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TOTALES
OBJETIVO:
Determinar la presencia de Enterobacterias. Son indicadoras de
contaminacin fecal, por lo que se utilizan para ver la calidad
sanitaria de alimentos procesados. Un nmero elevado indica
elaboracin poco higinica y/o contaminacin despus de fabricacin.
En alimentos no procesados o con tratamientos insuficientes para
eliminar formas vegetativas se emplea como indicador de
contaminacin fecal: coliformes fecales o E.coli
La familia Enterobacteriaceae agrupa a microorganismos con las
siguientes caractersticas: bacilos, gram negativos, aerbios y
anaerbios facultativos, no esporulados, mviles por flagelos o
inmviles, fermetan la glucosa, reducen los nitratos a nitritos, oxidasa
negativo, crecen en medios que contienen sales biliares. Algunos
gneros fermentan la lactosa (Escherichia) y otros no (Salmonella y
Shigella)
FUNDAMENTO:
Identificacin de colonias tpicas en medio de cultivo solido
agar biliado rojo violeta glucosa (VRBG) sembrando en doble
capa. Las sales biliares y cristal violeta del medio inhiben el
crecimiento de flora competitiva. Todas las Enterobacterias fermentan
la glucosa con produccin de cido y esto se pone de manifiesto por
un viraje al rojo violeta y la precipitacin de las sales biliares produce
un halo violeta alrededor de las colonias.
MATERIAL:
-Stomacher,bolsa de Stomacher, pinza
-Balanza analtica
-Autoclave
-Estufa de
-Material uso
CLCULOS:
Previamente tenemos que preparar medio VRBG y Agua de Peptona
para diluciones.
Vamos a preparar 12tubos de VRBG a razn de 9ml por tubo, por lo
que necesitaremos 108ml. Vamos a preparar 150ml.
Seguimos las instrucciones del fabricante: Suspenda 41,5g del polvo
en 1L de agua purificada y hierva por no ms de 2minutos para
disolver completamente el polvo. No esterilice en autoclave
41,5g/1000ml x 150ml = 6,225g de VRBG y 150ml agua
destilada.
Vamos a preparar 6 tubos de Agua de Peptona(aunque solo vamos a
emplear 3)a razn de 9ml exactos por tubo, por lo que necesitaremos
54ml. Vamos a preparar 60ml.
Seguimos las instrucciones del fabricante: Aadir 15g a 1L de agua
destilada. Mezclar bien y distribuir en recipientes finales. Esterilizar en
autoclave a 121C, 15 minutos
15g/1000ml x 60ml = 0,9ml de agua de peptona y 60ml
agua destilada.
TCNICA:
A) PREPARAR EL VRBG:
1-Pesar 6,225g de
(previamente tarado)
polvo
VRBG
en
un
vaso
de
precipitado
RESULTADO:
Resultado recuento:>300UFC x
1000(inverso del factor de dilucin) = > 300.000UFC =
Incontables UFC/g muestra contaminada
con Citrobacter
Interpretacin: El nmero elevado indica elaboracin poco higinica o
contaminacin despus de fabricacin.(Es lgico, hemos contaminado
apropsito).Por el color y forma de estas colonias tpicas podemos
decir que las bacterias fermentan la glucosa y consideramos que son
sospechosas de pertenecer a la familia Enterobacteriaceae, pero es
necesario hacer unas pruebas de confirmacin.
EN TUBOS DE PCA EN
PRUEBAS DE CONFIRMACIN:
1-PRUEBA DE LA CITOCROMO-OXIDASA.
OBJETIVO:
Diferenciar colonias sospechosas de pertenecer a la familia
Enterobacteriaceae (todas oxidasa - ), e identificar las sospechosas
de pertenecer a otros gneros como Aeromonas, Pseudomonas,
Vibrio (en general +).
FUNDAMENTO:
Se investiga la presencia de la enzima citocromo-oxidasa. La prueba
se basa en la utilizacin de un reactivo (di o tetrametil pfenilendiamina. Reactivo de Kovacs) que en estado reducido es
incoloro, pero en presencia de esta enzima y de oxgeno se oxida y
forma azul de indofenol (azul-violeta)
p-fenilendiamina reducida (incolora) + 02 + citocromoxidasa azul
de indofenol oxidado (azul-violeta)
Esta reaccin acta en el ltimo eslabn de la cadena respiratoria
transfiriendo electrones desde un substrato al oxigeno dando lugar a
la formacin de agua.
MATERIAL Y REACTIVOS:
-Tubo de PCA en pico de flauta con cultivo sospechoso de fam
Enterobacteriaceae
-Asa de siembra estril, de plstico
-Tiras reactivas, pinzas y porta limpio.
TCNICA:
1-Dejar atemperar el tubo de PCA resembrado
2-Leer instrucciones del fabricante. (Cada marca comercial tiene su
tcnica y lectura)
3-Sacar una tira reactiva con ayuda de unas pinzas, cogindola por
el extremo y la colocamos sobre un porta limpio.
4-Con el asa de plstico estril, coger una colonia que est aislada y
depositarla en el otro extremo de la tira reactiva.
5-A los 10 segundos hacer la lectura del resultado: Si cambia
despus de 10 segundos indica oxidasa positivo, y si a los 10 minutos
no cambia de color indica oxidasa negativo.
Todos los pasos se hacen siempre cerca de la llama del mechero. Y la
tira utilizada se tratar como material contaminado por lo que habr
que meterla en una bolsa de autoclave para descontaminar, junto con
las placas, en el autoclave.
RESULTADO: No hay aparicin de color. Es oxidasa ( - )
Interpretacin: Se trata de bacterias que no tienen la enzima
citocromo-oxidasa y podemos afirmar que pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae.
OBSERVACIONES:
Para esta prueba son fundamentales algunas precauciones:
-Seguir las instrucciones del fabricante. Guardar las tiras siempre en
su bote y protegidas de la luz.
-Que la colonia se tome de un medio no coloreado, para que no
interfiera en la reaccin (por eso resembramos en PCA que no es
coloreado).
-Utilizar asa de plstico (estril y desechable), porque la de metal
puede interferir en la reaccin.
- Balanza, Agitador
- Mechero Bunsen.
- Material de uso
TCNICA:
1 Vamos a preparar el medio de cultivo Agar Hierro de Kligler (AHK)
en pico de flauta
Grupo 4Preparar 11 tubos. 11tubos x 10ml/tubo = 110ml; Vamos a
preparar 150ml.
Instrucciones del fabricante: Aadir 58g del polvo a 1L de agua
destilada y llevar a ebullicin. Distribuir en tubos y esterilizar a 121C
durante 15 minutos. Dejar solidificar con una corta cua y fondo
abundante.
la
familia