Microbiologa de Alimentos II

Mtodos de Anlisis
Microbiolgico en Alimentos

Juan Villanueva
2016

ANLISIS MICROBIOLGICOS EN
ALIMENTOS
Indicadores
Recuento total (Ejem BAM)
Enterobactericeas totales
Coliformes totales E. coli
Mohos y levaduras, etc.

Patgenos
Salmonella
Campylobacte
r E. coli
O157:H7
Listeria

En el 2008:
Aproximadamente 1500 millones de ensayos
microbiolgicos
- 58% corresponde a la
industria alimentaria
- 49% alimentos
- 9% bebidas

Toxina estafiloccica

Otros E.
coli ?
Cronobacter
Protozoos y virus

30% Amrica del Norte

30% Europa
30% Resto del mundo (en crecimiento)

MTODOS CONVENCIONALES
Objetivo

Ventajas
Sensibilidad
Facilidad de interpretacin
Bajo costo
Inconvenientes
Demora en la obtencin de datos
Grandes cantidades de medios de
cultivo
Laboriosidad

MTODOS RPIDOS DE DETECCIN DE

PATGENOS

EXPECTATIVAS DE LOS MTODOS ALTERNATIVOS

Ventajas
- Rapidez
- Procesar elevado nmero de muestras/ tiempo
- Facilidad de uso
- Lmites de deteccin bajos
- Precisin (sensibilidad y especificidad)

Inconvenientes
- Inversin inicial (equipamientos) en general
- No excluye la etapa de enriquecimiento a veces,

- Necesidad de confirmacin a veces,

- Difcil traduccin cuantitativa de resultados

PhD Daniel Fung, Pionero en anlisis

microbiolgico miniaturizado

Factores de eleccin de una tcnica

- Precisin necesaria
- Nivel de resolucin
- Facilidad de uso
- Tiempo de obtencin de resultados
- Aceptabilidad / Validacin Coste analtico
- Amortizacin de la inversin
- Disponibilidad de espacios (en ocasiones)
- Soporte y mantenimiento tcnico
- Versatilidad / Evolucin

Factores necesariamente exigibles

1. Mtodos rpidos

Significativa

2. Mtodos muy rpidos

Econmicamente aceptable

3. Automatizacin de mtodos convencionales

1. Mtodos rpidos

Clasificacin segn tiempo empleado

Fiable

2. Mtodos muy rpidos

Permiten obtener resultados en 6-12 horas

Permiten obtener resultados incluso

Actan amplificando los efectos del crecimiento

en menos de una hora

activo de los

microorganismos

3. Automatizacin de mtodos
convencionales

Las tcnicas de anlisis microbiolgico de alimentos

se basarn en:

Reducir el gasto de material

Tcnicas de enumeracin directa y de

recuento de clulas viables

Aumentan el nmero de muestras a analizar

Sin embargo no disminuye el tiempo

necesario para completar cada ensayo

El principal factor de eleccin ser el

nmero habitual de muestras a procesar

Tcnicas de medicin de biomasa

Sistemas miniaturizados y kits de
diagnstico
Mtodos inmunolgicos

Mtodos genticos Automatizacin de

procesos y rutinas laboratoriales

MTODOS DE ENUMERACIN
DIRECTA

TURBIDIMETRA
Las clulas refractan la luz incidente

CITOMETRA DE FLUJO

Marcador Fluorassure (sustrato enzimtico no

fluorescente)
fluorescencia del citoplasma celular de clulas viables

Citmetro de flujo

capta la fluorescencia

EPIFLUORESCENCIA: Microscopio de epifluorescencia

No necesario tiempo de incubacin

Filtrado de muestra (concentracin bacteriana)

Tincin con FLUOROCROMO
Microscopio Epifluorescencia
Recuento directo de las bacterias
Alta exactitud

Mtodos inmunolgicos: ELISA (ensayo por inmunoadsorcin

ligado a enzimas)
Visualizacin de la interaccin entre un Ag y su correspondiente Ac
No requiere enriquecimiento previo para microorganismos

ELISA (ELISA SANDWICH): Ac inmovilizado sobre matriz solida captura al

Ag, Un 2 Ac marcado con una enzima reconoce un eptopo del Ac captura. Color
al reaccionar 2 Ac con el complejo Ag-Ac (ELISA

DIRECTO)

Alta sensibilidad, rapidez y bajo coste por anlisis

Disminuyen el tiempo de anlisis (Minutos a horas y Nmero elevado de

muestras)

Poco instrumental necesario

Automatizacin de ELISA para:

Salmonella
E. coli O157:H7
Listeria monocytogenes
Campylobacter spp.
Toxina estafiloccica

Kits que combinan inmunoensayo

Tecnologa ELFA
Enzyme-Linked Fluorescent Assay

Mtodos genticos
RT-PCR
Reaccin en cadena de
la polimerasa con
transcriptasa inversa
(Reverse transcription
polymerase chain reaction)

PCR en tiempo real (RT-Q-PCR)

- Extraccin del Ag flagelar de listeria
- Lnea inmovilizada de Ac
- Lnea azul

Mtodos genticos

PCR en tiempo real

Se dirigen a la deteccin de caractersticas celulares mucho

ms estables contenida en los cidos nucleicos
Hibridacin (existen tcnicas de hibridacin con ARN ribosmico)

RIBOTIPADO
El Ribotipado es un mtodo que permite identificar y
clasificar bacterias en funcin de los genes del RNA
ribosomal.
Los genes del rRNA se encuentran dentro de las regiones
mejor conservadas del genoma bacteriano. Existen varias
copias de genes para el rRNA en cada clula y su nmero
y localizacin especfica en el cromosoma varan segn las
especies.
1.Extraccin y digestin del DNA a partir de una
colonia bacteriana en placa.
2.Separacin mediante electroforesis de los
fragmentos de DNA.
3.Transferencia de los fragmentos separados a
una membrana de Nylon.
4.Hibridacin con una sonda del opern rRNA
de E. coli marcada qumicamente.
5.Adicin de un conjugado enzima-anticuerpo
que se une al marcaje de la sonda. 6.Deteccin
de las bandas mediante quimioluminiscencia.
7.Anlisis y comparacin de las bandas frente a
una base de datos, lo que permite la
caracterizacin y presunta identificacin de la
cepa bacteriana.

RIBOTIPADO
RIBOPRINTER
El sistema determina la
huella gentica

de

microorganismo

compara

con

un
la
los

marcadores

genticos

almacenados

de

los

diferentes microorganismos
de inters


Mtodo muy rpido
BIOLUMINISCENCIA

Recuento sobre membranas de filtracin

Membranas incubadas, se libera el ATP y acta complejo

luciferina / luciferasa

Ventajas

Desventajas

Rapidez en obtencin de los resultados: hasta en 11

segundos
Fcil manejo: equipos porttiles

Fungible de costo elevado

Resultados no extrapolables a ufc/g o ml

Tcnica sencilla

No especifica tipo de microorganismo

Resultados estimulantes

Posibilidad de medidas correctoras

Interferencias por ATP no microbiano

Interferencias por detergentes y desinfectantes

Elevada Sensibilidad: Deteccin de muy bajos niveles de

ATP

Medicin de actividad metablica

IDENTIFICACIN RPIDA AUTOMATIZADA

SISTEMA API (Analytical Profile Index, ndice Analtico de Perfil)

REDUCCIN DE COLORANTES: modificacin del

color
MICROCALORIMETRIA: cantidad de calor debida al
catabolismo microbiano
RADIOMETRIA: CO2 en el metabolismo
IMPEDANCIA: Resistencia al flujo de una corriente
elctrica (BACTOMETER y MALTHUS). El
metabolismo microbiano altera la composicin qumica de
los medios de cultivo. Variacin en la impedancia del
medio, reduce de 2 a 15 veces el tiempo de anlisis
IDENTIFICACIN RAPIDA AUTOMATIZADA

Automatizacin de mtodos
SISTEMA ESPIRAL DE SIEMBRA

DILUIDOR GRAVIMETRICO

Se coloca la muestra en la
bolsa de Stomacher

El diluidor aade la cantidad

necesaria de diluyente hasta
conseguir
la
dilucin
deseada

Aumenta el nmero
muestras a analizar

Dispensador: deposita de forma

continua un volumen decreciente
de muestra en la superficie de una
placa de agar - Intervalo amplio de
recuento en una sola placa - Se
eliminan las diluciones seriadas

de

(menos material) - Siembra

automtica

MEDIOS CROMOGNICOS
PETRIFILM

Medio selectivo con 2 Sustratos

Coliformes

Escherichia coli

-glucuronidasa

-galactosidasa

Biosensores (mtodo nodestructivo):

Biological,

electrochemical,

etc.

Biosensors can measure parameters that are related to a hazard (e.g.,

temperature during storage of a food product) or in the presence or

concentration of a hazard (toxin, pathogenic microorganism, or
indicator microorganism