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URI CAMPUS DE ERECHIM

DEPARTAMENTO DE CINCIAS AGRRIAS


PROGRAMA DE MESTRADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS

Concentrao, Imobilizao e Caracterizao Parcial de


Lipase produzida por Penicillium verrucosum utilizando
Fermentao em Estado Slido

Silvana Menoncin

Dissertao de Mestrado submetida ao Programa


de Mestrado em Engenharia de Alimentos da URICampus de Erechim, como requisito parcial
obteno do grau de Mestre em Engenharia de
Alimentos, rea de concentrao: Engenharia de
Alimentos, da Universidade Regional Integrada do
Alto Uruguai e das Misses URI, Campus de
Erechim.

ERECHIM, RS BRASIL
FEVEREIRO DE 2007

Concentrao, Imobilizao e Caracterizao Parcial de


Lipase produzida por Penicillium verrucosum
utilizando Fermentao em Estado Slido
Silvana Menoncin

Dissertao de Mestrado submetida Comisso Julgadora do Programa de


Mestrado em Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos necessrios
obteno do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos, rea de Concentrao:
Engenharia de Alimentos.

Comisso Julgadora:

__________________________
Dbora de Oliveira, D.Sc.
(Orientadora)

__________________________
Helen Treichel, D.Sc.
(Orientadora)
__________________________
Eliana Setsuko Kamimura, D.Sc.
__________________________
Geciane Toniazzo, D.Sc.

Erechim, 27 de fevereiro de 2007.

ii

Dedico esta conquista a meus pais, Selvino e Ivete,


por todo apoio e incentivado vencer as dificuldades
encontradas na busca da realizao de meus objetivos.

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me dado fora em todos os momentos de dificuldade. Sem


Ele nada teria conseguido.
Aos meus pais Selvino e Ivete, meus irmos Silvete e Carlos e minha
madrinha Lurdes por todo carinho e incentivo que me deram.
Ao meu grande amor Eluzardo por todos os momentos de alegrias vividos,
por todo apoio, incentivo e compreenso.
Aos demais familiares e amigos que sempre me apoiaram e incentivaram
nesta etapa vivida.
s

professoras

Dbora

Helen

por

compartilharem

de

seus

conhecimentos, pela orientao durante a realizao deste trabalho, pelo carinho,


amizade e incentivo em todos os momentos.
Ao professor Marco Di Luccio por toda a contribuio dada para a
realizao deste trabalho
minhas colegas e amigas de turma, pelos momentos de alegrias vividos e
experincias compartilhadas.
bolsista Natlia, pela colaborao na realizao deste trabalho.
Aos demais colegas e amigos do Laboratrio de Biotecnologia e da Central
de Materiais pela amizade, incentivo e ajuda nos momentos necessrios.
s minhas grandes amigas Camila e Ieda, pela pacincia, carinho,
amizade, pelo ombro amigo nos momentos difceis e por todos os momentos de
alegria vividos durante este tempo em que convivemos.
URI-Campus de Erechim e ao Departamento de Engenharia de
Alimentos, por possibilitarem minha formao.
INTECNIAL por fornecer apoio financeiro, viabilizando a realizao deste
projeto.
A todos que de alguma maneira contriburam para a realizao deste
trabalho.

iv

SUMRIO
RESUMO .........................................................................................................

xi

ABSTRACT......................................................................................................

xii

1 INTRODUO............................................................................................... 1
2 REVISO BIBLIOGRFICA.........................................................................

2.1. DEFINIO DE LIPASES....................................................................... .

2.2.APLICAES DE LIPASES.......................................................................

2.3.FONTES E PROPRIEDADES DAS LIPASES............................................

2.4.PRODUO DE ENZIMAS POR FERMENTAO EM ESTADO


SLIDO............................................................................................................

2.5.CONCENTRAO DE LIPASES...............................................................

12

2.6.IMOBILIZAO DE LIPASES....................................................................

14

2.7.CARACTERIZAO PARCIAL DAS LIPASES..........................................

16

2.8.CONSIDERAES FINAIS........................................................................ 17
3 MATERIAL E MTODOS..............................................................................

19

3.1.MATERIAIS................................................................................................. 19
3.2. EQUIPAMENTOS......................................................................................

20

3.3.MTODOS.................................................................................................. 21
3.3.1. PRODUO DE LIPASES POR FERMENTAO EM ESTADO
SLIDO............................................................................................................

21

3.3.1.1. Microrganismo.....................................................................................

21

3.3.1.2. Inculo.................................................................................................

21

3.3.1.3. Preparo dos Meios de Cultivo.............................................................. 22


3.3.1.4. Preparo das Amostras.........................................................................

22

3.3.1.5. Atividade de Hidrlise..........................................................................

23

3.3.2. OTIMIZAO DAS CONDIES DE EXTRAO................................ 24


3.3.3. CONCENTRAO DO EXTRATO ENZIMTICO.................................. 25
3.3.3.1. Precipitao com sulfato de amnio....................................................

25

3.3.3.2. Dilise do extrato enzimtico concentrado.........................................

27

3.3.4. IMOBILIZAO DAS LIPASES PRECIPITADAS................................... 27

3.3.5. CARACTERIZAO PARCIAL DA LIPASE DE Penicillium


verrucosum.......................................................................................................

30

3.3.5.1. Temperatura e pH timos do extrato enzimtico concentrado............

31

3.3.5.2. Estabilidade da Torta Fermentada, do Extrato Enzimtico Bruto e da


Lipase Concentrada a baixas temperaturas.....................................................

31

4 RESULTADOS E DISCUSSO..... ..............................................................

33

4.1.OTIMIZAO DAS CONDIES DE EXTRAO DA LIPASE................

33

4.2.CONCENTRAO DO EXTRATO ENZIMTICO ..................................... 36


4.3.IMOBILIZAO DO EXTRATO ENZIMTICO PRODUZIDO POR FES...

47

4.4.CARACTERIZAO PARCIAL DA LIPASE .............................................. 49


4.4.1.TEMPERATURA E pH TIMOS DO EXTRATO ENZIMTICO
CONCENTRADO.............................................................................................. 49
4.4.2.ESTABILIDADE DA TORTA FERMENTADA, DO EXTRATO BRUTO E
DO EXTRATO CONCENTRADO ARMAZENADOS A BAIXAS
TEMPERATURAS............................................................................................

52

4.4.2.1 Estabilidade da torta fermentada em temperatura de congelamento...

52

4.4.2.2. Estabilidade do extrato bruto em temperatura de congelamento........

53

4.4.2.3. Estabilidade do extrato enzimtico concentrado armazenado em


geladeira...........................................................................................................

54

4.4.4.4. Estabilidade do extrato enzimtico concentrado armazenado em


congelador........................................................................................................

55

5 CONCLUSES E SUGESTES................................................................... 58
5.1.CONCLUSES..........................................................................................

58

5.2.SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS.........................................

59

6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.............................................................

60

7 ANEXOS........................................................................................................ 68

vi

NDICE DE TABELAS
Tabela 2.1. Fontes de carbono (substrato principal) utilizadas para Fermentao
em Estado Slido....................................................................................................11
Tabela 2.2. Atividades especficas obtidas na precipitao com sulfato de amnio
relatadas na literatura..................................................................................13
Tabela 3.1. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para
otimizao das condies de extrao........................................................24
Tabela 3.2. Variveis e nveis estudados no planejamento de experimentos 22 para
concentrao do extrato enzimtico obtido por P. verrucosum...................25
Tabela 3.3. Variveis e nveis estudados no segundo planejamento fatorial
completo 22 para concentrao do extrato enzimtico obtido por P.
verrucosum..................................................................................................25
Tabela 3.4. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para
a determinao do pH e temperatura timos...............................................31
Tabela 4.1. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipsica) para extrao da lipase de P.
verrucosum..................................................................................................34
Tabela 4.2. Anlise de varincia para a atividade lipsica do extrato enzimtico
bruto obtido por Penicillium verrucosum......................................................35
Tabela 4.3. Matriz do primeiro planejamento experimental realizado (valores
codificados e reais com as respostas da atividade lipsica) para
precipitao do extrato enzimtico obtido por FES utilizando P.
verrucosum................................................................................................37
Tabela 4.4. Anlise de varincia para a atividade lipsica do extrato enzimtico
concentrado obtido por Penicillium verrucosum .........................................38
Tabela 4.5. Matriz do primeiro planejamento experimental realizado (valores
codificados e reais com as respostas da atividade especfica) para
avaliao

do

efeito

da

dilise

das

lipases

de

Penicillium

verrucosum..................................................................................................40
vii

Tabela 4.6. Matriz do segundo planejamento experimental realizado (valores


codificados e reais com as respostas da atividade especfica) para a
precipitao do extrato enzimtico...............................................................41
Tabela 4.7. Matriz do segundo planejamento experimental realizado (valores
codificados e reais com as respostas da atividade especfica) para
avaliao

do

efeito

da

dilise

do

extrato

enzimtico

precipitado....................................................................................................43
Tabela 4.8.Anlise de varincia para a atividade lipsica do extrato enzimtico
concentrado obtido por Penicillium verrucosum, aps dilise................................44
Tabela 4.9. Mdias da atividade especfica da lipase de P. Verrucosum e Desvios
Padro encontrados na anlise dos resultados obtidos nos testes com
dilise pelo Teste de Tukey.........................................................................46
Tabela 4.10. Valores da Atividade Especfica, Reteno, Rendimento e Contedo
de gua na imobilizao da lipase produzida por FES utilizando Penicillium
verrucosum..................................................................................................47
Tabela 4.11. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipsica) para a caracterizao parcial
do extrato enzimtico concentrado..............................................................49
Tabela 4.12.Anlise de varincia para a atividade lipsica na etapa de
caracterizao parcial do extrato enzimtico concentrado..........................51
Tabela 7.1.Curva Padro Albumina utilizada para medida de protena pelo mtodo
de Bradford..................................................................................................68
Tabela 7.2. Caractersticas Carvo Ativo ANF Carvorite.....................................70
Tabela 7.3. Curva de Calibrao utilizada para medida de atividade de hidrlise do
extrato enzimtico imobilizado.....................................................................71

viii

NDICE DE FIGURAS
Figura 2.1. Caractersticas do fungo Penicillium verrucosum...................................8
Figura 2.2. Classificao dos mtodos utilizados para imobilizao de enzimas
(DallaVecchia et al., 2004)....................................................................................15
Figura 3.1. Bqueres utilizados para a FES do farelo de soja utilizando Penicillium
verrucosum..................................................................................................22
Figura 4.1. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica
obtida na otimizao das condies de extrao da lipase produzida por
FES..............................................................................................................35
Figura 4.2. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica
obtida no estudo das condies de precipitao por sulfato de amnio por
FES .............................................................................................................39
Figura 4.3. Grfico de Pareto da precipitao do extrato enzimtico produzido por
FES em funo das variveis estudadas aps dilise.................................40
Figura 4.4. Grfico de Pareto da precipitao do extrato enzimtico produzido por
FES em funo das variveis estudadas aps precipitao........................42
Figura 4.5 Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica
obtida

na

precipitao

da

lipase

produzida

por

FES

aps

dilise........................................................................................................45
Figura 4.6. Foto da enzima imobilizada com Accurel EP 100 (direita) e Carvo
Ativo (esquerda)........................................................................................48
Figura 4.7. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica
obtida na avaliao da temperatura e pH timos para o extrato enzimtico
concentrado...............................................................................................51
Figura 4.8. Grfico de Barras da estabilidade da torta de soja fermentada
armazenada em congelador (-10oC)............................................................53

ix

Figura 4.9. Grfico de Barras da estabilidade do extrato enzimtico bruto aquoso


armazenado em congelador (-10oC)............................................................54
Figura 4.10. Grfico de Barras da estabilidade do extrato enzimtico concentrado
armazenado em geladeira (4oC)..................................................................55
Figura 4.11. Grfico de Barras da estabilidade do extrato enzimtico concentrado
armazenado em congelador (-10oC)............................................................56

RESUMO
CONCENTRAO, IMOBILIZAO E CARACTERIZAO PARCIAL DE LIPASE
PRODUZIDA POR Penicillium verrucosum UTILIZANDO FERMENTAO EM
ESTADO SLIDO
Silvana Menoncin
Fevereiro/2007
Orientadoras: Dbora de Oliveira e Helen Treichel
As lipases de origem microbiana constituem um importante grupo de enzimas com
alto potencial biotecnolgico, porm sua aplicao bastante reduzida devido ao seu
custo de produo. A imobilizao das enzimas visa a obteno de um biocatalisador com
atividade e estabilidade que no sejam afetadas durante o processo, em comparao
sua forma livre. Neste trabalho buscou-se a avaliao das condies de extrao, de
concentrao com sulfato de amnio e imobilizao em dois suportes, bem como a
caracterizao parcial dos extratos enzimticos (em termos de temperatura e pH timos e
estabilidade em baixas temperaturas). Observou-se que 37C e pH 7,0 foi a condio
otimizada para a extrao e que 60% de saturao com 5 horas foi a condio
maximizada para a precipitao da lipase com sulfato de amnio. A enzima imobilizada
com Carvo Ativo foi a que apresentou melhores resultados em termos de atividade
especfica (1,5 X 106 U/mg de protena), rendimento (30,42%) e reteno (382,51%). Na
caracterizao parcial da enzima precipitada, a temperatura de 42C e pH 8,5 foram as
condies timas encontradas. A torta de soja fermentada pde ser armazenada em
temperatura de congelamento at 56 dias sem perda da atividade de hidrlise e o extrato
bruto apresentou um aumento de atividade ao final do perodo de acompanhamento, 218
dias. O estudo realizado com o extrato enzimtico concentrado indicou que tanto a 4oC
como a -10oC a atividade de hidrlise praticamente a mesma da inicial, aps 91 dias de
armazenamento.

xi

ABSTRACT
CONCENTRATION, IMOBILIZATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF
LIPASE FROM Penicillium verrucosum BY SOLID STATE FERMENTATION
Silvana Menoncin
Fevereiro/2007
Advisors:

Dbora de Oliveira
Helen Treichel

Lipases from microbial organisms comprise an important group of enzymes with potential
biotechnological interest but with unfavorable production costs. Towards establishing costeffective systems, enzyme immobilization has been attempted as an alternative to the use
of free enzymes. In this context, the main objective of this work was to evaluate the
conditions of the extraction, concentration in ammonium sulphate and immobilization using
two supports, as well as the partial characterization of the enzymatic extracts (in terms of
optimum temperature and pH and stability at low temperatures). The best extraction
condition was determined to be at 37C and pH 7.0 and that 60% of saturation in 5 hours
was the maximized condition for the precipitation with ammonium sulphate. The enzyme
immobilizaed with activated carbon led to best results in terms of specific activity (1.5 X
106 U/mg of protein), yield (30.42%) and retention (382.51%). Regarding enzyme partial
characterization, the most proper condition found was 42C and pH 8.5. It was possible to
store the frozen fermented soy cake for 56 days without verified losses of hydrolysis
activity. The raw extract presented an enhancement of activity at the end of the storage
period, 218 days. Results showed that the concentrated enzymatic extract at 4oC as well
as -10oC exhibit negligible change in the hydrolysis activity after 91 days of storage.

xii

Captulo 1 Introduo

1 INTRODUO
As lipases so enzimas que catalisam a quebra de gorduras e leos
liberando cidos graxos, diacilgliceris, monoacilgliceris e glicerol. Podem
tambm catalisar reaes de esterificao, transesterificao e interesterificao
em solventes orgnicos (Villeneuve et al., 2000). So biocatalisadores de grande
valor, devido principalmente a caractersticas como: ao sob condies amenas,
estabilidade em solventes orgnicos, especificidade ao substrato e rgio enncio
seletividade (Snellman et al., 2002).
Estas enzimas so encontradas em tecidos animais, vegetais e em
microrganismos (bactrias, fungos e leveduras) (Villeneuve et al., 2000), tendo
suas propriedades variadas de acordo com sua procedncia (Saxena et al., 2003).
As lipases provenientes de microrganismos constituem um grupo de importantes
enzimas de aplicaes biotecnolgicas, devido principalmente versatilidade de
suas propriedades, no que se refere atuao enzimtica, especificidade pelo
substrato e facilidade de produo em grandes quantidades (Hasan et al., 2006).
Podem ser aplicadas na indstria oleoqumica em processos que
consomem grande quantidade de energia como hidrlise, glicerlise e alcolise,
na produo de cidos graxos poliinsaturados (aditivos de alimentos), na indstria
txtil (melhoria da qualidade e propriedade dos tecidos) (Hasan et al., 2006) e na
indstria de detergentes (remoo de manchas de batom, frituras, manteiga,
azeites, molhos, etc.) (Castro et al., 2004).
So utilizadas tambm na modificao de sabores (no processo de
fermentao de salame e vinho) (Hasan et al., 2006). Na indstria de laticnios so
empregadas no melhoramento do sabor e processo de maturao de queijos e na
obteno de margarinas com baixo teor calrico (Alonso, 2001), entre outras. No
entanto, sua utilizao reduzida devido aos altos custos de produo e
purificao e na busca por novas cepas produtoras que produzam mais
quantidade em tempos menores, com caractersticas desejveis (Martins, 2001).
As lipases podem ser produzidas por fermentao em estado slido (FES)
sendo que esta se baseia no crescimento e metabolismo dos microrganismos em

Captulo 1 Introduo

substratos sem a presena de gua livre. Dentre as vantagens da FES pode-se


citar a economia de espao para a realizao das fermentaes, simplicidade dos
equipamentos utilizados para fermentao e altos rendimentos, entre outras
(Mahadik et al., 2002).
Os resduos gerados nos processos agroindustriais podem ser usados
como substrato para o crescimento celular, a matria orgnica presente neste
material usada como fonte de energia para o crescimento e carbono para a
sntese de biomassa celular e dos produtos do metabolismo microbiano (Silva et
al., 2005).
No entanto, muitas enzimas esto sujeitas inativao por fatores
qumicos, fsicos ou biolgicos, podendo ocorrer quando estocados ou durante o
uso. A tcnica da imobilizao utilizada para fornecer estabilidade s enzimas e
facilitar sua recuperao no final do processo (Villeneuve et al., 2000).
O mtodo de imobilizao por adsoro ainda o mais comum. Este
apresenta baixo custo, poucos efeitos deletrios para a atividade e seletividade da
enzima. Vrios materiais podem ser utilizados e a escolha de um deles depende
de suas propriedades, como fora mecnica, estabilidade fsica e qumica, carter
hidrofbico/hidroflico, capacidade de adsoro de enzimas e custo, sendo que a
eficincia da adsoro depende do tamanho da protena a ser adsorvida, rea
superficial adsorvente e, principalmente, da porosidade e tamanho dos poros
(Villeneuve et al., 2000).
Com base nestes aspectos, o objetivo geral deste trabalho foi a
caracterizao da lipase produzida em FES (Penicillium verrucosum), verificao
da sua estabilidade em condies de congelamento e imobilizao da mesma.
Como objetivos especficos pode-se citar: otimizao das condies de extrao,
estudo das condies de precipitao, imobilizao da enzima em resina
polimrica (Accurel EP100) e Carvo Ativado e caracterizao parcial da enzima
precipitada em termos de pH e temperatura timos, estabilidade da enzima
precipitada em temperatura de 4C e -10C, estabilidade de torta de soja
fermentada e do extrato bruto em temperatura de 10C, O trabalho foi dividido
em captulos, os quais contemplam uma reviso da literatura (Captulo 2), a

Captulo 1 Introduo

apresentao dos materiais e metodologias utilizadas (Captulo 3), os resultados


obtidos e a discusso dos mesmos (Captulo 4) e, no Captulo 5, so
apresentadas as concluses e sugestes para trabalhos futuros.

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

2 REVISO BIBLIOGRFICA
Neste captulo ser apresentada uma breve reviso da literatura referente
definio, aplicaes, fontes e propriedades de lipases e consideraes gerais
sobre Fermentao em Estado Slido. nfase especial ser dada ao processo de
extrao, estudo da concentrao, imobilizao e caracterizao parcial de
lipases, temas de interesse especfico deste trabalho.
2.1. DEFINIO DE LIPASES
Lipases (triacilglicerol ster hidrolases, EC 3.1.1.3) so enzimas que
catalisam a quebra de gorduras e leos liberando cidos graxos, diacilgliceris,
monoacilgliceris e glicerol. Alm disso, elas so tambm eficientes em vrias
reaes tais como esterificao, transesterificao e interesterificao em
solventes orgnicos. Estas enzimas so encontradas em tecidos animais, vegetais
e em microrganismos, tendo papel fundamental no metabolismo de lipdios destes
seres vivos: como enzimas digestivas, a deposio e mobilizao dos tecidos de
reservas energticas e no metabolismo intracelular, atuando sobre as membranas
celulares (Villeneuve et al., 2000).
As lipases eram tradicionalmente obtidas de pncreas de animais. A
descoberta foi feita por Claude Bernard, em 1856 e anos mais tarde, aumentou o
interesse pelas lipases microbianas devido dificuldade de acesso ao material de
origem animal (Hasan et al., 2006).
Embora a lipase mais estudada at hoje seja a lipase pancretica, do ponto
de vista industrial, as lipases microbianas so bem mais interessantes por
permitirem produo em maior escala. Alm disso, podem mais facilmente ser
expressas, via clonagem, em outros organismos, o que facilita sua obteno e
purificao (Palekar et al., 2000).
As lipases so originrias de um grande nmero de bactrias, fungos,
plantas e animais, tendo suas propriedades variveis de acordo com sua
procedncia (Saxena et al., 2003). As lipases provenientes de microrganismos
constituem um grupo de valiosas enzimas de aplicao biotecnolgica, devido
4

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

principalmente versatilidade de suas propriedades, no que se refere atuao


enzimtica e especificidade ao substrato e facilidade de produo em escala,
sendo um dos grupos mais utilizados no segmento industrial (Hasan et al., 2006).
As lipases so muito utilizadas em sntese orgnica principalmente por no
requerem cofatores, atuarem em uma faixa de pH relativamente grande, serem
muito estveis neste meio, apresentarem especificidade, regiosseletividade e
enantiosseletividade. As lipases tm sido extensivamente investigadas com
relao s suas propriedades bioqumicas e fisiolgicas e, mais recentemente,
para aplicaes industriais (Pandey et al., 1999; Gandhi, 1997).
2.2. APLICAES DE LIPASES
O uso de lipases nas indstrias permite o desenvolvimento de processos
tecnolgicos muito prximos aos eficientes processos executados pela natureza.
Constituem o mais importante grupo de enzimas com valor biotecnolgico, devido
versatilidade de aplicaes possveis e facilidade de produo em larga escala.
A economia de energia e minimizao da degradao trmica so provavelmente
as maiores vantagens na substituio de tecnologias qumicas atuais pelas
biolgicas (Hasan et al., 2006).
Entre as vantagens que o uso de lipases apresenta sobre os processos
qumicos convencionais esto (Xu, 2000):
-

Alta eficincia em condies de baixa temperatura e presso


atmosfrica;

Reduo da poluio ambiental;

Produtos originados de reaes enzimticas so considerados naturais


pela legislao da maioria dos pases;

Lipases apresentam vrios graus de seletividade, ao contrrio dos


catalisadores convencionais, gerando menos produtos secundrios e
reduzindo a necessidade de purificao.

O mbito para a aplicao de lipases na indstria oleoqumica enorme.


leos e gorduras so produzidos no mundo a uma escala de aproximadamente 60
milhes de toneladas por ano e uma substancial parte (2 milhes por ano)
5

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

utilizada em processos que consomem uma grande quantidade de energia como


hidrlise, glicerlise e alcolise (Hasan et al., 2006).
Devido ao seu valor nutritivo, a no degradao de cidos graxos
poliinsaturados pode ser importante para a preservao de aditivos de alimentos
tais como mono e diacilgliceris, sendo este ltimo, o principal componente dos
novos leos comestveis. Entretanto, apesar de sua superioridade aparente, os
mtodos enzimticos ainda no alcanaram um nvel de explorao comercial
proporcional a seu potencial de aplicaes (Hasan et al., 2006).
Na indstria txtil, as lipases so usadas para ajudar na remoo de
lubrificantes, a fim de promover uma melhor absoro da tinta no tecido. Seu uso
reduz tambm riscos e rachaduras nos sistemas de abraso de jeans. As
preparaes comerciais usadas para o design de jeans e outros tecidos de
algodo contm as enzimas alfa amilase e lipase. Fibras sintticas modificadas
enzimaticamente so utilizadas para a produo de fios e tecidos usados na
produo de tapetes e outros artigos de consumo, dando a eles maior resistncia
ao estiramento, enrugamento, abraso e ao tratamento com produtos qumicos. O
uso de poliesterases melhora as habilidades do tecido de polister em fixar outros
produtos qumicos como compostos catinicos, tintura, compostos antiestticos,
antimanchas e/ou compostos desodorizantes (Hasan et al., 2006).
O campo de aplicao comercialmente mais importante para as lipases
hidrolticas a sua adio aos detergentes, sendo responsvel pela remoo de
manchas de gorduras tais como batom, frituras, manteiga, azeites, molhos e as
difceis manchas em colarinhos e punhos (Castro et al., 2004). Para melhorar a
detergncia, o tipo moderno de detergentes em p e detergentes usados em lavalouas contm geralmente uma ou mais enzimas, tais como proteases, amilases,
celulases e lipases. As enzimas permitem o uso de temperaturas mais baixas de
lavagem e os produtos qumicos adicionados aos detergentes so reduzidos. Alm
disso, estes catalisadores tornam o produto biodegradvel, no deixando nenhum
resduo prejudicial, no tendo impacto negativo no processo de tratamento e no
apresentando risco ao meio ambiente (Hasan et al., 2006).

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

As lipases so utilizadas tambm para modificar o sabor dos alimentos pela


sntese dos steres, dos cidos graxos e lcool de cadeias curtas, que so os
compostos bsicos do sabor e aroma. So utilizadas tambm para a produo de
carne de peixe e margarina com reduzido teor calrico, alm de atuarem no
processo de fermentao de salames e vinhos (Hasan et al., 2006). Na indstria
de queijos so empregadas na alterao e intensificao do sabor e em processos
de acelerao da maturao (Alonso, 2001).
As lipases so utilizadas nos processos de tratamento de efluentes, onde
as finas camadas de gorduras devem ser continuamente removidas da superfcie
dos tanques para permitir a transferncia de oxignio (para manuteno da
biomassa presente). Tal fato importante em muitas operaes como a
degradao de restos orgnicos, tratamento de efluentes, limpeza de tanques, etc
(Hasan et al., 2006).
Cabe ressaltar que as aplicaes das lipases esto em nmero bastante
reduzido em relao s possibilidades de utilizao desta enzima no futuro. Cabe
frisar que a sua plena utilizao est diretamente relacionada a reduo dos
custos dos processos de produo e purificao, na busca por novas cepas
produtoras e no melhoramento gentico destas cepas, a fim de que produzam
maiores quantidades destas enzimas em tempos menores, com caractersticas
desejveis (Martins, 2001).
2.3. FONTES E PROPRIEDADES DAS LIPASES
As lipases podem ser encontradas em clulas de tecidos animais, e podem
ainda ser produzida por microrganismos como bactrias, fungos filamentosos e
leveduras (Sharma et al., 2001; Pastore et al., 2003), sendo que as lipases
fngicas so preferidas por produzirem geralmente enzimas extracelulares, o que
facilita a recuperao da enzima do caldo de fermentao (Dai et al., 2005).
Entre os fungos, o gnero Penicillium se destaca por abranger muitos
produtores: P. expansum (Stocklein et al., 1993 e Dai et al., 2005), P. citrinum
(Miranda et al., 1999), P. wortmanii (Costa e Peralta, 1999), P. chrysogenum
(Manuel et al., 2000), P. aurantiogriseum (Limaa et al., 2004). A maioria das
7

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

espcies saprfita e geralmente encontrada no solo, vegetais podres, sementes


e gros (Jesus et al., 1999). Apresenta como caractersticas principais: colnia
radialmente sulcada, velutinosa, miclio branco, condiognese moderada de cor
verde-acizentada. A Figura 2.1 apresenta algumas caractersticas do fungo
Penicillium verrucosum microrganismo utilizado para o desenvolvimento deste
trabalho sendo este utilizado tambm por Pinheiro, 2006 na produo de lipases
por fermentao submersa, o qual obteve atividade lipsica na ordem de 2 U/mL.

Figura 2.1. Caractersticas do fungo Penicillium verrucosum.


Cabe salientar que dentre as enzimas hidrolticas de maior interesse
esto as lipases, que so biocatalisadores versteis capazes de catalisar
diferentes reaes, tanto em meio aquoso como em meio orgnico, com teor de
gua restrito. Entre as lipases de vegetais, animais e microbianas estas ltimas
so as mais utilizadas e, na sua grande maioria, no so nocivas sade
humana (Carvalho et al., 2005).
Alm disto, as lipases microbianas so freqentemente mais utilizadas
que as derivadas de plantas ou animais devido grande variedade de
atividades catalticas disponveis, a facilidade de manipulao gentica, por ser
uma fonte regular devido ausncia de flutuao sazonal e o rpido
crescimento do microrganismo em resduos. As enzimas microbianas so
tambm mais estveis do que as enzimas de plantas e animais e sua produo
mais conveniente e mais segura (Hasan et al., 2006).

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

Dependendo da fonte, as lipases podem ter massa molecular variando de


20 a 75 kDa, atividade em pH entre 4 a 9 e em temperaturas variando desde a
ambiente at 70C. So geralmente estveis em solues aquosas neutras
temperatura ambiente apresentando, em sua maioria, uma atividade tima na
faixa de temperatura entre 30 e 40C. Contudo, sua termoestabilidade varia
consideravelmente em funo da origem, sendo as lipases microbianas as que
possuem maior estabilidade trmica (Castro, et al., 2004).
Dentre os processos de produo destes biocatalisadores destaca-se a
fermentao em estado slido pela srie de vantagens que apresenta. Tal
processo ser detalhado a seguir, tambm em funo de ter sido a tcnica
utilizada para a produo de lipase de Penicillium verrucosum, objeto de estudo
deste trabalho.
2.4. PRODUO DE ENZIMAS POR FERMENTAO EM ESTADO SLIDO
A tcnica da Fermentao em Estado Slido (FES) envolve o crescimento e
o metabolismo dos microrganismos em slidos midos sem a presena de gua
livre. Dentre as vantagens apresentadas por esta tcnica pode-se citar a economia
de espao necessria para a fermentao, simplicidade dos meios de
fermentao, os equipamentos utilizados para a fermentao so simples e de
fcil controle, altos rendimentos de produo, menor demanda de energia, entre
outras (Mahadik et al., 2002).
Uma das principais caractersticas da FES a utilizao de substratos com
baixa atividade de gua. Somente os fungos filamentosos e leveduras, baseandose na classificao terica, seriam microrganismos capazes de se desenvolver na
FES (Pandey, 2003).
As condies de crescimento da FES aproximam-se do habitat natural de
fungos filamentosos, o que facilita o crescimento deste no substrato slido e a
produo de grandes quantidades de enzimas. Os resduos gerados nos
processos agroindustriais podem ser usados como substrato para o crescimento
celular. A matria orgnica presente neste material usada como fonte de energia

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

para o crescimento e o carbono para a sntese de biomassa celular e dos produtos


do metabolismo microbiano (Silva et al., 2005).
Outras vantagens apresentadas pela FES so a superior produtividade, a
pequena quantidade de gua presente no resduo e facilidade de recuperao do
produto. Porm, a FES geralmente lenta, em funo da barreira transferncia
de massa gerada durante a fermentao. Entretanto, os processos metablicos
dos microrganismos so influenciados pela mudana de temperatura, de pH, de
substrato, do ndice de umidade, do fornecimento de ar, da concentrao de
inculo, etc., sendo que estas circunstncias variam extensamente de espcie
para espcie. Assim, torna-se muito importante saber as condies ambientais
dos microrganismos para a mxima produo (Ellaiah et al., 2004).
A Fermentao em Estado Slido apresenta outras caractersticas tais
como (Bianchi et al., 2001; Sato e Sudo, 1999; Palma et al., 2000; Gervais e Molin,
2003):
A reduo da umidade do meio provocada pelo calor gerado durante o
processo de crescimento e metabolismo do microrganismo devido elevao
de temperatura gerada;
O cultivo geralmente estacionrio, devido dificuldade de agitao do meio. A
agitao pode causar danos s clulas em alguns casos;
Pode-se adicionar nutrientes suplementares ao substrato slido;
O volume de meio reacional reduzido, implicando em um menor investimento
capital em bioreatores;
Altos rendimentos quanto formao de metablitos e simplicidade nas etapas
de purificao, pois os produtos esto concentrados no lquido da extrao;
Os esporos dos microrganismos podem ser utilizados diretamente na
inoculao, evitando etapas prvias como pr-cultivo que envolvem grandes
volumes de meio e tanques para seu desenvolvimento.
Na FES a seleo de um substrato apropriado para a fermentao um
dos fatores crticos e envolve assim a seleo de um grande nmero de resduos
agroindustriais que favoream o crescimento microbiano (Ellaiah et al., 2004).

10

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

Tabela 2.1. Fontes de carbono (substrato principal) utilizadas para Fermentao


em Estado Slido.
Autor/ ano

Substratos

Silva et al., 2000; Ellaiah et al., 2004

farelo de trigo

Ellaiah et al., 2004

farelo de arroz

Domingues et al., 2003

farelo de cevada

Cordova et al., 1998; Ellaiah et al., 2004

bagao de cana-de-acar

(Benjamin e Pandey, 2000

torta de coco

Vargas, 2004; Pinheiro, 2006

torta de soja

Palma et al., 2000; Gombert et al., 1999;


Castilho et al., 2000

torta de babau

A temperatura e tempo de fermentao so bastante variveis, dependendo


do microrganismo este pode variar de 1 a 7 dias, e a temperatura de 20 a 40C. O
equipamento utilizado para a fermentao composto por cmaras de
fermentao de volume definido, com controle de temperatura e porcentagem de
umidade do meio. Em escala laboratorial so utilizadas bandejas menores ou
placas de Petri, que so acondicionadas nas cmaras (Alonso, 2001).
Alm e imediatamente aps a obteno de condies de processo
(temperatura e umidade) ideais para a mxima produo de enzimas por FES,
de fundamental importncia a otimizao das condies de extrao, pois atravs
desta etapa pode-se definir as condies que conduzam mxima atividade
enzimtica, conhecer as faixas de atuao das lipases e, conseqentemente,
definir as suas possveis aplicaes.
Alm disso, o extrato obtido geralmente possui maior estabilidade quando
comparado torta fermentada, facilitando a aplicabilidade da enzima bruta em
processos, bem como as etapas posteriores de purificao e imobilizao. No
entanto, poucos so os trabalhos apresentados na literatura concernentes

11

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

otimizao das condies de extrao para lipases obtidas por FES, sendo esta
etapa tambm efetuada durante o desenvolvimento desta pesquisa.
Apenas como referencial terico, Vikineswary et al. (2006) encontraram
como condies timas de extrao de lacase produzida por Pycnoporus
sanguineus pH de 5,0 em 252C, na qual a atividade encontrada foi de 46,5 U/g
de substrato.
Castilho et al. (2000) em seu estudo para a otimizao das condies de
extrao de pectinases obtidas de Aspergillus niger, definiram o uso do tampo de
acetato pH 4,4 e a temperatura de 35C como ideais.
2.5. CONCENTRAO DE LIPASES
A etapa de purificao importante para a obteno de enzimas com alto
grau de pureza e com maiores nveis de atividade enzimtica. O processo de
purificao fundamental na obteno e aplicao industrial de uma enzima. Aps
a fermentao, a enzima encontra-se no meio contendo uma srie de outros
compostos que no so de interesse (Maldonado, 2006).
A precipitao normalmente utilizada como etapa inicial de isolamento,
sendo o fracionamento com sulfato de amnio o mtodo mais empregado
(Martins, 2001). Esta metodologia consiste em uma das tcnicas de concentrao
de protenas, para separao das mesmas dos outros compostos do meio. A
concentrao pela adio de sais, como sulfato de amnio, baseia-se no aumento
da fora inica, de tal forma que as molculas proticas se agregam e precipitam.
O sal adicionado ao sobrenadante at uma porcentagem de saturao em que a
enzima de interesse precipitada e separada por centrifugao. A composio do
extrato, sua concentrao e temperatura podem influenciar a precipitao, no caso
das enzimas a temperatura deve ser mantida baixa (4C). A adio do sal deve
ser lenta e sob agitao para favorecer a homogeneidade. Aps a centrifugao o
precipitado deve ser redissolvido em tampo adequado, utilizando-se um volume
de aproximadamente duas vezes o volume de precipitado (Borzani et al., 2001).

12

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

Independente da fonte de lipase ou da tcnica empregada, a pr-purificao


tem uma capacidade limitada no que se refere ao aumento da atividade
especfica, mantendo o aumento sempre dentro de uma faixa (Koblitz, 2003).
Na literatura so relatados vrios trabalhos sobre precipitao de lipases
com sulfato de amnio, como pode ser observado na Tabela 2.1.
Tabela 2.2. Atividades especficas obtidas na precipitao com sulfato de amnio
relatadas na literatura.
Autor/ ano/ saturao

Benjamin e Pandey
(2000) (20% a100%)
Bacha et al. (2005) (60%)
Sharma et al. (2002)
(30% a 70%)
Kanwar et al. (2002)
(60%)
Shu et al. (2006) (70%)

Fonte

Candida rugosa
lipase de pncreas
de avestruz

Bacillus sp. RSJ 1


Pseudomonas
Antrodia
cinnamomea

Kakugawa et al. (2002)

Kurtzmanomyces

(80%)

sp. I 11

Pastore et al. (2003)


(70%)
Jesus et al. (1999) (80%)
Abbas et al. (2002) (75%)

Rhizopus sp
Penicillium
restrictum
Mucor sp

Atividade do

Atividade

extrato

especfica (U/mg

enzimtico

de protena)

18,14 U/mL

3,88

116000 U

521

2425 U

44,82

14,750 U

19,46

188,7 U

12,7

4,860 U

3,52

135600 U

103

31,038 U

14,1

118099 U

129

13

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

2.6. IMOBILIZAO DE LIPASES


As enzimas esto sujeitas inativao por fatores qumicos, fsicos ou
biolgicos, podendo ocorrer quando estocadas ou durante o uso. Para que a
catlise seja eficiente em um determinado processo, h necessidade de proteger
as enzimas da interao com o solvente, meio no qual realizada a reao, pois o
mesmo poderia provocar a inativao, impossibilitando a catlise da reao.
Frente a este problema, a tcnica da imobilizao utilizada para fornecer
estabilidade s enzimas e facilitar sua recuperao e reutilizao (Villeneuve et al.
2000).
O principal interesse em imobilizar uma enzima obter um biocatalisador
com atividade e estabilidade que no sejam afetadas durante o processo, em
comparao sua forma livre. Idealmente, a enzima imobilizada dever exibir uma
atividade cataltica superior. Alm disso, no devero ocorrer alteraes
estruturais, bem como modificaes no stio ativo. A imobilizao pode inibir ou
aumentar a atividade e estabilidade da enzima, porm no existe uma regra que
prediga a manuteno destes parmetros aps o processo de imobilizao (DallaVecchia et al., 2004).
A imobilizao pode ocorrer atravs da adsoro ou ligao em um material
insolvel, pelo uso de um reagente multifuncional atravs de ligaes cruzadas,
confinamento em matrizes formadas por gis polimricos ou encapsulao atravs
de uma membrana polimrica. A Figura 2.2 mostra, esquematicamente, a
classificao dos mtodos utilizados para imobilizao de enzimas (Dalla-Vecchia
et al., 2004).

14

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

Figura 2.2. Classificao dos mtodos utilizados para imobilizao de enzimas


(Dalla-Vecchia et al., 2004).
O mtodo de imobilizao por adsoro ainda o mais comum. Este
apresenta baixo custo, poucos efeitos deletrios para atividade e seletividade da
enzima. A enzima imobilizada em um suporte slido por ligaes de baixa
energia, tais como interao de Van der Waals ou hidrofbicas, ligaes de
hidrognio e inicas, entre outras. Vrios materiais podem ser usados para este
propsito e a escolha de um deles depende de suas propriedades, como fora
mecnica, estabilidade fsica e qumica, carter hidrofbico/hidroflico, capacidade
de adsoro de enzimas e custo. O sucesso e a eficincia da adsoro de uma
enzima em um suporte, que em geral na superfcie, dependem de vrios
parmetros, tais como tamanho da protena a ser adsorvida, rea superficial do
adsorvente e, principalmente, da porosidade e tamanho dos poros (Villeneuve et
al., 2000).
As imobilizaes por adsoro so usualmente realizadas pela incubao
do suporte e da enzima em tampo ou pela precipitao da lipase com solventes,
como acetona, sobre a superfcie do suporte. Ao contrrio do que ocorre com

15

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

outras protenas, a adsoro de lipases favorecida em meios com baixa fora


inica (Bastida et al., 1998).
prefervel o emprego de suportes hidrofbicos em relao aos suportes
hidroflicos para a imobilizao de lipases devido tendncia dos suportes
hidroflicos competirem pela gua disponvel no meio reacional. Alm disto, a
quantidade de enzimas adsorvidas em tais suportes geralmente maior e so
obtidas atividades enzimticas mais elevadas. As resinas polimricas como
Accurel EP 100 (atualmente Accurel MP 1000), constitudas por polipropileno, e
materiais contendo grupos hidrfobos de ligaes como octil-agarose so
exemplos de suportes que vm se destacando como sendo apropriados
imobilizao das lipases (Villeneuve et al., 2000).
Dentre os trabalhos encontrados na literatura pode-se citar o de Kaewthong
et al. (2005) os quais, imobilizando a lipase PS (Amano) em diferentes suportes,
obtiveram rendimentos de 37,16% utilizando Accurel EP100 (<200 m), na
imobilizao em Accurel EP 100 (200-400 m) o rendimento encontrado foi de
31,10%, em carbonato de clcio obtiveram rendimento de 0,79%, em Celite
rendimento de 3,56%, em Slica Gel o rendimento foi de 6,42% e em Carvo
Ativado obteve rendimento de 0,36%. J Bryjak e Trochimczuk (2006), na
imobilizao de lipase de Candida rugosa por adsoro em suportes acrlicos,
encontraram rendimento mximo de 25,4%. Em termos de reteno de atividade,
Knezevic et al. (2002), imobilizando lipases de Candida rugosa em diferentes
concentraes de alginato, obtiveram reteno mxima de 79,99%.

2.7. CARACTERIZAO PARCIAL DE LIPASES


As lipases constituem o mais importante grupo de enzimas com valor
biotecnolgico, por causa da versatilidade de aplicaes possveis e facilidade de
produo em grandes quantidades (Hasan et al., 2006). Neste sentido, a
caracterizao destas enzimas (extrato bruto, extrato concentrado, enzima
purificada ou enzima imobilizada) de suma importncia para o estabelecimento
das condies de aplicao, como temperatura e pH timos (Alonso, 2001) e a

16

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

estabilidade da atividade enzimtica em funo da temperatura e do pH bem como


durante seu armazenamento a baixas temperaturas.
Alguns trabalhos apresentados na literatura demonstram que as faixas de
atuao de lipases em funo do pH e da temperatura podem variar de acordo,
principalmente, com o microrganismo utilizado, tornando esta etapa fundamental
aps a otimizao da produo de determinada lipase.
Neste sentido, Shu et al. (2006) estudando a caracterizao de lipase de
Antrodia cinnamomea encontraram uma temperatura tima de 45C e pH de 8,0.
Martins (2001) determinou como tima a mesma temperatura e pH de 9,0 para
lipase de Yarrowia lipolytica. Pastore et al. (2003) determinaram 40C e pH entre
6,0 e 6,5 como sendo a temperatura e o pH timos em seu estudo da
caracterizao de lipase de Rhizopus sp. Pinheiro (2006), estudando a
caracterizao de lipase de Penicillium verrucosum, determinou como temperatura
tima 44C e pH timo de 7,0. Benjamin e Pandey (2000) relataram que uma das
trs formas de distintas lipases produzidas por Candida rugosa apresentou
atividade tima em pH 7,0 e temperatura de 40C.

2.8. CONSIDERAES FINAIS


Como pde ser observado na reviso da literatura apresentada, as lipases
de

origem

microbiana

apresentam

um

grande

potencial

de

aplicaes

biotecnolgicas.
O conhecimento das caractersticas da lipase produzida como condies de
extrao, pH e temperaturas timas de atuao e estabilidade quando
armazenadas a baixas temperaturas so de extrema importncia para determinar
suas possveis aplicaes.
A concentrao da lipase utilizada como uma etapa inicial de isolamento,
sendo a concentrao com sulfato de amnio a mais utilizada, para
posteriormente purificar e/ou imobilizar as enzimas em suportes de material
insolvel como resina polimrica (Accurel EP100) e Carvo Ativo pelo processo de

17

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

adsoro, obtendo-se assim enzimas mais estveis, facilitando sua recuperao e


reutilizao.
Portanto, de grande valia, aps a otimizao do processo de produo, o
estudo das condies de extrao, concentrao, caracterizao e imobilizao da
lipase produzida. Com base nestes aspectos, lacuna encontrada na literatura e
vislumbrando a aplicao industrial da lipase de Penicillium verrucosum produzida
por FES utilizando farelo de soja como substrato, o presente trabalho teve por
objetivo geral investigar estas importantes etapas de processo.

18

Captulo 3 Material e Mtodos

3 MATERIAL E MTODOS
Neste captulo sero descritos os materiais, procedimentos experimentais e
a metodologia analtica utilizados para o desenvolvimento do estudo relacionado
otimizao da extrao, concentrao, imobilizao e caracterizao parcial da
lipase produzida por FES utilizando P. verrucosum.
3.1. MATERIAIS
Os principais reagentes, meios de cultura e suportes para a imobilizao da
lipase utilizados no decorrer deste trabalho foram:

Acetona (Quimex);

cido Clordrico 37% (Quimex);

cido Fosfrico 85% (Nuclear);

Acetonitrila (Vetec);

Accurel EP 100 (Nortec);

Biftalato de Potssio (Nuclear);

Brilliant Blue (Laomasi Brilhante Blue) (Sigma);

Carvo Ativo (ANF Carvorite);

CaCl2 (Nuclear);

Etanol 95% (Quimex);

Farelo de Soja (Olfar);

Fenolftalena (Nuclear);

Fosfato de Sdio Monobsico (Vetec);

Fosfato de Sdio Bibsico (Vetec);

Goma Arbica (Synth);

Hidrxido de Sdio (Nuclear);

Meio PDA (Composio aps o preparo (39 g em 1 L): 4 g/L de infuso de


batata, 20 g/L de glicose e 15 g/L de gar) (Acumedia);

Membranas de Dilise (Inlab);

Metanol seco (Max. 0,005% H2O) (Merck);


19

Captulo 3 Material e Mtodos

leo de Oliva (Arisco);

Sulfato de Amnio (Synth);

Soluo de Karl Fisher (CombiTitrant 5) (Merck);

Tween 80 (Vetec);

Tris-HCl (Tris (hydroxymethil-aminomethan) (Merck);

-nitrofenol (Merck);

-nitrofenol butirato (Sigma).

3.2. EQUIPAMENTOS
Os principais equipamentos utilizados neste estudo foram os seguintes:

Agitador Orbital (Marconi MA-410);

Agitador Magntico (Fisatom);

Banho Agitador (Nova tica);

Bomba a Vcuo (Marconi);

Balana Analtica (Bel Engineering);

Cmara de Fluxo Laminar (Pachane);

Congelador -80C (CFC FREE);

Centrfugas Refrigeradas (Nova Tcnica);

Dessecador;

Espectrofotmetro (Agilent Tecnologies 8453);

Freezer Frost Free (Brastemp);

Germinadora para Incubao (Tecnal TE-401);

Karl Fisher (Mettler Toledo DL 50 Graphix);

Liofilizador (Edwards);

Mixer Manual (Black & Decker);

Potencimetro (Gehaka);

Refrigerador (Brastemp).

20

Captulo 3 Material e Mtodos

3.3. MTODOS
Nesta seo ser apresentada a metodologia empregada para a produo,
concentrao, imobilizao e caracterizao parcial da lipase produzida por FES
utilizando P. verrucosum.
3.3.1. PRODUO DE LIPASES POR FERMENTAO EM ESTADO SLIDO
3.3.1.1. Microrganismo
O fungo Penicillium verrucosum usado

para

estudo

foi

isolado

previamente por Freire (1996) em solo brasileiro. Este microrganismo foi prselecionado como bom produtor de lipases atravs das metodologias de seleo
em meio slido e lquido descritas na literatura (Freire, 1996). Este fungo tem sido
permanentemente estocado em glicerol, slica e meio slido recoberto com leo
mineral sob refrigerao. A propagao de esporos para posterior fermentao foi
feita por um perodo de 7 dias a 27,5C.
3.3.1.2. Inculo
O meio (Potato Dextrose Agar PDA) para o inculo era constitudo por
PDA 3,9% (m/v) e gua destilada. Aps a solubilizao completa do componente,
100 mL de meio foram transferidos para um Erlenmeyer de 500 mL e ento
autoclavados a 121C por 30 minutos.
Do tubo estoque, retirou-se uma alada e transferiu-se para um tubo de
ensaio contendo 10 mL de soluo de Tween 80. Aps a homogeneizao retirouse 0,30 mL contendo uma concentrao de esporos de 4 X 108 esporos/g e
inoculou-se nos erlenmeyers j resfriados, mantendo-se em cmara de
germinao a 27,5C por 7 dias (Vargas, 2004). O recolhimento de esporos foi
feito adicionando-se 10 mL de soluo Tween 80 (0,1% v/v) e prolas de vidro
estreis ao Erlenmeyer. Retirou-se 1 mL da soluo contendo esporos, este
volume foi transferido para um tubo de 9 mL de soluo de Tween 80 at diluio
10-3 podendo estes ser estocados a 4C, no mximo, 15 dias.

21

Captulo 3 Material e Mtodos

3.3.1.3. Preparo dos Meios de Cultivo


O substrato utilizado em todos os experimentos de fermentao em meio
slido constituiu de farelo de soja obtido no moinho Olfar (Erechim-RS) o qual foi
peneirado (Tyler 35-60) e armazenado em freezer at o momento da sua
utilizao, sendo que a fermentao em meio slido foi realizada em bqueres de
polipropileno de 500 mL tampados com manta acrlica, de acordo com a Figura
3.1.
Em cada bquer eram colocados 10 g de farelo de soja e a adio de
9,6mL de gua por gotejamento manual com auxlio de pipeta graduada de forma
que toda a rea do farelo fosse recoberta obtendo-se um percentual de umidade
de 50%. Os bqueres eram autoclavados a 121C por 15 minutos e, aps
resfriamento, inoculava-se a suspenso de esporos previamente diluda at
concentrao de esporos desejada (4 x 108 esporos/g) (Pinheiro, 2006).

Figura 3.1. Bqueres utilizados para a FES do farelo de soja utilizando Penicillium
verrucosum
3.3.1.4. Preparo das Amostras
Aps 48 horas de fermentao na cmara de germinao a 27,5C
(Pinheiro, 2006) as amostras foram maceradas em cmara de fluxo e colocadas
em Erlenmeyers de 250 mL a adicionados 45 mL de tampo fosfato de sdio 100

22

Captulo 3 Material e Mtodos

mM pH 7,0. Efetuou-se, ento, a incubao em agitador orbital temperatura de


37C e velocidade de agitao de 150 rpm por 30 minutos. Em seguida era feita a
extrao da frao lquida por prensagem manual em filtro e o sobrenadante era
utilizado para a dosagem da atividade de hidrlise das amostras.

3.3.1.5. Atividade de Hidrlise


Como substrato para dosagem da atividade de hidrlise foi utilizado leo de
oliva (10% m/v) emulsionado com goma arbica (5% m/v) em tampo fosfato de
sdio 100 mM pH 7,0. Para a medida da atividade de hidrlise nas etapas da
otimizao da extrao e estabilidade do extrato bruto e da torta em temperatura
de congelamento, 18 mL desta emulso contidos em Erlenmeyers de 125 mL
foram adicionados 2 mL da amostra. J para a medida da atividade nas etapas de
concentrao, estabilidade do extrato concentrado precipitado em temperatura de
congelamento e caracterizao em termos de pH e temperatura timos a 20 mL
desta emulso foram adicionados 0,10 g de amostra.
Aps este procedimento, o meio reacional era incubado por 15 minutos a
37C e 150 rpm e, a seguir a reao era interrompida e os cidos graxos extrados
pela adio de 20 mL de uma soluo de acetona/etanol (1:1 v/v). Os cidos
graxos eram, ento, titulados com uma soluo de NaOH (0,05 M) at pH 11.
Os brancos reacionais eram preparados colocando-se acetona/etanol aps
a incubao em agitador orbital e ento se acrescentava os 2 mL ou 0,1 g de
amostra, realizando-se, em seguida, a titulao. As dosagens da atividade foram
feitas em duplicata e a mdia aritmtica dos valores encontrados foi utilizada para
o clculo da atividade de hidrlise.
Uma unidade de atividade hidroltica foi definida como a quantidade de
enzima que libera 1mmol de cido graxo por minuto nas condies descritas
acima, podendo ser determinada atravs da Equao 3.1 (Leal, 2000).

A=

(Va Vb ).M .1000


t .Vc

(3.1)

23

Captulo 3 Material e Mtodos

onde:
A= Atividade de hidrlise (U/mL ou U/g de subtrato);
Va= Volume da amostra titulada (mL);
Vb= Volume do branco titulado (mL);
Vc= Volume da amostra usada na reao (mL) ou massa de amostra
utilizada na reao (g);
t= Tempo de reao (minutos);
M= Molaridade da soluo de NaOH.
3.3.2. OTIMIZAO DAS CONDIES DE EXTRAO
Na determinao das condies de extrao da lipase produzida por
Penicillium verrucosum em FES, foi realizado um planejamento fatorial completo
22 com dois pontos axiais para cada varivel independente e triplicata do ponto
central, totalizando 11 experimentos. As faixas de pH e temperatura estudadas
so apresentadas na Tabela 3.1. Todos os experimentos foram realizados em
duplicata e os resultados referem-se mdia aritmtica dos mesmos.
Tabela 3.1. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para
otimizao das condies de extrao.
Variveis/Nveis

Temperatura

pH

-1,41

30

4,88

-1

32

5,50

37

7,00

42

8,50

1,41

44

9,11

Para a realizao da extrao, a torta de soja fermentada era colocada em


Erlenmeyers e eram adicionados 45 mL de tampo fosfato de sdio com pH prestabelecido no planejamento de experimentos. Os frascos permaneciam em

24

Captulo 3 Material e Mtodos

agitador orbital por 30 minutos a 150 rpm nas temperaturas tambm avaliadas
segundo metodologia de planejamento experimental, sendo efetuada aps este
procedimento, a medida da atividade de hidrlise, como descrito anteriormente.
3.3.3. CONCENTRAO DO EXTRATO ENZIMTICO
3.3.3.1. Precipitao com sulfato de amnio
Para a determinao da melhor condio de concentrao do extrato
enzimtico, foram realizados planejamentos experimentais fatoriais completos 22
seqenciais, onde foram estudados a saturao do sulfato de amnio (%) e o
tempo de precipitao, conforme apresentados nas Tabelas 3.2 e 3.3.
Tabela 3.2. Variveis e nveis estudados no primeiro planejamento fatorial
completo 22 para a concentrao do extrato enzimtico obtido por P. verrucosum.
Variveis/Nveis

% saturao

Tempo (h)

-1

40

70

10

100

14

Tabela 3.3. Variveis e nveis estudados no segundo planejamento fatorial


completo 22 para a concentrao do extrato enzimtico obtido por P. verrucosum.
Nveis

% saturao

Tempo (h)

-1,41

32

-1

40

60

80

12

1,41

88

13

25

Captulo 3 Material e Mtodos

Aps otimizada a condio de extrao, 150 mL deste extrato enzimtico foi


colocado em bqueres de 500 mL e acrescentou-se sulfato de amnio at a
saturao desejada, determinada no planejamento experimental. Esta etapa foi
realizada em agitador magntico em banho de gelo (4C) com controle de pH (7,0)
ajustado com adio de NaOH 20% at completa dissoluo do sal.
O extrato era ento colocado em tubos de centrfuga e permanecia pelo
tempo determinado no planejamento a -10C para a precipitao da amostra.
Decorrido

este

tempo

de

precipitao,

as

amostras

eram

ento

centrifugadas a 4C, 8000 rpm por 30 minutos. O sobrenadante era descartado e o


precipitado removido com quantidade mnima de tampo fosfato de sdio 100 mM
pH 7,0 (Shu et al., 2006).
As amostras foram ento congeladas a -80C e liofilizadas por 12 horas at
peso constante. Estas foram armazenadas em geladeira para posterior medida de
atividade hidroltica e protena pelo mtodo de Bradford (Bradford, 1976).
Para a determinao de protenas pelo mtodo de Bradford era utilizado
Reagente de Bradford e uma curva padro de albumina (1 mg/mL) em tampo
fosfato de sdio 0,1 M pH 6,5, preparado conforme descrito no Anexo I.
Para a medida de protena eram utilizadas diversas diluies: amostra
bruta, 3X, 5X, 10X e 25X, as quais eram lidas em espectrofotmetro a 595 nm.
Para cada diluio era pesada uma amostra de aproximadamente 4 mg de
slido. A amostra era diluda em 200 L de tampo fosfato de sdio pH 7,0 e
deste, ento, retirados os 100 L utilizados para a leitura de absorbncia, sendo
que a concentrao de protena era calculada conforme Equao 3.5:

[ ] prt. =

Abs.
. 10 . d
fator

(3.5)

onde:
[ ] prt= Concentrao de protena (mg prot./mL);
Abs= Absorbncia lida nas amostras a 595nm;
d= Diluio das amostras;
fator = valor obtido na curva de calibrao.
26

Captulo 3 Material e Mtodos

3.3.3.2. Dilise do Extrato Enzimtico Concentrado


Aps a concentrao da amostras foi realizada a dilise das mesmas em
tampo Tris-HCl 50 mM pH 7,0 por 24 horas utilizando membranas de dilise
33X21 mm, previamente preparadas conforme descrito no Anexo II.
Com o intuito de verificar alguns parmetros desta etapa, foram realizados
experimentos adicionando CaCl2 nas concentraes de 0%, 0,5%, 1%, 5% e 10%
ao tampo Tris-HCl 50 mM pH 7,0, substituio do tampo Tris-HCl por tampo
fosfato de sdio 100 mM pH 7,0, sendo que estes permaneceram por 24 horas em
temperatura ambiente e sob refrigerao.
Decorridas as 24 horas, as amostras foram congeladas a -80C e
posteriormente liofilizadas e, ento, era medida a atividade de hidrlise, conforme
metodologia descrita anteriormente.
3.3.4. IMOBILIZAO DAS LIPASES CONCENTRADAS
O extrato concentrado na condio maximizada foi imobilizado utilizando o
princpio de adsoro. Neste sentido, dois suportes foram utilizados, resina
polimrica (Accurel EP 100) e Carvo Ativo, cuja ficha tcnica apresentada no
Anexo III.
Para a imobilizao da enzima, 1 g de suporte resina polimrica (Accurel
EP 100) foi embebido em 10 mL de etanol, sendo esta soluo mantida por 30
minutos em contato sob agitao. Posteriormente, o etanol foi removido e o
suporte lavado sucessivas vezes com gua destilada. O objetivo deste
procedimento foi o deslocamento do ar existente no interior do suporte para
permitir o acesso de solues contendo a enzima. Na imobilizao com Carvo
Ativo esta etapa no foi realizada.
Aos suportes previamente preparados adicionou-se 50 mL de uma soluo
enzimtica contendo 3 g de enzima precipitada em 60 mL de tampo fosfato de
sdio 0,05 M, a qual foi mantida sob agitao magntica em temperatura de 5C
(banho de gelo) por 2 horas. Esta metodologia foi definida aps ensaios
preliminares nos quais verificou-se que para a imobilizao do extrato enzimtico
27

Captulo 3 Material e Mtodos

era necessria uma atividade especfica mnima para garantir a eficincia da


adsoro.
Em tempos de 0, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 minutos foram retiradas
alquotas de 250 L para posterior medida de protena e construo de um grfico
do teor de protena em funo do tempo de reao e clculo do rendimento da
imobilizao, de acordo com a Equao 3.4. A medida de protena foi feita pelo
mtodo de Bradford, conforme descrito anteriormente.
Foram medidas tambm as atividades de hidrlise da soluo de entrada e
soluo de sada, conforme metodologia descrita a seguir, e clculo da reteno
durante a imobilizao atravs das Equaes 3.5 e 3.6.

(% ) =

Ps
x 100
Po

(3.4)

onde:
= Rendimento (%);
Ps= Quantidade de protena absorvida (diferena entre a inicial e a estvel);
Po= Quantidade de protena utilizada na imobilizao (soluo de entrada).

Ra (% ) =

As x 100
Ar

(3.5)

onde:
Ra= Reteno (%);
As= Atividade Real (atividade da enzima imobilizada) (U);
Ar= Atividade Terica (U) (Equao 3.6).

Ar = Ae As

(3.6)

onde:

28

Captulo 3 Material e Mtodos

Ae= Atividade de entrada (U);


As= Atividade de sada (U).
Aps o trmino do processo de adsoro, as amostras foram filtradas a
vcuo e permaneceram por 48 horas em dessecador. Em seguida, foram medidas
a atividade de hidrlise das enzimas imobilizadas e o contedo de gua das
mesmas por aparelho Karl Fisher. Foi medida tambm a protena da soluo de
entrada e de sada e da enzima imobilizada pelo mtodo de Bradford, sendo que
foi acrescentada 0,1% de amostra para a enzima imobilizada com Carvo Ativo e
2% para a imobilizada em resina polimrica (Accurel EP 100) em relao ao total
de reagente utilizado para a anlise. Estas concentraes foram determinadas em
testes preliminares realizados.
A metodologia utilizada para medida da atividade de hidrlise da enzima
imobilizada baseou-se na formao de um produto cromforo (-nitro fenol) a
partir da reao de hidrlise do -nitrofenil butirato catalisada por lipases. A
utilizao deste mtodo deveu-se ao fato da necessidade de um mtodo com
maior sensibilidade de deteco da atividade hidroltica das amostras (Bastida et
al., 1998).
Para a determinao da atividade de hidrlise por este mtodo
primeiramente foi construda uma curva de calibrao a partir do -nitrofenol,
conforme Anexo IV. Como substrato para a medida da atividade de hidrlise foi
utilizado reagente -nitrofenol butirato, preparado conforme descrito no Anexo
IV.
A reao se processou em banho agitado 37C e 150 rpm, no qual eram
colocados tubos de ensaio contendo 1,968 mL de tampo fosfato de sdio 25 mM
mais 16 L de -nitrofenolbutirato e, aps, eram acrescentados 16 L de extrato
enzimtico. O meio reacional permaneceu nestas condies por 0, 1, 2, 3, 5, 7 e
10 minutos. Decorrido o tempo de reao, as amostras eram colocadas na cubeta
e feita a leitura em espectrofotmetro 348 nm. Para as enzimas imobilizadas
eram acrescentadas 1% m/v de extrato enzimtico, de acordo com testes
preliminares.

29

Captulo 3 Material e Mtodos

Aps realizadas as leituras foram construdos grficos da absorbncia em


funo do tempo de reao para obteno do fator da curva a ser utilizado para o
clculo da atividade de hidrlise, conforme Equao 3.7.

A=

(F

. VF . 1000
(CC . VA )

(3.7)

onde:
A= Atividade de hidrlise (U);
F= Fator da curva obtido do grfico ABS com tempo;
VF= Volume total (amostra + tampo + substrato) (2mL);
CC= Coeficiente da curva de Calibrao;
VA= Volume da Alquota (substrato).
A partir dos valores de atividade de hidrlise e protena das amostras foi
calculada a atividade especfica do extrato enzimtico imobilizado, conforme
Equao 3.8.

Ae =
onde:

AH
P

(3.8)

Ae= Atividade especfica (U/ mg de protena);


AH= Atividade de hidrlise (U);
P= Protena (mg de protena).

3.3.5. CARACTERIZAO PARCIAL DA LIPASE DE Penicillium verrucosum


A caracterizao das enzimas (extrato bruto, extrato concentrado, enzima
purificada ou enzima imobilizada) de suma importncia para o estabelecimento
das condies de aplicao, como temperatura e pH timos e a estabilidade da
atividade enzimtica durante seu armazenamento a baixas temperaturas, uma vez
que tais condies podem ter uma grande variao de acordo com o
microrganismo e os meios de produo utilizados.
30

Captulo 3 Material e Mtodos

3.3.5.1. Temperatura e pH timos do extrato enzimtico concentrado


A caracterizao parcial do extrato bruto obtido por Penicillium verrucosum
em FES em termos de temperatura e pH timos foi definida anteriormente por
Pinheiro (2006).
Na determinao dos valores timos de pH e temperatura para a atividade
lipsica do extrato enzimtico concentrado, foi realizado um planejamento fatorial
completo 22 com dois pontos axiais para cada varivel independente e triplicata do
ponto central, totalizando 11 experimentos. Preparou-se a emulso para medida
da atividade lipsica em diferentes pH e as amostras foram incubadas em
diferentes temperaturas por 15 min a 150 rpm em agitador orbital. As faixas de pH
e temperatura estudadas esto apresentadas na Tabela 3.4. Todos os
experimentos foram realizados em duplicata.
Tabela 3.4. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para
determinao do pH e temperatura timos.
Variveis/Nveis

Temperatura (C)

pH

-1,41

30

4,88

-1

32

5,50

37

7,00

42

8,50

1,41

44

9,11

3.3.5.2. Estabilidade da Torta de Soja Fermentada, do Extrato Enzimtico


Bruto e da Lipase Concentrada a baixas temperaturas.
Aps o perodo de fermentao foram armazenadas amostras de 3 g da
torta em congelador (-10C) e ento realizada a extrao e medida de atividade de

31

Captulo 3 Material e Mtodos

hidrlise, como descrita anteriormente, nos tempos 0, 48 h e a cada 7 dias, a fim


de acompanhar a estabilidade da atividade da enzima.
Para a determinao da estabilidade do extrato enzimtico este foi extrado
segundo metodologia descrita anteriormente e, ento, separadas amostras de 10
mL, sendo a atividade medida nos tempos estudados para a torta fermentada.
Aps a concentrao da enzima com sulfato de amnio na condio
maximizada, os extratos foram armazenados (amostras de 0,1 g) temperatura de
4C e -10C, sendo medida a atividade de hidrlise (como descrito anteriormente)
nos tempos 0, 48 h e a cada 7 dias, a fim de acompanhar a estabilidade da
atividade da lipase concentrada.

32

Captulo 4 Resultados e Discusso

4 RESULTADOS E DISCUSSO
Neste captulo sero apresentados e discutidos os resultados obtidos ao
longo dos processos de otimizao da extrao, precipitao com sulfato de
amnio, imobilizao com os diferentes agentes imobilizantes, bem como
caracterizao parcial e estabilidade em temperatura de congelamento dos
extratos enzimticos obtidos a partir de Penicillium verrucosum por fermentao
em estado slido.
4.1 OTIMIZAO DAS CONDIES DE EXTRAO DA LIPASE
Nesta etapa, avaliou-se o efeito da temperatura e do pH na extrao da
lipase produzida por fermentao em estado slido, sendo o conhecimento destas
variveis de grande importncia na determinao das condies de operao em
possveis aplicaes desta enzima. Foi utilizado um planejamento fatorial
completo com pontos axiais para verificao dos efeitos de primeira e segunda
ordem bem como as interaes entre as variveis. A Tabela 4.1 apresenta a
matriz do planejamento com os valores reais, codificados e as respostas para a
atividade lipsica.
Verifica-se que as maiores atividades enzimticas encontradas nesta etapa
do estudo esto no ensaio correspondente ao ponto central (temperatura de 37C
e pH 7,0), a qual ficou em torno de 4 U/mL.
As condies encontradas como timas para a extrao de lipases
produzidas por Penicillium verrucosum em FES neste trabalho so semelhantes
quelas utilizadas por Palma et al. (2000) e Gombert et al. (1999) para a extrao
de lipase de Penicillium restrictum utilizando torta de babau como substrato e por
Pinheiro (2006) na extrao de lipase de Penicillium verrucosum utilizando farelo
de soja como substrato. Cavalcanti et al. (2005) utilizaram pH 7,0 e temperatura
de 35C para a extrao de lipases de Penicillium simplicissimum utilizando torta
de babau como substrato. importante salientar que em todos os trabalhos
citados as condies de extrao no foram estudadas de maneira sistemtica,

33

Captulo 4 Resultados e Discusso

como foi conduzida neste trabalho. Os valores citados anteriormente referem-se


condies utilizadas na extrao.
Tabela 4.1. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipsica) para extrao da lipase de P.
verrucosum.
Ensaio

Temperatura (C)

pH

Atividade Lipsica (U/mL)

-1 (32)

-1 (5,5)

1,20

+1 (42)

-1 (5,5)

3,40

-1 (32)

+1 (8,5)

3,40

+1 (42)

+1 (8,5)

2,80

5*

0 (37)

0 (7,0)

3,75

6*

0 (37)

0 (7,0)

4,06

7*

0 (37)

0 (7,0)

4,37

0 (37)

-1,41 (4,9)

0,41

0 (37)

+1,41 (9,1)

1,88

10

-1,41 (29,9)

0 (7,0)

1,80

11

+1,41 (44,1)

0 (7,0)

1,72

* Ponto central

Os resultados encontrados representam condies timas de atuao para


a maioria das enzimas, bem como condies amenas o que favorecer a
manuteno da atividade enzimtica quando submetida aos processos industriais.
Os resultados apresentados na Tabela 4.1 foram tratados estatisticamente
e um modelo emprico foi obtido (Equao 4.1). O modelo codificado otimizado
para a extrao da enzima em funo da temperatura e do pH foi validado pela
anlise de varincia apresentada na Tabela 4.2. Verifica-se que o coeficiente de
correlao obtido (0,95) e o valor de F (F calculado maior que o F tabelado)
validaram estatisticamente o modelo (p<0,05) e permitiram a construo da
superfcie de resposta e curva de contorno apresentadas na Figura 4.1.

Atividade lipsica (U / mL) = 4,1 0,46 pH 1,14 pH 2 0,83 T 2 0,7 pH T

(4.1)

34

Captulo 4 Resultados e Discusso

Tabela 4.2. Anlise de varincia para a atividade lipsica do extrato enzimtico


bruto obtido por Penicillium verrucosum.
Fonte de

Soma

Graus de

Mdia

Variao

Quadrtica

Liberdade

Quadrtica

Regresso

12,56

3,14

Resduo

4,04

0,67

Falta de ajuste

3,85

Erro puro

0,19

Total

16,60

10

F calculado

4,66

Coeficiente de correlao: R=0,87, F0,95;4;6 =4,53

Figura 4.1. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica


obtida na otimizao das condies de extrao da lipase produzida por FES.

35

Captulo 4 Resultados e Discusso

Na Figura 4.1 pode-se verificar uma regio tima compreendida entre pH


6,5 e 8,3 e temperatura de 35C e 40C na qual encontram-se os melhores
resultados para atividade lipsica, conforme modelo matemtico obtido. Observase tambm que em condies extremas, dentro da faixa investigada, de pH e
temperatura tem-se uma tendncia de inibio da atividade da enzima.
Esta regio tima obtida de extrema importncia do ponto de vista de
aplicao industrial, pois permite que a extrao seja realizada em uma faixa de
pH e temperatura permitindo oscilaes do processo em termos destas variveis
sem conseqncias na atividade enzimtica. Estes resultados devem ser
novamente confrontados com a literatura para que seja salientada a importncia
de um estudo sistemtico frente ao uso direto de condies fixas de extrao.
Para cada enzima, dependendo do microrganismo, substrato e condies de
produo utilizadas, uma diferente faixa tima de extrao ser obtida. Porm, a
grande importncia deste estudo refere-se a mostrar uma metodologia para definir
condies de extrao, a qual pode ser usada para outras condies, enzimas e
substratos.
4.2. CONCENTRAO DO EXTRATO ENZIMTICO
Na precipitao com sulfato de amnio ocorre a concentrao das enzimas,
o que facilitar a posterior imobilizao destas. A determinao da melhor
condio de precipitao da lipase produzida por Penicillium verrucosum foi
avaliada atravs da realizao de um planejamento fatorial 22 completo, sendo a
matriz do planejamento experimental bem como os resultados de atividade
especfica obtidos apresentados na Tabela 4.3.
Pode-se verificar que o ensaio 1, o qual corresponde aos menores nveis de
saturao e tempo de precipitao (40% e 6 horas, respectivamente) apresentou a
maior atividade especfica (1,24 U/mg). J na condio de maior saturao e
tempo de precipitao (100% e 14 horas, respectivamente) observa-se perda total
da atividade enzimtica.
Observando os resultados relatados na literatura, verifica-se que resultados
prximos foram encontrados por Benjamin e Pandey (2000) precipitando lipase de
36

Captulo 4 Resultados e Discusso

Candida rugosa em sulfato de amnio com saturao variando de 20% a 100%


(3,88 U/mg) e Kakugawa et al., (2002) na precipitao de lipase de
Kurtzmanomyces sp. I 11 (3,52 U/mg).
Tabela 4.3. Matriz do primeiro planejamento experimental realizado (valores
codificados e reais com as respostas da atividade especfica) para precipitao do
extrato enzimtico obtido por FES utilizando P. verrucosum.
Ensaio

Saturao (%)
(S)

Tempo (h) (t)

Atividade Especfica
aps Precipitao (U/mg)

-1 (40)

-1 (6)

1,24

+1 (100)

-1 (6)

1,10

-1 (40)

+1 (14)

0,81

+1 (100)

+1 (14)

0,00

5*

0 (70)

0 (10)

1,03

6*

0 (70)

0 (10)

0,94

7*

0 (70)

0 (10)

0,88

* Ponto central

Atividades especficas mais altas foram encontradas por Shu et al. (2006)
(12,7 U/mg) precipitando lipase de Antrodia cinnamomea com 70% de saturao.
Jesus et al., (1999) obtiveram 14,1 U/mg com 80% de saturao na precipitao
de lipases de Penicillium restrictum e Kanwar et al., (2002), precipitando lipase de
Pseudomonas com 60% de saturao, atingiram uma atividade mxima de 19,46
U/mg. Sharma et al., (2002) obtiveram 44,82 U/mg na precipitao de lipases de
Bacillus sp. RSJ 1 com 30% a 70% de saturao. Pastore et al., (2003), na
precipitao de lipase de Rhizopus sp. com 70% de saturao, alcanaram 103
U/mg. Abbas et al., (2002), na precipitao de lipases de Mucor sp. com 75% de
saturao, atingiram 129 U/mg e Bacha et al. (2005) encontraram 521 U/mg de
atividade precipitando lipase de pncreas de avestruz 60% de saturao .
Observa-se, portanto, que h uma diferena significativa entre as atividades
encontradas na literatura, variando de acordo com a condio experimental e o
37

Captulo 4 Resultados e Discusso

microrganismo utilizado, o que justifica o confronto criterioso que deve ser


realizado entre os resultados obtidos neste trabalho e os citados na literatura.
Os resultados apresentados na Tabela 4.3 permitiram a obteno de um
modelo codificado para a atividade especfica do extrato enzimtico em funo da
saturao e tempo, o qual est apresentado na Equao 4.2. Para verificao da
validade do modelo foi realizada a anlise de varincia apresentada na Tabela 4.4.
Verifica-se que o coeficiente de correlao obtido (0,95) e o teste F (F calculado
maior que o F tabelado) validaram estatisticamente o modelo (p<0,05) e
permitiram a construo da superfcie de resposta e curva de contorno
apresentadas na Figura 4.2.

Atividade lipsica (U / mg) = 0,86 0,24 S 0,39 t 0,17 S t

(4.2)

Tabela 4.4. Anlise de varincia para a atividade lipsica do extrato enzimtico


concentrado obtido por Penicillium verrucosum.
Fonte de Variao

Soma

Graus de

Mdia

Quadrtica

Liberdade

Quadrtica

Regresso

0,92

0,31

Resduo

0,06

0,02

Falta de ajuste

0,05

Erro puro

0,01

Total

0,98

F calculado
15,83

Coeficiente de correlao: R=0,96, F0,95;3;3 =9,27

Atravs da Figura 4.2 verifica-se que, diminuindo a porcentagem de


saturao e o tempo de precipitao, h uma tendncia ao incremento da
atividade especfica obtida, o que representa reduo de custos de processo
devido as menores quantidades de sulfato de amnio utilizadas e menores tempos
de reao. Convm salientar ainda a forte interao existente entre as duas
variveis estudadas na resposta atividade especfica.

38

Captulo 4 Resultados e Discusso

Figura 4.2. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica


obtida no estudo da condio de precipitao por sulfato de amnio por FES.
Aps a precipitao foi realizada a dilise das amostras com o intuito de
remover possveis impurezas presentes na enzima concentrada. A determinao
da atividade especfica da lipase produzida por Penicillium verrucosum foi avaliada
atravs da realizao de um planejamento fatorial 22 completo, sendo a matriz do
planejamento experimental bem como os resultados de atividade especfica
obtidos apresentados na Tabela 4.5.

39

Captulo 4 Resultados e Discusso

Tabela 4.5. Matriz do primeiro planejamento experimental realizado (valores


codificados e reais com as respostas da atividade especfica) para a avaliao do
efeito da dilise das lipases de Penicillium verrucosum.
Atividade Especfica

Ensaio

Saturao (%)

Tempo (h)

-1 (40)

-1 (6)

0,83

+1 (100)

-1 (6)

0,29

-1 (40)

+1 (14)

0,53

+1 (100)

+1 (14)

0,09

5*

0 (70)

0 (10)

0,69

6*

0 (70)

0 (10)

0,66

7*

0 (70)

0 (10)

aps Dilise (U/mg)

* Ponto central

Nos resultados obtidos nos experimentos com dilise verifica-se que o


ensaio 1 foi o que apresentou a maior atividade especfica (0,83 U/mg) embora
inferior ao maior resultado obtido no planejamento experimental realizado sem
dilise (1,24 U/mg), conforme pode ser observado na Tabela 4.3. Os dados foram
tratados estatisticamente e obteve-se o Grfico de Pareto apresentado na Figura
4.3.

Figura 4.3. Grfico de Pareto da precipitao do extrato enzimtico produzido por


FES em funo das variveis estudadas aps dilise.
40

Captulo 4 Resultados e Discusso

Observa-se que apenas a saturao apresentou efeito significativo negativo


o que refora a concluso de que diminuindo a saturao h uma tendncia a
aumentar a atividade especfica da enzima.
Com base nas concluses obtidas no primeiro planejamento realizou-se um
segundo planejamento de experimentos completo com pontos axiais para
verificao dos efeitos de primeira e segunda ordem bem como as interaes
entre as variveis para a precipitao e dilise das amostras. A matriz
experimental bem como os resultados obtidos para atividade especfica aps
precipitao esto apresentados na Tabela 4.6.
Tabela 4.6. Matriz do segundo planejamento experimental realizado (valores
codificados e reais com as respostas da atividade especfica) para precipitao do
extrato enzimtico.
Atividade Especfica

Ensaio

Saturao (%)

Tempo (h)

-1 (40)

-1 (6)

0,48

+1 (80)

-1 (6)

0,31

-1 (40)

+1 (12)

0,52

+1 (80)

+1 (12)

0,65

5*

0 (60)

0 (9)

0,69

6*

0 (60)

0 (9)

0,61

7*

0 (60)

0 (9)

0,71

-1,41 (31,8)

0 (9)

0,63

+1,41 (88,2)

0 (9)

0,33

10

0 (60)

-1,41 (5)

0,91

11

0 (60)

-1,41 (13)

0,67

aps Precipitao (U/mg)

* Ponto central

Verifica-se pelos resultados obtidos que o ensaio 10, correspondente s


condies de 60% de saturao e 5 horas de precipitao, apresentou a maior
atividade especfica aps precipitao (0,91 U/mg). Salienta-se tambm que
41

Captulo 4 Resultados e Discusso

novamente nos nveis superiores de saturao (80%) foram obtidas as menores


atividades especficas. Estes resultados esto condizentes com a literatura a qual
apresenta valores de 60-70% de saturao como os mais adequados para
concentrao da enzima produzida em diferentes substratos por diferentes
microrganismos (Shu et al., 2006; Kanwar, et al., 2002; Sharma, et al., 2002;
Pastore, et al., 2003).
Aps anlise estatstica do planejamento experimental realizado no foi
possvel a validao de um modelo emprico que descrevesse a atividade lipsica
em funo das variveis independentes estudadas. Construiu-se ento o Grfico
de Pareto apresentado na Figura 4.4.
Atravs da Figura 4.4 verifica-se que apenas a saturao apresentou efeito
significativo negativo, reforando a concluso de que menores concentraes de
saturao resultam em maiores atividades especficas aps a precipitao.

Figura 4.4. Grfico de Pareto da precipitao do extrato enzimtico produzido por


FES em funo das variveis estudadas aps precipitao.
Na Tabela 4.7 apresentada a matriz experimental bem como os
resultados encontrados no segundo planejamento realizado aps a dilise.

42

Captulo 4 Resultados e Discusso

Tabela 4.7. Matriz do segundo planejamento experimental realizado (valores


codificados e reais com as respostas da atividade especfica mdia) para a
avaliao do efeito da dilise do extrato enzimtico precipitado.
Ensaio

Saturao (%)
(S)

Tempo (h) (t)

Atividade Especfica
aps Dilise (U/mg)

-1 (40)

-1 (6)

0,23

+1 (80)

-1 (6)

0,39

-1 (40)

+1 (12)

0,58

+1 (80)

+1 (12)

0,51

5*

0 (60)

0 (9)

0,79

6*

0 (60)

0 (9)

0,63

7*

0 (60)

0 (9)

0,67

-1,41 (31,8)

0 (9)

0,45

+1,41 (88,2)

0 (9)

0,56

10

0 (60)

-1,41 (5)

0,51

11

0 (60)

-1,41 (13)

0,74

* Ponto central

Aps a realizao da dilise destas amostras verificou-se, pelos resultados


apresentados na Tabela 4.7, que o ensaio 5, o qual corresponde ao ponto central
(60% saturao e 9 horas de precipitao), foi a que apresentou a maior atividade
especfica (0,79 U/mg). Os resultados obtidos permitiram a obteno de um
modelo codificado para o estudo da precipitao da lipase, o qual est
apresentado na Equao 4.3 em funo da saturao e tempo de precipitao. O
modelo foi validado pela anlise de varincia apresentada na Tabela 4.8. Verificase que o coeficiente de correlao obtido (0,90) e o teste F (F calculado maior que
o F tabelado) validaram estatisticamente o modelo (p<0,1) e permitiram a
construo da superfcie de resposta e curva de contorno apresentadas na Figura
4.5.

43

Captulo 4 Resultados e Discusso

Atividade lipsica (U / mg ) = 0,63 0,11S 2 + 0,10 t

(4.3)

Tabela 4.8. Anlise de varincia para a atividade lipsica do extrato enzimtico


concentrado obtido por Penicillium verrucosum, aps dilise.
Fonte de Variao

Soma

Graus

de Mdia

Quadrtica

Liberdade

Quadrtica

Regresso

0,16

0,08

Resduo

0,11

0,01

Falta de ajuste

0,09

Erro puro

0,01

Total

0,26

10

F calculado
5,90

Coeficiente de correlao: R=0,77, F0,90;2;8 =3,11

Atravs da Figura 4.5 observa-se que, ao contrrio do caso anterior, a


regio compreendida entre 45% a 75% de saturao e tempos superiores a 10
horas de precipitao apresentou maiores atividades especficas aps dilise,
porm todos os resultados obtidos com a dilise foram menores que os obtidos
sem a dilise. Convm salientar que as maiores atividades especficas somente
sero obtidas em tempos superiores a 10 horas em condies intermedirias de
saturao, dentro da faixa estudada.
Observa-se que os resultados encontrados no estudo da precipitao da
lipase com sulfato de amnio foram menores que os reportados na literatura,
porm os resultados obtidos mostraram que no havia necessidade de realizao
da dilise no extrato enzimtico precipitado. Tendo em vista que o valor da
atividade especfica encontrada no primeiro planejamento sem dilise (1,24 0,05
U/mg) e o encontrado no segundo planejamento tambm sem dilise (0,91 0,16
U/mg) no apresentaram diferena significativa entre si pelo teste de Tukey
(p<0,05) optou-se por utilizar as condies do segundo planejamento (5 horas de
precipitao e 60% de saturao) para dar continuidade ao presente estudo, visto
que esta condio consiste em reduo do tempo de precipitao.

44

Captulo 4 Resultados e Discusso

Figura 4.5. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica


obtida na precipitao da lipase produzida por FES aps dilise.
Como possvel explicao para o fato dos resultados encontrados para a
atividade especfica da enzima aps a dilise em ambos planejamentos ser menor
que os resultados antes da dilise, sugere-se o fato de que as lipases estariam
perdendo ons clcio de sua estrutura durante a dilise, o que provocaria a perda
da atividade. Outro fator que poderia estar provocando esta queda seria o fato de
a dilise ter sido realizada temperatura ambiente. Props-se, ento, a realizao
de testes adicionando ao Tampo Tris-HCl 50 mM pH 7,0 variadas concentraes
de CaCl2 e tampo Fosfato de Sdio 100 mM pH 7,0 em substituio ao tampo
anterior, sendo os experimentos realizados a temperatura ambiente e sob
refrigerao.
45

Captulo 4 Resultados e Discusso

Os resultados foram analisados pelo Teste de Tukey e so apresentados


na Tabela 4.9. Tendo em vista que as amostras apresentaram diferena
significativa entre si e o maior resultado encontrado foi na amostra 2, precipitado
sem dilise, confirmou-se que a condio maximizada neste estudo foi 5 horas de
precipitao com sulfato de amnio a 60% de saturao, sem necessidade de
dilise, podendo esta precipitao ser realizada a temperatura ambiente (25 oC).
Tabela 4.9. Mdias da atividade especfica da lipases de P. verrucosum e Desvios
Padro encontrados na anlise dos resultados obtidos nos testes com dilise pelo
Teste de Tukey.
Amostra

Mdia* (U/mg)

Desvio Padro

1 (Extrato)

0,96

0,04

2 (Extrato Precip.)

1,61a

0,07

3 (Fosf. de sdio)

0,49c

0,02

4 (Fosf. de sdio Geld.)

0,46c,d

0,02

5 (Tris- HCl)

0,47c,e

0,02

6 (Tris-HCl Geld.)

0,50c

0,02

7 (Tris-HCl 0,5% CaCl2)

d,e

0,36

0,02

8 (Tris-HCl 0,5% CaCl2 Geld.)

0,14g

0,01

9 (Tris-HCl 1,0% CaCl2)

0,93b

0,02

10 (Tris-HCl 1,0% CaCl2 Geld.)

0,25

0,02

11 (Tris-HCl 5,0% CaCl2)

0,00

0,00

c,e

0,39

0,02

13 (Tris-HCl 10,0% CaCl2)

0,92b

0,04

14 (Tris-HCl 10,0% CaCl2 Geld.)

0,37d,e

0,02

12 (Tris-HCl 5,0% CaCl2 Geld.)

* Letras minsculas iguais no diferem entre si pelo Teste de Tukey (p<0,05),


*Geladeira (Geld).

46

Captulo 4 Resultados e Discusso

4.3. IMOBILIZAO DO EXTRATO ENZIMTICO PRODUZIDO POR FES

Os resultados obtidos na imobilizao da lipase produzida por FES


utilizando Penicillium verrucosum como microrganismo esto apresentados na
Tabela 4.10.
Tabela 4.10. Valores de Atividade Especfica, Reteno, Rendimento e Contedo
de gua na imobilizao da lipase produzida por FES utilizando Penicillium
verrucosum.
Accurel EP 100

Carvo Ativo

10,4 X 103

10,4 X 103

7,9 X 103

6 X 103

92,4 X 103

1,5 X 106

Reteno (Ra) (%)

368,130

382,516

Rendimento () (%)

11,74

30,42

Contedo de gua (%)

5,50

10,06

Atividade Especfica de Entrada


(U/mg de protena)
Atividade Especfica de Sada
(U/mg de protena)
Atividade Especfica Imobilizada
(U/mg de protena)

Nesta tabela pode-se observar que a enzima imobilizada com Carvo Ativo
apresentou melhores resultados em termos de atividade especfica (1533425,5
U/mg de protena), reteno (382,516%) e rendimento (30,42%). Estes resultados
so muitos promissores, pois o Carvo Ativo tem um baixo custo e existem poucos
relatos na literatura quanto ao uso deste suporte na imobilizao de lipases
(Kaewthong et al., 2005).
Observa-se que a reteno obtida em ambos os suporte utilizados foi maior
que 100%, significando que alm de imobilizar, devido afinidade da enzima pelo
suporte, pode ter ocorrido uma concentrao desta obtendo-se, portanto,
porcentagens de reteno na ordem de 300%.

47

Captulo 4 Resultados e Discusso

Com base nestes resultados pode-se observar que os mesmos foram


maiores que alguns reportados na literatura. Kaewthong et al. (2005), imobilizando
a lipase PS (Amano) em diferentes suportes, obteve rendimentos de 37,16% para
resina polimrica (Accurel EP100, <200 m). Quando esta mesma lipase foi
imobilizada em Accurel EP 100 (200-400 m) o rendimento encontrado foi de
31,10%, em carbonato de clcio 0,79%, 3,56% em Celite, 6,42% em Slica Gel e
0,36% em Carvo Ativado. J Bryjak e Trochimczuk (2006), na imobilizao de
lipase de Candida rugosa por adsoro em suportes acrlicos, encontraram
rendimento mximo de 25,4%, tambm menores que os encontrados no presente
estudo.
Em termos de reteno de atividade, Knezevic et al. (2002), imobilizando
lipases de Candida rugosa em diferentes concentraes de alginato, obtiveram
reteno mxima de 79,99%, sendo esta muito inferior que encontrada neste
estudo.
As enzimas imobilizadas em Accurel EP100 e Carvo Ativo podem ser
visualizadas na Figura 4.6.

Figura 4.6. Foto da enzima imobilizada com Accurel EP100 (direita) e Carvo Ativo
(esquerda).
O estudo de imobilizao de lipase produzidas por Penicillium verrucosum
em FES mostrou-se bastante relevante do ponto de vista do baixo custo de um
dos suportes utilizados (carvo ativo), bem como em funo dos altos valores de
reteno da enzima a este suporte.
48

Captulo 4 Resultados e Discusso

4.4 CARACTERIZAO PARCIAL DA LIPASE


4.4.1.

TEMPERATURA

pH

TIMOS

DO

EXTRATO

ENZIMTICO

CONCENTRADO
Como j citado no captulo anterior, a caracterizao parcial do extrato
bruto obtido por Penicillium verrucosum em FES em termos de temperatura e pH
timos foi definida anteriormente por Pinheiro (2006). Nesta etapa foram ento
avaliados a temperatura e pH timos do extrato enzimtico concentrado, nas
condies definidas e apresentadas anteriormente.
Para a determinao da temperatura e pH timos do extrato concentrado
por precipitao com sulfato de amnio, foi realizado um planejamento fatorial 22
completo com 4 pontos axiais e 3 pontos centrais, sendo a matriz do planejamento
experimentos bem como os resultados de atividade lipsica apresentados na
Tabela 4.11.
Tabela 4.11. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipsica) para caracterizao parcial do
extrato enzimtico concentrado.
Ensaio

pH

Temperatura (C)

Atividade Lipsica (U/g de


slido)

-1 (5,5)

-1 (32)

22,32

-1 (5,5)

+1 (42)

28,49

+1 (8,5)

-1 (32)

48,51

+1 (8,5)

+1 (42)

60,06

5*

0 (7,0)

0 (37)

44,93

6*

0 (7,0)

0 (37)

57,55

7*

0 (7,0)

0 (37)

41,78

-1,41 (4,9)

0 (37)

21,28

+1,41 (9,1)

0 (37)

59,12

10

0 (7,0)

-1,41 (30)

46,97

11

0 (7,0)

+1,41 (44)

40,81

* Ponto central

49

Captulo 4 Resultados e Discusso

Observa-se que o valor mximo da atividade enzimtica, 60,06 U/g, foi


encontrado no ensaio 4 que corresponde a um pH de 8,5 e temperatura de 42C,
sendo possvel observar tambm outras condies com altas atividades lipsicas.
O experimento utilizando pH 9,1 e temperatura de 37 oC resultou em uma
atividade de 59,12 U/g, bem como o experimento 6 que tambm ocasionou alta
atividade (57,55 U/g) na mesma temperatura citada anteriormente porm em pH
7,0. Menores atividades enzimticas foram obtidas nos menores pH estudados
(4,9 e 5,5)
Os resultados encontrados no estudo foram semelhantes aos resultados
encontrados por Shu et al. (2006) estudando a caracterizao de lipase bruta de
Antrodia cinnamomea, determinando como condies timas temperatura de 45C
e pH 8,0. Resultado semelhante tambm foi encontrado por Martins (2001) (45C
e pH de 9,0) para lipase bruta de Yarrowia lipolytica. Pinheiro (2006), estudando a
caracterizao do extrato bruto de Penicillium verrucosum, determinou como
temperatura tima 44C e pH timo de 7,0.
Benjamin e Pandey (2000) relataram que uma das trs formas de distintas
lipases bruta produzidas por Candida rugosa apresentou atividade tima em pH
7,0 e temperatura de 40C. Pastore et al. (2003) determinou 40C e pH entre 6,0 e
6,5 como sendo a temperatura e o pH timos em seu estudo da caracterizao de
lipase de Rhizopus sp.
A Tabela 4.12 apresenta a anlise de varincia para a atividade enzimtica
obtido nos nveis estudados. Verifica-se que o coeficiente de correlao e o F
calculado permitiram a validao do modelo codificado apresentado na Equao
4.4, a qual possibilitou a construo da superfcie de resposta e curva de contorno
apresentada na Figura 4.7.

Atividade lipsica (U / g de slido) = 42,89 + 13,93 pH

(4.4)

50

Captulo 4 Resultados e Discusso

Tabela 4.12. Anlise de varincia para a atividade lipsica na etapa de


caracterizao parcial do extrato enzimtico concentrado.
Fonte de

Soma

Graus de

Mdia

Variao

Quadrtica

Liberdade

Quadrtica

Regresso

1547,90

1547,90

Resduo

380,66

42,29

Falta de ajuste

241,36

Erro puro

139,29

Total

1928,56

10

F calculado
36,59

Coeficiente de correlao: R=0,90, F0,95;1;9 =5,12

Figura 4.7. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica


obtida na avaliao da temperatura e pH timos para o extrato enzimtico
concentrado.

51

Captulo 4 Resultados e Discusso

A Figura 4.7 mostra que a temperatura, dentro da faixa estudada, no


apresenta efeito na atividade enzimtica. J em relao ao pH nota-se que
maiores valores acarretam em maiores atividades enzimticas, independente da
temperatura.
Cabe salientar que, analisando de forma geral, os resultados obtidos na
determinao da temperatura e pH timos para o extrato enzimtico obtido a partir
de Penicillium verrucosum por FES concentrado com sulfato de amnio so
interessantes do ponto de vista de aplicabilidade, uma vez que a enzima mantm
sua atividade em uma ampla faixa de temperatura e pH.
4.4.2 ESTABILIDADE DA TORTA DE SOJA FERMENTADA, DO EXTRATO
BRUTO E DO EXTRATO CONCENTRADO ARMAZENADOS A BAIXAS
TEMPERATURAS
Embora no tenham sido encontrados relatos na literatura, uma
caracterstica muito importante e que deve ser avaliada a estabilidade da enzima
quando armazenada a baixas temperaturas, pois esta influenciar no tempo que a
enzima poder ser armazenada, mantendo suas caractersticas iniciais em termos
de atividade enzimtica.
A seguir sero relatados os comportamentos da torta fermentada, do
extrato enzimtico bruto e do extrato concentrado armazenados a baixas
temperaturas (-10C). No extrato enzimtico concentrado tambm foi avaliada a
atividade enzimtica em temperatura de armazenamento de 4C.

4.4.2.1. Estabilidade da torta de soja fermentada em temperatura de


congelamento
Na Figura 4.8 esto apresentados os resultados encontrados para o
acompanhamento da atividade lipsica da torta de soja fermentada durante o
armazenamento em congelador (-10C) durante 200 dias.

52

19
6

18
2

15
4

13
3

10
5

77

56

28

15

140
120
100
80
60
40
20
0
0

% da Ativ. Lipsica em
relao a Inicial

Captulo 4 Resultados e Discusso

Tempo (dias)
Figura 4.8. Grfico de Barras da estabilidade da torta de soja fermentada
armazenada em congelador (-10C).
Os resultados apresentados na Figura 4.8 demonstram que a atividade
lipsica da torta de soja fermentada armazenada em congelador apresentou um
aumento at o 28 dia de armazenamento, diminuindo aps este perodo, sendo
que aos 196 dias era de apenas 5% e aps 200 dias de armazenamento a torta
fermentada perdeu toda sua atividade.
Observa-se, portanto, que a torta de soja fermentada apresentou um
comportamento varivel em relao manuteno da sua atividade durante o
armazenamento. importante tambm frisar que a torta fermentada apresentou
boa

estabilidade,

pois

aos

56

dias

de

armazenamento

apresentava

aproximadamente 100% de atividade em relao atividade inicial.

4.4.2.2. Estabilidade do extrato enzimtico bruto em temperatura de


congelamento
Os resultados encontrados para o acompanhamento da atividade lipsica
do extrato enzimtico bruto aquoso quando armazenado em congelador durante
218 dias esto apresentados na Figura 4.9.

53

120
100
80
60
40
20

8
21

19

17

16

14

13

11

10

91

77

63

42

28

0
0

% da Ativ. Lipsica em relao a


Inicial

Captulo 4 Resultados e Discusso

Tempo (dias)

Figura 4.9. Grfico de Barras da estabilidade do extrato enzimtico bruto aquoso


armazenado em congelador (-10C).
Atravs da anlise da Figura 4.9 verifica-se que a atividade lipsica do
extrato enzimtico bruto diminuiu at o 98 dia de armazenamento. Aps este
perodo a atividade aumentou, sendo este aumento mantido durante os demais
dias de armazenamento. Este aumento pode ser explicado pelo fato de que
algumas enzimas so capazes de se regenerar.
Cabe salientar que o extrato bruto enzimtico apresentou uma boa
estabilidade, pois ao 218 dias de armazenamento apresentou 80% da atividade
lipsica em relao atividade inicial.

4.4.2.3. Estabilidade do extrato enzimtico concentrado armazenado em


geladeira
A estabilidade da atividade lipsica do extrato enzimtico concentrado
armazenado em geladeira foi acompanhado durante 91 dias. Os resultados
encontrados esto apresentados na Figura 4.10.

54

% da Ativ. Lipsica em relao a


Inicial

Captulo 4 Resultados e Discusso

120
100
80
60
40
20
0
0

14

21

28

35

42

49

56

70

77

84

91

Tempo (dias)

Figura 4.10. Grfico de Barras da estabilidade do extrato enzimtico concentrado


armazenado em geladeira (4C).
Observa-se por esta figura que ocorreu um decrscimo (65%) na atividade
lipsica aos 7 dias de armazenamento em relao atividade inicial e logo aps,
um aumento foi observado, mantendo 64% da atividade em relao atividade
inicial, ndice mantido praticamente constante durante os demais dias de
armazenamento.
Aps 91 dias de armazenamento em geladeira, pode-se observar que o
extrato enzimtico concentrado manteve 100% de sua atividade original. Cabe
salientar que o estudo, em funo dos resultados obtidos encontra-se ainda em
andamento.
4.4.2.4. Estabilidade do extrato enzimtico concentrado armazenado em
congelador
Os resultados encontrados para o acompanhamento da atividade lipsica
do extrato concentrado armazenado em congelador durante 91 dias esto
apresentados na Figura 4.11.

55

% da Ativ. Lipsica em relao a


Inicial

Captulo 4 Resultados e Discusso

140
120
100
80
60
40
20
0
0

14

21

28

35

42

49

63

70

84

91

Tempo (dias)

Figura 4.11. Grfico de Barras da estabilidade do extrato enzimtico concentrado


armazenado em congelador (-10C).
Pela anlise desta figura pode-se observar que a atividade do extrato
enzimtico concentrado armazenado em congelador teve uma pequena queda at
o 28 dia de armazenamento (25%), aumentando do 35 ao 49 dia, diminuindo
novamente aps este perodo at 91 dia de armazenamento.
Em comparao com o extrato concentrado armazenado em geladeira
pode-se concluir que no houve uma grande diferena entre o comportamento
apresentado por ambos. As duas formas de armazenamento apresentaram, em
alguns momentos, diminuio da atividade e, em outros, aumento da atividade
sendo que ao final mantiveram ndices semelhantes ao da atividade inicial. Mais
uma vez cabe salientar a necessidade de um acompanhamento por um perodo de
tempo maior para poder se estabelecer o tempo que o extrato enzimtico
concentrado mantm-se estvel e, conseqentemente, suas caractersticas iniciais
permaneam constantes, em termos de atividade de hidrlise.
Como consideraes finais em relao ao estudo de estabilidade conclui-se
que a torta fermentada pode ser armazenada em temperatura de congelamento
at 56 dias sem perda de atividade de hidrlise. J o extrato bruto apresentou um
comportamento bastante distinto ao da torta, pois houve um aumento de atividade
ao

final

do

perodo

de

acompanhamento,

indicando

possibilidade

de

armazenamento deste em temperatura de congelamento at 218 dias.


56

Captulo 4 Resultados e Discusso

O estudo realizado com o extrato enzimtico concentrado em geladeira e


congelador indicou que tanto a 4oC como a -10oC a atividade de hidrlise
praticamente a mesma da inicial aps 91 dias.

57

Captulo 5 Concluses e Sugestes

5 CONCLUSES E SUGESTES
5.1 CONCLUSES
Aps a realizao deste estudo pode-se concluir que:

A metodologia de planejamento de experimentos mostrou-se til na

otimizao da extrao da lipase produzida por Penicillium verrucosum em FES. A


condio otimizada foi usando tampo fosfato de sdio 100mM pH 7,0 e
temperatura de 37C atingindo-se uma atividade de 4 U/mL.

No estudo da concentrao do extrato enzimtico com sulfato de amnio a

condio de 60% de saturao por um perodo de 5 horas de precipitao foi


escolhida

como

maximizada

aps

realizao

de

dois planejamentos

experimentais seqenciais.

Nos experimentos realizados com dilise no foi observada diferena

significativa entre as amostras, optando-se por no realizar esta aps a


concentrao do extrato enzimtico.

Na imobilizao do extrato enzimtico concentrado de Penicillium

verrucosum obtido por FES os melhores resultados foram encontrados quando


este foi imobilizado em Carvo Ativo, sendo que, neste caso, para este a atividade
especfica foi de 1,53 X 106 U/mg de protena, rendimento de 30,42% e reteno
de 382,516%.

Aps

realizao

de

um

planejamento

de

experimentos

para

caracterizao parcial do extrato enzimtico concentrado em termos de


temperatura e pH timos a mxima atividade atingida foi de 60,06 U/g na
temperatura de 42C e pH 8,5.

Em relao ao estudo de estabilidade conclui-se que a torta fermentada

pode ser armazenada em temperatura de congelamento at 56 dias sem perda de


atividade de hidrlise.

O extrato bruto apresentou um comportamento bastante distinto ao da torta

de soja pois houve um aumento de atividade ao final do perodo de


58

Captulo 5 Concluses e Sugestes

acompanhamento,

indicando

possibilidade

de

armazenamento

deste

em

temperatura de congelamento at 218 dias.

O estudo realizado com o extrato enzimtico concentrado em geladeira e

congelador indicou que tanto 4 oC como a -10 oC a atividade de hidrlise


praticamente a mesma da inicial aps 91 dias.
5.2 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS
Com base nos resultados obtidos neste trabalho sugere-se para trabalhos
futuros:

Caracterizao parcial (temperatura e pH timos e de estabilidade e

estabilidade a baixas temperaturas) da enzima imobilizada;

Teste de imobilizao com outros suportes;

Aprimoramento da metodologia de medida de atividade da enzima

imobilizada testando, por exemplo, o uso de inibidores de reao.

Avaliao da atividade de quiralidade do extrato enzimtico livre e


imobilizado.

Acompanhamento da atividade hidroltica do extrato enzimtico submetido


alta presses.

Purificao do extrato enzimtico concentrado.


Aplicao do extrato enzimtico livre e imobilizado em reaes de interesse.

59

Captulo 6 Referncias Bibliogrficas

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67

Captulo 7 Anexos

7 ANEXOS
Anexo I
Reagente de Bradford
Para o preparo do reagente de Bradford, 100 mg de Laomassi Brilhante
Blue foram dissolvidos em 50 mL de etanol e transferidos a um balo volumtrico
de 1 L. Foram adicionados 100 mL de cido fosfrico 85%. A soluo resultante foi
diluda em gua destilada at o volume final de 1 L.
A soluo foi filtrada e transferida para um frasco mbar e identificado e foi
preparada uma curva padro de albumina, conforme apresentada na Tabela 7.1.
Tabela 7.1. Curva Padro Albumina utilizada para medida de protena pelo mtodo
de Bradford.
Tubo

Reag. Bradford Vol. Tampo pH 6,5 Vol. Soluo Padro mg Protena


(mL)

(L)

Alb. (L)

100

0,00

80

20

0,02

70

30

0,03

60

40

0,04

40

60

0,06

30

70

0,07

68

Captulo 7 Anexos

Anexo II
Preparo das Membranas de Dilise
O procedimento adotado para utilizao das membranas de dilise consistiu
em preparar 1 L de soluo de EDTA 1 mM com 2% de bicarbonato de sdio,
utilizando gua miliQ estril. A soluo teve seu pH ajustado para 7,98 8,0.
Ferveu-se por 10 minutos as membranas nesta soluo. Esperou-se esfriar e
lavou-se individualmente cada membrana com gua miliQ estril.
Aps preparou-se 1 L de soluo EDTA 1 mM com gua miliQ estril
ajustando o pH para 8,0. Ferveu-se por 10 minutos as membranas nesta soluo.
Deixou-se esfriar e guardou-se em geladeira.

69

Captulo 7 Anexos

Anexo III

Ficha Tcnica do Carvo Ativo


A Tabela 7.2 apresenta a caracterizao do carvo ativo utilizado como
suporte de imobilizao do extrato enzimtico obtido a partir de Penicillium
verrucosum por FES.

Tabela 7.2. Caractersticas Carvo Ativo ANF - Carvorite .


Aspecto

Pulverizado

Granulometria

38% a 45% retido pela malha de mesh 325

pH

5,0 a 6,5

Eficincia relativa

75%

Cinzas

5% a 7%

Densidade aparente

0,450 g/cm3

Umidade ao embalar

<4%

Filtrabilidade

tima

Fonte: Empresa Carvorite Irati/PR

70

Captulo 7 Anexos

Anexo IV
Curva de Calibrao Atividade Enzimtica do Extrato Enzimtico Imobilizado
A Tabela 7.3 apresenta a curva de calibrao para medida da atividade
enzimtica do extrato imobilizado, obtida a partir do -nitrofenol. Preparava-se
uma soluo de -nitrofenol adicionando-se 0,00811 g de -nitrofenol a 10,93 mL
de acetonitrila.
Tabela 7.3. Curva de Calibrao utilizada para medida da atividade de hidrlise do
extrato enzimtico imobilizado.
Ensaios

Sol. -nitrofenol (L)

gua (L)

Tampo Fosfato de sdio 25


mM (L)

0,000

1,050

1,95

0,005

1,045

1,95

0,010

1,040

1,95

0,015

1,035

1,95

0,020

1,030

1,95

0,025

1,025

1,95

0,030

1,020

1,95

Reagente -nitrofenol Butirato


O Reagente -nitrofenol Butirato foi preparado conforme descrito abaixo:
Peso Molecular (PM)-nitrofenol Butirato = 206,2 g/gmol

71

Captulo 7 Anexos

Densidade = 1,19 g/cm3

M =

massa
PM

massa = (0,05) x 209,2

massa = 10,46g
d=

massa
volume

1,19 =

10,46
volume

volume = 8,79mL

So necessrios 8,79 mL de -nitrofenol Butirato para 1000mL de soluo,


logo para 5 mL foram utilizados 0,0439 mL de -nitrofenol Butirato em 5 mL de
acetonitrila.

72