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H.J.Mitchell, J.L.Hall, M.S.Barber. American Society of Plant Physiologists. Febrero 1994 Pag 551-556
(23 -25),
Las quitinasas Clase I, son polipptidos bsicos y actan como la quitina en las plantas,
presentando dos molculas de lecitina con unin de quitina y un pequeo sector rico en
glicina (27).
Las quitinasas Clase II, similares a la de Clase I, pero sin el sector rico en glicina.
Las quitinasas Clase III, que incluyen las lizosimas (papaya, pepino, etc.), y no
contienen el sector rico en glicina y no tienen la unin de quitina (28,30).
Las propiedades antifungosas de las quitinasas vegetales han sido ampliamente demostradas
a travs de varios bioensayos in vitro (31), demostrando esta propiedad en frejol a
concentraciones tan bajas como 2 microgramos. Tambin, Mausch et al. (32) demostraron
que la combinacin de quitina purificada inhibi a 15 de 18 hongos testeados. Adems se
han determinado efectos similares con las quitinasas de la avena, maz y trigo (33), del
chamico, tabaco y trigo (34) y de la goma arbica (35), las que inhibieron el desarrollo de
varios hongos.
Adicionalmente la incorporacin de quitinasa del frejol purificada en el cultivo de
Rhizoctonia, origina zonas de inhibicin prximas al punto de aplicacin de la quitina (36).
Se descubri que esta inhibicin del crecimiento de los hongos aument mientras mayor fue
la concentracin de quitina. La inhibicin del crecimiento del hongo surge de la hidrlisis
con enzimas catalizadas de quitina recin formadas y ello resulta en la interrupcin de los
pices hifales del hongo (37). Un examen microscpico de las hifas del hongo Rhizoctonia
olani, al enfrentarlas con cierta dosis de quitina, mostr clulas lticas y abultadas,
retraccin del plasmalema, disolucin de la pared y filtraciones de protoplasma (38),
validando de esta manera el modo de accin de las quitinas descrito anteriormente. Estos
resultados permitiran concluir tambin que la quitinasa, por si sola, est lista para el ataque
de las hifas y presumiblemente ello es ms efectivo, al estar presente en la periferia de las
clulas, causando la muerte de clulas de hifas de ciertos hongos.
As como los estudios in vitro en las plantas superiores han demostrado las propiedades
antifungales de la quitina, recientes estudios, tambin in vitro, pero usando plantas
transgnicas, han entregado mayores antecedentes sobre el rol defensivo de este tipo de
compuestos en las plantas. Broglie & Broglie (39) demostraron que las plantas transgnicas
de tabaco con el gen de la quitinasa del frejol fueron resistentes al ataque del hongo
Rhizoctonia olani, que es un hongo del suelo sumamente patgeno y que produce la
descomposicin de tallos y races provocando la cada de plantas o dumping off en
diferentes especies cultivadas de las familias de las leguminosas y solanceas
especialmente. Las plantas de tabaco, con quitinasa originaria del frejol, presentaron un
superior crecimiento, races ms vigorosas y menor dao causado por el hongo que las
plantas testigo. Asimismo, se encontro el mismo efecto positivo ante la presencia del hongo
Phytium, de caractersticas tanto o ms patgenas que el anterior. Para un mejor
conocimiento se presenta a continuacin ensayo efectuado por A. El Ghaoth.
Efecto de la aplicacin de Quitosano para controlar Pythium e Inducir reacciones de
Defensa en Pepinos
Ahmed El Ghaouth, Joseph Arul, Jean Grenier, Nicole Benhamou, Aalin Asselin and Richard Belanger
USDA-ARS Appalachian Fruit Research Station, Kearneysville, WV, USA Departement de Science et
Tecnologie des aliments et Centre de Recherche, en Horticulture, Departement de Phytologie, Universite
Laval, Quebec , Canada, Publicado en The American Phytopathological Society en Marzo 1994, Vol 84,
Paginas 313-320
Esta investigacin fue efectuada haciendo crecer una planta de Pepino contaminada con
Pythium aphanidermatum en una solucin con nutrientes a la cual se le agrego Quitosano.
Como resultado se logro controlar la putrefaccin de las races y accionar una serie de
respuestas defensivas, incluyendo la induccin de barreras estructurales en los tejidos
radiculares y la estimulacin de enzimas antifungicas(Chitinase, Chitosanase y B-1,3glucanase) tanto en las races como en las hojas, sin producir ningn efecto txico en las
plantas.
Tambin se han detectado resultados similares en la variedad de raps (canola) Westar, cuyas
plantas transgnicas procedentes de un gen de frejol, se defendieron exitosamente de
ataques del hongo Rhizoctonia (39).
Un trabajo reciente, realizado por Melchers et al. (40), demostr que las plantas de tomate
con la incorporacin del gen con quitinasa presentaron un aumento significativo de
resistencia frente al hongo Fusarium xysporum, causante de la cada de plantas en almcigo,
concluyndose nuevamente que la quitinasa inhibe el crecimiento del hongo. Otros trabajos
ms completos son los siguientes:
Nicole Benhamou and George Theriault. Departement de Phytologie, Faculte des Sciences de lagriculture
et de lalimentation, Universite Laval, Saint-Foy, Quebec, Canada
Publicado Physiological and Molecular Plant Pathology en 1992 Pag 33-52
Esta investigacin fue efectuada aplicando Quitosano a plantas de Tomate en forma previa
a su inoculacin con el patgeno radicular Fusarium oxysporum f. Sp. Radicis-Iycopersici.
La aplicacin fue va pulverizacin a las hojas y tratamiento va Bao de races. En
ambos casos redujo en forma importante el numero de lesiones radiculares causadas por el
hongo y aumento drsticamente la formacin de barreras fsicas en tejidos infectados de
las races. Esta investigacin demostr que el Quitosano protegio efectivamente a la planta
contra la pudricin del cuello y de la raz. Tambin indica que no solo es til estimulando
el sistema general de defensa de las plantas sino tambin en reducir el efecto de los
patgenos predominantes del suelo tales como Fusarium. La proteccin contra el ataque
fungal a las races se pudo observar por mas de 6 das.
Induccin de Resistencia Sistemica a pudricin de cuello y raz por efectos de
Fusarium en plantas de Tomate cuyas semillas fueron tratadas con Quitosano
N. Benhamou, P.J. Lafontaine and M. Nicole
Publicado en American Phytophatology 84, PAG 1432-1444, Septiembre 1994
Esta investigacin fue efectuada revistiendo la semilla y tratando el sustrato con Quitosano
en forma previa a infestar con Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici. Se utilizo ya
sea una mezcla de Turba, Perlita y Vermiculita o placas petri con Agar. En ambos casos la
combinacin del tratamiento de semilla y la enmienda al sustrato redujo significativamente
la incidencia de la enfermedad evaluada por la disminucin en las lesiones de las races y
una apariencia mas sana del sistema radicular. El anlisis de los tejidos de las races por
donde penetro el hongo revelaron que el tratamiento previo con Quitosano estuvo siempre
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asociado por las reacciones de defensa de la planta. En la epidermis, las clulas mostraron
tpicos signos de necrosis caracterizada por una marcada desorganizacin del citoplasma.
El crecimiento de hongos fue reducido en el interior pero no estuvo restringido solo a esta
rea de reaccin. Aun mas, el patgeno fue detectado en la corteza. El anlisis de los
tejidos de las races por donde penetro el hongo revelaron que el tratamiento previo con
Quitosano estuvo siempre asociado con las reacciones de defensa de la planta. En la
epidermis, las clulas mostraron tpicos signos de necrosis caracterizada por una marcada
desorganizacin del citoplasma. El crecimiento de hongos fue reducido en el interior pero
no estuvo restringido solo a esta rea de reaccin. Aun mas, el patgeno fue detectado en
la corteza exterior en la cual su desarrollo fue frenado.
Estructura de los Genes que Codifican la Produccin de Quitinasa.
El anlisis de secuencias de nucletidos de clones aislados de cADN indic que al menos
dos de los genes de quitinasa (CH5A y CH5B) se transcriben en respuesta al tratamiento
con etileno (61). La expresin de estos genes, en plantas trangnicas de tabaco, se determin
dependiente de la aplicacin de etileno exgeno o de promotores de oligosacridos.
El anlisis de las deleciones promotoras de CH5B sugiere la presencia de una secuencia de
43 pares de bases que se encuentra precisamente entre los genes CH5A y CH5B, los que
pueden jugar un rol en la regulacin transcripcional de la expresin gnica inducida por la
fitohormona etileno.
Se ha estudiado adems la induccin del gen CH5B (39,61) en respuesta al ataque de varios
hongos patgenos. Se estim el patrn temporal y espacial de la expresin del gene CH5B
durante la infeccin fungal, usando - glucoronidasa como gen informante. Se constituy
un gen quimrico fusionando un fragmento de 1 - 7 kb, que llevaba las secuencias
anteriores de CH5B, a la region codificante de - glucoronidasa , seguida por los signos de
termino del gen de sntesis de sintasa nopalina.
Se demostr que la expresin del gen CH5B est fuertemente inducida en respuesta al
ataque fungal.
Preutilizacin de las Propiedades de la Quitinasa.
Estudios realizados en los aos 80 en la universidad de Washington (50,61) observaron el
incremento de la resistencia de Pisum ativum al ataque de Fusarium olani, como respuesta
a la aplicacin exgena de quitina. La ampliacin de esta investigacin a otras especies
determin que los polmeros hexosaminas de quitosano (un derivado natural de la quitina)
inhiban la germinacin y el crecimiento de uresdosporas de Puccinia triiformis en trigo, y
que la acumulacin de quitosano poda estar involucrada tanto en la detencin del
crecimiento de las esporas como en la resistencia del husped a la enfermedad (50).
Al aplicarse quitosano exgeno a semillas de numerosas especies anuales, se supuso
correctamente que este induca una respuesta de defensa al ataque de un hongo que no
estaba presente, en forma de cambios bioqumicos, citogenticos y estructurales, tales como
sistemas radiculares mayores, tallos ms gruesos y acumulacin de lignina.
La aplicacin de quitosano ha demostrado ser efectiva tanto para las races de las plantas
como para sus partes areas. Existen ensayos muy interesantes realizados por Ahmed El
Gaouth y otros respecto a estos ltimos efectos.
Ahmed El Ghaouth, Joseph Arul, C.Wilson, Nicole Benhamou USDA-ARS Appalachian Fruit Research
Station, Kearneysville, WV, USA Departement de Science et Tecnologie des aliments et Centre de Recherche,
en Horticulture, Departement de Phytologie, Universite Laval, Quebec , Canada, Publicado en Physiological
and Molecular Plant Pathology en Junio 1994, Vol 44, Pag 417-432
Esta investigacin fue efectuada tratando los cortes en los Pednculos de Pimentones con
una solucin de Quitosano, para luego posteriormente infectarlos con esporas de Botrytis
cinerea. Como resultado se logro observar que en los frutos tratados con Quitosano no fue
visible la enfermedad hasta 7 das despus de la inoculacin, en cambio en el testigo la
enfermedad fue visible a las 24 horas. En la evaluacin efectuada a los 14 das todos los
testigos estaban infectados, en cambio en los frutos tratados con Quitosano solo el 25% lo
estaba. Adems cabe mencionar que dichas infecciones en los frutos no tratados era
generalizada, en cambio en los frutos tratados estaba restringida principalmente a
cavidades de los cortes y clulas epidermales rotas.
Ahmed El Ghaouth, Joseph Arul, C.Wilson, Nicole Benhamou USDA-ARS Appalachian Fruit Research
Station, Kearneysville, WV, USA Departement de Science et Tecnologie des aliments et Centre de Recherche,
en Horticulture, Departement de Phytologie, Universite Laval, Quebec , Canada.
Esta investigacin evala los efectos de varios productos para el mejoramiento de suelos
plantados con Pimentn. Para ello se hicieron 3 Tests de Campo, a fin de comprobar la
eficacia de distintos productos naturales comnmente utilizados para el Control de Hongos
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ACCION NEMOSTATICA
El Quitosano se ha transformado en una importante herramienta para el Control de
Nematodos Fitoparsitos ya sea como complemento a los Nematicidas Quimicos o
como preventivo y protector de raices.
Existen un sinnumero de trabajos que incluso muestran un efecto nematicida tales como
los siguientes:
El efecto nematicida de la quitina, en relacin a otros pesticidas, para control de los nematodos
fitoparsitos Heterodera avenae y Tylenchulus semipenetrans. Plntulas de trigo, cultivadas en
suelo, artificialmente o naturalmente infestadas con Heterodera avenae, fueron tratadas con 0.4%
(w/w) de Quitina fabricado a partir de quitina de cscara de crustceos, con aldicarb (Temik 15G), y
con ethylene dibromide (EDB 90EC). El Tratamiento con Quitina aumento significativamente la
paja, espiga y peso promedio seco de granos del trigo de las plantas infectadas con nematodos
respecto de los otros 2 tratamientos. En un experimento que cubra 2 temporadas consecutivas los
3 tratamientos redujeron el nmero de nematodos en el suelo en un 60%. En un experimento de
una temporada, la Quitina redujo el nmero de nematodos en un 51%, y aldicarb or EDB redujeron
en un 40%. Una reduccin del 50 al 90% en la densidad de poblacin de Tylenchulus
Semipenetrans en las races de 2 ctricos patrones fue medida luego de aplicar 0.2% (w/w) de
Quitina al suelo.
El estircol de ave (gallinaza) y vacuno constituyen la fuente de materia orgnica con mayores
posibilidades para incrementar el rendimiento de los tubrculos de papa en cultivares susceptibles
como Revolucin y tolerantes como Yungay, pero elevan la tasa de multiplicacin del
nematodo. En los cultivares resistentes como Mara Huanca, las enmiendas orgnicas tienen
poco efecto en la elevacin de los rendimientos pero reducen la reproduccin de G. pallida. El
estircol de gallina debe aplicarse antes o al momento de la siembra y como mnimo 10 t/ha.
Normalmente la incorporacin de enmiendas orgnicas al suelo y la descomposicin de sus
componentes contribuyen al buen desarrollo de la planta y en consecuencia a tolerar el ataque del
nematodo. Asimismo, la enmienda orgnica contribuye a la produccin de compuestos txicos y
proporciona las condiciones adecuadas para el desarrollo de nematodos predatores y
microorganismos que, de alguna forma, tienen un efecto biocontrolador sobre los nematodos.
Algunas enmiendas como la quitina pueden facilitar el desarrollo de una microflora
antagnica capaz de degradar estos polmeros y en consecuencia destruir la capa
quitinoltica de los huevos de Meloidogyne, Globodera y Heterodera.
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El Biorend tambin, a travs del quitosano, puede actuar como un inductor de protenas
que combaten microorganismos, tales como las lecitinas en las plantas. De estos resultados,
se ha inducido que las lecitinas de las plantas, por su similitud bioqumica con los
anticuerpos animales, poseen una funcin antimicrobiana de tipo anticuerpo (47,48).
Biorend y su Resistencia a familias de Insectos y Hongos patognicos.
Tambin se ha sealado que el quitosano puede generar pistina fitoalexina en los tejidos de
las vainas de arveja ( 49,50), que son compuestos de bajo peso molecular que se sintetizan
una vez que las plantas han sido expuestas a ataques de microorganismos (51). La
acumulacin de fitoalexinas en el rea de infeccin es uno de los mecanismos a travs de
los cuales resisten ataques de patgenos y estos compuestos inhiben el crecimiento de los
hongos y protegen los tejidos de ciertos cultivos frente a ataques severos de Fusarium Spp.,
hongo que ataca a muchos cultivos (50). Wagoner et al. (53), han demostrado que el
quitosano induce la sntesis de fenilalanina (Pal), una enzima muy efectiva en el combate
de hongos de diferentes tipos (50). Adems el quitosano es un potente inductor de
acumulacin del inhibidor de proteinasa en los cotiledones de tomate (50). Estos
compuestos nuevamente juegan un importante rol en el combate de microorganismos,
pero tambin tienen efecto sobre algunos rdenes de insectos tales como Lepidpteros
Colepteros y Ortpteros, algunos de cuyos representantes tienen un importante papel como
plagas silvoagropecuarias y de granos almacenados.
En otro tipo de resultados, se ha demostrado que el quitosano participa de la reduccin de
enzimas hidrolticas que se sintetizan en respuesta a los agentes patgenos, permitiendo, en
el cultivo del tabaco, una sistemtica resistencia frente al hongo Phytophtora nicotiana (57).
Sobresale en este caso el gran nmero de protenas que son inducidas, las que incluyen
quitinasas y gluconasas - 3 -1, que hidrolizan los polmeros del azcar, que son los
componentes principales de las paredes celulares de muchos hongos.
Por otro lado, se han sealado algunas evidencias que demuestran la actividad fungicida del
quitosano, lo que parece estar inversamente correlacionado con el tamao de las partculas
y en concentraciones cercanas a los 100 microgramos por mililitro. En general, el quitosano
tiene una mayor actividad fungicida que la quitina, y es as que de 46 hongos ensayados, el
quitosano inhibi a 32 de ellos, mientras que la quitina inhibi solamente a 6 de ellos (19).
A pesar que las paredes celulares de las plantas son una barrera frente a compuestos de alto
peso molecular, como lo es el quitosano, los tejidos de las plantas tienen enzimas capaces
de dividir el quitosano en pequeas mleculas que podran atravesar las barreras de las
paredes celulares. Un anlisis histoqumico, usando una solucin especfica de hexosamina
(49), demostr que existe una acumulacin significativa de quitosano en las esporas de los
hongos inoculados en arveja, especialmente en el conducto germinal, donde el crecimiento
ha sido finalizado despus del contacto con el tejido de la planta. Tambin se detect
quitosano en las clulas de las plantas adyacentes a la germinacin de la espora del hongo.
Hadwiger et al. (43), utilizando tcnicas de inmunoqumica, han examinado la ubicacin del
quitosano y otros componentes de la pared celular de hongos en plantas de arveja despus
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de la inoculacin con el hongo Fusarium solani y los resultados han evidenciado que esta
prueba inmunoqumica sirve para determinar la ubicacin de los componentes fungales en
la interaccin arveja - Fusarium. Entonces, los componentes de la pared celular del hongo
entran a las clulas de la planta y se acumulan dentro de ellas, mientras que el crecimiento
del hongo es inhibido. Los patrones de acumulacin de quitosano y de todos los
componentes con polmeros de hexosamina, se asemejaron a los de los componentes de la
pared fungal. El quitosano se encuentra presente en la superficie externa de la pared de la
espora fungal y el potencial de traslocacin del quitosano entre las esporas de Fusarium
spp. y las clulas de la planta sugiere que este compuesto tiene un papel preponderante en la
interaccin huesped - parsito.
Factores de efectividad del uso del Biorend en el sector silvoagropecuario.
Parodi, Nebrada y colaboradores (61) condujeron durante cinco aos, en Chile y Argentina,
numerosos experimentos destinados a cuantificar el efecto sobre especies cultivadas
anuales, destinados a determinar las dosis ms efectivas para la maximizacin de
rendimiento en cada especie y, en una segunda etapa, para cuantificar dicho incremento. El
rango geogrfico de este estudio incluy, en Chile, desde la IV a la X Regin, y en
Argentina a la Provincia de Buenos Aires. Este estudio incluy trigo, cebada, avena,
triticale, maz, maravilla, remolacha y canola. Los resultados obtenidos en esta
investigacin muestran un aumento de rendimiento de entre un 10 y un 20%, dependiendo
de la especie, no detectndose respuestas negativas a la aplicacin del Biorend. Un efecto
adicional sealado por esta investigacin apunta a la economa de nitrgeno como
fertilizante qumico, destacando adems que el Biorend no constituye riesgo ambiental
alguno, por ser de origen orgnico, no txico y biodegradable.
Este estudio ha sido ampliado por otros investigadores, que incluyen especies hortcolas,
frutcolas y forestales, continundose hasta hoy.
Por ltimo debemos considerar que el quitosano tiene un efecto nematostatico y nematicida,
al aumentar la flora microbiana quitinoltica antagonista de nemtodos fitoparsitos del
gnero Meloidogyne sp., Heterodera sp., Globodera sp., etc. Destacando a su vez, el
aumento significativo de nemtodos entomopatogenos del gnero Steinernema feltiae sp,
Steirnernema carpocapsae sp, y Heterorabdhitis sp. controladores de varias plagas de
lepidpteros y colepteros, fundamentalmente al inducir a la multiplicacin de bacterias
Simbiontes asociadas al gnero Xenorhabdus y Photorhabdus.
Uso de Biorend en especies hortcolas y fruticolas
Bioagro S.A. ha seguido estudiando la accin del quitosano en variadas especies, buscando
distintos tipos de aplicaciones de acuerdo a la especie a tratar. Para ello, se ha basado en los
cuatro grandes efectos que produce el quitosano al estar en contacto con las plantas o su
entorno:
Efecto Bioestimulante
Aumento del desarrollo del sistema radicular(raices y raicillas) y fortalecimiento del vigor y
grado de lignificacin de las plantas mediante el mecanismo SAR(Resistencia Sistemica
Adquirida).
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Efecto Fungistatico
Incita una respuesta de defensa al ataque de los hongos por lo que acta como proteccin de
los ataques producidos a las races por el complejo fungico del suelo.
Efecto Nemosttico
Control natural de los nematodos Fitoparasitos al aumentar la flora quitinolitica antagonista
de ellos y efecto protector sobre las raices.
Proteccin Enfermedades Areas
El Quitosano, por su efecto fungicida y capacidad de recubrir con una Pelcula Protectora
acta mejorando la calidad y el calibre de los frutos.
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2.- El quitosano, al formar un film en la pared celular de las plantas cultivadas, permite
una mayor y mejor proteccin de races al momento del transplante de cualquier especie,
ya que impide la penetracin de hongos y bacterias saprfitas y parsitas al interior de las
heridas o daos de races, que siempre ocurren al momento del transplante. Como una
manera de visualizar un uso para este tipo de accin, debemos mencionar que en Chile una
prctica comn consiste en el transplante de todos los frutales (con excepcin de los
injertados), plantaciones forestales, hortalizas tales como lechuga, tomate, pimentn,
cebolla, puerro, brsicas, frutales menores, etc.
3.- El quitosano, al inducir la acumulacin de inhibidores de proteinasas y afectar la
presencia de quitina en el exoesqueleto de los insectos, se presenta como una buena
alternativa para resistir ataques de insectos de las familias Lepidptera, Coleptera y
Ortptera, tanto en el campo como especialmente en grano almacenado, aprovechando la
ventaja de la muy baja toxicidad de este producto para el hombre.
4.- El quitosano, al conferir resistencia a la pared celular vegetal, permite a las plantas
tratadas resistir en mejor forma el stress hdrico, tanto el exceso como la falta de agua y, por
tal motivo, se han observado buenos resultados en arroz y en plantas creciendo bajo
condiciones de sequa, en plantaciones y cultivos en suelos rojo-arcillosos, en plantas
creciendo en suelos con poca disponibilidad de agua, etc. En este mismo sentido, el
quitosano protege a las races de las plantas tratadas de las prdidas de agua o
deshidrataciones normales al momento del transplante, permitiendo un mejor y rpido
crecimiento radicular de las plantas tratadas en suelos con bajo nivel de agua. El uso
potencial est, entonces, en ciertas zonas de inferior condicin de suelo destinadas al
desarrollo silvoagropecuario y en sectores de poca disponibilidad de agua de riego.
Tambin se han observado ciertos mecanismos de defensa de las plantas tratadas con
quitosano en condiciones de bajas temperaturas, confirindole a las clulas vegetales una
mejor proteccin debido al engrosamiento de sus paredes celulares.
5.- El Quitosano, por su efecto nematicida, permite controlar eficazmente una variedad de
nemtodos.
Sin embargo, an nos quedan los mecanismos inherentes a los que se producen por
aplicacin foliar. Ellos son:
1.- Por su efecto fungistatico permite tanto a la parte area de las plantas como a sus frutos
protegerse de Hongos tales como Botrytis. En este aspecto son muy importantes las
aplicaciones previas a la cosecha.
2.- Por la caracterstica del Quitosano como Filtrante de Rayos Ultravioletas acta como
protector solar, produciendo un film que cubre hojas y frutos. La luz ultravioleta
produce estrs en las plantas y sus frutos. Para ello, en las plantas se ha descubierto que
existe la elicitacion de un compuesto llamado cido jasmonico o jasmonatos como
producto final. Estos jasmonatos alivian en algo el estrs producido por UV pero se ha
demostrado que ellos, entregados a las plantas por medios externos, afectan o producen
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8.- Las propiedades antes citadas son validas para cualquier tipo de frutos.
De estos ltimos mecanismos entregamos finalmente algunos ensayos:
Shao W. Fang, Chin F. LI, and DANIEL Y.C.SHIH Division of Food Microbiology, National Laboratories of
Foods and Drugs, Taipei, Taiwan, Republic of China
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