
nm
200
250
300
350
400
450
500
27
550
nm
Continuacin
18,36 min
20,88 min
21,20 min
*DAD1, 21.203 (6.4 mAU, - ) Ref=21.098 & 21.353 of LEPE0006.D
mAU
mAU
1.6
mAU
120
1.4
100
1.2
80
0.8
60
0.6
40
0.4
20
0.2
250
300
350
400
450
500
550
2
1
0
200
nm
250
300
22,59 min
350
400
450
500
550
200
600 nm
23,02 min
300
350
400
450
500
550
23,13 min
mAU
mAU
14
12
10
4
3
250
300
350
400
450
500
550
600
200
nm
250
300
350
400
450
500
23,37 min
23,81 min
mAU
550
200
nm
250
300
350
400
450
500
550
24,06 min
*DAD1, 24.065 (109 mAU,Apx) Ref=23.943 & 24.253 of LEPE0006.D
mAU
mAU
100
80
60
40
20
500
400
300
200
100
0
200
nm
mAU
200
250
250
300
350
400
450
500
550
nm
200
0
250
300
350
400
450
500
550
nm
200
250
300
350
400
450
500 nm
28
nm
Continuacin
24,34 min
24,61 min
24,88 min
mAU
mAU
mAU
60
0.8
0.6
0.4
50
40
30
0.2
20
1
10
-0.2
200
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
250
300
25,44 min
350
400
450
500
550
200
nm
mAU
mAU
15
10
7.5
5
2.5
0
300
350
400
450
500
550
200
nm
250
26,40 min
300
350
400
450
500
550
12
10
400
450
500
550
600nm
600 nm
2
1.5
0.5
200
550
500
2.5
450
3.5
400
mAU
350
27,09 min
350
300
mAU
300
250
26,69 min
mAU
250
200
nm
550 nm
12.5
0.5
500
17.5
450
mAU
1.5
400
26,22 min
350
2.5
250
300
25,94 min
*DAD1, 25.941 (7.2 mAU, - ) Ref=25.630 & 26.045 of LEPE0006.D
200
250
250
300
350
400
450
500
550
nm
200
250
300
350
400
450
500
550
29
nm
7.5
10
12.5
15
17.5
20
min
5,87 min
7,15 min
mAU
mAU
20
10
15
12.5
10
10
4
7.5
2.5
5
0
200
250
300
350
400
450
500
550
600
nm
200
250
7,32 min
300
350
400
450
500
550
nm
200
250
7,93 min
mAU
15
100
14
12.5
80
5
2.5
20
500
nm
10
8
6
4
2
0
200
450
12
60
40
400
10,17 min
mAU
7.5
350
10
300
250
300
350
400
450
500
550
Fig. 6.
nm
200
250
300
350
400
450
500
550
600
nm
200
250
300
350
400
450
500
550
30
nm
Continuacin
10,92 min
12,00 min
12,75 min
mAU
2
1.5
1
mAU
1.25
mAU
2000
1750
0.75
1500
0.5
1250
0.25
1000
750
-0.25
0.5
500
-0.5
250
-0.75
0
200
250
300
350
400
450
500
550 nm
200
250
300
13,99 min
350
400
450
500
550nm
200
250
300
14,15 min
400
450
500
550
600 nm
14,88 min
mAU
350
mAU
mAU
10
30
40
25
8
30
20
15
20
10
10
2
0
200
250
300
350
400
450
500
nm
200
250
300
15,47 min
350
400
450
500
200
nm
250
300
17,12 min
400
450
500
550
17,75 min
*DAD1, 17.756 (5.2 mAU, - ) Ref=17.656 & 17.926 of LEPE0010.D
mAU
350
mAU
6
mAU
60
50
40
30
20
10
0
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
200
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
200
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
31
nm
Continuacin
18,02 min
18,17 min
18,35 min
mAU
mAU
mAU
20
17.5
200
15
12.5
10
7.5
5
150
100
50
2.5
0
0
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650 nm
200
250
300
350
18,60 min
400
450
500
550
600 nm
200
300
18,71 min
50
400
450
500
550
nm
40
350
19,39 min
mAU
25
4
30
20
3
20
15
10
10
0
200
250
250
300
350
400
450
500
550
200
nm
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
200
250
300
350
400
450
500
20,02 min
*DAD1, 20.019 (97.0 mAU, - ) Ref=19.855 & 20.173 of LEPE0010.D
mAU
80
60
40
20
0
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
32
550
nm
140
120
100
80
60
40
20
10
15
20
25
30
35
min
Fig. 7.
300
350
400
450
500
550
600
nm
33
e.2
De la emulsin
Durante la particin del extracto etanlico se form un
volumen considerable de emulsin (Fig. 4), la que fue
tratada con 2 volmenes de diclorometano, separndose
una suspensin
de
fase
se
35
23. 304
1.
1.715
922
25
22. 270
23. 028
50
0
0
10
15
20
25
30
35
Fig. 8.
250
300
350
400
450
nm
36
min
Fig. 9.
37
Fig. 10.
38
Fig. 11.
39
Fig. 12.
40
72 fracciones
CCD
13 fracciones
HPLC analtica
6-8
1-5
Comp. minoritarios
9
+
MeCN-MeOH
1:3
Filtracin
Solucin
10-13
Comp. minoritarios
Slido
PEE2-a
(Polvo blanco)
9-1
9-2
9-3
9-4
HPLC analtica
PEE2-b
Cristales amarillos
Fig. 13.
41
Fig. 14.
42
PEE2-a
Fig. 15.
43
PEE2-a
CH3
H3 C
Ursolic acid
CH3
COOH
CH3
CH3
HO
H3 C
Fig. 16.
CH3
44
600
500
400
300
200
100
0
0
10
15
20
25
30
18,38 min
*DAD1, 18.352 (1227 mAU, - ) Ref =17.616 & 19.146 of LEPE0025.D
800
252 nm
268 nm
1000
342 nm
mAU
600
400
200
0
250
Fig. 17.
300
350
400
450
500
550
nm
45
min
Fig. 18.
46
Fig. 19.
47
Fig. 20.
48
e.3
De la fase acuosa
La fase acuosa (Fig. 4) luego de una particin con acetato
de etilo present dos fracciones, fase orgnica y fase
acuosa. De la fase orgnica, por evaporacin a sequedad,
se obtuvo PEA1 (9,91 g).
PEA1, fue la fraccin que present la ms alta actividad
antioxidante a la concentracin de 10 g/mL (90,36 %)
(Tabla 9).
mismo
compuesto.
- La fraccin PEA1-4 se separ por HPLC preparativa
obtenindose 8 fracciones (PEA1-4-1 a PEA1-4-8) (Fig. 21)
las que fueron analizadas por HPLC analtica y determinada
su actividad antioxidante (Tabla 12).
49
PEA1
C. columna flash
(silicagel)
CHCl3- Tol- MeOH: 8:1:1(F1-F8)
MeOH (F9)
(vol de recoleccin 50 mL c/fraccin)
17 Fracciones
CCD
12 Fracciones
HPLC analtica
Compuesto
Minoritarios
4-2
Conc.
1/3 vol.
filtracin
HPLC
PEA1-4-3a
Fig. 21.
HPLC
Preparativa
4-4
4-3
7
HPLC
Preparativa
Slido
PEA1-3a
Solucin
4-1
4-5
6-1.
6-2
6-3
6-4
6-5 PEA1-6-5a
6-6 PEA1-6-6b
4-6
4-7
4-8
HPLC
PEA1-4-6b
50
Tabla 11:
50 g/mL
PEA1
90,36
96,24
PEA1 1
5,83
17,11
PEA1 2
20,01
94,80
PEA1 3a
25,06
89,80
PEA1 3b
1,33
12,53
PEA1 4
89,79
93,27
PEA1 5
81,42
92,37
PEA1 6
93,99
94,90
PEA1 7
82,00
94,10
PEA1 8
82,02
94,11
PEA1 9
85,17
94,16
51
La subfraccin PEA1-4-6
denominada PEA1-4-6b se
espectroscopa
ultravioleta
con
reactivos
de
f.
52
Tabla 12 :
50 g/mL
PEA1 - 4
89,79
93,27
PEA1 4-1
92,22
91,93
PEA1 4-2
87,34
93,23
PEA1 4-3
90,34
95,21
PEA1 4-4
15,0
53,49
PEA1 4-5
80,29
88,99
PEA1 4-6
88,46
89,24
PEA1 4-7
87,46
90,13
PEA1 4-8
90,79
91,88
PEA1 6
93,99
94,90
PEA1 6-1
20,89
77,65
PEA1 6-2
11,05
61,76
PEA1 6-3
4,65
28,68
PEA1 6-4
70,28
95,18
PEA1 6-5
94,15
95,18
PEA1 6-6
88,72
91,74
53
2.5
7.5
10
12.5
19 .450
14 .368
100
7. 120
1.
1. 740
917
200
15
17.5
20
min
250
300
350
400
450
500 nm
19 .295
400
200
0
0
2.5
7.5
10
12.5
15
17.5
20
min
250
300
350
400
450
500
550
nm
54
2000
1000
7. 381
6. 766
6. 882
5. 603
5. 751
5. 903
6. 074
6. 182
6. 317
6. 534
500
7. 615
7. 100
1500
10
min
7,37 min
*DAD1, 7.370 (86.7 mAU, - ) Ref =7.290 & 7.488 of LEPE0046.D
mAU
mAU
70
1200
60
1000
50
800
40
600
30
400
20
200
10
200
250
300
350
400
450
500
nm
200
250
300
7,6 min
350
400
450
500
550 nm
7,86 min
mAU
mAU
1750
500
1500
400
1250
300
1000
750
200
500
100
250
200
250
Fig. 23
300
350
400
450
500
550
nm
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
0,4
9,61
0,2
9,23
10,08
0,1
22,67
Intensity (AU)
0,3
0,0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Absorbancia
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
100
200
300
400
500
600
nm
Fig. 24.
56
Title:
Analyzed:
Reported:
System Name:
Sys 1
9,60
1,0
0,8
0,2
22,64
9,21
10,07
0,4
0,0
MET_PROP1
Application:
LICENCIATURA
Series Name:
37
Vial Number:
Sample Name:
(4-3) + c. cafeico
Vial Type:
UNK
Volume:
2,5 ul
Injection:
1 of 1
Sample Description:
Peak Quantitation:
AREA
Calc. Method:
EXT-STD
Sample Amount :
INT STD Amount :
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Scale Factor 1:
55
1.000
Scale Factor 2:
Absorbancia
Intensity (AU)
0,6
Method Title:
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
100
200
300
400
500
600
nm
Fig. 25.
57
PEA1-4-3a
PEA1-4-3a
Fig. 26.
58
PEA1-4-3a
Fig. 27.
mAU
300
250
200
1 4 .9 2 6
100
50
0
1 8 .3 3 0
150
10
15
20
min
15,48 min
mAU
mAU
1600
1400
40
1200
30
1000
800
20
600
400
10
200
0
0
250
300
350
400
450
500
550
200
nm
250
300
350
550
nm
400
450
500
550 nm
18,33 min
*DAD1, 18.331 (24.5 mAU, - ) Ref =18.215 & 18.548 of LEPE0041.D
mAU
20
15
10
5
0
250
Fig. 28.
300
350
400
450
500
60
PEA1-4-6b
Fig. 29.
61
100.0
90
80
70
60
%T
50
40
30
20
10
0,0
4000.0
3000
1500
2000
1000
400.0
cm-1
PEA1-4-6b
Fig. 30.
62
mAU
40
30
11 .. 89 24 43
10
21 628
20
0
0
2.5
7.5
10
12.5
15
17.5
20
min
Fig. 31.
300
350
400
450
500
550
600 nm
63
Fig. 32.
64
Fig. 33.
65
a) En metanol
1,10
1,0
0,8
290,20
330,90
0,6
A
0,4
0,2
0,00
200,0
250
300
350
nm
400
450
500,0
400
450
500,0
400
450
500,0
373,69
0,8
247,36
290,20
330,90
0,6
301,35
A
0,4
0,2
0,00
200,0
250
300
350
nm
361,90
330,90
263,71
A
0,4
291,96
0,2
0,00
200,0
250
300
En MeOH
Fig. 34.
301,86
350
nm
Con MeONa
Con AlCl3
Continuacin
d) Con tricloruro de aluminio-cido clorhdrico
1,10
1,0
330,90
0,8
290,20
0,6
A
331,84
0,4
290,21
0,2
0,00
200,0
250
300
350
nm
400
450
500,0
350
nm
400
450
500,0
400
450
500,0
0,6
A
0,4
289,27
337,82
0,2
0,00
200,0
250
300
330,90
349,99
0,8
290,20
0,6
289,27
A
337,82
0,4
292,51
0,2
0,00
200,0
En MeOH
250
300
Con AlCl3-HCl
350
nm
Con AcONa
Con H3BO3-AcONa
67
mAU
4
2
1
13 .534
1 .18.2934 0
0
-1
-2
-3
2.5
7.5
10
12.5
15
17.5
min
13,53 min
14,06 min
mAU
16
mAU
40
14
35
12
30
10
25
20
15
10
0
200
250
300
350
Fig. 35.
400
450
500
550
600
nm
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
68
181
Fig. 36.
69
Tabla 13:
Concentracin
1
10
12
MUESTRAS
PEO1
-----
11,99
23,8
36,74
49,37
60,68
-----
PEA1-6-5a
17,25
36,08
60,66
87,73
93,92
------
-----
PEA1-6-6b
-----
-----
35,20
53,10
69,85
88,72
94,80
PEA1-4-3a
-----
------
34,96
52,98
70,69
88,60
93,05
PEA1-4-6b
-----
------
35,10
52,98
68,95
88,46
90,01
Rutina
------
7,28
24,96
42,64
61,07
73,78
-----
Quercetina
14,81
26,42
58,76
85,99
89,58
-----
-----
(g/mL)
Tabla 14:
MUESTRAS
r2
PEO1
-0,2790
6,1385
0,9996
8,19
PEA1-6-5a
12,1450
10,948
0,9708
3,46
PEA1-6-6b
6,406
7,741
0,9789
5,63
PEA1-4-6b
8,98
7,265
0,9561
5,64
PEA1-4-3a
7,336
7,59
0,9696
5,62
Rutina
-6,5640
7,9791
0,993
7,09
Quercetina
6,0637
11,103
0,9799
3,96
EC50 (g/mL)
70
71
c. Actividad antioxidante
Se evalu la actividad antioxidante del aceite esencial a las
concentraciones de 10 g/mL y 50 g/mL siguiendo el procedimiento
detallado en 2.2.3, la que fue de 0,31 % a la concentracin de 10
g/mL y de 3,36 % a la concentracin de 50 g/mL; motivo por el
cual no se consider necesario continuar con el estudio del aceite.
72
10
15
20
25
30
35
min
13,63 min
17,58 min
60
mAU
35
mAU
30
175
25
150
25
40
30
15
100
15
75
10
20
10
10
25
300
350
400
450
500
20
125
20
250
50
550 nm
250
300
350
18,16 min
400
450
500
550
5
0
200
nm
250
300
350
18,6 min
70
400
450
500
550 nm
200
250
300
350
400
23,09 min
mAU
200
50
200
17,89 min
mAU
mAU
20
1200
500
550 nm
23,7 min
*DAD1, 23.711 (63.7 mAU, - ) Ref=23.559 & 23.946 of LEPE0015.D
mAU
450
mAU
60
50
60
1000
15
50
40
800
40
10
20
30
600
30
20
400
10
200
10
0
200
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
200
250
300
350
25,88 min
400
450
500
mAU
300
200
300
200
200
200
250
300
350
400
32,22 min
450
500 nm
32,91 min
*DAD1, 32.919 (244 mAU, - ) Ref=32.716 & 32.996 of LEPE0015.D
mAU
200
150
2000
100
1500
1000
50
500
-500
550 nm
nm
2500
-400
500
450
3000
-300
400
3500
-200
100
Fig. 37.
350
4000
450
300
-100
400
250
mAU
100
350
200
400
300
nm
26,45 min
250
0
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
0
225
250
275
300
325
350
375
400
425 nm
200
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
73
250
200
150
100
50
10
15
20
extracto etanlico
Fig. 38.
25
30
35
min
aceite esencial
74
Fig. 39.
75
IV.
4.1
DE
DISCUSIN DE RESULTADOS
53
ESPECIES
VEGETALES
76
1 ( 2%)
2( 3%)
6 (10%)
Grupo I
Grupo II
Grupo III
Grupo IV
53 (85%)
Fig. 40.
133
% respecto a rutina
140
120
100
80
60
40
119
100
105
98
88
61 59 58
52
36
20
R
Q uti
ue na
rc
et
in
a
BH
M A
13
6
M 39
13
6
M 28
13
66
2
R
-5
R
M 11
13
65
7
M
-2
2
M
-2
3
Fig. 41.
77
Para comparar los valores de EC50 de los extractos etanlicos ensayados, se tuvo
que escoger el patrn de comparacin el cual result de un estudio entre las
actividades antioxidantes de quercetina, rutina y BHA (Tabla 4). Se eligi la rutina
como patrn por ser un compuesto qumico de procedencia natural y de valores
experimentalmente ms manejables.
30
24,17
EC50 (g/mL)
25
20
13,82 14,25 14,54
15
10
5,31
7,54
16,17 16,69
8,9
7,09
Fig. 42.
a
ut
in
-2
3
M
-1
1
R
13
65
7
-5
13
65
8
-2
2
13
66
2
13
62
8
13
63
9
78
4.2
DEL
Lepechinia
meyenii (Walp.)
Para la bsqueda de metabolitos secundarios con actividad antioxidante se tuvo
que elegir una especie vegetal comprendida en alguno de los grupos II, III o IV y
que permita su recoleccin en cantidad suficiente. Estos criterios determinaron
que el trabajo se realice con R-5, que es una planta andina de nombre cientfico
Lepechinia meyenii (Walp.).
mx.:
flavonoides30
79
De
la
separacin
de
metabolitos
secundarios
con
actividad
antioxidante
a. Slido PEO1
Se present como cristales blanquecinos, solubles en diclorometano y
metanol. En el cromatograma HPLC (Fig. 8) se observa un pico
mayoritario a 23,36 min (rea 1094,6).
Por CCD, en el sistema CHCl3-Benz-MeOH 70:15:5 se present como
una mancha oscura en la regin 254 nm de la lmpara ultravioleta, y
luego de la aspersin con H2SO4 25 % se present como una mancha
de color verde a un Rf de 0,47. Su punto de fusin fue de 211-213 C.
En el espectro ultravioleta present dos absorciones a 205 y a 284 nm,
esta ltima de pequea intensidad (Fig. 8), y en el espectro infrarrojo
(Fig. 9) se presentan las siguientes seales: cm-1: 3493 (aguda),
3287 (amplia) correspondientes al estiramiento OH libre y enlazado; a
2965, 2937, 2871, a los estiramientos C-H alifticos; a 1715 (intenso)
caracterstico del estiramiento C=032, otras seales a 1453, 1403,
1388, 1348, 1322, 1309, 1200, 1147, 1086, 1032, 989 y 917.
En el espectro de masa (Figs. 10, 11), el in molecular fue de m/z 330
(EI-MS y FAB-MS). Se determin la composicin elemental del
compuesto siendo su frmula global de C20H26O4. Por comparacin
con la base de datos Wiley/NBS se determin que el compuesto
corresponde a Carnosol (diterpeno oxidado del cido carnsico, Fig
12).
OH
HO
O=C
Carnosol
O
80
b. Slido PEE2-a
Se present como un slido blanco de pf 258 260 C soluble en
CHCl3, CH2Cl2, benceno y metanol.
Por CCD en el sistema CHCl3-Tol-MeOH 8:1:1 present un Rf de
0,57 luego de ser revelado con H2SO4 (mancha grosella que cambi
con el tiempo a violeta y marrn oscuro). No absorbi a 254 ni 366
nm de la regin ultravioleta. Dio positivo la reaccin de Liebermann
Burchard; por estas caractersticas se puede decir que es un triterpeno
y/o esteroide.
En el espectro infrarrojo (Fig 14), present una seal amplia a 3435
cm-1 caracterstica del grupo O-H, a 2980 y 2800 (estiramiento C-H de
metilo y metilenos), a 1694 una seal intensa debido al estiramiento
C=0 del grupo carboxilo [1710-1680 cm-1], entre otras30,32.
Por espectrometra de masas, el peso molecular fue de m/z 456. El
pico padre a m/z 248 se debe a una escisin tpica de compuestos 12
ursano u oleanano ya que segn la literatura33 los compuestos -12
ursanos -12 oleananos experimentan fragmentacin tipo retrodiels
alder originando un pico caracterstico a m/z 248, lo que podra
explicarse de la siguiente manera:
81
Acido Urslico
c. Slido PEE2-b
Se present como un slido amarillo cristalino, poco soluble en
metanol, soluble en cloroformo y dimetilsulfxido. Su punto de fusin
fue de 247-249 C.
Por HPLC analtica (Fig. 17) present un tiempo de retencin de 18,38
min. Por CCD en el sistema CHCl3-Benz-MeOH 8:1:1; luego del
revelado con NP/PEG y tambin con H2SO4 al 25 % se present como
una mancha amarilla de Rf 0,41.
En el espectro ultravioleta (Fig. 17), se observaron dos seales a
MeOH
mx
82
HO
HO
83
PEE2-b
HO
Diosmetina
H
HO
O
84
OH
OH
OCH3
HO
HO
HO
HO
M = m/z 300
M - CO-CH3
C14H9O5
(m/z = 257)
-28
fragmentacin
retrodiels
alder
OH
O
+
C C
HO
C8H5O2
+
C OH
(m/z = 133)
HO
HO
C13H9O4
(m/z = 229)
HO
C7H5O4
(m/z = 153)
+
OH
OCH3
HC C
C9H8O2
(m/z = 148)
Fig. 43.
85
d. Slido PEA1-3a
Se present como un slido amarillo cristalino de tiempo de retencin
de 18,38 min en HPLC (Fig. 22). Su espectro ultravioleta as como su
solubilidad, punto de fusin y CCD fueron iguales que PEE2-b y
corresponden al mismo compuesto (flavona: diosmetina).
e. Slido PEA1-4-3a
Slido blanco amarillento, por HPLC analtica present un tiempo de
retencin de 7,86 min (Fig. 23).
En el espectro de masas (EI-MS) present un peso molecular de 180
(Fig. 26).
En el espectro ultravioleta se presentan dos absorciones, a 212 nm con
un hombro a 240 nm y la otra a 330 nm con un hombro a 295 nm
caracterstico de un derivado del cido cinmico 31 (Fig. 23).
Por HPLC analtica (Figs. 24 y 25) y por espectrometra de masas por
comparacin con la base de datos Wiley/NB (Fig. 27), se encontr
similar comportamiento que el cido cafeico.
Los resultados del anlisis por HPLC y por espectrometra de masas
nos permiten deducir que el slido PEA1-4-3a es cido cafeico (cido
3,4-dihidroxicinmico).
HO
HO
CO2H
cido cafeico
86
Slido PEA1-6-5a
Se present como un slido verde cristalino, soluble en metanol y
etanol. En el cromatograma de HPLC (Fig. 31) se presenta a un tr de
12,88 min, por CCD en el sistema AcOEt-MeOH-H2O 37:5:3 present
un Rf de 0,22 luego de revelar con NP/PEG.
+
CH2-CH=OH
CH2-CHOH-COOH
-45
HO
OH
HO
OH
M - COOH
m/z 153
-75
OH
+
f.
OH
m/z = 123
87
Por el comportamiento descrito se confirm que el compuesto PEA16-5a presenta los grupos hidroxilos en la posicin orto.
Luego el compuesto PEA1-6-5a es un derivado del cido cafeico cuya
estructura es la siguiente:
88
g. PEA1-6-6b
Por HPLC analtica se observan dos picos a 14,06 min y a 13,53 min
(Fig. 35).
En el espectro ultravioleta el compuesto mayoritario presenta una
absorcin a 330 nm y un pequeo hombro a 285 nm caracterstico de
compuestos derivados del cido cinmico31.
Por espectrometra de masas el compuesto (a tr 14,06 min) presenta un
peso molecular de m/z 212 (Fig. 36); picos importantes a 123 m/z y a
153 m/z contribuyen a la propuesta de su estructura y corresponden a
los mismos fragmentos estructurales presentes en PEA1-6-5a; a 123
m/z indica la presencia de un fragmento benclico dihidroxilado y a
153 m/z a un sustituyente hidroxilo en carbono de la cadena lateral
del anillo fenlico. El peso molecular 212 menos el fragmento 153,
corresponde a la prdida de 59 uma lo que permite deducir dos
posibilidades para este fragmento:
a. Un grupo carboxilo y un grupo metileno ( CH2-COOH = 59 uma)
b. Un grupo ster metlico ( COO-CH3 = 59 uma).
La falta de evidencia de prdida de un grupo carboxilo cido a partir
del in molecular y tambin de un grupo metileno permite descartar la
primera posibilidad (a).
En el espectro de masas los grupos ster sufren ruptura en ambos
lados del grupo carbonilo35, el compuesto PEA1-6-6b presenta iones
fragmentos correspondientes a esta ruptura (Fig. 36).
Esto permite proponer la siguiente estructura para PEA1-6-6b:
89
CH2-CHOH-C O
OCH3
O
CH2-CHOH-C-OCH3
OH
HO
m/z=31
m/z=181
CH2-HC= OH
OH
HO
+
O
C-OCH3
M = 212
HO
OH
M/z=153
m/z=59
el compuesto mayoritario
90
+
CH2-CH=OH
CH2-
CH2-CHOH
+
HO
OH
HO
m/z 123
OH
OH
HO
m/z 153
HO
OH
HO
OH
91
36
. El carnosol es
el
92
DE
LOS
COMPUESTOS
PRESENTES
EN
OTRAS
FRACCIONES
Las subfracciones de PEA1: 4-1, 4-2, 4-7 y 4-8 fueron analizadas por
HPLC (Anexo: Figs. 50, 51, 52 y 53) mostrando escasa complejidad.
Por las caractersticas de sus espectros ultravioleta se puede deducir
que algunos de los compuestos son derivados del cido cafeico. La
poca cantidad de muestra obtenida en cada caso no permiti realizar
mayores ensayos para determinar sus estructuras.
93
V.
1.-
CONCLUSIONES
2.-
De la comparacin del EC50 de los 9 extractos ms activos con rutina (EC50 = 7,09
g/mL), el extracto M13639 fue 25 % ms activo (EC50 = 5,31g/mL) y el extracto
M13628 (EC50 = 7,54 g/mL) fue 6,35 % menos activo.
3.-
4-
5.-
6.-
94
8.-
95
VI.
1.-
BIBLIOGRAFA
Anden
unter
besonderer
Bercksichtigung
der
Gatting
3.-
Epling, C. 1937. Sinopsis of South American Labiatae. Rep. sp. novarum, Beihefte
85.
4.-
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5.-
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6.-
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9.-
10. -
96
11. -
12. -
13.-
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Sphacele chamaedryoides. Planta Mdica 58, 273-274.
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25. -
26.-
27.-
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28. -
29. -
30.-
31.-
32. -
98
33. -
34. -
35. -
36.-
37.-
38. -
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hydroxycinnamic acid compounds. J. Agric. Food Chem. 45, 2374 2378.
99
VII.
ANEXOS
10
15
20
25
30 min
18,14 min
18.36 min
22,32 min
mAU
mAU
175
mAU
175
175
150
150
150
125
125
125
100
100
100
75
75
75
50
50
50
25
25
25
200
250
300
350
400
450
500
nm
200
250
300
350
400
450
500
23.37 min
600
200
nm
250
300
350
400
450
500
550
nm
24.06 min
*DAD1, 24.064 (156 mAU,Apx) Ref =23.944 & 24.177 of LEPE0007.D
mAU
mAU
140
1750
1500
120
1250
100
1000
80
750
60
500
40
250
20
0
0
200
550
250
Fig. 44.
300
350
400
450
nm
250
300
350
400
450
500
550 nm
100
60
40
20
0
0
10
15
20
25
min
18,36 min
mAU
mAU
100
175
150
80
125
60
100
40
75
50
20
25
200
250
300
350
400
450
500
550
200
nm
21,4 min
250
300
350
400
450
500
600
nm
22,32 min
23,37 min
mAU
mAU
mAU
120
140
250
120
100
200
80
150
60
100
80
60
100
40
50
20
40
20
0
200
550
250
300
Fig. 45.
350
400
450
500
nm
200
0
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
250
300
350
400
450
500
101
550
nm
20
30
m in
Fig. 46.
250
300
350
400
450
500
nm
102
15
10
-5
0
10
15
20
25
30
35
23,38 min
mAU
mAU
80
60
40
20
0
200
250
300
Fig. 47.
350
400
450
500
550 nm
200
250
300
350
400
450
500
nm
103
min
10
15
20
25
30
35 min
23,38 min
mAU
mAU
140
25
120
20
100
80
15
60
10
40
20
0
0
250
300
350
Fig. 48.
400
450
500
550
nm
200
250
300
350
400
450
500
nm
104
7.5
10
12.5
15
17.5
min
12,77 min
mAU
mAU
35
4
30
25
20
2
15
10
5
0
0
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
200
250
300
13,3 min
350
400
450
500
550 nm
18,28 min
mAU
mAU
175
5
150
125
100
75
50
1
25
0
200
250
300
350
400
Fig. 49.
450
500
550
nm
200
250
300
350
400
450
500
550nm
105
mAU
250
200
150
2.5
2 1 .7 7 9
7.396
7.951
50
3.802
43 .. 19 79 41
4.449
1 . 6 53 91
121...90839441791
100
7.5
10
12.5
15
17.5
20
min
b- Espectros ultravioleta
5,27 min
7,39 min
mAU
600
mAU
17.5
500
15
12.5
400
10
300
7.5
200
100
2.5
250
300
350
400
450
500
550
200
nm
250
300
350
400
450
500 nm
7,95 min
*DAD1, 7.946 (96.8 mAU, - ) Ref =7.608 & 8.236 of LEPE0044.D
mAU
80
60
40
20
0
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
106
7.906
mAU
800
600
7.622
5.369
5.567
55 .. 78 37 71
6.092
6.410
11 .. 01 66 41
1.219
1.440
1 . 76 28 42
11 .. 89 659 637
200
6.878
7.101
400
10
12
min
7,01 min
7,37 min
mAU
500
400
300
mAU
160
mAU
800
140
700
120
600
100
500
80
400
60
300
200
40
100
100
0
200
200
20
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
200
250
300
350
400
450
500
550
250
nm
300
350
400
450
7,90 min
*DAD1, 7.904 (2034 mAU, - ) Ref =7.722 & 8.257 of LEPE0045.D
mAU
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
250
300
350
400
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500
550
nm
107
nm
mAU
25
20
15
10
1 8 .1 3 6
5
0
-5
14
15
16
17
18
19
20 min
18,62 min
18,75 min
mAU
175
mAU
100
150
80
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100
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20
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0
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Fig. 52.
250
300
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500
nm
200
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500
550 nm
108
20.030
20
10
19.435
1.803
1.961
30
0
-10
0
10
15
20
25
min
20,02 min
mAU
mAU
300
250
6
200
150
100
2
50
0
200
Fig. 53.
0
250
300
350
400
450
500
550 nm
200
250
300
350
400
450
500
550
600 nm
109