UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CINCIAS RURAIS

DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINRIA PREVENTIVA
LABORATRIO DE BACTERIOLOGIA

POLYMERASE CHAIN REACTION

Princpios, aplicaes e optimizao

Mateus Matiuzzi da Costa

Agueda Castagna de Vargas

Novembro de 2002.

Sumrio
Introduo e histrico
A tcnica
Cintica do PCR
Constituintes do mix
Instalaes e equipamentos
Preparo do mix
Variaes na PCR
Verificao dos produtos de amplificao-eletroforese em agarose
Problemas na reao da PCR
Optimizao da PCR

POLIMERASE CHAIN REACTION-PCR

(REAO EM CADEIA DA POLIMERASE)

INTRODUO E HISTRICO
A reao em cadeia da polimerase (PCR) um mtodo para amplificao in vitro
de segmentos de DNA. Este mtodo considerado excelente para caracterizao de cidos
nucleicos, especialmente no que diz respeito a sua sensibilidade e especificidade (tabela 1).
Pela PCR, podem ser amplificados fragmentos de cido nuclicos, a partir de picogramas
do DNA molde presente nas amostras. O nmero de aplicaes para o PCR parece infinito,
sendo que entre elas podemos citar clonagem e seqnciamento de DNA e cDNA
genmicos, mutagnese in vitro, anlise de fingerprinting, medicina forense, testes para
deteco de agentes infecciosos, diagnstico de doenas gentica perinatais, anlise de
variaes nas seqncias genticas allicas, estudos da estrutura de transcritos de RNA. A
PCR foi desenvolvida em 1985, por Saiki e colaboradores, sendo que no mesmo ano os
primeiros artigos aplicando esta metodologia para o diagnstico clinico foram
apresentados. Estes PCRs de primeira gerao propagaram-se rapidamente entre os
laboratrios, principalmente aps o desenvolvimento e comercializao de DNA
polimerases termoestveis, obtidas da alga termoflica Thermus aquaticus. Em 1989, esta
enzima foi clonada expressa em linhagens de E. coli por Lawyer e colaboradores. Em 1990
uma nova gerao de PCR (segunda) foi obtida atravs da construo de termocicladores.
Desde ento, esta tcnica tem sido amplamente utilizada nos laboratrios. A tabela 2
apresenta as vantagens e desvantagens da tcnica de PCR.

Tabela 1. Sensibilidade de algumas tcnicas moleculares aplicadas para o diagnstico

molecular de patgenos bacterianos
Mtodo
Colorao com brometo de etdeo

Nmero de cpias
108
3

Sondas radio marcadas

Sondas marcadas com enzimas
Sondas quimioluminescentes
PCR

106
104
104
Menos de 10

Tabela 2. Vantagens e desvantagens da tcnica de PCR para o diagnstico e estudos

epidemiolgicos
Vantagens
Rapidez
Sensibilidade
Especificidade
Versatilidade
Baixo custo (relativo)
Informao gentica
Aplicabilidade
Resultados padronizados
No necessita esterilidade
No necessita viabilidade dos organismos
Segurana
Rpida instalao

Desvantagens
Risco de contaminao
Equipamentos necessrios
Reagentes necessrios
Instabilidade dos reagentes
Pessoal necessrio
Problemas tcnicos
Reprodutibilidade
Deteco de organismos no viveis.

TCNICA
Esta tcnica baseada num processo cclico que mimetiza a replicao do DNA, in
vitro uma vez que o nmero de molculas de DNA duplica aps cada ciclo. Logo aps x
ciclos teremos 2x molculas de DNA. Ou seja, aps 30 ciclos seriam obtidos milhes de
molculas de DNA amplificado, o que justifica a sensibilidade da tcnica.
As fases do Ciclo da PCR

Desnaturao: A desnaturao ocorre a altas temperaturas (rupturas das pontes de H),

sendo que as duas fitas devem ficar separadas at que a temperatura seja reduzida.
Geralmente esta temperatura pode ser de 91-97oC. Um dos fatores limitantes da
temperatura de desnaturao, do nmero de ciclos e do tempo de execuo do PCR a
meia vida da DNA polimerase (enzima que realiza a duplicao do DNA). A meia vida da
Taq polimerase de 30 minutos a 95oC, o que explica a realizao de 30 ciclos. Geralmente
o tempo de desnaturao varia de 15s (temperaturas elevadas, ex.: 96 oC) a 1 minuto (9495oC)
Annealing / Associao dos primers: Nesta fase os primers (oligonucleotdeos sintticos),
devem hibridizar com distino no genoma analisado. Os primer so sintetizados para
serem complementares as regies franqueadoras do fragmento a ser amplificado, sendo que
os dois primers devem ter os stios 3 voltados para si e no devem ser complementares um
ao outro (formao de primer-dimer). Devido o excesso de primers colocados em presena
do DNA, a formao de um complexo primer-template favorecida em relao a
reassociao das fitas de DNA desnaturadas. A unio dos primers ao DNA molde ocorre
quando a temperatura baixa. A temperatura adequada para o annealing depende diretamente
do tamanho e constituio dos primers (Tm). Geralmente a temperatura de annealing varia
de 55-65oC, sendo que o tempo nunca deve exceder 90 seg., pois podem ocorrer
hibridizaes inespecficas.
Extenso: Amplificao dos segmentos de DNA realizado por uma polimerase (5-3) para
replicao do complexo primer-template, sendo que o primer incorporado ao produto de
amplificao. A amplificao destes complexos d origem a dois tipos de molculas, os
produtos longos e curtos. A temperatura de extenso e de melhor atividade da enzima de
72oC, sendo que o tempo pode variar de 30 seg 3 minutos, entretanto fragmentos maiores
(3 Kb), podem requerer um tempo maior (at 5 minutos).

OBS.:
* Como dito anteriormente o nmero de ciclos normalmente utilizado em PCR so de 30,
sendo que esta varivel depende da quantidade inicial de DNA presente na amostra.
Entretanto um nmero maior de ciclos pode no ser interessante, uma vez que existe um
efeito plateau onde a amplificao do DNA cessa (meia vida da enzima e esgotamento dos
constituintes da reao-mix);
* As diferentes temperaturas e tempo necessrios para cada ciclo so obtidos com uma
mquina denominada termociclador.
CINTICA DA PCR
Ciclos iniciais

No incio da PCR existe o DNA genmico (molde) e uma alta concentrao dos
primers. Estas pequenas sondas buscaro em todo DNA (que nos casos das bactrias pode
conter 109 nucleotdeos) at encontrar seu stio complementar e desta forma hibridizar com
seqncia molde de DNA. Durante sua busca os primers iro se ligar transitoriamente e ao
acaso com diferentes regies do genoma. Contudo, pelas condies otimizadas de
temperatura e pela adio de MgCl2, estes se dissociaro rapidamente, em busca de regies
onde a ligao ao DNA molde seja favorecida, de modo especfico. A busca dos stios alvo
do DNA pelos primers facilitada pela sua alta concentrao no ciclos iniciais.
Ciclos intermedirios
a fase onde ocorre a amplificao exponencial do DNA. Nesta fase da
amplificao, os primers encontram facilmente os locais de hibridizao, uma vez que as
molculas amplificadas nos ciclos iniciais servem como molde e apresentam um tamanho
menor, assim como regies de homologia perfeita. Nesta a fase a concentrao do DNA
genmico diminui, enquanto que a do produto de amplificao aumenta cada vez mais
(tabela 3).
Ciclos finais e plateau
O final da reao de PCR ocorre devido a alterao na concentrao dos
constituintes do PCR, em particular pelo esgotamento da Taq polimerase (tabela 3). Alm
disto, o acmulo de molculas de DNA amplificado, acompanhado pela reduzida
concentrao dos primers permite que estas se reassociem, impedindo a amplificao. A
ausncia de stios especficos para o anelamento dos primers faz com estes liguem-se a
regies inespecficas da molcula molde, o que pode interferir na reao. Geralmente o
PCR deve acabar com 30-35 ciclos.

Tabela 3. Relao dos componentes do PCR no incio e fim da PCR com relao ao
nmero de produtos amplificados.
Componente
DNA
Produto amplificado
Primer
DNTP
Taq

Inicio
10-6
10-6
108
1010
2 x 105

Fim
10-6
1
99
9.5 x 103
0,2

CONSTITUINTES DO MIX DA PCR

Template: a molcula de cido nuclico molde (DNA e RNA) utilizado no PCR. Existem
muitos mtodos para preparao do DNA para PCR, sendo que em alguns casos at cidos
nucleicos com um certo grau de degradao podem ser utilizados, principalmente para
amplificao de fragmentos de tamanho menor. Vrias substncias encontradas na amostra
(DNA) podem reduzir a eficincia do PCR, como uria, SDS, acetato de sdio, EDTA,
fenol, etanol, hemoglobina entre outros. Quanto mais limpo o DNA molde, maior a
sensibilidade da tcnica. Logo existem diversos protocolos de extrao e limpeza, sendo em
sua maioria baseados em extrao orgnica, precipitao com etanol, separao em
membranas de slica, extrato brutos utilizando detergentes e proteases, clorofrmio, resinas
quelantes, fervura, autoclavagem, ou extrao direta. A escolha do protocolo est
diretamente relacionada fonte do DNA molde. Entre elas podemos citar:
DNA genmico: Existem diversos protocolos para extrao de DNA genmico de
bactrias, leveduras, fungos, plantas e animais. A alta pureza do DNA a ser utilizado
somente requerida quando produtos grandes (<1Kb) devem ser obtidos. Estas preparaes
geralmente so mais complicadas exigindo reagentes caros e consumindo um maior tempo
para sua execuo.
RNA: O RNA pode ser utilizado como molde para o PCR (RT-PCR). Este pode ser obtido
por lise celular e precipitao com etanol. Entretanto, a estabilidade e quantidade de RNA
obtido so limitantes. Em muitos casos, Kits comerciais podem ser empregado com sucesso
para extrao de RNA das mais diferentes amostras.
Plasmdeos, Bacterifagos, Cosmdeos e Cromossomos artificiais: Estas molculas so
fontes eficientes para utilizao em PCR, sendo muitas vezes o PCR utilizado no Screening
de colnias transformantes. Geralmente o DNA plasmidial extrado atravs de miniprep
(lise alcalina), a qual pode ser realizada tanto para culturas individuais, com em larga
escala, em microplacas (sequenciamento)
Amostras clnicas e forenses: Nestas amostras, a pureza e conservao das amostras
muito importante, principalmente no sentido de prevenir a contaminao com DNA
exgeno presente no meio ambiente. No caso de sangue, a hemoglobina um dos principais

inibidores da reao, sendo necessrio adoo de protocolos visando a sua remoo das
amostras a serem analisadas. Para o diagnstico clnico, o uso de cortes de tecido
embebidas em papel, parafina e at mesmo em lminas de microscspio podem ser
utilizadas.
Amostras de stios arqueolgicos: Geralmente os estudos moleculares baseados em
amostras conservadas ao longo do tempo podem ser realizados atravs da anlise do DNA
mitocondrial ou ribossomal. Estas regies so muito importantes, pois permitem a obteno
de resultados conclusivos utilizando regies pequenas (100-200nt). Isto muito til nestes
casos, pois ao longo do tempo as amostras de DNA tendem a degenerar, mas no o
suficiente para impedir estas anlises. O grande problema neste caso a introduo de
amostras exgenas o que poderia levar a resultados errneos pela ausncia de amostras de
referncia. Logo, controles so muito importantes. Como exemplo temos os estudos feitos
em cadveres de mamuti conservados na Sibria, sendo extrado de mosquitos conservados
em ambar.
A quantidade do DNA necessrio para amplificao no PCR geralmente est
associada ao nmero de molculas molde presentes na amostra. Tendo como padro um
nmero aceitvel de 3x 105 molculas de molde, necessitaramos:
1g de DNA genmico humano
10ng de DNA genmico de levedura
1ng de DNA genmico de E. coli
1-2pg de DNA plasmidial
20pg de DNA de bacterifago
Primers (Iniciadores): Oligonucleotdeos sintticos que variam de 18-30nt, que so
projetados para serem complementares as extremidades do fragmento de DNA a ser
amplificado. Os primers so sempre projetados aos pares, contendo o mesmo nmero de
nucleotdeos, sendo que estes delimitam a regio do DNA a ser amplificada. Os primers
podem ser especficos para determinada regio do DNA de um grupo reduzido de ??? ou

10

serem universais. Primers universais contm seqncias que so extremamente comuns a

um grande nmero de espcies. Como exemplo temos os primers universais para bactria.
Em casos onde no se sabe a seqncia total do stio a ser amplificado, devem ser utilizados
primers degenerados que so construdos a partir da seqncia de protena (cdigo
gentico). Entretanto alguns nucleotdeos no so precisamente estimados, devido
degenerao prpria do cdigo gentico.
Ex.: HisPheProPhe=CAYTTYCCNTTY, onde Y=pirimidinas, N=qualquer base
Os primers so projetados em programas de biologia molecular (como o Vector ) e
estes tambm podem ser sintetizados por diversas companhias (como a Invitrogen ). O
desenho de primers sempre deve levar em conta alguns aspectos como:

Devem ter de 20-30nt para obter-se um fragmento de amplificao nica em um

genoma complexo;

Conter um nmero semelhante de nucleotdeos;

Evitar a ocorrncia de seqncias repetidas inversas;

Evitar o ocorrncia de trs ou mais GC na extremidade 3, evitando ligaes

inespecficas em regies ricas em GC;

No formarem pareamento interno;

Procurar no genoma em estudo a ocorrncia de outros stios de hibridizao para os

primers;

Evitar a ocorrncia de regies complementares entre os primers para evitar a

formao de primers-dimers.

Primer-Dimer: Ocorre quando da hibridizao dos primers entre si, o que leva a uma
amplificao do DNA dos primers em detrimento ao do DNA alvo. Isto ocorre por que
quanto menor o produto (no caso alguns pares de bases), mais facilmente este ser
amplificado.

11

Algumas vezes a homologia entre os primers e as seqncias do DNA alvo no

perfeita. Isto nem sempre representa um problema, uma vez que a extremidade 3do primer
mais importante para a hibridizao (stio de extenso pela polimerase). De um modo
geral, somente os trs nucleotdeos da extremidade 3 que devem estar perfeitamente
hibridizados com o template. Como a poro 5 do primer no to fundamental a
amplificao do DNA alvo, esta muitas vezes modificada de acordo com o interesse. As

12

modificaes mais comuns so a introduo de stios de restrio com endonucleases e

13

incorporao de novos nucleotdeos (mutagnese). Alm das alteraes possveis na regio

5do primer esta regio geralmente escolhida para marcao (tabela 4), com compostos
como fosfato radioativo, digoxigenina, compostos fluorescentes (N-hidroxisuccicinamida
(NHS), 6-carbonofluorescena (FAM), 4,7, 2, 4, 57-hexacloro-6carboxifluoresceina
(HEX), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), tetracloro-6-carboxiflouresceina (TET)). Muitos
destes compostos so ligados a molculas na forma de um aminolink, ligados ao fosfato:

Tabela 4. Principais compostos de marcao da regio 5dos primers e sua finalidade

Composto
fosfato
Fosfato gama 32
biotina
NHS
FAM, HEX, ROX, TET

Ligao
Via T4 PNK e ATP
A partir do ATP[32]
Aminolink
Aminolink
Direto na sntese

Finalidade
clonagem
Deteco autoradiogrfica
ELISA-PCR
PCR Real time
PCR Real time

Tm
No PCR, Tm

refere-se temperatura onde metade dos primers encontra-se

anelados a seqncia do DNA alvo. Esta calculada pela seguinte frmula:

Tm=[(mnmero de G+C) x 4oC + (nmero de A+T) x 2 oC]

14

Neste clculo toma-se como padro 4oC para realizar a ligao entre G e C e 2 oC
para ligaes entre A e T. Esta frmula foi descrita por Suggs e colaboradores em 1981,
tomando como base 1M de sal. Frmulas mais acuradas foram desenvolvidas
posteriormente para o desenho de primers que vo de 15 a 70nt em solues aquosas:
Tm= 81,5+16,6[log10(I)] + 0,41 (%GC)- (600/N)
Onde, I a concentrao de ctions monovalentes e N o tamanho do primer
OBS.: Nos clculos devemos sempre considerar somente os nucleotdeos que realmente
hibridizaro com o DNA alvo.
O que podemos concluir destas frmulas que a Tm dependente do tampo onde
o primer ser reconstitudo e que devemos sempre escolher pares de primers que tenham
uma reduzida diferena nesta varivel (5-7oC). Na primeira PCR de padronizao, deve
sempre ser escolhida uma temperatura de anelamento cerca de 5 oC abaixo da Tm descrita
para os primers. A temperatura de anelamento e a concentrao de Mg presente no tampo
so muito importantes para a correta associao dos primers com a seqncia de interesse e
desta forma para especificidade do PCR.
Concentrao dos primers
Na maioria dos casos, os primers devem ser utilizados na mesma concentrao,
sendo que esta variao de 0,1 a 1 M, equivalente a 5-50pmol para um volume de reao
de 50l. Os primers so sempre adicionados em excesso tendo em vista que aps a PCR
cerca de 95% do seu total permanea sem uso. O clculo de concentrao dos primers
sempre baseado na absorbncia obtida durante o processo de sntese dos mesmos. Sendo
calculada a massa dos primers sintetizados e sendo estes diludos a fim de se conseguir uma
concentrao de 1mg/ml ou 1g/l , sendo esta a soluo estoque, que deve ser conservada
a 20oC e manuseada com todo cuidado afim de evitar possveis contaminaes com DNA
ou outros primers. Alquotas devem ser diludas 10X (estoque) afim de se conseguir uma
diluio de 100g/l, o que equivale a 30pmol/l.
15

DNTPs: So os nucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) que servem de substrato para
duplicao das seqncias de DNA, sendo utilizados numa mistura equimolar, tendo em
vista a fidelidade da reao. Para isto, quantidades iguais dos quatro desoxiribonucleotdeos
devem ser includos na reao, geralmente numa concentrao de 0,2mM (200M) cada, o
que seria suficinete para amplificao de 10ng do produto. Em alguns casos, para aumentar
a especificidade do PCR as concentraes dos nucleotdeos podem ser reduzida, uma vez
que quanto maior a concentrao de nucleotdeos maior a possibilidade da Taq polimerase
amplificar fragmentos inespecficos. Alm disto, devemos evitar quantidades reduzidas de
DNTPs quando queremos amplificar DNA utilizando enzimas de Proofreading, pois sua
atividade de exonuclease 3-5 aumentada nestas condies, levando a degradao de
molculas de DNA fita simples, como os primers. Da mesma forma, quantidades reduzidas
de DNTPs podem comprometer a eficincia da reao. Os nucleotdeos podem ser
marcados com compostos radioativos ou fluorognicos, para diversas finalidades como
preparo de sondas e sequnciamento de regies do DNA (tabela 5).
Tabela 5. Compostos utilizados para marcar os nucleotdeos utilizados no PCR
Nucleotdeo modificado
7deaza-dGTP

Finalidade
Resoluo

de

Principio
estruturas Reduz a

secundrias

formao

estruturas

de

secundrias

(grampos ou hairpin) em
regies

ricas

facilitando
DUTP

Reduo de contaminao

em
o

GC
seu

sequenciamento
Serve de substrato

para

enzima

que

N-glicosilase

destri produtos de PCR

DNTPs

marcados Preparo

de

sondas

amplificados
e O material radiotaivo revela

radioativamente [ P,P e sequenciamentos

por Radiografia a presena

S]

do nucleotdeo ou do produto

16

amplificado ou at mesmo de
DNTPs

marcados

compostos
(fluoresceina
digoxigenina)
DdNTPs

com Preparo

de

sondas

fluorescentes serquenciamento

genes no genoma em estudo

e Substituem
o
material
no radioativo

ou radioativo
Sequenciamento de DNA

no

sequenciamento de DNA e
southern blot.
Por no possuir a oxidrila no
carbono 3, realizam a parada
na sntese da molcula de
DNA( terminao de cadeia)

Enzima (polimerase): Inicialmente o PCR utilizava o fragmento Klenow da DNA pol I de

Escherichia coli, entretanto este fragmento era instvel a temperatura e devia ser reposta
aps cada etapa de desnaturao (em cada um dos 30 ciclos!), constituindo um processo
laborioso. Porm, o isolamento e clonagem de DNA polimerases de organismos
termoflicos, que crescem a elevadas temperaturas (algumas prximas a 100C), permitiu
avanos significativos tcnica de PCR. A enzima mais utilizada para o PCR a DNA
polimerase (Taq DNA polimerase) de Thermus aquaticus, uma alga que cresce em poos
vulcnicos. Entretanto, esta enzima conhecida por inserir erros (substituies) na
seqncia de DNA amplificada, uma vez que esta no apresenta atividade de proofreading 3
-5 e exonuclease. Por esta razo, enzimas com maior preciso se tornam adequadas para
amplificao de fragmentos grandes (devido a problemas com a processividade) e onde
seja necessria uma grande fidelidade com a seqncia alvo.
A habilidade de proofreading refere-se capacidade da enzima em discriminar se o
resduo 3-OH de uma fita de DNA est corretamente ligado a fita complementar, logo se
este no for o correto por usa atividade de exonuclease 3-5ele ser removido e substitudo
pelo nucleotdeo correto graas a sua atividade de sntese 5-3. Alm disto, estas enzimas
tem a capacidade de gerar fragmentos blunt (de extremidades cegas), ao passo que a Taq,
costuma introduzir alguns nucleotdeos, geralmente, na extremidade do fragmento a ser
amplificado. Estas enzimas foram mais recentemente descobertas isoladas, caracterizadas e
clonadas sendo oriundas de bactrias de poos ocenicos (Thermococcus litoralis-Vent

17

Pyrococcus furiosus-Pfu ). Recentemente uma enzima com ambas atividades de

transcriptase reversa e DNA polimerase foi descrita (rTth- Thermus thermophillus).
Tampo de enzima: tampo recomendado para a Taq DNA polimerase. Entretanto,
algumas enzimas apresentam algumas necessidades especiais Devemos sempre utilizar o
tampo fornecido com a enzima, visando sua maior eficincia, sendo o mesmo diludo em
gua Milli-Q, para obter-se uma concentrao adequada dos sais, sendo:
10-50mM Tris-Cl ( pH 8,3 a 25C): Mantm o pH na faixa ideal de funcionamento para a
polimerase. Esta enzima deve estar num pH maior, pois com o aumento da temperatura
ocorre uma diminuio no pH do Tris. Logo a 72oC, o pH fica em torno de 7,6 o que
timo para atividade da Taq DNA polimerase. Alm disto, em pH baixos a Taq apresenta
uma fidelidade reduzida.
50mM de KCl: Auxilia no anelamento entre os primers e o template. Em altas
concentraes pode levar a ligaes inespecficas.
1,5mM ou mais de MgCl2: O magnsio um dos fatores crticos do PCR uma vez que
dele depende boa parte da sensibilidade e eficincia da reao. A maior eficincia da Taq
observada numa concentrao de cerca de 1,2 - 1,3mM de magnsio livre. Tampes padro
de Taq contm cerca de 1,5mM de MgCl2. Porm a concentrao de Mg livre est
relacionada com a concentrao de DNTPs, uma vez que este ligam de forma
estequiomtrica numa relao 1:1. Logo, as concentraes de magnsio devem sempre
considerar a perda para os DNTPs. As concentraes de magnsio podem variar de acordo
com o grau de especifidade requeridos pelo teste, quanto maiores as concentraes deste
on maior a especificidade do PCR.
Estabilizadores: Substncias utilizadas para estabilizar a polimerase. Albumina bovina
srica (0,01%), gelatina (0,01%) e glicerol (1-2%) so geralmente acrescentadas no mix.

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Enhancers: Muitos compostos podem ser utilizados para otimizar a performance e

sensibilidade do PCR. Entre estas substncias podemos citar o DMSO e cloreto de
tetrametilamnio (TMAC). Estes atuam desestabilizando as pontes de hidrognio entre as
bases da dupla hlice, facilitando desta forma a desnaturao do DNA e reduzindo a
temperatura de anelamento.

INSTALAES E EQUIPAMENTOS
Laboratrio
Em um laboratrio onde se trabalhe com a amplificao de cidos nuclicos sempre
devemos levar em considerao a possibilidade de se carrear produtos de amplificao para
reas onde se manipulem as amostras e desta forma altera os resultados. Alm disto, o
preparo do mix deve sempre ser realizado em reas onde no se trabalhe com DNA (capela
de fluxo, ou capela com UV). Desta forma geralmente o laboratrio deve ser dividido em
duas reas, uma limpa, onde se trabalha com os constituintes da mix. Na rea suja seriam
analisados os produtos de amplificao (hibridizao, eletroforese, restrio, clonagem e
sequenciamento de DNA amplificado). Abaixo representado um esquema sugerido para
um laboratrio que trabalhe com PCR.

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Recepo de amostras e extrao de DNA

Escritrios

Preparo da mix

Amplificao do DNA

Fluxo
Sala escura

Equipamentos
Pipetadores: Utilizadas para o preparo da mix, logo importante que estas estejam
corretamente calibradas para garantir a preciso da PCR. Como o volume de cada um dos
20

componentes da mix reduzido (microlitros) a correta pipetagem fundamental. Alm

disto, como a principal causa de contaminao da PCR a introduo de DNA exgeno
presente na forma de aerossol, o uso de pipetas exclusivas para o preparo do mix
fundamental.

Material plstico: Existem diferentes fabricantes de produtos plsticos para PCR. O mix
geralmente preparado em tubos de 0,5ml a 1,5ml, enquanto que a PCR pode ser realizado
tanto em microtubos de 0,5ml, 0,2ml e em placas de 96 poos, de acordo com o tipo de
bloco presente no termociclador. No caso de microplacas, membranas plsticas seladoras
devem ser utilizadas, para garantir a ausncia de contaminao, bem como reduzir a

21

evaporao. O tipo de plstico (espessura da parede) muito importante para as trocas de

temperatura durante os ciclos da PCR.
As ponteiras para PCR so muito importantes uma vez que elas entraro em contato
com os estoques dos componentes para o mix e transportaro alquotas destes reagentes
para o tubo do mix da PCR. Logo o plstico deve ser de boa qualidade (porosidade
reduzida), a fim de evitar o acmulo de gotas nas ponteiras, bem como em alguns casos
conter barreiras de algodo que evitam o contato direto com as solues estoque e tambm
a passagem de microaerrossois. Todo material plstico utilizado no PCR deve ser4 novo e
nunca deve ser reciclado afim de evitar a ocorrncia de contaminao.
Termo ciclador: A automatizao do PCR foi um dos pontos iniciais para sua utilizao
em larga escala no laboratrio. Esta evoluo na tecnologia do PCR foi possvel pela
utilizao dos termocicladores. Estas mquinas substituram o uso de banhos de gua, o que
se constitua num processo laborioso e demorado. Os termocicladores so constitudos de
blocos contendo um sistema de aquecimento em espiral, o qual aquece o bloco de 1-2C
por segundo. Para o rpido resfriamento do bloco a mquina possui um sistema de
refrigerao a ar. Como a temperatura do bloco geralmente est prxima a temperatura de
evaporao da gua, isto faz com que os constituintes do mix evaporem durante o processo
se acumulando na tampa do microtubo e longe da variao da temperatura o que pode
prejudicar o PCR. Para reduzir este fenmeno devemos adicionar leo mineral de alta
qualidade ao mix, o qual forma uma camada que previne a evaporao. Alm disto, os
termocicladores em sua maioria apresentam tampas aquecidas que impedem a condensao
do lquido na tampa do microtubo. Os termocicladores mais modernos possuem blocos que
trabalham com gradiente de temperatura, ou seja, a temperatura no a mesma ao longo de
todo o bloco e desta forma muito til para determinao da temperatura ideal de
anelamento dos primers.

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PREPARO DO MIX
Material Necessrio
Caixa com gelo
Luvas
Pipetadores limpos (preparo da mix)
Pipetadores para o template
Ponteiras e microtubos de 0,5ml ou 0,2 ml
Constituintes do mix
leo mineral estril
Termociclador
Preparo do mix
Constituinte
Tampo
dNTPs
Primer
Enzima
gua
template

Estoque
10mM (cada)
varivel
-

Soluo de uso
10X
1mM (cada)
30pmol/l
5U/l
-

Volume por reao

2,5l
5,0l
1l (cada)
0,2l
qsp 20l
5l

Concentrao por reao

1x
200Mcada)
30pmol
1U
-

Cuidados no preparo do mix

Manuseio
Pipetagem
Quantidades- enzima
Homogenizao
Ordem e precauo
Controles
Positivo: Utilizar uma amostra de DNA como padro de amplificao
Negativo: Utilizar gua ou a prpria mix que sem conter DNA no pode apresentar a
amplifciao. Controle da contaminao dos reagentes da mix e da manipulao (aerossis)

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Interno: para amostras que forma negativas no PCR. Para ter certeza de que no se trata de
inibio da reao repeti-la utilizando o DNA template mais 1l de um produto de
amplificao (controle interno). O segundo PCR deve ser positivo (produto de PCR
adicionado) caso contrario significa que algo est inibindo a reao de PCR
Cuidados na realizao do PCR:
CONTAMINAO!!!!!!!!!!!!!!!!
*Sempre preparar a mix num local onde no exista manipulao com cidos nuclicos
*Utilizar ponteiras (tips) novos
*Utilizar luvas
*Evitar manipulao exagerada
*Utilizar pipetas livres de contaminaes
*Acrescentar o template num local diferente daquele onde se prepara a mix

VARIAES DA PCR
PCR multiplex
Nesta tcnica utilizam-se mais de um par de primers, sendo obtidas mais de um
resultado ao mesmo tempo, poupando tempo e reagentes. Pode ser utilizado para identificar
dois genes de um mesmo organismo, ou dois microrganismos diferentes presentes numa
amostra. Um problema associado a esta tcnica a competio entre os primers para
amplificao de suas seqncias alvo, a formao de primers-dimers e a temperatura de
annealing que deve ser a mesma para os dois conjuntos.
PCR Nested

24

Nesta tcnica o DNA inicialmente amplificado com um par de primers e em

seguida este produto de amplificao utilizado como template (molde) para um novo PCR
empregando primers construdos para regio interna a amplificada inicialmente. Uma
variao da tcnica o PCR semi nested, onde apenas um primer e desenhado para regio
interna do produto amplificado na primeira reao, sendo o utilizado um dos primers
iniciais para completar o par, ou seja, amplificada uma extremidade. Esta tcnica
utilizada para melhora tanto a sensibilidade como especificidade, porm o problema de
contaminao maior, bem como a interferncia dos constituintes da primeira reao na
segunda (excesso de primers, DNTP, produtos abortados, impurezas, ...).

RT-PCR
PCR empregado para verificar a expresso de genes e montar bancos de cDNA.
Neste mtodo ocorre inicialmente a sntese de uma fita de DNA molde a partir de uma fita
de RNA, utilizando a enzima transcriptase reversa (retrovrus). Inicialmente gera-se uma
molcula hbrida DNA-RNA, contudo a fita de RNA removida pela adio de RNAses
(RNAse H) e a molcula de DNA serve de molde para o ensaio de PCR convencional.
OBS.: RNA no serve como molde para amplificao por PCR.

25

PCR Real Time (Taqman )

Permite o monitoramento da quantidade de DNA amplificado a cada ciclo. Este se
torna possvel pela incorporao de sondas fluorescentes (deteco por FRET), que
hibridizam internamente aos primers na seqncia a ser amplificada. Estas sondas so
marcadas com um composto fluorescente na sua extremidade 5 e um inibidor na sua
extremidade 3. Na sonda os dois compostos esto unidos e a fluorescncia no emitida,
entretanto quando a Taq chega a sonda, por sua atividade de exonuclease 5-3, ocorre a
remoo desta e a liberao do composto fluorescente, a qual detectada em um leitor de
fluorescncia permitindo a quantificao das molculas de DNA emitidas (1 por molcula).
Desta forma, num processo muito semelhante ao ELISA calculado um ponto de corte e as
amostras so determinadas como positivas ou negativas logo aps os 30 ciclos de
temperatura, permitindo maior rapidez ao diagnstico.

Taq

VERIFICAO DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAO-ELETROFORESE EM

AGAROSE
A eletroforese em gel de agarose (polmero que se forma quando hidratado fundido
e colocado em temperatura ambiente) possibilita a separao de fragmentos de DNA
atravs de uma rede de poros, que permitem a rpida passagem dos fragmentos pequenos
de DNA enquanto retarda os fragmentos maiores. Esta separao s possvel devido
carga eltrica negativa caracterstica do DNA. Quando as molculas de DNA so colocadas
em um campo eltrico, estas tendem a migrar do plo negativo para o positivo, permitindo
desta forma a separao no gel de agarose. Num gel de agarose O DNA detectvel pela
adio de brometo de etdeo o qual um agente intercalante que se coloca entre as fitas de

26

DNA. Quando o brometo de etdeo colocado sobre luz ultravioleta este emite uma
fluorescncia laranja, visvel a olho n.
As amostras devem ser aplicadas no gel com um tampo de amostra que contm
compostos de alta densidade (glicerol, xilol) e azul de bromotimol, que permitem a descida
do DNA para os poos formados no gel, para assegurar a correta migrao do DNA estes
devem ser colocados numa cmara contendo um tampo (TBE ou TAE), sendo que a
velocidade de migrao do DNA no gel est diretamente relacionado com a concentrao
de agarose e a voltagem aplicada (tabela 6).
Tabela 6. Resoluo dos gis de DNA
Matriz
poliacrilamida
agarose

Pulse-field

%
20
15
8
2
1,5
1,0
0,8
0,4

Espectro de separao
5- 100pb
20-150pb
60-400pb
0,2-1,5Kb
0,3-3Kb
0,5-5Kb
1-71Kb
5-30Kb
>5000Kb

Obs.
Sequenciamento de DNA
PCR
PCR
DNA GENMICO
Mega plasmdeos
CHEF

27

28

PROBLEMAS NA REAO DE PCR

Inibidores: Muitos componentes podem inibir a atividade da polimerase e desta forma
impedir a reao. Muitas destas substncias esto presentes nas amostras clnicas como
sangue, bilirrubina, sais de bile nas fezes. Alm disto anticoagulantes como heparina e
EDTA. Este critrio muito importante para escolha de qual amostra clnica a ser utilizada
para amplificao do DNA, bem como dos protocolos para extrao e lavagem do DNA.
Extenso incompleta: pode ocorrer devido a uma distncia excessiva entre os primers, ou
um tempo de amplificao insuficiente, estruturas secundrias presentes no DNA alvo que
podem bloquear a polimerase, alto contedo de GC no template, concentrao muito baixa
dos primers e reduzida processividade da polimerase.
Primer-Dimer: So produtos curtos de 40-50 pares de base que so formados pela
hibridizao dos primers entre si. A formao destes produtos pode ser minimizada pela
reduo na concentrao dos primers e utilizao da tcnica de hot start.
Contaminao cruzada: Existem diversos mecanismos de preveno para contaminao.
Este assunto ser discutido com mais detalhes na optimizao da PCR.
Fidelidade: Um dos grandes problemas da amplificao do DNA por PCR a introduo
de erros pela Taq DNA polimerase. Entretanto este problema somente de grande
importncia quando o objetivo seja a clonagem, sequenciamento e expresso de genes.
Alm disto este problema somente observado de 1.000 a 10.000 nucleotdeos, ou seja,
depende do tamanho do fragmento a ser amplificado.
Tabela 7. Possveis problemas e suas solues para tcnica de PCR
Problema
Possveis causas
Solues
Ausncia de produto de amplificao Falta de componentes na mix Cuidado no preparo
Nmero
insuficiente
de Retirar alquotas ao 25, 30,
ciclos
Desenho errado dos primers

35 e 40 ciclos
Reconsiderar os dados de
sequenciamento

29

Qualidade e quantidade do Checar o template (molde)

template

em agarose
Avaliar

protocolo

de

Problema no termociclador
Desnaturao insuficiente
Tempo reduzido de extenso

extrao
Monitorar
Usar jump start
Utilizar como padro 1 min.

Problema na enzima

para cada Kb
1-2 unidades de enzima so
suficientes
verificar a enzima
testar com alquota de outra

Mltiplas bandas

Desoxinucleotdeos
Baixa
temperatura

partida ou trocar enzima

Checar concentrao
de Usar hot start

anelamento

Usar um termociclador com

Nmero excessivo de ciclos

gradiente
Reduzir o nmero de ciclos
checando

Desenho dos primers

alquotas

da

amplificao
Aumentar o tamanho dos
primers

Arraste

Checar a seqncia do DNA

Tempo excessivo de extenso Reduzir o tempo de 1 min.
Nmero excessivo de ciclos Reduzir o nmero de cilos
em 5
Temperatura de desnaturao Jump start

Bandas fracas

muito baixa
Muita polimerase
Muito template
Nmero
insuficiente

Reduzir a quantidade
Diluir o DNA molde
de Aumentar o nmero de ciclos

ciclos
Quantidade e qualidade do Checar o DNA em gel
template
Tempo de extenso curto
Requerimento de aditivos

Aumentar
Utilizar enhancers

30

OPTIMIZAO DA PCR
Muitas vezes no se consegue obter nas condies normais do PCR uma banda
intensa e nica de amplificao. Quando ao se observar o gel de agarose se verifica a
ausncia de amplificao ou a ocorrncia de inmeras bandas, isto um indicativo que algo
deve ser alterado na reao a fim de obter-se melhores resultados. A maior parte das
modificaes visa, ou o aumento na sensibilidade do PCR, ou a reduo da contaminao.
Aumentando sensibilidade do PCR
Nos casos onde nenhuma banda de amplificao observada no PCR, diversos fatores
podem ser considerados:
1.Desenho dos primers: O desenho dos primers um ponto muito importante, uma vez
que eles so fundamentais a reao. Logo o par de primers deve ter uma Tm prxima para
que possam trabalhar eficientemente juntos (geralmente no deve ser maior do que 5 oC).
Alm disto, sempre que um novo primer for incorporado a reao, este deve ser analisado,
pois pode trazer consigo grandes problemas ao PCR.
2. Concentrao de Mg e outros ons: O magnsio um dos fatores limitantes para
correta atividade da Taq, logo est diretamente ligado com a estringncia do PCR, sendo
que quanto maior sua concentrao maior a estrigncia do PCR e menor o nmero de
bandas visualizadas no gel. Na padronizao da tcnica de PCR o ideal que tampes
contento diferentes concentraes de cloreto de magnsio sejam testadas (variando de 0,5 a
2,5mM). O KCl tambm muito importante uma vez que concentraes elevadas deste sal
(maiores que 0,2M) levam a uma inibio da PCR, por bloquear a desnaturao das fitas
por um mecanismo de neutralizao das cargas negativas da cadeia de fosfato.
3. Concentrao de Taq: A ausncia de produtos de amplificao ou bandas fracas
observadas no gel pode refletir uma baixa concentrao da polimerase. Para verificar se

31

este o problema, uma titulao (diluio seriada) pode ser feita com a enzima a fim de
determinar qual a concentrao de Taq adequada para correta amplificao. Um aspecto
muito importante a ser considerado a meia vida da Taq DNA polimerase, logo PCR muito
longos ou com altas temperaturas de desnaturao devem prever a incorporao de maior
quantidade de Taq.
4. Temperaturas:
Desnaturao: muito importante pois expe os stios de hibridizao dos primers. Para
melhorar a desnaturao do DNA molde geralmente se adiciona um ciclo inicial de 5
minutos a 94oC (Jump Start) a fim de permitir que as molculas de DNA j estejam
desnaturadas no incio do primeiro ciclo do PCR. A temperatura de desnaturao depende
grandemente do contedo GC da seqncia alvo de amplificao, sendo geralmente
utilizado 94oC. Entretanto estudos comprovam que temperaturas entre 90-92 oC j seriam
suficientes.
Anelamento: A temperatura de anelamento um dos pontos chave no controle da
estringncia do PCR. Geralmente em Tm baixas ocorre a ligao aleatria dos primers e
amplificao de fragmentos inespecficos. Desta forma sempre devemos escolher a
temperatura ideal que permita a amplificao correta dos produtos.
Obs: Geralmente na optimizao do PCR os primeiros testes devem ser realizados visando
encontrar a Tm e a concentrao de cloreto de magnsio de maior estringncia.
5. PCR Touchdown: Esta tcnica a temperatura de anelamento deve ser maior que a Tm
dos primers nos primerios ciclos da PCR, sendo gradativamente reduzida. O ideal para um
primer de 20nt que a temperatura de anelamento seja reduzida de 1oC a cada dois ciclos.
Alm disto, ciclos adicionais de anelamento no final do PCR podem ser adequados.
6.PCR Hot Start: Nesta tcnica os componentes do mix devem ser aquecidos antes da
aplicao da polimerase, que ocorre aps o jump start. Isto impede que baixas temperaturas
(ex. gelo e durante o aquecimento), os primers anelem com seqncias inespecficas,

32

permitindo sua amplificao. Entretanto este protocolo questionado uma vez que pela
manipulao pode ocorrer a contaminao do PCR.
7.PCR Booster: Nesta tcnica durante os primeiros cilclos se adiciona os primers numa
baixa concentrao a fim de se obter uma relao ideal com a as molculas do template isto
permite que os primers anelem de forma mais especfica
8.Nmero e durao dos ciclos: O nmero de ciclos deve sempre ser mantido no mnimo
necessrio a amplificao de produtos suficientes para uma anlise e manipulao futuras.
Em casos onde a amplificao do material no seja adequada podemos aumentar o nmero
de ciclos de 30 a no mximo 40.
9.Termociclador: Deve sempre ser avaliado para deteco de problemas tcnicos e falhas
no funcionamento. Esta pode ser monitorada atravs da adio de controladores de
temperatura digitais, que podem indicar toda variao de temperatura que ocorreu numa
amostra durante determinado perodo de tempo.
Aditivos para PCR: Uma srie de aditivos (enhancers) so disponveis comercialmente e
muitos deles so supridos com a prpria enzima. Estes so adicionados para aumentar a
eficincia da reao permitindo a amplificao em alta quantidade de produtos especficos.
Porm no existe nenhum componente capaz de solucionar todos os problemas e em muitos
casos so incompatveis com substncias presentes na amostra.
Abaixo so exemplificadas algumas destas substncias:
Tabela 8. Principais aditivos utilizados no PCR
Substncia
DMSO
Formamida
Cloreto de trimetilamnio
Tween 20
PEG 6000
7-deaza-DGTP

Concentrao
Mais de 10%
5%
10-100M
0,1-2,5%
5-15%
150

33

Eliminao de Inibidores: Sempre que ocorre a inibio do PCR um dos procedimentos

mais simples a diluio do DNA da amostra. Alm disto o aumento no nmero de ciclos
do PCR pode ser indicado
Tabela 9. Inibidores do PCR
Inibidor
EDTA

Fonte
sangue

Remoo
Obs.
Extrao de clulas

Heparina

sangue

por centrifugao
Extrao de clulas

Porfirinas

Sangue-eritrcitos

por centrifugao
Extrao de clulas
por

das

centrifugao-

Extrao de DNA
clulas- Extrao com fenol

Detergentes

Lise

aninicos

Protocolos

de

Proteinase K

extrao
Protocolos

de Extrao fenlica

Fenol

extrao
Protocolos

Inativao trmica
de Precipitao
e

Compostos

extrao
fezes

SDS

Potentes

inibidores

(conc.

Inferiors a 5%)

Lavagem com etanol

aromticos

PCR Nested: Descrito anteriormente.

Qualidade e quantidade do template: Em muitos casos a quantidade e a qualidade do
DNA presente na amostra pode ser um dos fatores limitantes da tcnica. O DNA pode ser
obtido de vrias maneiras, sendo geralmente por termoextrao. Contudo estes lisados
geralmente so pouco estveis, quando mantidos refrigerados, principalmente se o DNA
no retirado da amostra por centrifugao. Excesso de DNA tambm pode ser um
problema para o PCR, inibindo a associao dos primers e o correto funcionamento da Taq.

34

Contaminao
A contaminao do PCR por DNA exgeno a principal preocupao de um
laboratrio que trabalhe com a amplificao de cidos nuclicos e principalmente naqueles
onde se realize o diagnstico molecular de enfermidades. A alta sensibilidade do PCR
permite que quantidades nfimas de DNA sejam amplificadas, entretanto uma vez o molde
presente na reao a Taq no pode diferenciara entre molculas da amostras daquelas
incorporadas a reao do ambiente laboratorial. Devido a especificidade do PCR o DNA
molde que pode ocasionar a contaminao do PCR so:
Templates originais
Genes clonados contendo a seqncia alvo
Produtos de amplificao
Tendo em vista a reduo da contaminao no PCR, vrias medidas podem ser
tomadas entre elas:
1.Separao de uma rea para preparo da mix: Que deve ser separada da rea de
manipulao do template e produtos amplificados.
2.Manter os constituintes do mix aliquotados: Especialmente a gua, a qual deve ser
autoclavada e aliquotada em tubos contendo 0,2-1,0 ml.
3.leo mineral : Deve ser esterilizado e sempre devemos evitar o contato do mesmo com
os tubos e pipetadores.
4.Clorina: Trata-se do hipoclorito de sdio a uma concentrao de 1,5%, o qual deve ser
empregado para limpeza da rea de preparo do mix e dos pipetadores (utilizar clorina
diluda, dar uma banho nos componentes dos pipetadores de 10 a 30 miutos, lavar com
gua destilada abundante e secar bem)

35

5.Uso de pipetas com barreira a microaerossois

6.UV: Muito utilizada para levar a degradao do DNA pois ocasionar alteraes em sua
molcula (dmeros de pirimidina) para limpeza da sala de preparo do mix, bem como dos
pipetadores (exposio de 15 minutos, entretanto, pode danificar o material plstico dos
mesmos)
7. Uso do Uracil N- Glicolase: Esta enzima pode destruir resduos de dUTP, presentes em
produtos de amplificao onde este nucleotdeo substitua o dTTP. O dUTP no leva a
nenhuma alterao no produto final da amplificao, contudo no adequando em caso de
clonagem de genes para sequenciamento e expresso, bem como quando da utilizao de
polimerases de alta fidelidade, as quase no aceitaro a substituio. A enzima pode ser
adicionada aos componentes do mix antes de sua utilizao no PCR. Esta enzima pode
rapidamente ser degrada pela elevao da temperatura (2min. a 95 oC) no interferindo no
prosseguimento da reao.

Tabela 10.Fatores que afetam a estringncia de um PCR

Fator
Temperatura de anelamento
Concentrao de magnsio
Nmero de cilos
Tempo de extenso
Concentrao da enzima
Concentrao dos nucleotdeos
Concentrao dos primers
Concentrao dos primers

Alta estringncia
aumentar
aumentar
reduzir
reduzir
reduzir
reduzir
reduzir
reduzir

Baixa estringncia
reduzir
reduzir
aumentar
aumentar
aumentar
aumentar
aumentar
aumentar

36

37