Variantes de PCR

L A B O R ATO RIO D E B I O LOG A MO L E CULA R

D R . J O R G E R A MI R O D O M NGUE Z R O D R I G UEZ

A L M A LO R E NA LUNA BECER R A

OBJETIVO

Mejorar el rendimiento o la
especificidad.
Amplificar molculas de RNA
Producir cadenas de hebra sencilla

PCR ANIDADA (NESTED PCR)

Se trabaja con cuatro cebadores, en una primera ronda
se amplifica de manera convencional con los dos
cebadores ms externos a la regin que se desea
amplificar.
El producto de este primer PCR se utiliza como molde
para una segunda ronda que utiliza cebadores internos a
la regin previamente amplificada.

Dos nuevos cebadores hibridan dentro del fragmento diana

amplificado por el prime par, dando como productos
fragmentos ms cortos pero ms especficos.
Las copias correctas de la primera diana contendrn ambas
secuencias complementarias a loas nuevos cebadores, a
diferencia de los productos no especficos generados en la
primera PCR.

Ventajas
o Mayor sensibilidad que la tcnica de PCR
estndar.
o Control de especificidad de la primera PCR
Desventajas
o Posibilidad aumentada de contaminacin, y
adems no permite cuantificar la cantidad inicial
de ADN molde presenta en la muestra analizada.

PCR INVERSA
Se emplea para clorar regiones desconocidas de DNA
situadas en posicin vecinal a secuencias diana conocida,

Es necesario cortar el DNA a ambos lados de la regin diana

con una enzima de restriccin de tal forma que los
extremos cohesivos resultantes puedan hibridarse entre si,
formando una molcula circular.

Es cerrada por una ligasa y se realiza la PCR con

cebadores que hibridan con los extremos 5 de la
secuencia conocida.

La elongacin se extiende alrededor del circulo.

PCR CON TRASCRIPTASA INVERSA (RT-PCR)

Amplificacin de mRNA a travs de su sntesis
previa de su cDNA, que despus ser amplificado
por PCR.
Permite estudiar la expresin de determinados
genes.

PCR TIEMPO REAL.

La PCR en tiempo real es una tcnica que combina la

amplificacin y la deteccin en un mismo paso, al
correlacionar el producto de la PCR de cada uno de los
ciclos con una seal de intensidad de fluorescencia.
Los productos de amplificacin se observan a medida
que transcurren los ciclos de la PCR.

Los fluorforos utilizados para seguir la

amplificacin del ADN durante la PCR en tiempo
real
pueden
ser
de
dos
tipos:
a) Fluorforos con afinidad por el ADN y
b) Sondas especficas para fragmentos del ADN,
es decir, que slo emiten fluorescencia cuando se
ha amplificado un fragmento del ADN de inters
(blanco).

Esta basado en:

La deteccin y cuantificacin de un reportero

fluorescente, cuya seal aumenta en proporcin
directa a la cantidad de producto de PCR en la
reaccin.
El empleo de una termociclador que tiene acoplado
un sistema de deteccin que es capaz de adquirir y
cuantificar la seal emitida por el reportero al final
de cada ciclo para cada muestra

PCR-RFLP ( P O L I MOR F IS MOS D E LO NG ITU D D E

F R AG ME NTO S D E R E S T R I CCIN ):

Mtodo que permite detectar

mutaciones,
combinando
una
amplificacin por PCR y una
posterior digestin con enzimas de
restriccin.
Permite
detectar
cambios en los tamaos de los
fragmentos de restriccin.

Bibliografa
L U QUE J ., HE R R A E Z A . , ( 20 0 0 ) B I O LO GIA MO L E CULA R E I NG E NIER IA G E NE TICA ,
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