UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN

MARCOS

FACULTAD DE QUMICA E INGENIERA QUMICA

DEPARTAMENTO ACADMICO DE QUMICA ORGANICA

PRODUCTOS NATURALES
EXTRACCIN, SEPARACIN Y ELUCIDACIN ESTRUCTURAL
DE DOS METABOLITOS SECUNDARIOS DEL ALGA MARINA
Bostrychia calliptera

PROFESORA: Tomas Chota, Gloria

ALUMNOS:
- Avendao Bendezu, Sandra Lucia... 09070146
- lvarez Chocce, Yris Gabriela.10070073
- Cabrera Rocha, Jorge Martin......09070048
1

- Zapata Fernndez, Eugenio.05070119

2016-II
l.0.- INTRODUCCION

Bostrychia Calliptera es un alga roja (Rhodophyta), cuyo estudio se llev a cabo en la

Baha de Buenaventura y la Ensenada de Tumaco (Costa Pacfica Colombiana),
durante los meses de Junio a Agosto para el anlisis de sus metabolitos se efectu
islamiento por medio de cromatografa liquida en columna y la elucidacin
estructural empleando RMN de dos metabolitos secundarios, Compuesto 1:
monoterpeno irregular. Compuesto 2: acido p- cumarico
Particularmente en las algas marinas se han encontrado grupos de metabolitos
como: diterpenos, eicosanoides, lecitinas, esteroles y alcaloides.
Investigaciones recientes han confirmado, que lo que hace interesante a los
metabolitos de las algas marinas es que muchos de ellos presentan novedosas
variaciones en su estructura qumica. Estas variaciones, son en la mayora de los
casos responsables de las diversas propiedades biomdicas que poseen las algas
marinas.

2.0.- SECCION EXPERIMENTAL

2.1. General:
Los espectros de RMN 1H, 13C, DEPT, HMQC, HMBC, COSY-45 fueron tomados en
un Espectrmetro Bruker AMX-400 MHz usando secuencia de pulsos estndar.
Como solvente de referencia para este anlisis espectroscpico se emple CDCl 3
cuyas resonancias caractersticas son (dH 7.25, dC 77.0). Los compuestos fueron
separados a travs de cromatografa lquida en columna utilizando como fase
estacionaria Gel de slice (Typ 60) y elucin en modo gradiente.

2.2. Proceso de Recoleccin:

Las muestras de B. calliptera, fueron recolectadas en la Baha de Buenaventura
(Valle del Cauca, Colombia, 3 54' N, y 77 5' W) entre los meses de Junio a Agosto.
Las muestras se lavaron con agua desmineralizada y se envolvieron en toallas de
papel humedecido con agua desmineralizada, se empacaron en bolsas de polietileno
y se transportaron al laboratorio de biologa marina de la Universidad del Valle
para su identificacin y conservacin a una temperatura de -6 C hasta el momento
de su extraccin.

2.3. Proceso de Extraccin:

Las muestras fueron transportadas al laboratorio de Qumica de Productos
Naturales de la Universidad del Cauca donde 5 kg. de Bostrychia calliptera
recolectados fueron secados a una temperatura de 40 C, obtenindose 2 kg. de alga
secos, los cuales se sometieron a un proceso de extraccin con una mezcla de
etanol:agua (90:10). El extracto etanolico:agua (29.775g) se fraccion inicialmente
con hexano (4x100 mL) (7.735 g), luego con cloruro de metileno (4x500 mL) (9.965 g)
y finalmente con etanol (3.900 g). Teniendo en cuenta la cantidad de muestra
obtenida en la fraccin de cloruro de metileno se decide abordar su separacin.

2.4. Proceso de Separacin:

La fraccin de cloruro de metileno (9.897 g) fue fraccionada por cromatografa
lquida en columna (CC) sobre Gel de silice usando como fase mvil hexano, acetato
de etilo y etanol, con elucin en gradiente, obteniendo: 1.084 g de subfraccin de
hexano (SFCH), 4.1700 g de subfraccin de acetato de etilo (SFCAE) y 0.735 g de
subfraccin de etanol (SFCE). La subfraccin de acetato de etilo present en
cromatografa en capa fina (CCF) desarrolla con fase mvil hexano: acetal de etilo
(7:5) la mayor cantidad de compuestos; igualmente se llevaron a cabo pruebas
fitoqumicas preliminares indicando la presencia de terpenos, saponinas y taninos.
1.577g de SFCAE se fraccionaron sobre Gel de slice mediante elucin en gradiente
empleando como solventes hexano, acetona, acetato de etilo y etanol en diferentes
proporciones, obtenindose ocho subfracciones. Posteriormente, dos de ellas fueron
sometidas a dos fraccionamientos bajo similares condiciones obtenindose las
fracciones SFCAE6,9,6 (13.4 mg , compuesto 1) y SFCAE6*-4 (6.60 mg, compuesto
2).

2.5.- Analisis Cromatogrfico

2.6.- Reacciones Qumicas de identificacin:

A.- Ensayo del Hidroxamato frrico:

La muestra se disuelve en etanol, se aade solucin de clorhidrato de hidroxilamina
y KOH. La mezcla se calienta hasta que aparezca una espuma de color rojizo. Se
enfra y se acidula con HCl. Se aade cloruro frrico y se forma
una coloracin violeta.

Esta prueba la dan positiva en general todas las sustancias con funcionalidad ster
o lactona como p.ej. las cumarinas, y se basa en la formacin de un complejo entre el
cido hidroxmico formado y el cloruro frrico.
La determinacin de cumarinas, en presencia de hidroxilamina hidroclrica y
tricloruro de hierro es bastante especfico para la identificacin de lactonas.

O-

Fe+3

+ NH OH HCl + KOH
2

Fe+
3

OH

+ FeCl3

B.- Reactivo de Folin Ciocalteu:

El reactivo de Folin-Ciocalteu (FCR), usado para la determinacin de monoterpenos
y fenoles totales. Los compuestos fenlicos reaccionan con el reactivo de FolinCiocalteu, a pH bsico, dando lugar a una coloracin azul. Este reactivo contiene
una mezcla de wolframato sdico y molibdato sdico en cido fosfrico y reacciona
con los compuestos fenlicos presentes en la muestra. El cido fosfomolibdotngstico
(formado por las dos sales en el medio cido), de color amarillo, al ser reducido por
los grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso, cuya intensidad es
la que medimos para evaluar el contenido en polifenoles. El mecanismo de reaccin
es una reaccin redox,y puede considerarse, como un mtodo de medida de la
actividad antioxidante total.

Figura 1

Mecanismo de accin del reactivo de Folin-Ciocalteu

3.0.- DATOS ESPECTROSCPICOS CARACTERSTICOS:

Del proceso de extraccin del alga Bostrychia calliptera se obtuvo tres fracciones de
diferente polaridad: apolar (hexano), medianamente polar (cloruro de metileno) y
polar (etanol). Sin embargo, en ste estudio se considera la fraccin de cloruro de
metileno para llevar a cabo el proceso de separacin y purificacin. La separacin de
la fraccin de cloruro de metileno a travs de gel de slice, empleando hexano,
acetato de etilo y etanol como fase mvil dio origen a tres subfracciones. Se continu
el proceso de separacin con la subfraccin de acetato de etilo (SFCAE) teniendo en
cuenta que fue la subfraccin de mayor peso y de polaridad intermedia.
Al fraccionar 670 mg de sta sobre gel de slice y una elucin en gradiente con
hexano: acetona (7:3), acetona y etanol, se recolectaron volmenes de elucin de
aproximadamente 6 mL, desarrollando CCF con fase mvil de hexano: acetona (1:1),
obteniendo de esta forma ocho subfracciones. En CCF se emple como revelador
cido fosfomolbdico debido a que ste es un revelador general. Se consider la
subfraccin SFCAE6 (220 mg) para continuar el proceso de separacin por presentar
valores diferenciables de RF (0.85, 0.68, 0.51, 0.26) en CCF desarrollada con una
fase mvil de hexano: acetato de etilo (7:5). Dicha fraccin se someti a dos
separaciones sucesivas sobre Gel de slice por medio de una elucin en gradiente con
hexano y acetato de etilo obteniendo la subfraccin SFCAE 6,9,6 la cual mostr una
sola mancha en CCF con un RF de 0.26 al ser revelada con luz UV y cido
fosfomolbdico, y un espectro de absorcin tomado en acetato de etilo con dos
longitudes de onda: 210 nm y 280 nm como mxima de absorcin (Figura 2),
permitiendo establecer que hubo separacin, por lo que sta subfraccin fue
almacenada para posterior anlisis por RMN.

Figura 2
Seguidamente, se abord nuevamente la subfraccin SFCAE (907 mg) empleando un
gradiente de polaridad con hexano,
etilo 6,9,6
y etanol sobre Gel de slice, se
Espectroacetato
UV de de
SFCAE
eluyeron ocho subfracciones SFCAE1* - SFCAE8*, de stas se consider la subfraccin
SFCAE6* (178 mg) por observarseCompuesto
ms limpia1 en CCF desarrollada con hexano:
acetato de etilo (7:5) y por presentar valores de RF de: 0.36, 0.24, 0.12, 0.07
indicando la presencia de compuestos de tendencia polar, para una nueva
separacin bajo las mismas condiciones obteniendo la subfraccin SFCAE 6*-4 que
registro un RF de 0.36 en CCF desarrollada con hexano: acetato de etilo (7:5),
empleando como reveladores luz UV y cido fosfomolbdico y un espectro UV-Vis
tomado en acetato de etilo con longitudes de onda de absorcin de 210 y 280 nm
(Figura 3), indicando que hubo separacin, por lo que se almacen para
posteriormente realizar su anlisis de RMN.

Figura 3
Espectro UV de SFCAE6*-4
Compuesto 2

Los compuestos 1 y 2 purificados a travs de cromatografa en columna fueron

llevados a sequedad, rotulados y empacados bajo atmsfera de nitrgeno. Estos
10

fueron enviados a la Universidad de Santiago de Compostela (Espaa) para el

anlisis espectroscpico de RMN mono y bidimensional.
La subfraccin SFCAE6,9,6 (Compuesto 1) se aisl prcticamente puro por CC como
un aceite caf. Los resultados espectroscpicos se muestran en la Tabla 1. El
espectro RMN 1H mostr a campo bajo cinco seales entre 5.40 y 6.52 ppm que son
caractersticas de protones oleofnicos, una seal a 4.21 ppm de un protn metnico
geminal a un grupo hidroxilo, una seal singlete a 3.66 ppm que integra para tres
caracterstica de protones del grupo metxilo. A campo alto se observ seales entre
1.31 y 2.34 ppm caractersticas de protones metilnicos y una seal a 0.98ppm que
integra para tres correspondiente a protones metlicos. El espectro de RMN 13C
mostr 17 seales de carbono cuyas multiplicidades se dedujeron a travs de un
experimento DEPT. Las resonancias de carbonos a 35.41, 34.06, 29.46, 29.03, 27.67,
24.88, 20.73 ppm corresponden a grupos metilnicos (CH 2), a 135.19, 135.04,
132.87, 127.75, 125.82, 123.77, 72.11 ppm resuenan grupos metinos (CH), a 51.4,
14.18 ppm resuenan grupos metilos (CH3) y a 174.30 ppm resuena un carbono
cuaternario. El triplete alrededor de 77 es 100 caracterstico de CDCl 3. Las
resonancias a 174.30, 72.11, 51.4 y 14.18 ppm sugieren la presencia de un grupo
COO-, C-OH, CH3O- y CH3-R respectivamente.

TABLA 1

Resultados de RMN 13C, 1H, HMBC de SFCAE6,9,6 Compuesto 1

11

Los experimentos bidimensionales HMQC y COSY 1H- 1H permitieron establecer

las correspondientes correlaciones carbono-hidrgeno y protn-protn. De esta
forma, se confirm que la seal a un d 51.44 ppm estaba directamente unido a los
protones de d 3.66 y por lo tanto constituyen un grupo metilo unido a un tomo de
oxgeno. As mismo, se pudo determinar que los protones a desplazamientos de 5.41,
5.97, 6.52, 5.69, 5.40, 5.56 ppm estaban directamente unidos a los carbonos
oleofnicos que se registran a desplazamientos de 123.77, 127.75, 125.82, 135.04,
132.87, 135.19 ppm respectivamente. El experimento COSY 1H- 1H mostr las
correlaciones protn-protn, permitiendo establecer las uniones adecuadas de los
sistemas carbono-protn formados con HMQC, para de esta forma proponer el
fragmento de la Figura 4. As, los protones a desplazamiento de 2.34 ppm se
correlacionan con los de d 1.60 ppm, estos a su vez se correlacionan con los de d 1.32
ppm y as sucesivamente. El valor de las constantes de acoplamiento para los
protones metinicos a desplazamientos de 5.41 y 5.97 ppm de 11.0 Hz y para los de
desplazamiento a 5.40 y 5.56 ppm de 10.7 Hz (Tabla 2), demuestran la presencia de
sistemas oleofnicos alifticos con isomera geomtrica Z ya que estn alrededor de
11.00 Hz que es el valor terico. Mientras que los protones a d 6.52 y 5.69 ppm
registran una constante de acoplamiento de 15.2 Hz, que indica una isomera E
para este sistema oleofnico. El fragmento ya constituido se uni al grupo metoxilo
ya propuesto, a travs del carbono cuaternario (d174.30 ppm) cuyo desplazamiento
corrobora la existencia de un grupo ster, para finalmente proponer la estructura de
la Figura 5.

Figura 4
12

Fragmento de la estructura sugerida para el compuesto 1

formada empleando los experimentos HMQC y COSY

Esta estructura verifica la multiplicidad y las correlaciones a larga distancia

carbono protn registrado por el espectro RMN 1H y HMBC (Tabla 2), muestra
claramente las correlaciones HMBC del carbono a 174.30 ppm con los protones
metlicos y con los que se encuentran en posicin a y b con respecto al carbonilo. La
estructura sugerida se denomina 10-hidroxi- (6Z,8E,12Z)-trienohexadecanoato de
metilo, la existencia de los grupos COO-, HO- y los dobles enlaces confirman la
polaridad intermedia que present la subfraccin cuando se obtuvo a travs CC, ya
que fue eluida con una mezcla de fase mvil de hexano: acetato de etilo (7:4). De
igual forma, al nico sistema de doble enlace conjugado que presenta la molcula se
le atribuye la capacidad de absorber luz UV, que fue la caractersticaobservada en el
revelado de la placa en CCF desarrollada para esta subfraccin en el momento de la
separacin. Se puede considerar un monoterpeno irregular derivado de la va
biosinttica del cido mevalnico con la intervencin de dos unidades de isopreno
(C5), isopentenil pirofosfato (IPP) y dimetilalil pirofosfato (DMAPP). Este tipo de
compuestos se encuentran en la naturaleza y son excepciones a la regla del isopreno
en la cual se condensan sucesivas unidades de isopreno a travs de una unin
cabeza cola 1-4 produciendo compuestos de frmula (C5)n. Con respecto a la
subfraccin SFCAE6*,4, (compuesto 2), sta se aisl pura por CC como un aceite
caf. Los resultados espectroscpicos se muestran en la Tabla 2. El espectro de
RMN 1H (CDCl3) de esta subfraccin revel la presencia de seis tipos de protones
(Tabla 2), a campo bajo se observan los protones de grupos metinos a: d 6.30 ppm
(J= 15.95Hz), d 6.85 ppm (J= 8.49Hz), d 7.42 ppm (J= 8.51Hz), d 7.64 ppm (J=
15.95Hz), a campo alto el protn de un grupo hidroxilo a d 5.84 ppm y el protn de
un grupo CH3-O a d 3.80 ppm. Estas seales mostraron correlaciones HMQC a
seales de carbonos a d 115.10, 115.89, 129.98, 144.76 ppm respectivamente. El
espectro de RMN 13C indican la presencia de ocho tipo de carbonos cuyas
multiplicidades se dedujeron por medio del experimento de DEP T.

13

TABLA 2
Resultados de RMN 13C, 1H, HMBC de SFCAE 6*,-4
Las resonancias a d: 144.76, 129.98, 115.89, 115.10 ppm corresponden a grupos
metinos de (CH=), la seal a d: 51.7ppm
se atribuye
a un carbono de un grupo
Compuesto
2
metoxilo (CH3-O) y las seales a d: 168.09, 157.90, 127.08 ppm indican la presencia
de tres carbonos cuaternarios de seales CH3-CO-X, X: O; =C-X, X: O; -C=
respectivamente. En el espectro COSY 1H- 1H, la seal a d 7.64 mostr correlacin
con la seal a d 6.30ppm y el valor de la constante de acoplamiento de J = 15.95Hz
permite establecer una isomera geomtrica E. La seal a d 7.42 ppm mostr
correlacin con la seal a d 6.85 y el valor de la constante de acoplamiento de J
8.49Hz permite establecer una isomera geomtrica Z. La integracin para las
seales de RMN 1H a 7.42 y 6.85 ppm indican la presencia de dos protones y segn
HMQC estn enlazados a los carbonos de desplazamiento de 129.98 y 115.89 ppm
respectivamente, sin embargo el DEPT demuestra que estos dos carbonos
corresponden a grupos metinos (CH), por lo que se deduce que debe haber presencia
de dos carbonos simtricos, de esta forma se construye el fragmento a. A partir de la
informacin espectroscpica de RMN 1H, 13C, DEPT, HMQC, COSY 1H- 1H y la
multiplicidad el fragmento a se une al carbono cuaternario que resuena a 168.09
ppm, que como ya se menciono anteriormente corresponde a un grupo -COOCH3 y
de esta forma se sugiere la estructura de la Figura 6 para la subfraccin SFCAE 6*,4.
Esta estructura muestra correlaciones a larga distancia HMBC, que corresponden a
las obtenidas en el anlisis espectroscpico de la subfraccin SFCAE 6*,4 (Tabla 2),
14

muestra las correlaciones del carbono a 168.09 ppm con los protones que resuenan a
desplazamientos de 3.80, 6.30 y 7.64 ppm, como tambin las correlaciones del
carbono oleofnico aliftico con los protones del sistema aromtico.

Figura 6
Fragmento de la estructura sugerida para el compuesto 2
formada empleando los experimentos HMQC y HMBC

La

estructura sugerida se denomina (E)- metil-3-(4- hidroxifenil) acrilato o 3-(4Figura 7

15

Fragmento de la estructura sugerida para el compuesto 2:

(E)-metil-3-(4-hidroxifenil)

hidroxifenil)-(2E)- propenoato de metilo. La presencia de los grupos OHy COO- , le

confieren carcter polar a la molcula, mientras que el sistema aromtico y la
cadena aliftica oleofnica carcter apolar; de esta forma se justifica su solubilidad y
su fuerte interaccin con la mezcla de hexano: acetato de etilo (7:4) que corresponde
a la proporcin de fase mvil de elucin.

4.0.- ACTIVIDAD FARMACOLOGICA

Y MECANISMO DE ACCION
Investigaciones recientes han confirmado, que lo que hace interesante a los
metabolitos de las algas marinas es que muchos de ellos presentan novedosas
variaciones en su estructura qumica. Estas variaciones, son en la mayora de los
casos responsables de las diversas propiedades biomdicas que poseen las algas
marinas. Algunos efectos farmacolgicos ya demostrados son: respuesta antiviral,
antitumoral, antiinflamatoria, antimicrobiana, anticonvulsivante y antioxidante.
16

Por otra parte no menos importante es el hecho de que un gran nmero de especies
de algas son comestibles, combinndose los efectos nutricionales con las propiedades
farmacolgicas. De esta manera las algas al ser consumidas aporten no solo energa,
sino salud y por ende una mejor calidad de vida.
Muchos autores han comprobado que los extractos de algas marinas presentan
actividad antioxidante explicada por varios mecanismos de accin; entre estos se
encuentran la capacidad atrapadora de radicales libres, la quelacin de metales prooxidantes, los mecanismos de donacin y aceptacin de electrones y la capacidad de
interrupcin de la peroxidacin. Algunas especies de algas (y otros organismos
marinos) tienen aminocidos tipo micosporinas, capaces de absorber cantidades
apreciables de radiaciones UV y evitar as el dao peroxidativo.
Los metabolitos secundarios de las algas marinas han atrado por largo tiempo el
inters de los bioqumicos,. Los isoprenoides (como los terpenos, carotenoides, y
esteroides), polictidos (como los florotaninos), productos naturales derivados de
aminocidos (como los alcaloides) y los siquimatos tambin conocidos como
shikimates- (como los flavonoides, entre muchos otros derivados del cido shikmico)
son los principales grupos de metabolitos secundarios encontrados en las algas
Rojas (Rodofita) son fuentes ms ricas de estos metabolitos secundarios. Poseen
fuertes propiedades antioxidantes y actan contra el estrs oxidativo. Ciertos
polifenoles trabajan como medicamentos preventivos para problemas como
enfermedades cardiovasculares, cnceres, artritis y desrdenes autoinmunes que
tienen una asociacin directa con el estrs oxidativo. Adicionalmente, los
florotaninos poseen actividad bactericida (por ejemplo, con los estafilococos) junto
con otras perspectivas teraputicas.
Los flavonoides y sus glicsidos presentes en las algas rojas, tambin exhiben
propiedades antioxidantes, y han demostrado su capacidad para actuar contra la
arterioesclerosis y el cncer. La fucoxantina, el -caroteno y la violaxantina son
carotenoides encontrados en las marinas que exhiben poderosas caractersticas
antioxidantes. Adems, la fucoxantina ha mostrado fuertes efectos anticancergenos
as como su capacidad para prevenir la obesidad. La correlacin entre una dieta rica
en carotenoides y un menor riesgo de enfermedades cardiovasculares y
oftalmolgicas ha sido respaldada por investigaciones recientes, empleando
17

diferentes tipos de carotenoides en sistemas celulares y en estudios de intervencin

en humanos.
Los compuestos halogenados, otro tipo de metabolitos encontrados en las algas, son
producidos principalmente por las algas rojas, y entre otros compuestos
halogenados, los monoterpenos polihalogenados encontrados en las algas rojas han
exhibido funcionalidades anticancergenas, antimicrobianas y antituberculares.

18

5.0.-APLICACION INDUSTRIAL
Y OCURRENCIA EN ALIMENTOS

5.1.- Alimentacion Humana:

El beta-caroteno es el pigmento ms comn en la familia de los carotenoides
proveniente de las algas es ampliamente utilizado en la produccin de
golosinas, helados, lcteos, bebidas y alimentos procesados.
5.2.- Fertilizantes:
Es uno de los usos ms antiguos de las algas, los taninos presentes en las
algas son los responsables de esta propiedad.
5.3.- Pigmentos:
La astaxantina se usa como fuente de pigmentacin en alimentos para peces
y camarones. Es una fuente natural que imparte el color rojo caracterstico a
la carne de salmn, trucha u otras especies acuticas.

19

6.0.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Se pesaron 5 g de muestra seca y molida, se separan los metabolitos agitando una
solucin en ter de petrleo con un volumen de metanol al 90 %; queda una fase
metanlica y una fase etrea, se separan en las fases. Una vez obtenido el extracto o
los extractos, estos se pueden separar y analizar por cromatografa en capa fina, en
papel o en columna.
Se realiz la extraccin de la fase metanolica, utilizando un Soxhlet, con el que se
extrajo una muestra utilizando como solvente acetona, durante 6 horas hasta que el
color del solvente condensado en el superior del aparato estaba claro. Los
rendimientos obtenidos fueron de 13,73 mg o 2,75 % del peso seco.
A.- Analisis del problema:

20

Figura 8
Espectro UV en etanol

Figura 9
Espectro IR

21

Figura 10
Espectro de masas

B.- Solucion del problema:

Con los datos obtenidos se deduce que el nombre quimico es 3,3-dihidroxi-b,b,caroteno-4,4 diona o una Astaxantina

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7.0.-BIBLIOGRAFIA

file:///C:/Users/home/Downloads/extrac_separ_y_elucid__estruc_de_2_met_sec
_algas%20(1).pdf
http://www.chr-hansen.es/productos/colorantes-naturales/nuestros-grupos-deproductos/beta-caroteno.html
https://nutricionpersonalizada.wordpress.com/2012/01/03/algas_marinas_ingr
edientes_alimentos_funcionales/
https://tenshinoakuma.wordpress.com/2008/10/09/terpenos-aceites-esenciales/

23

 http://www.elergonomista.com/fitoterapia/cumarinas.htmhttp://www.elergono
mista.com/fitoterapia/cumarinas.htm
file:///C:/Users/home/Downloads/426-1412-1-PB.pdf

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