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Editoria l - - - - - - - - - - - - - Nacional

O GEN 1 Grupo Editorial Nacional rene as editoras Guanabara Koogan, Santos, Roca,
AC Farmacutica, Forense, Mtodo, LTC, E.P.U. e Forense Universitria, que publicam nas
reas cientfica, tcnica e profissional.
Essas empresas, respeitadas no mercado editorial, construram catlogos inigualveis,
com obras que tm sido decisivas na formao acadmica e no aperfeioamento de
vrias geraes de profissionais e de estudantes de Administrao, Direito, Enfermagem, Engenharia, Fisioterapia, Medicina, Odontologia, Educao Fsica e muitas outras
cincias, tendo se tornado sinnimo de seriedade e respeito.
Nossa misso prover o melhor contedo cientfico e distribu-lo de maneira flexvel e
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Nosso comportamento tico incondicional e nossa responsabilidade social e ambiental
so reforados pela natureza educacional de nossa atividade, sem comprometer o crescimento contnuo e a rentabilidade do grupo.

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Corre a es C nico-La oratoriais

Antonio Walter Ferreira, PhD


Professor Assistente Doutor do Depar tamento de Doenas Infecciosas e Parasitrias da
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo - USP e Instituto de Medicina
Tropical da USP.

Sandra do Lago Moraes, PhD


Pesquisadora Cientfica do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de
So Paulo - USP.

Terceira edio

GUANABARA
KOOGAN

Os autores deste livro e a EDITORA GUANABARA KOOGAN LTDA. empenharam seus melhores esforos para assegurar que as informaes e os procedimentos apresentados no texto estejam em acordo
com os padres aceitos poca da publicao, e todos os dados foram atualizados pelos autores
at a data da entrega dos originais editora. Entretanto, tendo em conta a evoluo das cincias da
sade, as mudanas regulamentares governamentais e o constante fluxo de novas informaes sobre
teraputica medicamentosa e reaes adversas a frmacos, recomendamos enfaticamente que os
leitores consultem sempre outras fontes fidedignas, de modo a se certificarem de que as informaes
contidas neste livro esto corretas e de que no houve alteraes nas dosagens recomendadas ou na
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da obra em http://gen-io.grupogen.com.br.

Os autores e a editora se empenharam para citar adequadamente e dar o devido crdito a todos os
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Uma editora integrante do GEN 1Grupo Editorial Nacional

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Rio de Janeiro - RJ - CEP 20040-040
Tels.: (21) 3543-0770/(11) 5080-0770 1 Fax: (21) 3543-0896
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parte, em quaisquer formas ou por quaisquer meios (eletrnico, mecnico, gravao, fotocpia, distribuio pela Internet ou outros), sem permisso, por escrito, da EDITORA GUANABARA KOOGAN
LTDA.

Capa: Editora Guanabara Koogan


Editorao eletrnica: l""*l..nthares
Projeto grfico: Editora Guanabara Koogan
Ficha catalogrfica
F439d
3.ed.
Ferreira, Antonio Walter
Diagnstico laboratorial das principais doenas infecciosas e autoimunes :
correlaes clnico-laboratoriais / Antonio Walter Ferreira e Sandra do Lago Moraes.
- 3. ed. - Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
il.
ISBN 978-85-277-2302-2
1. Doenas transmissveis - Diagnstico. 2. Doenas parasitrias - Diagnstico.
3. Doenas autoimunes - Diagnstico 1. Moraes, Sandra do Lago. li. Ttulo.
13-01624.

CDD: 616.90475
CDU: 616.9

Colaboradores

Adelaide Jos Vaz, MSc, PhD (in memoriam)


Professora Associada do Departamento de Anlises Clnicas
da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de
So Paulo - USP.
Aida Maria da Cruz, MD, PhD
Professora Associada da disciplina Parasitologia da Faculdade
de Cincias Mdicas da Universidade do Estado do Rio de
Janeiro - UERJ. Pesquisadora Titular em Sade Pblica do
Laboratrio Interdisciplinar de Pesquisas Mdicas do Instituto
Oswaldo Cruz/Fiocruz.
Alexandre Meneghello Fuentefria, Se, PhD
Professor Adjunto Doutor do Departamento de Anlises
da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul - UFRG.
Alusio Augusto Cotrim Segurado, MD, PhD
Professor Titular do Departamento de Molstias Infecciosas e
Parasitrias da Faculdade de Medicina da Universidade de So
Paulo - USP.
Ana Karolina Barreto de Oliveira, MD, MSc
Mdica colaboradora do Ambulatrio de Imunodeficincias
Primrias do Servio de Imunologia Clnica e Alergia
do Hospital das Clnicas - FMUSP.
Ana Marisa Fusco Almeida, MSc, PhD
Professora Assistente Doutora da disciplina Micologia Clnica
do Departamento de Anlises Clnicas da Faculdade de
Cincias Farmacuticas da Unesp (Araraquara). Docente do
Programa de Ps-Graduao em Biocincias e Biotecnologia
Aplicada Farmcia.
Angela Maria Egydio de C. Barreto, MSc
Chefe do Departamento de Diagnstico da Sorologia da
Fundao Pr-Sangue - Hemocentro de So Paulo.
Benedito Anselmo Peres, PhD
Professor Assistente Doutor do Departamento de Molstias
Infecciosas e Parasitrias da Faculdade de Medicina da
Universidade de So Paulo - USP.
Cludio Srgio Pannuti, MD, PhD
Professor Associado do Departamento de Molstias Infecciosas
e Parasitrias da Faculdade de Medicina da Universidade de
So Paulo - USP. Docente pesquisador do Laboratrio de
Virologia do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, da
Universidade de So Paulo.

Cristina Maria Kokron, MD, PhD


Professora Assistente Doutora e Colaboradora Mdica da disciplina Imunologia Clnica e Alergia do Hospital das Clnicas
da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo - USP.
Vice-Coordenadora do Laboratrio de Imunologia Clnica e
Alergia (LIM-60) - FMUSP.
Cristina Miuki Abe Jacob, MD, PhD
Professora Associada do Departamento de Pediatria e Chefe
da Unidade de Alergia e Imunologia do Instituto da Criana
do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de So Paulo - FMUSP.
Cristvo Luis Pitangueira Mangueira, MD, PhD, MBA
Gerente Mdico do Departamento de Patologia Clnica e
Anatomia Patolgica do Hospital Israelita Albert Einstein.
Mdico da seo de Imunologia do Laboratrio Central
do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de So Paulo - FMUSP.
Edite Hatsumi Y. Kanashiro, MSc
Pesquisadora do Laboratrio de Soroepidemiologia e Imunobiologia do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo.
Edna Maria Vissoci Reiche, MSc
Professora Associada do Departamento de Patologia, Anlises
Clnicas e Toxicolgicas do Centro de Cincias da Sade da
Universidade Estadual de Londrina. Responsvel pelos setores de Imunologia Clnica e Diagnstico Molecular do
Laboratrio de Anlises Clnicas do Hospital Universitrio da
Universidade Estadual de Londrina.
Edward Oliveira, MSc, PhD
Pesquisador Nvel II do CNPq e Pesquisador Adjunto no
Centro de Pesquisas Ren Rachou - Fundao Oswaldo Cruz.
Eide Dias Camargo
Pesquisadora Cientfica, Diviso de Biologia Mdica, Seo de
Sorologia, rea de Imunodiagnstico do Instituto Adolfo Lutz
de So Paulo, Secretaria de Estado da Sade.
Emanuela Avelar Silva Costa, MSc
Doutoranda em Cincias do Departamento de Molstias
Infecciosas e Parasitrias da Faculdade de Medicina da
Universidade de So Paulo - FMUSP.
Ester Cerdeira Sabino, MD, PhD
Professor Livre-Docente do Departamento de Molstias
Infecciosas e Parasitrias da Faculdade de Medicina da
Universidade de So Paulo - FMUSP.

VI

Gerusa Dreyer, MD, PhD


Professora Adjunta aposentada de Doenas Infecciosas
e Parasitrias do Departamento de Medicina Tropical da
Universidade Federal de Pernambuco - UFPE e Pesquisadora
Titular aposentada do Centro de Pesquisas Aggeu MagalhesFiocruz. Consultora Cientfica da ONG Amaury Coutinho
para Doenas Tropicais.
Guita Elefant, MSc, PhD
Pesquisadora Cientfica do Instituto de Medicina Tropical da
Universidade de So Paulo - USP.
lvani Lcia Leme, MSc, PhD
Pesquisadora Cientfica da disciplina Infectologia do
Departamento de Medicina da Universidade Federal de So
Paulo - UNIFESP e membro da Comisso de Epidemiologia
Hospitalar - Controle Ambiental do Hospital So Paulo.
Jerolino Lopes Aquino
Professor Titular aposentado de Parasitologia Mdica da
Faculdade de Cincias Mdicas da Universidade Federal de
Mato Grosso - UFMT. Chefe do setor de Parasitologia do
Laboratrio Carlos Chagas em Cuiab (MT).
Joo Renato Rebello Pinho, MD, PhD
Mdico do Departamento de Patologia Clnica do Hospital Israelita Albert Einstein e do Departamento de Gastrenterologia da
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo - FMUSP.
Jos Antnio Livramento, MD, PhD
Professor Livre-Docente do Departamento de Neurologia da
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo - FMUSP.
Scio do Laboratrio de Neurodiagnstico Spina Frana.
Jos Eduardo Levi, MSc, PhD
Pesquisador do Laboratrio de Virologia do Instituto de
Medicina Tropical da Universidade de So Paulo - USP. Chefe
do Laboratrio de Biologia Molecular da Fundao PrSangue/Hemocentro de So Paulo. Consultor de Pesquisas do
Banco de Sangue do Hospital Albert Einstein (SP).
Jos Figuerdo-Silva, PhD
Ex-Professor Titular do Departamento de Patologia do Centro
de Cincias da Sade da Universidade Federal de Pernambuco
- UFPE. Professor adjunto de Patologia da Faculdade de
Cincias Mdicas da Universidade Estadual do Piau UESPI.
Jos Marcos Pereira Costa, MD, MSc
Mdico Infectologista e Patologista Clnico do Hospital
Helipolis do Estado de So Paulo.
Jos Pascoal Simonetti, MSc
Pesquisador Titular da Fundao Oswaldo Cruz (Fiocruz).
Consultor Tcnico e Cientfico em Biologia Molecular,
Virologia, Imunovirologia, Biossegurana e Bioproteo.
Assessor Tcnico e Cientfico para a Superintendncia de
Vigilncia em Sade/CGLab/MS e para a Coordenao Geral
de Assuntos Regulatrios, Departamento do Complexo
Industrial e Inovao em Sade, Secretaria de Cincia,
Tecnologia e Insumos Estratgicos/MS.

Diagnstico Laboratorial
Kelly Aparecida Kanunfre, MSc, PhD
Pesquisadora Cientfica do Instituto de Medicina Tropical da
Universidade de So Paulo - USP.
Kioko Takei, MSc, PhD
Professora Doutora aposentada do Departamento de
Anlises Clnicas e Toxicolgicas da Faculdade de Cincias
Farmacuticas da Universidade de So Paulo - USP e responsvel pela Unidade de Imunologia do Servio de Laboratrio
Clnico do Hospital do Servidor Pblico Estadual de So
Paulo.
Lilian Ferri Passadore, MSc
Farmacutica do setor de Biologia Molecular do Laboratrio
de Anlises Clnicas do Hospital Universitrio da Universidade
de So Paulo - USP.
Luciana de Almeida Silva Teixeira, MD, MSc, PhD
Professora Adjunta da disciplina Doenas Infecciosas e
Parasitrias da Universidade Federal do Tringulo Mineiro UFTM.
Lus dos Ramos Machado, MD, PhD
Professor Assistente Doutor em Neurologia da Faculdade de
Medicina da Universidade de So Paulo. Membro e ex-chefe do
Grupo de Doenas Infecciosas do Sistema Nervoso do Hospital
das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So
Paulo - USP. Editor da revista Arquivos de Neuro-Psiquiatria.
Mara Pedreschi, MSc
Doutoranda em Cincias pela Faculdade de Medicina da
Universidade de So Paulo - FMUSP. Colaboradora do
Laboratrio de Imunologia Clnica e Alergia (LIM - 60) da
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo.
Mrcia de Souza Carvalho Melhem, MSc, PhD
Pesquisadora Cientfica nvel VI do Instituto Adolfo Lutz,
Coordenadoria de Controle de Doenas, Secretaria de Estado
da Sade.
Marcos Vincius da Silva, MD, MSc, PhD
Professor Associado do Departamento de Medicina da
Faculdade de Medicina da Pontifcia Universidade de
Campinas (SP), disciplina Doenas Infecciosas e Parasitrias.
Professor do Programa de Ps-Graduao em Cincias da
Coordenadoria de Controle de Doenas da Secretaria de
Sade do Estado de So Paulo. Diretor da Diviso Cientfica
do Instituto de Infectologia Emlio Ribas da Secretaria de
Sade do Estado de So Paulo.
Maria Carmen Arroyo Sanchez, MSc, PhD
Pesquisadora Cientfica do Laboratrio de Soroepidemiologia
e Imunobiologia do Instituto de Medicina Tropical da
Universidade de So Paulo - USP.
Maria Jos S. Mendes-Gianinni, MSc, PhD
Professora Titular do Departamento de Anlises Clnicas, disciplina Micologia Clnica da Faculdade de Cincias Farmacuticas
da Universidade Estadual Paulista - UNESP. Pr-Reitora
de Pesquisa da UNESP e membro do Conselho Superior da
Fundao de Amparo Pesquisa de So Paulo - FAPESP.

Diagnstico Laboratorial

VII

Mrio Endsfeldz Camargo, MD, PhD


Professor Assistente Doutor do Departamento de Molstias
Infecciosas e Parasitrias da Faculdade de Medicina da
Universidade de So Paulo - USP.

Sandra Trevisan Beck, MSc, PhD


Professora Associada de Imunologia Clnica do curso de
Farmcia da Universidade Federal de Santa Maria - UFSM
(RS).

Olavo Henrique Munhoz leite, MD


Infectologista do Hospital das Clnicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de So Paulo - SP. URDIP - CEPES,
Faculdade de Medicina do ABC.

Silvia Maria Di Santi, MSc, PhD


Pesquisadora Cientfica VI na Superintendncia de Controle
de Endemias. Professora Orientadora no Programa de
Ps-Graduao em Doenas Infecciosas e Parasitrias da
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo FMUSP.

Paulo Jaconi Saraiva, MSc, PhD


Professor Adjunto IV da Faculdade de Farmcia da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS. Diretor
Tcnico do Laboratrio !MUNO Pesquisas Clnicas.
Pedro Paulo Chieffi, MD, PhD
Professor Titular da Faculdade de Cincias Mdicas da Santa
Casa de So Paulo e Professor Assistente Doutor da Faculdade
de Medicina da Universidade de So Paulo (Instituto de
Medicina Tropical de So Paulo) - USP.
Regina Ayr Floria da Cunha, MSc, PhD
Professora Assistente Doutora aposentada do Departamento
de Anlises Clnicas da Faculdade de Cincias Farmacuticas
da Universidade de So Paulo - USP.
Regina Clia Rodrigues de Moraes Abdulkader, MSc, PhD
Professora Orientadora do Programa de Ps-Graduao em
Nefrologia da Faculdade de Medicina da Universidade de So
Paulo - USP.
Sandra Regina Rodrigues Simonetti, MSc, PhD
Tecnologista em Sade Pblica do Instituto Oswaldo Cruz,
Fundao Oswaldo Cruz.

Sumie Hoshino-Shimizu, PhD


Pesquisadora Associada do Instituto de Medicina Tropical
de So Paulo - USP. Professora Titular do Departamento de
Anlises Clnicas da Faculdade de Cincias Farmacuticas
- USP. Orientadora ad hoc nos cursos de Ps-Graduao
da USP e da Universidade Est adual de Campinas UNICAMP.
Thelma Suely Okay, MD, PhD
Professora Livre-Docente pela Faculdade de Medicina
da Universidade de So Paulo - FMUSP. Coordenadora
do Programa de Ps-Graduao em Medicina Tropical
e Sade Internacional da USP. Chefe do Laboratrio de
Soroepidemiologia e Imunobiologia do Instituto de Medicina
Tropical de So Paulo.
Yoshimi lmoto Yamamoto, MSc, PhD
Professora Assistente Doutora aposentada da Faculdade
de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo
- USP. Professora do curso de Farmcia do Centro de
Cincias Biolgicas e da Sade da Universidade Presbiteriana
Mackenzie.

Homenagens

Prestamos uma singela homenagem Prof. Dr. Adelaide Jos Vaz, amiga e colaboradora, que
faleceu em 27 de setembro de 2011, deixando-nos um enorme vazio.
Farmacutica bioqumica, formada pela Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade
de So Paulo, iniciou suas atividades profissionais como pesquisadora do Instituto Adolfo Lutz, na
seo de Sorologia, realizando e desenvolvendo testes para o diagnstico de doenas infecciosas e
parasitrias. Para entender melhor as questes jurdicas, ainda ingressou na Faculdade de Direito
do Largo de So Francisco, na qual concluiu o curso em 1995.
A partir de 1994, ingressou como docente em turno completo na Faculdade de Cincias
Farmacuticas da USP, na qual teve a oportunidade de ensinar e difundir conhecimentos, orientando e formando mestres e doutores, alm de publicar inmeros trabalhos cientficos - principalmente sobre neurocisticercose - com repercusso nacional e internacional.
Destacou-se como professora de cursos de graduao e ps-graduao de vrias outras instituies de ensino - Universidade de Guarulhos, Universidade Paulista, Universidade So Judas Tadeu e Faculdades Oswaldo
Cruz - e recebeu inmeras homenagens por sua conduta tica e profissional.
Participou do Conselho Regional de Farmcia do Estado de So Paulo, como Conselheira e Presidente, no perodo de 1990 a
1993, atuando com firmeza na defesa do interesse do profissional farmacutico.
Tive o prazer de orient-la em sua dissertao de mestrado e em sua tese de doutorado, concluda em 1993, no Departamento
de Imunologia do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo. Adelaide foi uma aluna exemplar. Autodidata,
comprometida, responsvel e criativa, foi muito mais uma parceira do que uma orientanda. Como orientador, tambm aprendi
muito sobre neurocisticercose, sua rea de atuao favorita.
Adelaide deixou saudades.

Nascido em 12 de maio de 1922, em So Paulo, Mrio Endzfeld Camargo estava predestinado a ser uma figura importante no mundo da pesquisa em anlises clnicas, principalmente
no diagnstico sorolgico de doenas infecciosas e parasitrias. Formado em Medicina pela
tradicional Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo em 1946, comeou o seu
trabalho no laboratrio de anlises clnicas do Hospital Sorocabano. No incio da dcada de
1960 foi convidado pelo Prof. Carlos da Silva Lacaz, diretor do Instituto de Medicina Tropical
de So Paulo - IMTSP, a chefiar o Laboratrio de Sorologia. No mesmo perodo, foi convidado a fazer parte do Laboratrio de Anlises Clnicas Fleury, hoje Fleury Medicina e Sade.
Com brilhantismo defendeu seu doutorado em 1964, introduzindo uma nova metodologia
para o diagnstico da toxoplasmose. A metodologia idealizada por Camargo, como gosta
de ser chamado entre seus amigos e discpulos, abriu perspectivas sem limites para a utilizao da reao de imunofluorescncia no diagnstico sorolgico. No IMTSP criou o curso
de Imunofluorescncia, sendo o responsvel pela formao de centenas de profissionais no Brasil e no exterior. Membro da
Organizao Mundial da Sade, ministrou conferncias e cursos pelo Brasil e em diferentes pases da Amrica Latina, alm
de ter orientado inmeros profissionais em teses de mestrado e doutorado. Foi dele a ideia de utilizar classes de imunoglobulinas e a propriedade da afinidade funcional dos anticorpos IgG para avaliar fases clnicas das doenas. Publicou dezenas
de trabalhos, sempre pioneiros e de grande repercusso nacional e internacional. Coordenou a parte laboratorial do maior
inqurito soroepidemilogico j realizado no mundo, para que pudssemos conhecer a real situao da doena de Chagas no
Brasil. Se como pesquisador notvel, como homem e sempre ser um amigo leal, admirado por todos que o conhecem.
Prof. Dr. Mrio E. Camargo, um homem frente do seu tempo.

Antonio Walter Ferreira

Apresentao

Nos ltimos anos, a incorporao de laboratrios de pequeno e de mdio porte a grandes redes tem possibilitado a execuo de rotinas laboratoriais mais amplas somente com processos automatizados e totalmente informatizados. Alm disso,
mtodos de biologia molecular comearam a ser utilizados na
realizao de exames, e a nanotecnologia padronizada para os
microarrays ou sistemas multiplex- que h 10 anos eram apenas uma utopia - ganharam espao ao apresentar perfis definidos para diferentes situaes clnicas. Entretanto, o excesso
de informaes fornecidas nos laudos dos laboratrios muitas
vezes gera dvidas de interpretao sobre o valor clnico dos
resultados, confundindo os profissionais em sua suspeita clnica inicial. Por isso, o conhecimento dos princpios dos testes
e o valor da informao decorrente dos resultados devem ser
cuidadosamente analisados pelos responsveis pelo diagnstico laboratorial, para que sejam capazes de esclarecer dvidas e
transmitir seus conhecimentos queles que necessitam.
Com o intuito de colaborar na construo desse conhecimento, apresentamos a terceira edio de Diagnstico
Laboratorial. Importantes alteraes foram realizadas nesta

edio, a comear pelo desenho grfico, estendendo-se pelo


texto, que foi cuidadosamente revisto e atualizado em funo
da rpida evoluo dos testes utilizados em patologia clnica.
Buscamos ainda responder aos questionamentos mais frequentes, bem como elucidar a utilizao de produtos registrados no
Ministrio da Sade, levando em considerao seus limites.
Agradecemos em especial aos dedicados colaboradores
desta obra, sem os quais esta edio no se tornaria realidade.
Especialistas em suas reas de atuao, eles souberam expor
objetivamente seus conhecimentos, tornando o texto claro e
didtico. Todos os convidados entenderam que esta atualizao era uma necessidade reivindicada por profissionais e
estudantes da rea da sade, que sentiram a lacuna deixada
durante os anos que se passaram desde o lanamento da ltima edio.
Agradecemos tambm Editora Guanabara Koogan, selo
do GEN, pela confiana.

Antonio Walter Ferreira e


Sandra do Lago Moraes

Sumrio

Seo 1

Metodologia Geral, 1

1 Sorologia ! Importncia e Parmetros, 3


Importncia dos testes sorolgicos na patologia clnica, 4
Importncia da pesquisa de anticorpos no diagnstico
individual, 4
Importncia da pesquisa de anticorpos em
inquritos soroepidemiolgicos, 5
Importncia da pesquisa de antgenos, 6
Parmetros para validao de um teste diagnstico, 6
Aplicao de testes diagnsticos, 1O
Bibliografia, 11

Hepatite A, 74
Hepatite B, 76
Hepatite C, 82
Hepatite delta, 87
Vrus da hepatite E, 89
Hepatites no A, no B, no C, no D, no E(no A-E), 91
Sumrio do diagnstico laboratorial das hepatites virais, 92
Referncias bibliogrficas, 94

8 Infeco por HPV, 113


Introduo, 114
Diagnstico laboratorial, 116
Referncias bibliogrficas, 119

9 Infeco por HTLV-1 e HTLV-11, 120


Agente etiolgico, 121
Resposta imunolgica infeco por HTLV, 122
Patognese e manifestaes clnicas, 122
Epidemiologia, 123
Diagnstico, 125
Referncias bibliogrficas, 131

3 Diagnstico Molecular, 54
Referncias bibliogrficas, 57

Seo 2
4

Vrus, 59

Citomegalia, 61
Introduo, 62
Caractersticas do vrus, 62
Aspectos clnicos e epidemiolgicos, 62
Diagnstico laboratorial, 63
Correlao clnico-laboratorial, 65
Referncias bibliogrficas, 67

5 Dengue,69
Diagnstico laboratorial, 70
Bibliografia, 72

Infeco por HIV, 97


Consideraes gerais em virologia e biologia molecular, 98
Epidemiologia, 103
Frmacos antirretrovirais, 105
Diagnstico laboratorial, 108
Bibliografia, 11 O

2 Testes Sorolgicos, 12
Introduo, 13
Precipitao, 13
Aglutinao, 18
Ensaios lticos, 20
Teste de imunofluorescncia, 21
Tcnicas com marcadores radioativos, 24
Tcnicas imunoenzimticas, 27
Ensaios quimioluminescentes, 36
Microscopia imunoeletrnica, 37
Ensaios imunocromatogrficos, 39
Tcnicas empregadas na automao, 41
Bibliografia, 48

Hepatites Virais, 73

o Mononucleose Infecciosa, 135


Introduo, 136
Epidemiologia e transmisso, 136
Caractersticas do vrus, 137
Diagnstico laboratorial, 138
Referncias bibliogrficas, 140

11 Rubola, 142
Introduo, 143
Epidemiologia, 143
Aspectos clnicos, 145
Vrus da rubola e seus antgenos, 146
Resposta imune infeco e interpretao clnica dos resultados, 147
Diagnstico laboratorial, 150
Referncias bibliogrficas, 152

Diagnstico Laboratorial

XIV

Seo 3 1 Bactrias, 155


12 Enterococcias, 15 7
Introduo, 158
Microbiologia, 158
Significado clnico e epidemiologia, 162
Interpretao do diagnstico laboratorial, 166
Consideraes finais, 166
Bibliografia, 166

13 Estafilococcias, 170
Introduo, 171
Infeces por estafilococos resistentes meticilina, 171
Taxonomia e descrio do gnero Staphylococcus, 172
Resistncia a antimicrobianos, 176
Tendncias sobre mtodos laboratoriais de
isolamento e identificao, 180
Referncias bibliogrficas, 181
14 Estreptococcias, 183
Classificao geral e etiopatogenia, 184
Streptococcus pyogenes, 184
Streptococcus agalactiae, 187
Streptococcus pneumoniae, 189
Vacinas, 190
Referncias bibliogrficas, 191

15 Infeces por Clamdias e Clamidfilas, 194


Introduo, 195
Mtodos laboratoriais de diagnstico, 200
Interpretao e repercusso dos resultados, 204
Bibliografia, 204
16 Infeco por Micoplasmas, 206
Introduo, 207
Micoplasmas humanos de interesse clnico, 208
Referncias bibliogrficas, 216

17 Leptospirose Humana, 218


Introduo, 219
Diagnstico laboratorial, 220
Bibliografia, 225
18 Meningites Bacterianas Agudas, 227
Introduo, 228
Diagnstico, 229
Tratamento, 230
Diagnstico diferencial, 232
Evoluo, 232
Bibliografia, 233

19 Sfilis, 234
Introduo, 235
Diagnstico laboratorial, 235
Utilizao e interpretao dos
testes para sfilis, 237
Referncias bibliogrficas, 240

20 Tuberculose, 242
Introduo, 243
Diagnstico clnico-laboratorial, 244
Micobacterioses, 248
Referncias bibliogrficas, 252

Seo 4 1 Protozorios, 255


21 Amebase, 257
Introduo, 258
Diagnstico laboratorial, 259
Diferenciao das amebas parasitos do trato intestinal, 265
Concluso, 266
Bibliografia, 267

22 Doena de Chagas, 268


Introduo, 269
Aspectos clnicos e epidemiolgicos, 270
Diagnstico de laboratrio, 271
Padronizao do diagnstico de laboratrio da doena de Chagas, 275
Bibliografia, 276

23 Leishmanioses, 277
Introduo, 278
Diagnstico da leishmaniose visceral, 278
Diagnstico da leishmaniose tegumentar, 280
Bibliografia, 282

24 Malria, 283
Introduo, 284
Diagnstico clnico, 286
Diagnstico de laboratrio, 286
Malria transmitida por transfuso, 295
Concluso, 296
Referncias bibliogrficas, 297

25 Protozooses Emergentes, 300


Introduo, 301
Cryptosporidium spp., 301
Cyclospora cayetanensis, 301
Microspordeos, 302
Referncias bibliogrficas, 303

26 Toxoplasmose, 304
Aspectos epidemiolgicos e parasitolgicos, 305
Aspectos clnicos, 305
Diagnstico laboratorial, 305
Referncias bibliogrficas, 313

Seo 5 1 Helmintos, 317


27 Esquistossomose Mansnica, 319
Introduo, 320
Diagnstico laboratorial, 320
Consideraes finais, 325
Referncias bibliogrficas, 325

Diagnstico Laboratorial

28 Filariose Bancroftiana, 329


Introduo, 330
Correlao clnico-laboratorial, 330
Diagnstico da infeco ativa, 333
Linfocintigrafia, 335
Referncias bibliogrficas, 335

29 Hidatidose, 337
Introduo, 338
Etiologia, 338
Epidemiologia, 339
Diagnstico, 340
Bibliografia, 345

30 Neurocisticercose, 347
Introduo, 348
lmunobiologia da neurocisticercose humana, 348
Aspectos clnico-epidemiolgicos, 348
Diagnstico da neurocisticercose, 349
Consideraes finais, 350
Bibliografia, 350

31 Toxocarase, 351
Introduo, 352
Gnero Toxocara, 352
Epidemiologia, 352
Manifestaes clnicas, 353
Alteraes laboratoriais, 354
Tratamento, 354
Diagnstico, 355
Perspectivas, 360
Referncias bibliogrficas, 360

XV

Seo 6 1 Fungos, 363


32 Infeces Fngicas, 365
Introduo, 366
Qualidade em laboratrio de micologia, 367
Exames micolgicos, 368
Identificao de culturas de fungos, 376
Metodologias auxiliares de diagnstico micolgico, 385
Micoses superficiais, 393
Micoses cutneas, 397
Micoses cutneas e sistmicas, 403
Fungos dimrficos causadores de micoses sistmicas, 416
Fungos demcios, 431
Outras micoses, 438
Bibliografia, 440

Seo 7 1 Alergias, 447


33 Doenas Alrgicas, 449
Introduo, 450
Diagnstico das alergias, 450
Bibliografia, 457

Seo 8 1 Doenas Autoimunes, 459


34 Doenas Autoimunes Sistmicas, 461
Introduo, 462
Mtodos de deteco, 462
Interpretao dos testes laboratoriais em situaes clnicas especficas, 465
Referncias bibliogrficas, 470

ndice Alfabtico, 471

u 01munes

Se o 1

Metodologia
Geral

Captulo 1

e Parmetros

Antonio Walter Ferreira e


Sandra do Lago Moraes

Importncia dos testes sorolgicos na


patologia clnica, 4
Importncia da pesquisa de anticorpos
no diagnstico individual, 4
Importncia da pesquisa de anticorpos
em inquritos soroepidemiolgicos, 5
Importncia da pesquisa de antgenos, 6
Parmetros para validao de um
teste diagnstico, 6
Aplicao de testes diagnsticos, 1O
Bibliografia, 11

. . . Importncia dos testes sorolgicos


na patologia clnica
O diagnstico de certeza de um processo infeccioso a
demonstrao do patgeno ou de seus produtos nos tecidos ou
fluidos biolgicos dos hospedeiros; porm, nem sempre isso
possvel, seja pela ausncia do agente infeccioso, pela falta
de sensibilidade dos mtodos utilizados, por falhas tcnicas
ou pelos longos perodos exigidos para uma resposta do laboratrio. Os mtodos imunolgicos diretos ou indiretos tm
sido amplamente utilizados para suprirem as deficincias dos
mtodos parasitolgicos ou microbiolgicos, na pesquisa de
antgenos, anticorpos ou imunocomplexos, em funo de sua
rapidez, simplicidade de execuo, possibilidade de automao
e seu baixo custo operacional. O conhecimento da aplicao
dos testes sorolgicos e a interpretao correta dos resultados
obtidos so fundamentais para clnicos, patologistas e laboratoristas orientarem o seu trabalho, visando ao diagnstico
correto, associando sempre os resultados obtidos s investigaes clnicas e epidemiolgicas. Na pesquisa de anticorpos, os
testes sorolgicos tm sido utilizados com sucesso, como auxiliares importantes no diagnstico individual ou em inquritos
soroepidemiolgicos, graas s mltiplas possibilidades com
que podem ser empregados.

. . . Importncia da pesquisa de
anticorpos no diagnstico individual
Elucidao de processos patolgicos com
sintomas e sinais clnicos confundveis
Como exemplo, so citadas, entre outras patologias, toxoplasmose e mononucleose infecciosa, toxoplasmose e rubola,
sfilis secundria e dermatoviroses ou processos alrgicos e
hepatites B e C. A pesquisa de anticorpos especficos por testes
rigorosamente padronizados de grande valia na definio da
suspeita clnica principal.

Diferenciao da fase da doena


Em algumas patologias, principalmente as que provocam
fetopatias, como toxoplasmose, sfilis, citomegalia, rubola,
doena de Chagas, a deteco de diferentes classes de imunoglobulinas especficas ao agente infeccioso na circulao
dos pacientes importante na identificao da fase da infeco. A mudana da classe de imunoglobulina ocorre durante
a resposta imune, seguindo uma ordem geneticamente
determinada. Assim, a imunoglobulina IgM a primeira a
ser formada, sendo normalmente encontrada nos processos agudos, enquanto a imunoglobulina IgG encontrada no
final dos processos agudos permanece durante longos perodos na circulao do hospedeiro, como imunoglobulina de
memria, estando muitas vezes relacionada com a proteo
do indivduo. Em algumas infeces, como na toxoplasmose
ou na citomegalia, outras imunoglobulinas como a IgE e a
IgA especficas tm sido estudadas, uma vez que o perodo de
permanncia na circulao aps o incio do processo infeccioso menor do que o da imunoglobulina IgM, fornecendo
maior preciso da fase aguda da doena. Dada a importncia
dessa pesquisa, resultados falso-positivos ou negativos devem

Diagnstico Laboratorial
ser evitados, bem como a correta interpretao dos resultados
deve ser devidamente conhecida. Mtodos sorolgicos com
base na avidez ou afinidade funcional dos anticorpos IgG j
esto sendo utilizados para a avaliao da fase recente de diferentes patologias. Na toxoplasmose a utilizao dessa metodologia tem permitido caracterizar com maior preciso a fase
recente da doena, evitando falsas interpretaes. Quando
so utilizados mtodos mais sensveis, anticorpos IgM anti- T.
gondii residuais permanecem por perodos superiores queles
detectados por imunofluorescncia indireta. A associao de
testes, inclusive a avidez de anticopos IgG, tem definido novos
perfis na toxoplasmose.

Diagnstico de doena congnita


A propriedade da imunoglobulina IgM de no atravessar
a barreira placentria tem desempenhado papel importante
na definio de doenas congnitas. Os achados de anticorpos IgM anti-T. pallidum no sangue de cordo umbilical, no
momento do parto, tm sido considerados patognomnicos de
sfilis congnita. Anticorpos IgG anti- T. pallidum aps o nascimento podem indicar um processo infeccioso congnito ou
estar simplesmente relacionados com a transmisso maternofetal dessa imunoglubulina, que permanece na circulao do
recm-nascido at o 5 ou 6 ms de vida. O acompanhamento
do recm-nascido por vrios meses e a diminuio seguida
do aumento gradual dessa imunoglobulina indicam a doena
congnita. Essa definio tardia, entretanto, prejudica o tratamento, que j deveria ter sido institudo. A sensibilidade dos
mtodos de deteco de anticorpos IgM e a correta interpretao dos resultados so fundamentais nessa pesquisa.

Seleo de doadores de sangue


No Brasil, h normas tcnicas determinadas pelo Ministrio
da Sade para seleo de doadores de sangue. Alm das triagens clnica e epidemiolgica, a triagem sorolgica tem um
papel de destaque na preveno da doena transfusional
para doena de Chagas, sfilis, hepatites B e C, sndrome da
imunodeficincia adquirida (AIDS) e HTLV-1 e II. Os testes
utilizados devem apresentar alta sensibilidade, e a associao
de dois ou mais testes de princpios diferentes tem sido recomendada em normas tcnicas pelo Ministrio da Sade como
alternativa para obteno de ndices mximos de sensibilidade
e especificidade no resultado final. Muito se tem discutido
sobre os critrios de seleo quando so utilizados testes que
pesquisam anticorpos IgG contra determinados patgenos. O
enfoque da discusso relevante, pois muitas vezes os achados
desses anticorpos referem-se a infeces passadas e j tratadas, no implicando risco transfusional. Na impossibilidade
de outros meios de seleo, e enquanto o mtodo reao em
cadeia da polimerase (PCR - polimerase chain reaction) no
integralmente padronizado para uso rotineiro dos bancos
de sangue, os testes sorolgicos continuam desempenhando
sua funo de selecionar doadores, mesmo nos casos em que o
patgeno j no est na circulao dos doadores.

Seleo de doadores e receptores de rgos


para transplantes
Anticorpos altamente especficos para determinantes estruturais individuais que caracterizam diferentes antgenos do
complexo principal de histocompatibilidade (sistema HLA)

Captulo 1

Sorologia ! Importncia e Parmetros

so utilizados em testes de linfocitotoxicidade. A reao entre


antgenos encontrados nos linfcitos e os soros que contm
anticorpos especficos anti-HLA torna possvel identificar
quais so os antgenos HLA expressos por diferentes indivduos. A tipagem desses antgenos importante na seleo de
doadores e receptores de rgos em transplantes.

Avaliao do prognstico da doena


Anticorpos contra determinados componentes antignicos
de microrganismos podem ser utilizados como marcadores
imunolgicos para avaliao do prognstico de uma doena.
Tomando-se como exemplo a hepatite B, componentes estruturais do vrus induzem a formao de anticorpos que so
utilizados como marcadores imunolgicos na avaliao dos
pacientes. Um antgeno solvel, denominado antgeno HBe
(HBeAg), relacionado com a infectividade e contagiosidade do
vrus, induz a formao de anticorpos anti-HBe, que surgem
na circulao do paciente, como primeiro marcador de recuperao de um processo patolgico crnico e tem sido utilizado
inclusive na avaliao da eficcia de a.-interferon como agente
quimioterpico. A ausncia desse marcador durante a evoluo
do processo crnico sempre um mau prognstico da doena.
Tambm na paracoccidioidomicose, a associao das respostas
humoral e celular tem sido utilizada no apenas na avaliao
do prognstico da doena, mas tambm para avaliar a resposta
quimioterapia instituda. Resposta humoral em altos ttulos,
com resposta celular ausente, indica um mau prognstico da
doena e ausncia de resposta medicamentosa.

Avaliao da eficcia da teraputica e


da suspenso da teraputica
O sucesso da teraputica pode acompanhar-se de queda
gradual dos anticorpos na circulao dos pacientes. Essa propriedade tem sido utilizada em muitas patologias para avaliar a eficcia e a suspenso da teraputica instituda. No caso
da sfilis, anticorpos anticardiolipina detectados no teste do
VDRL tm queda gradual quando a teraputica bem-sucedida, fato no observado para os anticorpos antitreponmicos,
que permanecem na circulao por longos perodos, de meses
a anos, mesmo aps a cura do paciente. Deve-se ficar atento
sorologia da sfilis, pois muitas vezes um resduo de anticorpos anticardiolipina em ttulos baixos (1/2, 1/4), por perodos
maiores que 2 meses, indica a cura do paciente e possibilidade
da suspenso da teraputica.

Avaliao da imunidade especfica naturalmente


adquirida ou artificialmente induzida
Anticorpos IgG especficos para componentes antignicos de um determinado microrganismo podem ser utilizados
como marcadores de imunidade especfica de um indivduo a
esse microrganismo. Em algumas patologias, como as viroses,
no difcil definir qual o melhor imungeno a ser utilizado.
Quanto mais complexa for a constitutio antignica do patgeno, mais difcil ser a definio do componente estrutural
alvo para a produo da vacina. Parasitos, como plasmdios,
leishmnias etc., tm sido exaustivamente estudados durante
muitos anos, mas, somente agora, com o advento da biologia molecular, resultados promissores tm sido alcanados,
principalmente quando so associadas as respostas celular e
humoral dos indivduos.

5
Nveis de anticorpos protetores determinados por testes
sorolgicos altamente sensveis e especficos tm importncia fundamental na avaliao da imunidade do indivduo.
Citem-se como exemplos a rubola, a difteria e o ttano.
Na rubola, o teste feito em sistemas automatizados possibilita estabelecer com rigor os nveis de anticorpos protetores
em unidades internacionais. Assim, nveis inferiores a 20 UI/
mf so interpretados como negativos (ausncia de anticorpos); nveis entre 20 e 30 UI/mf so interpretados como anticorpos presentes, porm no protetores; e nveis maiores de
30 UI/mf so interpretados como anticorpos presentes e protetores. O exemplo mostra claramente a necessidade de testes
altamente sensveis e especficos para deteco de pequenas
quantidades de anticorpos, que, na clnica mdica, tm grande
importanc1a.
'

'

Agravamento da patologia
Os achados de autoanticorpos durante a evoluo de um
processo patolgico esto relacionados com o agravamento
da patologia. Nos casos graves de esquistossomose, hepatite B,
malria etc., observam-se anticorpos contra estruturas do prprio indivduo. Imunocomplexos depositados em nvel de glomrulos tambm podem representar um agravamento da patologia e ser facilmente detectados por testes sorolgicos, como,
por exemplo, imunofluorescncia indireta anticomplemento.

..,. Importncia da pesquisa


de anticorpos em inquritos
soroepidem iolgicos
Prevalncia da doena
A prevalncia da doena pode ser estabelecida pela pesquisa de anticorpos IgG em amostras de sangue coletadas com
rigoroso critrio epidemiolgico. Na dcada de 1970, foi elaborado um trabalho conjunto entre o Ministrio da Sade e o
Instituto de Medicina Tropical de So Paulo (IMT-SP), para
se estabelecer a prevalncia da doena de Chagas no pas pela
pesquisa de anticorpos IgG anti-T. cruzi. O trabalho teve xito
pela associao de laboratrios de vrios estados brasileiros
credenciados pelo IMT-SP e aps intenso treinamento dos
tcnicos envolvidos no projeto. O Departamento de Medicina
Preventiva da Faculdade de Medicina da Universidade de So
Paulo orientou a coleta do material, seguindo padres estatsticos definidos, e o Ministrio da Sade garantiu todo o apoio
logstico para o trabalho de campo. O somatrio de esforos
possibilitou o conhecimento do nmero de indivduos infectados e serviu de base para aes ministeriais; foi o maior
inqurito sorolgico j realizado em todos os tempos.

Erradicao da doena
A erradicao de determinada doena em uma regio pode
ser verificada por testes sorolgicos. A ausncia de anticorpos contra o patgeno em crianas nascidas no local expostas s condies ambientais forte indcio da erradicao da
doena. O acompanhamento sorolgico dessas crianas por
um perodo de tempo necessrio para confirmao dos
resultados. Foi realizado um novo inqurito epidemiolgico
para determinao da prevalncia da doena de Chagas em

Diagnstico Laboratorial

6
crianas de O a 5 anos, durante o perodo de 2001 a 2008. Os
resultados mostraram diminuio significativa da transmisso
vetorial e pouca transmisso vertical.

Reintroduo de novos casos


em reas consolidadas
Achados de anticorpos IgM ou aumento do ttulo de anticorpos IgG contra determinado patgeno so indcios da
reintroduo de uma doena em reas onde ela j estava erradicada. Dessa maneira, o monitoramento sorolgico de uma
determinada rea, desde que realizado com rigor tcnico e
reagentes bem padronizados, possibilita aes corretivas que
evitem novos focos, fazendo parte de um programa de vigilncia sanitria.

..,. Importncia da pesquisa


de antgenos
Critrio de cura
A ausncia do patgeno ou de seus produtos aps um
processo infeccioso est diretamente relacionada com a
cura do paciente. Os testes sorolgicos utilizados para definio dessa possibilidade devem apresentar elevados nveis
de sensibilidade e especificidade por meio da utilizao de
anticorpos altamente especficos em tcnicas rigorosamente
padronizadas.

Definio da etiologia da doena


O encontro do patgeno no hospedeiro define o processo
infeccioso. Essa pesquisa, atualmente feita com sucesso pela
reao em cadeia da polimerase (PCR), tem de ser rigorosamente avaliada para que no sejam cometidos erros de
interpretao. Patologistas franceses, estudando biopsias de
gnglios de pacientes selecionados ao acaso, encontraram
toxoplasmas. O estudo retrospectivo desses pacientes mostrou que, em muitos casos, no havia relato de toxoplasmose,
supondo-se um equilbrio entre o parasito e o hospedeiro.
Os mtodos imunolgicos ou a PCR, por serem muito sensveis, podem detectar reaes positivas sem implicao com a
doena do hospedeiro.

Seleo de doadores de sangue


Selecionar doadores de sangue pela pesquisa do agente
etiolgico de uma patologia passvel de ser transmitida por
transfuso de sangue uma meta importante no diagnstico.
Essa pesquisa, indicativa de um processo agudo, poderia
ser utilizada mesmo na fase em que a pesquisa de anticorpos ainda negativa, fase pr-sorolgica. Os testes devem
apresentar nveis mximos de sensibilidade e especificidade.
Como exemplo, cita-se a pesquisa do antgeno de superfcie da hepatite B, HBsAg. A dificuldade dessa pesquisa por
mtodos imunolgicos para outros microrganismos, como
os parasitos, est na definio do antgeno-alvo a ser estudado, pela complexidade antignica e pela falha, em muitos
casos, da resposta imune a esses epitopos selecionados. Desse
modo, os mtodos moleculares para pesquisa do DNA so os

mais promissores.

Inquritos epidemilogicos
Embora mais restrita, essa aplicao tem sido utilizada
por muitos laboratrios. Em 1985, foi realizado um projeto
em colaborao com a Dra. Ruth Nussenzweig do laboratrio
de parasitologia do Centro Mdico da Universidade de Nova
York (New York University Medical Center [NYUMC]), para
pesquisa de esporozotos em mosquitos capturados na regio
amaznica, por teste imunoenzimtico com anticorpos monoclonais antiesporozotos de Plasmodium falciparum, P. vivax
e P. malariae. Os resultados serviram para mapear as regies
transmissoras de malria e identificar as espcies infectantes.
Trabalhos semelhantes foram realizados por outros autores
em diferentes regies do mundo.
Pelo exposto, fica claro que os testes sorolgicos desempenham um papel fundamental na patologia clnica como
auxiliares no diagnstico de uma suspeita clnica principal. Devemos lembrar, entretanto, que os resultados obtidos
podem variar em funo de uma srie de fatores relacionados
com a resposta imune do hospedeiro e com as variaes antignicas do patgeno. Esses fatores podem levar a resultados
falso-positivos pela possibilidade de reaes cruzadas contra
determinantes antignicos comuns encontrados nos parasitos,
contra antgenos ubiquitrios ou em razo de uma resposta
exacerbada do hospedeiro pela ativao policlonal de clulas B
ou a resultados falso-negativos pela ausncia de resposta imunolgica contra epitopos dos parasitos.
Todos os ramos da cincia mdica caminham na busca
incessante de um teste ou de um processo de referncia que
possa definir a presena ou a ausncia da doena no paciente,
ou seja, um teste padro-ouro (do ingls, gold standard test).
Contudo, os fatores anteriormente relacionados e outros parmetros a serem ainda discutidos devem ser rigorosamente
analisados para que a definio do processo infeccioso seja a
mais prxima do verdadeiro estado clnico do paciente.

..,. Parmetros para validao


de um teste diagnstico
Vrios parmetros devem ser analisados para a validao de
um teste diagnstico. A validade intrnseca de um teste, que
o desempenho do teste quando comparado a um teste de referncia, pode ser avaliada por parmetros como sensibilidade,
especificidade e eficincia. Estes so caractersticos do teste, e
no da populao em que est sendo aplicado; portanto, fornecem resultados consistentes independentemente da prevalncia da doena. J os valores preditivos dos resultados positivos e negativos do teste so parmetros que dependem da
prevalncia da doena na populao em estudo. A validade
extrnseca a capacidade do teste em detectar a real situao
da populao em relao doena que est sendo estudada e
tambm o desempenho do teste em uma determinada populao e pode ser avaliada por parmetros como reprodutibilidade, acurcia e preciso.

Parmetros intrnsecos
Muito importante na definio dos parmetros intrnsecos
a amostragem a ser utilizada. Devemos selecionar populaes de indivduos sabidamente doentes e no doentes para
cuja finalidade diagnstica o teste se destina. Por exemplo, ao se
padronizarem testes para o diagnstico da doena de Chagas,

Captulo 1

Sorologia !Importncia e Parmetros

devem-se escolher como indivduos doentes aqueles que apresentem alteraes clnicas e xenodiagnstico positivo. Para
evitar problemas de resultados falso-positivos, deve-se selecionar como indivduos no doentes aqueles residentes em
reas endmicas da doena, sem alteraes clnicas e com
xenodiagnstico negativo. Evidentemente, para selecionar os
indivduos doentes, deve-se levar em considerao as diferentes fases do processo infeccioso e coletar as amostras de sangue dessas fases, para avaliao do comportamento global do
teste. Como a sensibilidade do xenodiagnstico muito baixa
na fase crnica da doena, outros fatores devero ser considerados na seleo das amostras de sangue, como a epidemiologia e os achados clnicos e laboratoriais.
Para a definio dos parmetros de validao intrnseca de
um teste, foi utilizada uma tabela de dupla entrada, relacionando a presena ou no de doena e os resultados obtidos
no teste em estudo, positivo ou negativo (Quadro 1.1). Assim,
so apresentadas quatro possibilidades de resultados: (1) verdadeiro-positivo (VP), quando o resultado do teste positivo
na presena de doena; (2) falso-positivo (FP), quando o resultado positivo na ausncia de doena; (3) verdadeiro-negativo
(VN), quando o resultado negativo na ausncia de doena;
(4) falso-negativo (FN), quando o resultado negativo na presena de doena.

Sensibilidade
A sensibilidade de um teste refere-se porcentagem de
resultados positivos pelo teste na populao de doentes, ou
seja, a proporo de resultados verdadeiro-positivos. Esse
conceito diferente da sensibilidade da tcnica, que mede o
limiar de deteco, definido pela visualizao direta ou indireta da reao antgeno e anticorpo, que, muitas vezes, no
aplicada para fins de diagnstico.
Utilizando os dados do Quadro 1.1 podemos estabelecer a
sensibilidade do teste em estudo, pela relao:

v:

Sensibilidade = VP

7
utilizao de reagentes qumicos, so empregadas para minimizar o problema dos resultados falso-positivos. Por exemplo,
a utilizao de 2-mercaptoetanol, para diluir amostras de soro,
elimina anticorpos IgM sem prejuzo na deteco dos anticorpos IgG.
Atualmente, para melhorar a especificidade dos testes,
epitopos de microrganismos obtidos por recombinao
gentica ou sntese peptdica tm sido utilizados. Esse
procedimento pode levar a perda na sensibilidade dos testes.
Utilizando os dados do Quadro 1.1, podemos estabelecer a
especificidade de um teste sorolgico pela relao:
Especificidade =

V~FP

Em muitas ocasies, difcil, para o laboratorista que


deseja garantir a qualidade do seu trabalho, a seleo de uma
amostragem confivel para a definio dos parmetros de
sensibilidade e especificidade. Nesse caso, costuma-se relacionar os resultados do teste que est sendo padronizado
com um teste referncia. Nesse caso, os ndices obtidos sero
de sensibilidade relativa ou copositividade e especificidade
relativa ou conegatividade. Para estabelecer esses valores,
deve-se levar em conta a sensibilidade e a especificidade do
mtodo de referncia.

Eficincia
A eficincia do teste sorolgico refere-se relao entre o
somatrio dos resultados verdadeiro-positivos e verdadeironegativos com a populao estudada. Evidentemente, quanto
mais prximo de 1, melhor ser o teste em estudo.
Pelos dados do Quadro 1.1, pode-se estabelecer a eficincia
de um teste como sendo:
V_P_+
_ V_N_ __
Eficincia= ___
VP + VN + FP + FN

FN

Especificidade
A especificidade de um teste sorolgico definida pela porcentagem de resultados negativos pelo teste nos indivduos
no doentes, ou seja, a proporo dos verdadeiro-negativos.
A especificidade do teste pode ser influenciada por inmeros fatores que levam a resultados falso-positivos. Anticorpos
naturais e heteroanticorpos, normalmente IgM contra diferentes epitopos, levam a resultados falso-positivos do teste
de hemaglutinao para o diagnstico da doena de Chagas.
Indivduos polinfectados por parasitos intestinais apresentam
um somatrio de componentes antignicos que induzem a
formao de anticorpos que cruzam com inmeros antgenosalvo dos testes sorolgicos. Condutas laboratoriais, como a

Quadro 1.1 Combinao binria entre os provveis resultados


obtidos em um detenninado teste eo diagnstico verdadeiro da
doena.
Doena 1Diagnstico verdadeiro
Teste

Presente

Ausente

Positivo

Verdadeiro-positivos (VP)

Falso-positivos (FP)

Negativo

Falso-negativos (FN)

Verdadeiro-negativos (VN)

Total

VP+FN

FP+VN

Parmetros que dependem da


prevalncia da doena
Os valores preditivos dos resultados positivos ou negativos
dependem no apenas da sensibilidade e da especificidade do
teste, como tambm da prevalncia da doena que est sendo
diagnosticada na populao em estudo.
Prevalncia pode ser definida como a porcentagem de indivduos doentes em uma populao. So considerados indivduos doentes os verdadeiro-positivos somados aos falso-negativos (VP + FN).
VP + FN
Prevalncia = - - - - - - - VP + VN + FP + FN
Definimos como prevalncia sorolgica a porcentagem de
casos positivos pelo teste (VP + FP) em uma populao.
VP + FP
Prevalenc1a sorolog1ca = VP + VN + FP + FN
A

'

Dos conceitos anteriormente mencionados, pode-se estabelecer a prevalncia verdadeira, definida como a relao entre
a prevalncia sorolgica somada especificidade menos 1, e a
sensibilidade somada especificidade menos 1.
" . verd a d eira
. =Ps +E---1
P reval enc1a
S +E - 1

Diagnstico Laboratorial

Valor preditivo de um resultado positivo

Portanto, pelas definies de VPP e VPN:

O valor preditivo de um resultado positivo (VPP) pode ser


calculado pela proporo de indivduos doentes entre os resultados positivos obtidos no teste em estudo; portanto, refere-se
probabilidade de doena quando o resultado do teste positivo.
VP
VPP= VP +FP

VPP =

VP
VP + FP

Sensibilidade x Prevalncia
(Sensibilidade x Prevalncia)+ (1- Especificidade) x (1 - Prevalncia)
VN
VPN=VN +FN-

Valor preditivo de um resultado negativo


O valor preditivo de um resultado negativo (VPN) pode
ser calculado pela proporo de indivduos no doentes entre
os resultados negativos do teste em estudo; portanto, refere-se
probabilidade de no ocorrncia de doena quando o resultado do teste negativo.
VN
VPN=VN+FN
As expresses citadas so derivadas simplificadas do teorema
de Bayes (definido adiante). O teorema de Bayes uma expresso
algbrica que possibilita calcular os valores preditivos dos resultados positivos e negativos; ou seja, a probabilidade da ocorrncia ou
no da doena, quando so conhecidas a prevalncia da doena e
a sensibilidade e a especificidade do teste que est sendo utilizado.
Considerando as definies de sensibilidade, especificidade, VPP, VPN e prevalncia feitas a partir do Quadro 1.1, e
que esses valores so probabilidades e variam de 0,00 a 1,00,
pode-se dizer que:

Especificidade x (1 - Prevalncia)
[Especificidade x (!-Prevalncia)]+ [(!-Sensibilidade) x Prevalncia]
Com os parmetros anteriormente referidos, possvel calcular os VPP e VPN de um teste, cujos ndices de sensibilidade
e especificidade so conhecidos, quando ocorre variao na
prevalncia. Exemplificando, quais seriam os VPP e VPN de
um teste, com ndices de 95% de sensibilidade e 95% de especificidade no diagnstico de uma doena com 1% (Quadro 1.2)
e 20% (Quadro 1.3) de prevalncia, respectivamente, e com
uma amostragem de 2.000 indivduos?
Conforme demonstrado, quanto maior a prevalncia da
doena, maior ser o valor preditivo de um resultado positivo
do teste, e, quanto menor a prevalncia, maior ser o valor preditivo de um resultado negativo do teste.

Chance ou odds
O teorema de Bayes possibilita relacionar a probabilidade
pr-teste (que a prevalncia da doena) com a probabilidade
ps-teste (que o valor preditivo positivo do teste). Tambm
til quando expresso em termos de chance ( odds) de um

VP = Sensibilidade x Prevalncia
FN = ( 1 - Sensibilidade) x Prevalncia
VN =Especificidade x (1 - Prevalncia)
FP = (1 - Especificidade) x (1 - Prevalncia)

Quadro 1.2 Resultados de um teste com ndices de 95% de sensibilidade e95% de espedficidade no diagnstico de uma doena com 1% de
prevalncia em uma populao de 2.000 indivduos.
Doena 1Diagnstico verdadeiro
Teste

Presente

Ausente

Total

Positivo
Negativo
Total

19
1
20

99
1.881
1.980

118
1.882
2.000

1
Apartir dos dados apresentados, temos: VPP = { = 0,16 ou 16% e VPN = ~
18

:::i

= 0,999 ou 99,9%.

Quadro 1.3 Resultados de um teste com ndices de 95% de sensibilidade e95% de espedficidade no diagnstico de uma doena com 20% de
prevalncia em uma populao de 2.000 indivduos.
Doena 1Diagnstico verdadeiro
Teste

Presente

Ausente

Total

Positivo
Negativo
Total

380
20
400

80
1.520
1.600

460

Apartir dos dados apresentados, temos: VPP = !:~ = 0,82 ou 82% eVPN = ~ :~!~ = 0,98 ou 98%.

1.540
2.000

Captulo 1

Sorologia ! Importncia e Parmetros

evento, mais do que de probabilidade. A chance ou odds de um


evento acontecer expressa pela relao:
p
Chance (odds) = (l _ P)
em que P igual probabilidade.
Por exemplo, a probabilidade de 80% corresponde a quatro
chances de doena contra uma chance de no doena, segundo
essa frmula, pois: P = 80% = 0,8 (corresponde chance =
0,8/1 - 0,8 = 4). Chance ou odds e probabilidade so relacionados, mas os nmeros no so idnticos. A chance ou odds
expressa como fraes com nmero 1 no denominador, e a
probabilidade expressa como uma frao decimal variando
de zero a um, ou como um percentual.
Ao multiplicar a chance de um evento pr-teste pela likelihood ratio (LR) ou taxa de probabilidade, pode-se calcular a
chance do evento ps-teste.
Chance de doena ps-teste= chance de doena pr-teste x LR
A LR uma medida potente da preciso de um teste. A LR
para um resultado de um teste indica como o resultado obtido
com esse teste pode aumentar ou diminuir a probabilidade de
doena. expressa por relaes quando os dados avaliados so
expressos em sensibilidade e especificidade.
..
LR do resultado pos1t1vo ( +) =

Sensibilidade
E
ifi .d d
1 - spec c1 a e
1 - Sensibilidade
LR do resultado negativo (- ) = E
.fi .d d
spec1 c1 a e

As LR so estveis em relao s mudanas na prevalncia


da doena, diferentemente dos valores preditivos, que dependem da prevalncia da doena na populao. Utilizando os
dados do Quadro 1.1, podem-se expressar as LR como:
LR ( ) = VP/(VP + FN)
+
FP/(FP + VN)
LR (-) = FN/(VP + FN)
VN/(FP + VN)
Para mais bem compreender esses parmetros, segue um
exemplo, conforme publicado por Gambino, 1991: Imagine
um teste para a doena de Chagas que apresente as seguintes
caractersticas: sensibilidade de 98% e especificidade de 98%.
Aplica-se, ento, esse teste para uma populao de banco de
sangue de reas no endmicas do Brasil (10.000 indivduos)
com baixa prevalncia (P = 0,5%) (Quadro 1.4).
Com esses dados, podem-se calcular os valores preditivos
positivo e negativo.
19
VPP =
= 19,8%
118
9 75
VPN = l = 99 98%
9.752
)

bvio que o valor preditivo positivo baixo, mas se forem


considerados outros parmetros, possvel chegar concluso de
que, embora seja baixo, o VPP = 19,8% muito bom. O exemplo
dado por Gambino timo e facilita a compreenso dos dados
apresentados no Quadro 1.4. Imagine o teste aplicado para selecionar cavalos de raa como potenciais vencedores de corridas.
A primeira probabilidade (pr-teste) de acertar um cavalo vencedor ao acaso entre 10.000 cavalos somente de 0,005 (prevalncia de 0,5%). A chance (odds) de acerto dada por:
p
0,005
Chance (odds) = _ p - _ 0,00 = 0,00502
5
1
1

A chance de acerto (chance pr-teste) de 0,00502 para 1.


Muito pequena para um apostador que deseja ganhar. Para
aumentar a chance do apostador ganhar, aplica-se o teste nos
10.000 cavalos e tem-se um novo valor, que dado pelo total de
positivos no teste, ou seja, 248. Esse nmero representa o total
de cavalos selecionados pelo teste com potencial de vencer. Mas,
como os verdadeiro-positivos so 49, isso significa que apenas
49 sero vencedores. A probabilidade antes da aplicao do teste
(que a prevalncia da doena) era de 1/200. Aplicando-se o teste,
a probabilidade passa a ser de 49/248 = 1/5; ou seja, de 20%.
A chance de acerto, que era de 0,00502 para 1, passou a ser
de 0,25 para 1!
248
Chance (odds) = _
= 0,0254
1 248
Chance (odds) ps-teste= 0,0254/0,00502 = 5
Conhecendo a LR(+ ), pode-se, facilmente, converter a
chance que o apostador tinha (pr-teste) em chance aps o
teste, por simples multiplicao.
Chance (odds) ps-teste= chance (odds) pr-teste x LR
No exemplo, chance pr-teste: 0,005 para 1; chance psteste: 0,25 para 1 (o que significa um aumento de 50 vezes).
Alguns outros parmetros extrnsecos devem ser considerados na validao de um teste, como preciso, acurcia ou
exatido e reprodutibilidade.

Parmetros extrnsecos
Preciso
Preciso um parmetro que determina existir concordncia dos resultados obtidos quando um mesmo teste feito
vrias vezes; mede o erro acidental do mtodo, que corresponde ao erro experimental acumulado.

Acurcia ou exatido
um parmetro que determina a capacidade do teste em
fornecer resultados muito prximos ao verdadeiro valor do que
se est medindo. A medida da exatido torna possvel detectar
erro sistemtico ou tendncia dos resultados de se desviarem
em uma dada direo e proporo em relao ao valor real.

Quadro 1.4 Dados da aplica~o de um teste com sensibilidade de 98%, especificidade de 99%, para triagem da doena de Chagas em 10.000
amostras de sangue de banco de sangue, em que a prevalncia da doena de Chagas de 0,5%.
Doena 1Diagnstico verdadeiro
Teste

Presente

Ausente

Total

Reagente

49
1
50

199
9.751
9.950

248
9.752
10.000

No reagente

Total

Diagnstico Laboratorial

10

Reprodutibilidade

Quadro 1.6 Classificao do ndice kappa, segundo Fleiss (1985).

Refere-se obteno de resultados iguais em testes realizados com a mesma amostra do material biolgico, quando
feitos por diferentes pessoas em locais distintos e se garante
quando a preciso e a exatido so sempre avaliadas. A variao da reprodutibilidade est associada a fatores relacionados com erros acidentais ou sistemticos que podem ser
evitados quando se trabalha com profissionalismo, aparelhos
bem calibrados, reagentes confiveis e ambiente saudvel. A
introduo de um soro de referncia perfeitamente definido e
de boa procedncia, como rotina diagnstica, ajuda a detectar a ocorrncia de erros sistemticos ou acidentais. Muitas
vezes, erros humanos podem ser a causa da no reprodutibilidade dos resultados, principalmente quando o laboratorista
inventa sua prpria metodologia de trabalho, sem atender
s especificaes dos fabricantes mencionadas nas bulas dos
produtos.
A reprodutibilidade pode ser avaliada intrateste ou interteste. Reprodutibilidade intrateste refere-se repetio do
teste ao mesmo tempo, por ensaios em replicata do mesmo
material. Reprodutibilidade intert este refere-se repetio
da mesma amostra em testes realizados em dias diferentes e
em laboratrios distintos. A variao da reprodutibilidade
pode ser medida pelo desvio padro (DP), expresso pela
frmula:
DP =

Jcx - X) /N - 1
2

que pode ser tambm expresso como coeficiente de variao


(CV):
CV= DP x 100

X
A reprodutibilidade tambm pode ser medida pelo grau
de concordncia entre os resultados de dois ou mais observadores, calculando-se o ndice kappa, a partir do Quadro 1.5.
O ndice kappa leva em considerao as propores das concordncias esperadas (Pe) e das observadas (Po). O valor de
kappa varia de negativo a 1. O Quadro 1.6 apresenta a classificao do ndice kappa.
Po =a+ d/N (essa proporo no leva em conta os resultados concordantes que ocorrem em funo da chance).
Pe = [ (a + b) (a + c)] + (c + d) (b + d)
N2
~
.
Po - Pe
Ind1ce kappa (K) =
p
1- e

. .,. Aplicao de testes diagnsticos


Escolha de um limiar de reatividade ou cut-off
Entende-se como limiar de reatividade ou cut-off a regio
de corte de um teste diagnstico, ou seja, um valor acima

Valor de kappa

Concordncia

o
0,00 a 0,20
0,21a0,40
0,41 a 0,60
0,61a0,80
0,81a1,00

Ruim
Fraca
Moderada
Substancial
Quase perfeita

do qual os resultados so considerados positivos e indicam


os doentes, e abaixo os resultados so dados como negativos e correspondem aos no doentes. Para exemplificar, ser
analisada uma curva de distribuio de frequncia de ttulos
de anticorpos normalmente observada na populao-alvo
(Figura 1.1).
Analisando a curva A, de indivduos no doentes, observa-se alta frequncia de soros reagentes com baixos ttulos que
progressivamente vo se negativando. Imbricada a essa curva,
tem-se a curva B de indivduos doentes, que apresenta uma
frequncia menor de soros reagentes com ttulos elevados.
A reatividade observada na curva A ocorre por reaes
inespecficas de anticorpos a diferentes estmulos antignicos,
principalmente relacionados com epitopos comuns encontrados em inmeros microrganismos parasitos da microflora
normal, ou em indivduos poliparasitados.
Quanto menor for a frequncia no ponto de encontro das
curvas, maior ser a discriminao entre os resultados sorolgicos na populao estudada. No teste ideal no existiria o
ponto de encontro das curvas e facilmente seriam discriminados os indivduos doentes dos no doentes.
100/o

.ctl
(.)

e:

<Q)

::i
O"

LL

No
doentes
Doentes
--=-r---r--""T"""--.--~..--___,,......

10

20

40

80

160 320 640 1.280 2.560

No
J
- - - - Reagentes
reagentes

Figura 1.1 Curva de distribuio da frequncia de ttulos de anticorpos


normalmente observada na populao.

'

Quadro 1.5 Clculo do ndice kappa.


Observador 2
Observador 1

Positivo
Negativo
Total

Positivo
a
e
a+c

Ttulo

Negativo
b
d
b+ d

Total
a+ b
c+d
N

Captulo 1

Sorologia ! Importncia e Parmetros

Assim, para determinao do limiar de reatividade, deve-se


saber a que se destina o teste. Se for para uso em banco de sangue, necessrio um teste com mxima sensibilidade. Assim,
a regio de corte seria deslocada para a esquerda, isto , o cutoff seria em menor diluio do soro. Nesse caso, o nmero de
resultados falso-positivos tende a aumentar, o que pode levar
a um pnico social se os indivduos sorologicamente positivos no forem acompanhados clnica e epidemiologicamente.
Infelizmente, nem todos os bancos de sangue dispem desses
servios, e a marginalizao de indivduos sorologicamente
positivos, mas com falsos resultados, tem aumentado sistematicamente nos grandes centros urbanos.
Se o teste for ser usado em laboratrio clnico, onde a prevalncia teoricamente muito alta, necessrio um teste com
mxima especificidade. Desse modo, a regio de corte deslocada para a direita, isto , o cut-off seria em maior diluio
do soro. O aumento do nmero de resultados falso-negativos
compensado pela verdadeira histria clnica do paciente.
Em inquritos epidemiolgicos, necessrio um teste com
alta sensibilidade, considerando a baixa prevalncia da doena
na populao.
Se o teste for ser usado para avaliar o efeito de uma vacina,
o parmetro mais importante a especificidade do teste, considerando o risco de a doena ocorrer nos indivduos vacinados. Um teste com baixa especificidade ir fornecer muitos
resultados falso-positivos que vo caracterizar a vacina como
no eficaz.
A Figura 1.2 exemplifica a variao do limiar de reatividade
como anteriormente referido. A sensibilidade e a especificidade de um teste so inversamente correlacionadas.
A determinao do limiar de reatividade feita a partir da
mdia dos resultados obtidos com amostras de indivduos no
doentes mais n vezes o desvio padro (n pode ser 1, 2, 3 etc.),
at que o valor obtido em densidade ptica seja igual ao basal
da populao de indivduos no infectados. Nos testes imunoenzimticos ocorrem com muita frequncia variaes de densidades pticas entre diferentes placas. Para minimizar esse
efeito, pode-se utilizar um soro limiar de reatividade (SLR)
para uniformizar os resultados obtidos. O SLR preparado
a partir de pool de soros reagentes diludo em pool de soros
no reagentes at a obteno de densidade ptica igual basal
da populao no infectada. Os resultados so fornecidos em

11
ndice de reatividade que se obtm dividindo-se a densidade
ptica da amostra teste pela densidade ptica do SLR.

Curva receiver operating characteristics


Quando um teste diagnstico produz medida contnua,
conveniente selecionar um cut-off diagnstico para calcular a
sensibilidade e a especificidade. Para cada cut-offestabelecido,
h uma sensibilidade e uma especificidade correspondente.
Um grfico com a sensibilidade no eixo do y e a taxa de falsopositivos (1 - especificidade) no eixo do x para todos valores de cut-off possveis do teste diagnstico mostrar a curva
resultante conhecida como receiver operating characteristic
curve (ROC), ilustrada na Figura 1.3. Esta curva representa
o desempenho de um teste; um teste perfeito seria aquele
sem falso-positivos ou falso-negativos e seria representado
por uma linha que se iniciasse na origem e subisse verticalmente at 1 no eixo y, isto significaria zero de falso-negativos.
Um teste que tenha falso-positivos na mesma proporo de
verdadeiro-positivos apresentaria uma linha na diagonal. Se
dois ou mais testes esto disponveis para o mesmo problema
clnico pode-se comparar as curvas ROC. Quanto maior a rea
embaixo da curva, melhor o teste.
1,0
0,9
0,8
0,7
Q)

-o
co
-o
..e

0,6
Melhores
pontos de corte

0,5

cn

e:
Q)

cn

0,4
0,3
- - Sem valor
0,2

- - Bom

O,1

- - Excelente

o
O

O,1 0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

O, 7

0,8

0,9 1,0

1-E
100/o
Corte em :

= mxima sensibilidade
~ = mxima especificidade
y = mximas sensibilidade
a

co
-

e:

Q)

::J

O"

Figura 1.3 Exemplo de uma curva ROC (receiver operating characteristics). Eixo y: probabilidade de resu ltados positivos na ocorrncia de
doena; eixo x: probabilidade de teste positivo na ausncia de doena.
O ponto mais esquerda e mais acima corresponde ao melhor ponto de
corte para o teste em questo: maior sensibilidade com menor nmero
de falso-positivos (1 - E), tornando o diagnstico mais acurado.

e especificidade

..,. Bibliografia

LL.

--=-+-~-~-~-~---,--+ Ttulo

20

40

80

160 320

640 1.280 2.560

Figura 1.2 Curva de distribuio da frequncia de ttulos de anticorpos,


que mostra regies de corte para obteno de mxima sensibilidade
e/ou mxima especificidade.

Fleiss AR. Clinica! epidemiology. ln: The Architecture of Clinica! Research.


Philadelphia: Saunders 1985; p. 185-186.
Galen RS, Gambino SR. Beyond normality: the predictive value and efficiency
of medical diagnosis. New York: John Willey, 1975.
Gambino R. The misuse of predictive value - or why you must consider the
ODDS. Ann lst Super Sanita 1991; 27(3): 395-400.
Griner PF, Mayewshi RJ, Mushlin AI et al. Selection and interpretation of diagnostic tests and procedures. Ann Int Med 1981, 94:553-600.
Sox Jr. H. Probability theory in the use of diagnostic tests. An introduction to
critica! study of the literature. Ann Int Med 1986, 104:60-66.

Captuo 2

Maria Carmen Arroyo Sanchez

Introduo, 13
Precipitao, 13
Aglutinao, 18
Ensaios lticos, 20
Teste de imunofluorescncia, 21
Tcnicas com marcadores radioativos, 24
Tcnicas imunoenzimticas, 27
Ensaios quimioluminescentes, 36
Microscopia imunoeletrnica, 37
Ensaios imunocromatogrficos, 39
Tcnicas empregadas na automao, 41
Bibliografia, 48

Captulo 2

13

Testes Sorolgicos

. ._ 1ntroduo
Os testes sorolgicos ou imunoensaios so tcnicas para
detectar e quantificar antgenos e anticorpos, ou outras substncias que desempenhem o papel de antgeno no ensaio, tais
como frmacos, hormnios, cidos nucleicos, citocinas, receptores de clulas etc. Podem utilizar reagentes marcados ou no
marcados. Os ensaios clssicos com reagentes no marcados,
como os que se baseiam no princpio da precipitao, tm sensibilidade de deteco menor, pois necessria a formao de
grandes complexos antgeno-anticorpo para que sejam detectados. Por outro lado, sistemas automatizados que utilizam o
princpio da precipitao, como a nefelometria e a turbidimetria, apresentam sensibilidade bem maior. Nos ensaios com
reagentes marcados, estes amplificam o sinal, aumentando
a sensibilidade de deteco. Os marcadores comumente utilizados so os radioativos, enzimticos, fluorescentes e quimioluminescentes. A amplificao do sinal tambm pode ser
obtida com o emprego de partculas, como na aglutinao e
nos mtodos automatizados de precipitao, que so hbridos
entre os mtodos com reagentes marcados e no marcados.
Nas ltimas dcadas, houve grande desenvolvimento nos
testes para imunodiagnstico em relao aos anticorpos e
antgenos empregados e tambm em relao aos mtodos. O
advento dos anticorpos monoclonais proporcionou um grande
avano porque possibilitou a produo, em grandes quantidades, de anticorpos homogneos e totalmente caracterizveis.
Esses anticorpos, altamente especficos, so a base de vrios
testes de pesquisa de antgenos, hormnios, frmacos etc. Por
outro lado, a anlise da estrutura dos principais componentes antignicos dos microrganismos levou identificao dos
antgenos mais importantes na deteco de anticorpos. Tais
antgenos podem ser preparados, em larga escala, por sntese
peptdica e tecnologia recombinante, o que aumenta a especificidade dos testes para a pesquisa de anticorpos. Com relao
aos mtodos, tem sido observada uma tendncia ao aperfeioamento e consolidao dos testes j existentes, e, ao mesmo
tempo, ao emprego de tecnologias emergentes. Essas estratgias objetivam aumentar o nvel de sensibilidade e de confiabilidade dos resultados obtidos e tornar os testes mais rpidos,
de mais simples execuo e adaptveis a processos automatizados ou a ensaios point-of-care para aplicao em consultrios, clnicas, domiclios, reas remotas etc. Um importante
avano tem sido o desenvolvimento de mtodos multiparamtricos (que possibilitam a deteco de substncias diferentes,
simultaneamente, em um mesmo ensaio) para a pesquisa de
anticorpos, antgenos, hormnios, medicamentos etc., que
possam ser implementados na rotina laboratorial.
Os testes sorolgicos tm se tornado cada vez mais refinados
e de execuo simples, porm, para garantir a qualidade dos
resultados necessrio manter um controle bem rigoroso. As
tcnicas devem ser cuidadosamente padronizadas, observando
aspectos como a concentrao do antgeno, a especificidade dos
anticorpos, o ttulo dos conjugados, o tempo, a temperatura e
os diluentes. A fim de eliminar erros sistemticos, aconselhvel manter um programa de controle de qualidade permanente
para avaliar equipamentos, reagentes e outros fatores. Os testes devem ser monitorados sistematicamente, empregando-se
amostras de painel de soros rigorosamente padronizados. Os
protocolos dos testes devem ser seguidos risca e as medidas
devem ser feitas com exatido, evitando-se erros espordicos.
As condies de realizao do teste e de leitura dos resultados
devem ser padronizadas em cada laboratrio.

As metas para o laboratrio clnico devem ser melhorar a


disponibilidade, a exatido e a preciso dos testes de interesse
clnico, garantir a correta interpretao dos resultados, facilitar
a transmisso de dados e avaliar a importncia de novos testes
introduzidos. Nesse sentido, maior conhecimento dos mtodos e princpios utilizados na pesquisa de antgenos e anticorpos pode auxiliar na aplicao e interpretao da grande
variedade de tcnicas disponveis.
Neste captulo so descritas tcnicas para a pesquisa de
antgenos, anticorpos e outras substncias que desempenham
o papel de antgenos nos ensaios e so importantes no laboratrio clnico, como suporte e complementao ao diagnstico,
desde que utilizadas em condies timas de padronizao e
contr~le de qualidade e ressalvadas suas indicaes e limitaes. E importante salientar que este captulo no tem a pretenso de ser um manual de tcnicas, mas sim uma reviso
de mtodos, com seus princpios fundamentais e aplicaes
principais, para a pesquisa de antgenos e anticorpos.

. ._ Precipitao
As tcnicas de precipitao, fundamentadas na quantificao de precipitados produzidos pela reao antgeno-anticorpo, comearam h mais de 100 anos. Em 1897, Rudolf
Kraus, em Viena, relatou a precipitao que ocorria devido
interao de antgenos solveis e seus antissoros correspondentes e, em 1905, Bechhold, na Alemanha, apresentou seus
experimentos sobre precipitados em gis.
A quantidade de precipitado formado quando se adiciona
antgeno a uma concentrao constante de anticorpo caracterizada por uma curva parablica, descrita por Heidelberger
e Kendall em 1935. Essa quantidade de precipitado depende
de vrios fatores fsico-qumicos e imunolgicos, mas principalmente das concentraes relativas do antgeno e do anticorpo. Quando as quantidades de antgeno e de anticorpo
so equivalentes (regio de equivalncia), a precipitao
mxima, e decresce quando h excesso de antgeno ou anticorpo (Figura 2.1). Precipitados j formados podem se dissolver quando expostos a excesso de um dos reagentes, devido
reversibilidade da ligao antgeno-anticorpo. O fenmeno de
prozona ocorre quando h excesso de anticorpo e pode cau-

Excesso de
anticorpo

Regio de
equivalncia

Excesso de
antgeno

"O
C'O

.E
o

"O

Jg

a.

"
Q)
.....

a..

Concentrao de antgeno

Figura 2.1 Curva de precipitao representando a quantidade de precipitado formado na reao antgeno-anticorpo com concentraes
crescentes de antgeno e quantidade fixa de anticorpo.

Diagnstico Laboratorial

14
sar erros na interpretao dos resultados, tornando necessrio
realizar a titulao do anticorpo com quantidades fixas de
antgeno para evitar tais erros. Podem precipitar na presena
de anticorpos especficos, alm de protenas, carboidratos e
complexos glicolipdicos.

lmunodifuso
A difuso de uma substncia solvel em um meio fluido
um processo pelo qual a substncia transportada, de uma
parte para outra, como resultado do movimento molecular ao
acaso. A difuso pode ser efetuada em um meio gelificado, que
impede a formao de correntes por diferenas de temperatura. Se os poros do gel forem consideravelmente maiores do
que as partculas, a difuso ocorrer como em um meio fluido.
Quando os imunoprecipitados so formados no gel de gar
ou agarose, o tamanho dos agregados fica maior do que o dimetro dos poros e evita-se a difuso dos complexos antgenoanticorpo. As tcnicas de imunodifuso detectam a reao
antgeno-anticorpo por meio da formao de um precipitado.
A imunodifuso pode ser simples ou dupla. Na imunodifuso simples, o antgeno ou o anticorpo permanecem fixados ao
suporte e o outro se difunde at que ocorra a precipitao do
complexo. Na imunodifuso dupla, tanto o antgeno quanto
o anticorpo se movem, um em direo ao outro, at haver a
precipitao. Em ambos os casos, a difuso pode ser linear
(unidimensional) ou radial (bidimensional).

lmunodifuso simples em uma dimenso


O mtodo de Oudin (1946) baseia-se na difuso simples
em uma dimenso e permite a anlise qualitativa e quantitativa dos sistemas de precipitao. Nessa tcnica, o antissoro
incorporado ao gar e essa mistura colocada em um tubo
at formar uma coluna de 35 a 45 mm de altura. Aps a gelificao, o antgeno colocado no topo da coluna. Os tubos so
selados, para evitar evaporao, e deixados a uma temperatura
constante durante o perodo de observao, que , em geral, de
1 semana. A fim de induzir a difuso do reagente externo no
gel, sua concentrao deve ser bem maior do que a do reagente
contido no gel.

Dupla imunodifuso de Ouchterlony


O mtodo de dupla difuso em gel de gar foi descrito em
1947 por Ouchterlony, na Sucia, e se baseia na precipitao
que ocorre na regio de equivalncia, perpendicular linha
do eixo entre os orifcios, quando o antgeno e o anticorpo se
difundem no gar. O complexo antgeno-anticorpo apresenta-se sob a forma de linha ou arco de precipitao. A velocidade de difuso de cada substncia regida pelas leis da difuso e depende da concentrao e do tamanho da molcula, do
tamanho dos poros do gel, da temperatura, da concentrao
do gar e de sua pureza.
AgA

AgA

'

lmunodifuso radial simples


Foram desenvolvidos dois mtodos principais de imunodifuso radial simples para realizar a determinao quantitativa
de antgenos, o de Mancini e o de Fahey, ambos em 1965. A
diferena entre essas tcnicas est no tempo de difuso.

AgA

AcA

O teste realizado colocando-se uma camada de gar em


lminas de vidro ou placas de Petri previamente recobertas
por uma fina camada de gar. Aps a gelificao so feitos orifcios no gar, de acordo com o sistema a ser analisado. As
solues que contm o antgeno e o anticorpo so colocadas
nos orifcios do gar, e as placas ou lminas so incubadas em
cmara mida com vedao por 18 a 48 h a 37C, ou por 2 a
3 dias temperatura ambiente.
Cada linha em um espectro de precipitao corresponde a
um par antgeno-anticorpo. Cada precipitado funciona como
uma barreira para os reagentes que o formam e impede sua
difuso alm do stio de precipitao. Essa barreira imunoespecfica e a difuso de outros reagentes no impedida, a
menos que a densidade dos agregados provoque um obstculo
mecan1co.
O mtodo de Ouchterlony permite a comparao de
vrios sistemas antignicos, desde que colocados em orifcios adjacentes, contra um mesmo sistema de anticorpos,
formando vrios padres que indicam a existncia, ou no,
de determinantes antignicos comuns. As linhas formadas
podem ser completamente coalescentes se os anticorpos
forem especficos para os mesmos determinantes antignicos em cada preparao (identidade imunolgica); podem
apresentar um "esporo", como no caso de antgenos com
alguns determinantes em comum, parcialmente relacionados (identidade parcial); ou podem formar uma interseo, indicando a ausncia de determinantes antignicos em
comum (no identidade) (Figura 2.2). Quando os reagentes
esto em quantidades balanceadas, a linha de precipitao
formada ter curvatura voltada para o orifcio que contm a
substncia de maior peso molecular e se difunde mais lentamente.
O mtodo pode ser utilizado para avaliaes semiquantitativas, quando se conhece a especificidade das linhas de precipitao, como, por exemplo, na titulao de antgenos ou de
anticorpos. Podem-se caracterizar antgenos de vrios agentes
infecciosos empregando-se anticorpos de especificidade e reatividade conhecidas. A formao de uma nica linha de precipitao d indcios da pureza do antgeno ou do anticorpo,
porm no com muita preciso.
O mtodo apresenta vrias limitaes, pois requer 18 a 24 h
de difuso para que a reao se processe, no sendo til em
casos em que se necessita de um mtodo rpido de diagnstico. Ao mesmo tempo, apresenta sensibilidade baixa e limita-se deteco de reaes antgeno-anticorpo em que h a
formao de precipitados.

AgAB

Ag B

AcA+
cB

gAC

AcA+
cB

Figura 2.2 Padres da reao de dupla imunodifuso de Ouchterlony em gel de gar. A. Reao de identidade - indica a presena de determinantes antignicos idnticos. B. Reao de no identidade - indica a presena de determinantes antignicos no relacionados. C. Reao de
identidade parcial - indica a presena de determinantes antignicos parcialmente relacionados.

Captulo 2

Testes Sorolgicos

Em ambos os mtodos, o gar misturado com a diluio


apropriada do anticorpo especfico para determinado antgeno e a mistura colocada em placa de Petri ou lmina de
vidro. Em locais apropriados do gel, so feitos orifcios onde
se colocam volumes precisos das solues de antgeno a serem
testadas, bem como solues padro, com pelo menos trs
concentraes conhecidas do antgeno (Figura 2.3). O suporte
incubado em cmara mida at o trmino da difuso (48
a 72 h no mtodo de Mancini) ou por 6 a 12 h (no mtodo
de Fahey). Se houver quantidade de anticorpo suficiente e na
ausncia de restries difuso livre do antgeno, o dimetro
do halo de precipitao se correlaciona com a concentrao
do antgeno: enquanto o halo est aumentando, o logaritmo
da concentrao do antgeno aproximadamente proporcional ao dimetro do halo no ponto final, e a rea (quadrado
do dimetro) varia diretamente com a concentrao. A sensibilidade do teste pode variar de acordo com a concentrao
do antissoro. Uma concentrao baixa de antissoro aumenta a
sensibilidade, mas no permite a medida de concentraes de
antgeno em excesso. Por outro lado, uma alta concentrao de
antissoro diminui a sensibilidade, mas permite a quantificao
de concentraes maiores de antgeno.
O mtodo de Mancini, que mede o dimetro do halo aps
o trmino da difuso (ponto final), baseia-se no fato de que,
aps certo tempo, dependendo da concentrao e do peso
molecular da protena, o halo de precipitao alcana um valor
mximo que no aumenta ainda que o perodo de incubao
seja ampliado. Para uma dada concentrao de anticorpo, ao
trmino da difuso, a rea do halo formado (quadrado do seu
dimetro) diretamente proporcional concentrao do antgeno no orifcio. Em concentraes normais, o tempo necessrio para atingir o dimetro mximo de 24 h para IgG e
de 50 h para IgM, aproximadamente. Enquanto os halos do
padro e da amostra no atingem seu tamanho mximo, no
se estabelece a relao linear entre a rea (mm2) e a concentrao. Esse mtodo preciso, reprodutvel e sensvel, porm
muito demorado.
O mtodo de Fahey cintico e os halos de precipitao
podem ser medidos antes do trmino da difuso (aps 6 a
12 h) e, nesse caso, o logaritmo da concentrao do antgeno
proporcional ao dimetro do halo. Empregando-se antgenos
padro diludos em srie possvel construir curvas ~~dro,
e as equaes que descrevem tais curvas podem ser utilizadas
para determinar a concentrao de antgeno correspondente a
qualquer dimetro.

Figura 2.3 Esquema da imunodifuso radial de Mancini. O anticorpo


est incorporado ao gar. Diluies em srie do antgeno padro (puro,
diludo a 1/2, a 1/4 e a 1/8) so colocadas nos orifcios do gar, e aps
um perodo de difuso ocorre a precipitao, formando-se halos de
dimetro decrescente na regio de equivalncia. A concentrao de
antgeno na amostra desconhecida (A) pode ser determinada em funo
do dimetro do halo por interpolao na curva padro.

15
A sensibilidade desses mtodos varia de 1 a 3 g/mf de
antgeno.

Tcnicas que utilizam a eletroforese


O termo eletroforese foi utilizado pela primeira vez por
Michaelis, em 1906, para descrever a migrao de coloides sob
a influncia de um campo eltrico. Na eletroforese, ocorre a
migrao de partculas carregadas em um solvente condutor
sob a influncia de um campo eltrico. Entre os fatores que
governam a migrao esto a carga, o tamanho, a forma e o
grau de solvatao das partculas, a concentrao, a fora
inica e o pH do solvente, a temperatura e a viscosidade do
meio e o carter e a intensidade do campo eltrico.
As protenas so zwiterions, apresentam cargas positivas e
negativas, e, assim, segundo o seu ponto isoeltrico e variaes de pH, podem migrar para o polo positivo se a carga da
superfcie for negativa, ou para o polo negativo se a carga for
positiva. Em um campo eltrico de uma dada intensidade,
protenas diferentes migram com velocidades caractersticas,
o que permite defini-las em termos de sua mobilidade eletrofortica. Essa mobilidade depende diretamente da carga
lquida da protena e inversamente da resistncia exercida pelo
solvente e pelo suporte. A carga lquida da protena depende,
principalmente, do pH da soluo. Se o pH do tampo for
inferior ao ponto isoeltrico (pH em que a carga lquida da
protena zero), a protena migra como um ction para o polo
negativo, havendo aumento na mobilidade com a diminuio
do pH. Por outro lado, se o pH for superior ao ponto isoeltrico, a protena migra como um nion para o polo positivo,
havendo aumento da mobilidade com o aumento do pH. A
carga de uma protena tambm influenciada pelo grau com
que outros ons em soluo se ligam a ela. A fora inica do
tampo influencia a carga efetiva da protena e, consequentemente, a sua mobilidade. O aumento da fora inica diminui a mobilidade, porm aumenta a resoluo das bandas. Por
outro lado, foras inicas mais elevadas provocam aumento na
corrente, na temperatura, nos tempos de corrida e na difuso.
A escolha da fora inica do tampo um ponto de grande
importncia na eletroforese, sendo necessrio otimizar as
demais condies, de acordo com o equipamento e as necessidades de cada laboratrio.
A separao das protenas em um campo eltrico foi realizada pela primeira vez por Tiselius, em 1937, que utilizou a tcnica de eletroforese de fronteira mvel. No mesmo ano, Knig
descreveu a eletroforese de zona ou eletroforese em suporte
poroso empregando tiras de papel para separar as protenas
de veneno de cobra. Em 1950, Durrum utilizou a tcnica
para separar as protenas sricas, dando incio sua aplicao na Qumica Clnica. Posteriormente foram introduzidos
outros suportes, como gel de amido (1955), acetato de celulose
(1957), gel de poliacrilamida (1959) e gel de agarose (1961).
Em 1981, Jorgenson e Lukacs descreveram a eletroforese capilar utilizando coluna capilar de vidro e tampo aquoso para
separar compostos carregados eletricamente, o que demonstrou o potencial da tcnica na separao analtica.

Eletroforese de zona
Como j mencionado, h dois tipos bsicos de suporte para
a eletroforese de zona: os de papel (papel de filtro, acetato de
celulose) e os de gel (amido, agarose e poliacrilamida).
Na eletroforese de zona, com suportes de papel, devido
natureza hidroflica da celulose, forma-se uma pelcula de

Diagnstico Laboratorial

16
lquido sobre o papel de modo que a soluo sofre pouca
influncia de fatores mecnicos. Desse modo, as macromolculas so separadas, quase que exclusivamente, com base na
sua carga de superfcie; quanto maior a carga, maior a velocidade de migrao.
Empregando-se gis como suportes, a separao realizada
de acordo com a carga e tambm o tamanho e a estrutura das
molculas. Macromolculas de baixo peso molecular migram
livremente de acordo com as respectivas cargas, enquanto as
maiores ficam retidas nos poros do gel.
Em relao tcnica propriamente dita, as amostras de
soro ou outro fluido biolgico devem ser aplicadas como uma
banda compacta, em um suporte apropriado para impedir a
conveco. So colocadas na origem e separadas pela eletroforese aps 60 a 90 min de corrida, empregando-se tampo
alcalino. As molculas carregadas negativamente migram para
o nodo e as carregadas positivamente, para o ctodo. As tiras
so coradas para protenas e escaneadas em um densitmetro,
que detecta diferenas de absoro devidas a concentraes
diferentes de protenas e as reproduz, convertendo o padro
de bandas em picos.
As principais aplicaes clnicas da eletroforese de zona
incluem a anlise das protenas de amostras de soro, urina,
liquor e outros fluidos biolgicos, anlise de isoenzimas, anlise de cidos nucleicos etc. A escolha do meio de suporte
depende dos objetivos, mas, de modo geral, para protenas,
gis de poliacrilamida tm sido preferidos graas ao seu maior
poder de resoluo, variando o tamanho dos poros. Para fragmentos de DNA e RNA, utiliza-se o gel de agarose.
Devido sua menor sensibilidade em relao a outros
mtodos, a eletroforese de zona, quase sempre, um teste
de triagem, sendo necessrio utilizar testes bioqumicos ou
imunolgicos para identificar a protena em estudo. Entre as
aplicaes mais importantes da eletroforese de zona esto a
eletroimunodifuso, a imunoeletroforese, a imunofixao e o

immunoblotting.

Eletroimunodifuso
Tambm chamada de imunoeletrodifuso e eletroimunoprecipitao. Associa a imunodifuso eletroforese, promovendo aumento da velocidade de precipitao do complexo
antgeno-anticorpo no gar (ou agarose), devido ao direcionamento da migrao pelo campo eltrico. Essa tcnica tem sido
empregada na deteco de antgeno. As variaes da tcnica
com aplicao clnica so a eletroimunodifuso dupla unidimensional e a eletroimunodifuso simples unidimensional.
..,. Eletroimunodifuso dupla unidimensional. Tambm chamada
de imunoeletroforese de contracorrente, contraimunoeletroforese e eletroprecipitao. O princpio bsico do mtodo a
eletroforese do antgeno e do anticorpo, simultaneamente, que
migram em direes opostas a partir de orifcios separados do
gel, resultando na precipitao em um ponto intermedirio
entre as suas origens (Figura 2.4). O mtodo aproveita a propriedade de arrastamento, pela corrente de eletroendosmose,
das molculas de anticorpo, menos eletronegativas.
Esse mtodo requer que o antgeno e o anticorpo em teste
apresentem diferentes mobilidades eletroforticas. O pH do
tampo deve ser escolhido a fim de otimizar os efeitos eletroendosmticos do anticorpo para o ctodo (polo negativo),
enquanto o antgeno se move em direo ao nodo (polo
positivo). O movimento eletrofortico e a eletroendosmose
concentram rapidamente (30 min) o antgeno e o anticorpo
na regio entre os poos adjacentes. Essa tcnica semiquantitativa e, aproximadamente, 1O vezes mais sensvel do que a

Corrente eletrofortica

Eletroendosmose

Figura 2.4 Eletroimunodifuso dupla unidimensional - o antgeno e


o anticorpo so colocados nos orifcios do gar e precipitam pela ao
da corrente eletrofortica e da eletroendosmose na regio de equivalncia.

dupla difuso. Dependendo da sensibilidade e especificidade


do anticorpo utilizado, as concentraes de antgeno mnimas
detectveis giram em torno de 0,1 g/mf .
Foi o mtodo originalmente empregado para detectar o
antgeno de superfcie associado hepatite B e seu anticorpo.
Tambm tem sido utilizado para a pesquisa de anticorpos
contra Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum,
Cryptococcus neoformans e Candida albicans.
Esse mtodo apresenta as vantagens de concentrar o antgeno e o anticorpo em um nico ponto do gel, permitir a
realizao de vrias anlises em uma nica lmina, fornecer
resultados rpidos e ser mais sensvel do que a imunodifuso
convencional. Alm do gel de gar, outros suportes podem ser
empregados, como o acetato de celulose.
Alternativamente colorao proteica, pode-se empregar,
por exemplo, um conjugado enzimtico de anti-imunoglobulina marcada pela peroxidase, que d origem a um precipitado
colorido aps a revelao com o substrato apropriado.
.... Eletroimunodifuso simples unidimensional. Esse mtodo
tambm conhecido como eletroforese em foguete e tcnica
de Laurell. Nesta tcnica, o antissoro especfico para o antgeno ou antgenos que se quer quantificar incorporado ao
gel de agarose, que colocado em lmina de vidro. O pH do
gel escolhido de modo que o antgeno fique com carga negativa e os anticorpos no migrem. O material que contm o
antgeno colocado em um pequeno orifcio e submetido
eletroforese. O padro de precipitao resultante (Figura 2.5)
se assemelha a um foguete (eletroforese em foguete). Esse
+

Figura 2.5 Eletroimunodifuso simples unidimensional. O gar contm


o antissoro e nas cavidades h concentraes decrescentes de antgeno.
Aps a eletroforese ocorre a precipitao em forma de "foguete': cuja
distncia de migrao proporcional concentrao do antgeno.

Captulo 2 1 Testes Sorolgicos

17

padro ocorre porque a precipitao se forma nas margens


laterais dos limites do antgeno em movimento no gar que
contm o anticorpo. Conforme o antgeno vai precipitando,
sua concentrao diminui e as margens laterais convergem
para uma ponta. Para uma dada concentrao de antissoro,
a distncia total de migrao do antgeno, linearmente proporcional concentrao do antgeno.
A sensibilidade dessa tcnica para protenas de 0,5 g/mf .
Devido sua pequena carga negativa, as imunoglobulinas
apresentam pequena mobilidade eletrofortica nesse sistema,
a menos que se utilizem eletrlitos e gar especial.

lmunoeletroforese
Descrita pela primeira vez em 1953 por Grabar e Williams, a
imunoeletroforese combina dois mtodos, a eletroforese em gel,
seguida da imunodifuso e precipitao das protenas. Permite a
identificao e caracterizao de protenas que no seriam possveis com a eletroforese ou a imunodifuso separadamente.
No mtodo original, a imunoeletroforese realizada em gel de
gar em duas etapas: separao dos componentes por eletroforese;
imunodifuso de cada componente a partir do seu centro de difuso, contra o antissoro especfico, formando uma linha ou arco
de precipitao na regio de equivalncia. Assim, a caracterizao
de uma substncia feita a partir de suas propriedades eletroforticas (mobilidades diferentes devido s diferentes cargas eltricas), coeficientes de difuso (velocidades diferentes de difuso do
antgeno devido sua concentrao e ao tamanho da molcula)
e propriedades imunolgicas (especificidade). O sistema de imunodifuso obtido se aproxima de uma dupla difuso bidimensional e, portanto, os padres de precipitao que se obtm podem
ser interpretados como nas tcnicas de dupla difuso.

Ag abcd

e ~--)o
a

C)

e )

3
_ _ Anti-ABCD

e---...~
a

Aa

Bb

~~
Cc
Dd

Figura 2.6 Representao esquemtica da imunoeletroforese. 1. A mistura de antgenos (abcd) colocada no orifcio do gar. 2. A eletroforese
separa os antgenos da mistura. 3. Coloca-se o antissoro (ABCD) na
canaleta. 4. Aps um perodo de difuso, ocorre a precipitao e so
formados arcos correspondentes aos diferentes sistemas antgenoanticorpo nas respectivas regies de equivalncia.

Nessa tcnica, esquematizada na Figura 2.6, recobre-se uma


lmina de vidro com gar ou agarose em tampo alcalino e,
aps a solidificao, faz-se um orifcio transversal e uma canaleta, longitudinalmente lmina. A amostra com o antgeno
colocada no orifcio e separada em um campo eltrico por 30
a 60 min. Coloca-se, ento, o antissoro na canaleta e incuba-se
a lmina em cmara mida a uma temperatura constante, por
18 a 24 h, para que se processe a difuso. As fraes separadas pela eletroforese funcionam como antgenos e interagem
com seus respectivos anticorpos. No ponto de equivalncia de
cada sistema antgeno-anticorpo formam-se linhas ou bandas
de precipitao que podem ser lavadas, secas e coradas para
registro permanente. O anticorpo se difunde paralelamente
canaleta e os antgenos, quando homogneos, se difundem em
crculos, por isso a linha de precipitao se assemelha a um
arco de um crculo. Se o antgeno for heterogneo, a linha de
precipitao apresenta forma elptica.
Nas condies dessa tcnica, as gamaglobulinas praticamente permanecem no ponto de aplicao quando se utiliza
gel de agarose, ou se deslocam para o polo negativo (sentido
oposto ao do movimento na eletroforese) quando se utiliza gel
de gar, que no neutro e tem eletronegatividade em relao
ao tampo de pH bsico. Quando se emprega o gel de gar
ocorre o fenmeno conhecido por eletroendosmose, em que
h o movimento real de molculas de gua para o polo negativo a fim de compensar as cargas do gel que so atradas para
o polo positivo. As substncias dissolvidas na gua (como as
protenas) acompanham esse movimento, e, quando a mobilidade eletrofortica menor do que a velocidade da eletroforese, o movimento resultante a migrao para o polo negativo. O movimento relativo das substncias da mistura no se
altera devido a esse fenmeno. O fluxo da endosmose uma
funo da diferena entre a constante dieltrica do suporte
inerte (gar ou celulose) e a do lquido, e varia com o pH e a
fora inica. O efeito da eletroendosmose pode ser diminudo
empregando-se gar de maior pureza (com menor negatividade), reduzindo-se a temperatura do sistema eletrofortico
ou diminuindo-se a condutividade do tampo. Para evitar a
eletroendosmose deve-se empregar agarose no lugar de gar,
pois os gis de agarose no tm grupos polares.
A imunoeletroforese um mtodo qualitativo aplicvel a
qualquer substncia solvel imunognica cujos anticorpos sejam
precipitantes. Pode ser aplicada para diagnosticar paraproteinemias, associando-se os seus resultados aos obtidos na eletroforese;
para distinguir aumentos policlonais de aumentos monoclonais
de gamaglobulinas; para detectar a ausncia ou a diminuio
de imunoglobulinas que ocorrem em imunodeficincias; para
identificar cadeias leves na urina de pacientes com discrasias ou
doenas autoimunes; para detectar a natureza monoclonal da
protena de Bence Jones no mieloma; para identificar aumentos
na quantidade de protenas no liquor em doenas neurolgicas;
para realizar a triagem de imunocomplexos circulantes; e para
caracterizar crioglobulinemia e piroglobulinemia.

lmunofixao
A imunofixao combina dois mtodos, a separao das
protenas por eletroforese em gel e, em seguida, a precipitao
in situ com antissoro monoespecfico. Foi descrita em 1964,
porm foi introduzida no estudo das imunoglobulinas em
1976.
A amostra a ser analisada aplicada vrias vezes, dependendo do nmero de protenas que se quer identificar, sendo
submetida eletroforese em gel de agarose. A seguir, aplicam-se fitas de papel ou de acetato de celulose impregnadas

Diagnstico Laboratorial

18
com os antissoros. Os antissoros se difundem no gel de agarose
e, se os antgenos estiverem presentes em propores adequadas, ocorre a precipitao dos complexos antgeno-anticorpo,
que fixam as protenas ao gel. Aps um perodo de incubao
de 1 a 2 h, remove-se a fita, as protenas no precipitadas so
removidas por lavagem e as bandas so reveladas com corante
especfico para protenas.
Comparada imunofixao, a imunoeletroforese mais
simples e menos sujeita ao fenmeno de excesso de antgeno,
porm a imunofixao pode ser otimizada para obter maior
sensibilidade e resoluo e de mais fcil interpretao, pois se
baseia no exame de um padro de precipitao anlogo ao da
eletroforese. importante salientar que em ambas as tcnicas
a sensibilidade e especificidade do antissoro empregado so
fundamentais para a qualidade dos resultados obtidos.
H vrias modificaes da tcnica bsica, sendo exemplo a
utilizao de anticorpos marcados com radioistopos ou enzimas, que aumentam a sensibilidade.
Essa tcnica pode ser utilizada em amostras de soro, urina,
liquor ou outros fluidos biolgicos, principalmente na caracterizao de protenas anmalas, de difcil caracterizao na
imunoeletroforese, como ocorre nas gamopatias monoclonais, ou doena das cadeias leves, em que aparecem pequenas bandas. Tambm tem sido empregada na identificao de
paraprotenas e de componentes do complemento, sendo frequentemente utilizada como alternativa imunoeletroforese.

Eletroforese capilar
A eletroforese capilar se baseia na separao das molculas
pelo seu tamanho e propriedades fsico-qumicas, mediante
o fluxo em tubos capilares com dimetros internos de 15 a
100 m e 50 a 100 cm de comprimento. Esses capilares so
preenchidos com um eletrlito condutor e submetidos ao
de um campo eltrico. Esse mtodo oferece vantagens em
relao ao uso de gis ou papel, pois possibilita a dissipao
eficiente do calor e permite o estabelecimento de campos eltricos elevados (100 a 500 V/cm), aumentando a eficincia da
separao e o tempo de corrida e possibilitando, assim, a separao de bandas pouco visveis nos mtodos convencionais de
eletroforese. Alm disso, utiliza pequenos volumes de amostra
( 1 a 1O nf) e pode ser totalmente automatizado, garantindo
maior qualidade e rapidez aos resultados.
Na eletroforese capilar podem-se utilizar diferentes modos
de separao, com mecanismo e seletividade caractersticos:
eletroforese capilar de zona (CZE), cromatografia eletrocintica micelar (MEKC), cromatografia eletrocintica em microemulso (MEECK), eletroforese capilar em gel (CGE), focalizao isoeltrica capilar (CIEF), isotacoforese capilar (CITP) e
eletrocromatografia capilar (CEC). Essa versatilidade permite
analisar desde ons at macromolculas, como protenas e cidos nucleicos, em uma nica coluna, desde que seja utilizado
o eletrlito apropriado.
A eletroforese capilar no sequenciamento de DNA tem
aplicaes na identificao de pessoas: em testes de paternidade, na identificao de suspeitos de crimes, na indstria farmacutica e na agropecuria, entre outras.

. .,. Aglutinao
A reao de aglutinao caracteriza-se pela formao de
agregados visveis como resultado da interao de anticorpos
especficos e partculas insolveis que contm determinantes
antignicos em sua superfcie.

A aglutinao especfica faz parte de um processo dinmico


que ocorre em dois estgios. O primeiro estgio comea logo
aps a mistura das partculas recobertas pelo antgeno com os
anticorpos e consiste na ligao das molculas do anticorpo
aos antgenos de superfcie, por meio de ligaes no covalentes, de acordo com a lei de ao das massas. O segundo estgio
comea enquanto o primeiro continua e resulta das colises
que ocorrem entre as partculas, de modo que os anticorpos
ligados a uma partcula se ligam a determinantes antignicos
de outra; esses anticorpos estabelecem pontes entre partculas
que, aps vrios entrelaamentos, formam agregados visveis a
olho nu. Ambos os estgios comeam praticamente ao mesmo
tempo, porm a ligao do antgeno com o anticorpo se processa em poucos segundos, enquanto a formao de agregados
demora muito mais tempo.
A aglutinao pode ocorrer tanto com partculas que apresentam determinantes antignicos naturais em sua superfcie
(hemcias, bactrias, protozorios etc.) quanto com partculas
inertes (partculas de ltex, poliestireno, bentonita etc.), ou
mesmo com clulas antigenicamente no relacionadas (hemcias, bactrias), s quais se adsorvem ou se fixam antgenos
solveis. No primeiro caso, a reao dita aglutinao direta,
e, no segundo, aglutinao indireta ou passiva (Figura 2.7).
Comparadas com a precipitao, as tcnicas de aglutinao,
embora semiquantitativas, so mais sensveis e necessitam de
uma quantidade de anticorpos 500 vezes menor, pois as partculas amplificam a reao.
Vrios fatores interferem na formao de agregados, tais
como o tipo do anticorpo (a classe IgM 7 50 vezes mais eficiente do que IgG), eletrlitos, pH (ideal entre 6 e 8), macromolculas hidroflicas (em baixas concentraes, impedem
a autoaglutinao), enzimas (afastam reaes inespecficas),
tempo e temperatura.
As reaes de aglutinao so empregadas para o diagnstico laboratorial de doenas autoimunes, doenas causadas
por vrus, bactrias, protozorios e fungos, na deteco de
hormnios, na tipagem de grupos sanguneos etc.
Os testes de aglutinao podem ser realizados em tubos ou
placas. Se o soro apresentar elevado ttulo de anticorpos aglutinantes, pode-se observar o fenmeno de prozona, obtendo-se
falsos resultados negativos. Esse efeito eliminado empregando-se diluies seriadas do soro.

Antgeno

Partcula
carregadora

...
Partcula sensibilizada

+
Partcula
sensibilizada

Anticorpo

Aglutinao

Figura 2.7 Teste de aglutinao passiva. As clulas ou partculas funcionam como carregadores do antgeno ou de anticorpos. O anticorpo
especfico promove a aglutinao das partculas sensibilizadas.

Captulo 2

19

Testes Sorolgicos

Teste de aglutinao direta


Na reao de aglutinao direta, utilizam-se partculas
antignicas insolveis em sua forma ntegra ou fragmentada.
Hemcias, bactrias, fungos e protozorios podem ser aglutinados diretamente por anticorpo. Os testes para detectar
anticorpos especficos so realizados empregando-se diluies em srie do anticorpo, ante uma quantidade constante
de antgeno. Aps um perodo de incubao, a aglutinao se
completa e o resultado geralmente expresso como o ttulo do
antissoro, isto , o inverso da mxima diluio em que ocorre
a aglutinao.
As reaes de aglutinao direta que empregam hemcias
como antgeno incluem a tipagem de grupos sanguneos do
sistema ABO e Rh (antgenos especficos) e a reao de PaulBunnel-Davidson (antgenos heterfilos).
Entre as reaes que utilizam antgenos ntegros ou fragmentados de bactrias, espiroquetas e protozorios esto o
teste de Widal para o diagnstico das salmoneloses, o teste de
Wright para o diagnstico da brucelose, o teste de Weil-Felix
para o dia.g nstico de riquetsiose e o teste de aglutinao para
leptospirose, toxoplasmose e tripanossomase.

Teste de inibio de hemaglutinao direta


A inibio da hemaglutinao direta baseia-se na capacidade que certos antgenos virais tm de, espontaneamente, aglutinar certos tipos de hemcias. Os anticorpos,
se presentes na amostra, revestem as partculas virais, o que
resulta na inibio da aglutinao, indicando teste positivo
para a presena de anticorpos. Esses testes no distinguem
entre IgG e IgM. Esse mtodo usado para detectar anticorpos contra os vrus da rubola, sarampo, influenza e cer,
tos enterov1rus.

Teste de aglutinao passiva ou indireta


Para o teste de aglutinao passiva, as hemcias e as partculas inertes, como ltex (polmero de poliestireno ), bentonita,
sepharose, coldio, charcoal, leveduras etc. podem ser sensibilizadas por adsoro passiva, devida ao contato direto com os
antgenos solveis, por adsoro via agentes qumicos, como
cido tnico e cloreto de cromo, e por conjugao do antgeno
por meio de ligaes qumicas covalentes, fornecendo reagentes estveis. Devido grande diversidade de antgenos que
podem se ligar s clulas ou partculas, a aplicao dos testes
de aglutinao passiva muito variada.

so detectados anticorpos heterfilos no soro de muitos animais. Tais anticorpos devem ser removidos antes da realizao do teste.
Antgenos polissacardicos prontamente aderem a hemcias, enquanto antgenos proteicos requerem pr-tratamento
com cido tnico ou cloreto de cromo. A taninizao das
hemcias altera a sua superfcie quanto s cargas, o que
aumenta a quantidade de protena adsorvida e torna maior
a sensibilidade do sistema. Empregando-se antgenos purificados obtm-se maiores sensibilidade e especificidade; todavia, antgenos levemente desnaturados ou agregados ligam-se
melhor a hemcias taninizadas. Aps a sensibilizao com a
concentrao adequada de antgeno, as hemcias so suspen sas em solues estabilizadoras, que evitam reaes inespecficas sem diminuir a capacidade de aglutinao especfica.
O teste em placa utiliza pequenas quantidades de reagentes e considerado positivo quando se verifica a formao de
um tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em "V': e
negativo quando as hemcias sedimentam formando um
"boto" compacto. O ttulo da amostra testada ser o inverso
da mxima diluio em que ainda se observa a formao do
tapete (Figura 2.8).
O teste detecta anticorpos das classes IgG e IgM e, embora
os anticorpos IgM sejam 750 vezes mais eficientes na aglutinao do que os IgG, a quantidade de antgeno necessria para
obter a mxima reatividade com IgM muito maior do que a
necessria para a mxima reatividade com IgG. Empregando-se
hemcias sensibilizadas com antgenos proteicos, quando adequadamente padronizado, o teste detecta anticorpos em nveis
de concentrao de 0,01 g/mf. H vrios sistemas comerciais
para a pesquisa de anticorpos que utilizam essa tcnica, entre
eles, os sistemas de Trypanosoma cruzi, Treponema pallidum,
Toxoplasma gondii etc.

Teste de inibio de hemaglutinao passiva


O teste de inibio de hemaglutinao passiva sensvel e
especfico na deteco de pequenas quantidades de antgenos
solveis, haptenos ou anticorpos que competem com a substncia homloga com que a hemcia foi sensibilizada.
O princpio do teste baseia-se na competio, pelos stios
de combinao do anticorpo, entre o antgeno fixado hemcia e o antgeno solvel ou o hapteno. O grau de inibio relaciona-se com a quantidade do antgeno presente na amostra

Teste de hemaglutinao passiva


A verificao de Boyden, em 1951, de que protenas podiam
ser adsorvidas a hemcias tratadas com cido tnico e de que
essas clulas podiam ser aglutinadas por anticorpos especficos, possibilitou o emprego dos mtodos de aglutinao para a
deteco de anticorpos contra vrias substncias.
As hemcias esto entre os melhores suportes de antgenos para os testes de aglutinao, pois h uma srie de antgenos que pode ser ligada sua superfcie para fornecer um
sistema indicador sensvel na deteco de anticorpos. Alm
disso, os testes em placa permitem que a determinao do
ponto final da reao seja feita diretamente. Por serem de
fcil obteno, empregam-se preferentemente hemcias de
carneiro ou humanas do grupo O fixadas com formaldedo
ou glutaraldedo, o que resolve o problema da fragilidade e
permite que sejam estocadas por longos perodos. Entretanto,
devido superfcie complexa das hemcias, frequentemente

Figura 2.8 Placa de hemaglutinao mostrando o teste positivo (tapete)


e negativo (boto). A linha inferior mostra uma reao duvidosa (tapete
e boto simultaneamente).

20

Diagnstico Laboratorial

e, tambm, com a afinidade pelos stios de combinao do


anticorpo.
Esse mtodo requer pequenas quantidades de reagentes,
detecta antgeno na ordem de 0,1a10 g/mf, apresenta especificidade elevada e pode ser empregado em sistemas em que
antgenos solveis ainda no foram obtidos. Tem sido empregado na deteco de antgeno na hepatite e na hemofilia.

Teste de aglutinao do ltex


Singer e Plotz, em 1956, foram os primeiros a descrever o
emprego das partculas de ltex para um teste de diagnstico
pesquisando fator reumatoide em amostras de pacientes. Esse
mtodo, ainda muito empregado, a base de vrios sistemas
comerciais tanto qualitativos quanto semiquantitativos e automatizados.
Partculas de ltex so esferas de poliestireno que podem
ser utilizadas como suportes na adsoro de protena solvel e
antgenos polissacardicos, funcionando como sistema indicador da reao antgeno-anticorpo.
O teste pode ser empregado na pesquisa de antgenos ou
de anticorpos. A aplicao mais comum ocorre na deteco
do fator reumatoide, que anticorpo da classe IgM pentamrico (tambm h fator reumatoide IgG e IgA) dirigido contra
IgG (IgGl, IgG2, IgG4), IgA (IgAl), IgM e IgE. Adsorvendo
IgG passivamente s partculas do ltex, haver a exposio
dos determinantes de IgG que reagem com o fator reumatoide, resultando em aglutinao. Esse mtodo mais sensvel
e menos especfico que a hemaglutinao passiva para detectar
fator reumatoide. O fator reumatoide um autoanticorpo
poro Fc de IgG agregada ou alterada, ocorrendo em doenas
autoimunes, em processos agudos ou crnicos e em doenas
reumticas, infecciosas, degenerativas etc.
Essa tcnica til tambm para detectar antgenos polissacardicos bacterianos, como de Haemophilus influenzae,
Rickettsia sp., estreptococos do grupo B, Staphylococcus aureus,
Neisseria meningitidis etc. no soro, urina ou liquor. Tambm

empregada na deteco de frmacos e hormnios, como a


13-gonadotrofina corinica humana, na pesquisa de anticorpos
na rubola e de protena C, que aparece no soro de pacientes
na fase aguda de vrias infeces, como a estafiloccica ou a
estreptoccica, febre reumtica etc. A presena dessa protena
detectada com a antiprotena C ligada a partculas de ltex.
Em baixas concentraes, pode ser encontrada em indivduos
hgidos e frequentemente se observa o fenmeno de prozona,
que pode ser evitado diluindo-se o soro.

Teste de aglutinao de cristais de colesterol


O teste de VDRL (venereal disease research laboratory)
consiste no emprego de cristais de colesterol sensibilizados
com lecitina e cardiolipina para a pesquisa de anticorpos na
sfilis. Esse teste detecta anticorpos antilipdios que se formam no hospedeiro como resposta ao material de natureza
lipdica, liberado pelas clulas lesadas no incio da infeco, e
ao material lipdico do prprio treponema. A leitura do teste
feita macroscopicamente, contra fundo escuro, aps alguns
minutos de agitao. O teste positivo apresenta a formao de
flculos, enquanto o negativo apresenta aspecto homogneo e
sem agregados.

. .,. Ensaios lticos


Fixao do complemento
A ligao antgeno-anticorpo promove a fixao do complemento, cujo consumo, in vitro, pode ser empregado para detectar
a presena de anticorpos, antgenos ou ambos. Bordet e Gengou,
em 1901, demonstraram essa reao pela primeira vez.
O teste utiliza um sistema homogneo (no necessria a
separao entre fases) e realizado em duas etapas (Figura 2.9).
Na primeira etapa, o antgeno incubado com o anticorpo, na
fase fluida, na presena de uma quantidade definida de com-

Reao positiva

No h
hemlise

Reao negativa

Hemlise

~-t

Antgeno

~( Anticorpo

Hemcia de
carneiro

Complemento
Anticorpo
anti-hemcia
de carneiro

Figura 2.9 Teste de fixao de complemento esquematizando reaes positiva e negativa para a pesquisa de anticorpos.

Captulo 2

Testes Sorolgicos

plemento. Se o antgeno e o anticorpo correspondentes estiverem presentes, a cascata do complemento ser ativada pela
via clssica e haver consumo de complemento. Na segunda
etapa, adiciona-se o sistema indicador da reao que consiste em hemcias de carneiro sensibilizadas com hemolisina
(anticorpo anti-hemcias de carneiro obtido em coelhos). A
medida da atividade hemoltica do complemento no sistema
indicador permite determinar a presena ou no de antgeno
ou anticorpo na mistura inicial e sua quantidade. A atividade
hemoltica remanescente pode ser quantificada empregando-se diluies seriadas da amostra a ser analisada. Tanto o
anticorpo quanto o antgeno devem ser destitudos de ao
anticomplementar, ou seja, no podem ativar o complemento
separadamente. O complemento deve ser obtido de soro de
cobaia e colhido e estocado de maneira apropriada para preservar a atividade hemoltica. Anticorpos humanos IgM, IgG 1,
IgG2 e IgG3 fixam complemento pela via direta, enquanto a
IgA fixa complemento pela via alternativa.
O teste pode ser qualitativo ou quantitativo. O mtodo qualitativo foi desenvolvido por Mayer et al., em 1948, e baseia-se
na titulao do complemento residual que no foi consumido
pela reao antgeno-anticorpo com o sistema indicador. Esse
mtodo, embora sensvel, muito laborioso para fins de diagnstico. O mtodo quantitativo apresenta muitas variaes
tcnicas, dentre as quais o micromtodo de Wassermann e
Levine, de 1961, que permite revelar quantidades mnimas de
complemento fixado. Nesse mtodo, emprega-se uma quantidade fixa de complemento e faz-se a determinao direta do
complemento residual pela adio do sistema indicador. O
mtodo requer que as concentraes de todos os componentes,
exceto o da amostra em estudo, sejam predeterminadas com
preciso. Todos os aspectos do teste devem ser monitorados
por vrios controles devido instabilidade do complemento,
variao das hemcias e da hemolisina. A validade dos resultados obtidos com as amostras desconhecidas depende da avaliao dos resultados dos controles do teste.
Durante algum tempo, o teste de fixao de complemento
foi considerado dos mais importantes no sorodiagnstico
devido sua maior sensibilidade com relao aos testes da
poca. Atualmente, utilizado na pesquisa de anticorpos fixadores de complemento, no estudo de algumas viroses e micoses
sitmicas. Apresenta a vantagem de poder ser empregado para
diferentes sistemas sem mudar os parmetros do teste, porm
complexo e trabalhoso. A tendncia atual a sua substituio
por ensaios mais sensveis e menos laboriosos.

21

..,. Teste de imunofluorescncia


O teste de imunofluorescncia muito utilizado no diagnstico de laboratrio para a pesquisa de anticorpos e, com
anticorpos monoclonais, para a pesquisa de microrganismos
e seus componentes em espcimes clnicos. Baseia-se na capacidade das molculas de anticorpo de se ligar covalentemente
a fluorocromos sem perder sua reatividade especfica com o
antgeno. A conjugao de molculas de anticorpo a fluorocromos foi desenvolvida com sucesso pela primeira vez por
Coons, em 1941.
Fluorocromos so substncias que, quando excitadas com
luz de alta energia, absorvem luz de um comprimento de onda
menor e, instantaneamente, emitem luz de comprimento de
onda maior (menor energia), constituindo o fenmeno denominado fluorescncia. Os espectros de absoro e de fluorescncia de um fluorocromo em geral so prximos, sendo
o tempo de armazenamento da energia da ordem de 10-7 a
10-9 s (Figura 2.10). Os fluorocromos apresentam molculas
complexas, frequentemente sob a forma de anis com duplas
ligaes. Os mais utilizados so isotiocianato de fluorescena,
lisamina-rodamina B, vermelho Texas, ficoeritrina, cido
dimetil naftalenossulfnico, isotiocianato de tetrametilrodamina, que tm espectros de emisso e de absoro diferentes,
porm absorvem luz nas regies ultravioleta e prxima do
visvel e emitem luz na faixa do visvel. A conjugao do fluorocromo com o anticorpo se faz por meio dos grupos amino
da lisina, que no so crticos para a atividade do anticorpo:
ligao tiocarbamida, sulfonamida etc.
A qualidade do teste depende, em grande parte, da seleo do material empregado para o preparo dos conjugados.
Antissoros de m qualidade do origem a conjugados cujas
reaes apresentam elevada colorao de fundo, enquanto
conjugados preparados com antissoros potentes podem ser
empregados em altas diluies, o que possibilita a obteno de
uma proporo sinal/rudo maior, ou seja, reaes mais sensveis e com menor reao de fundo. O anticorpo a ser marcado deve ser uma preparao purificada de gamaglobulina
para aumentar a eficincia da colorao e evitar coloraes
no especficas, pois os fluorocromos tambm marcam a albumina e as fraes a- e f3-globulinas. A frao gamaglobulina

Absoro

Emisso

lctl

cn
cn

Ensaio de neutralizao da hemlise

rs......
5l

.e

Estreptococos beta-hemolticos do grupo A produzem


vrias toxinas extracelulares que estimulam a produo de
anticorpos e que lisam hemcias (hemolisinas). O ensaio de
neutralizao realizado em duas etapas; na primeira, incuba-se o soro do paciente (anticorpo) com a hemolisina especfica (antgeno); na segunda, adicionam-se hemcias do grupo
O. Se a hemolisina tiver sido neutralizada pelo anticorpo especfico, as hemcias no lisam e o teste positivo; se no havia
anticorpo especfico, a hemolisina fica ativa, lisa as hemcias
e o teste negativo. O teste de neutralizao mais comumente
empregado o ASO para pesquisa de antiestreptolisina O.

ctl

Q)

"C
Q)

"C
ctl
"C

cn

e:

Q)

Cl

Comprimento de onda

Figura 2.1 OEspectro de absoro e de emisso de um composto fluo-

rescente.

Diagnstico Laboratorial

22
pode ser obtida por precipitao com sulfato de amnio e cromatografia de troca inica em DEAE-celulose. Muitas vezes,
necessrio purificar a gamaglobulina empregando-se, por
exemplo, imunoadsorventes, pois a conjugao deve se limitar
o mximo possvel ao anticorpo. Desse modo, a marcao do
anticorpo pelo fluorocromo resulta em conjugado especfico,
em que se deve determinar a concentrao da gamaglobulina,
a relao fluorescena/protena e o ttulo para determinar a
atividade imunolgica. Com anticorpos policlonais, a relao
fluorescena/protena ideal 2,5 a 5,5, satisfatria para detectar antgenos em bactrias ou protozorios (grande nmero de
determinantes antignicos). Com anticorpos monoclonais, ou
na deteco de antgenos com pequeno nmero de determinantes, necessria uma relao fluorescena/protena maior
para obter a sensibilidade desejada.
A intensidade de luz emitida pela fluorescena depende do
pH do meio, sendo mxima em pH 8,5. Por isso, as preparaes so montadas com glicerina alcalina. O uso de corantes,
como o azul de Evans ou o vermelho congo, diminui a colorao de fundo e melhora o contraste.
O microscpio de fluorescncia composto por uma
fonte de luz de alta intensidade (lmpada de mercrio ou de
quartzo-halognio), filtros de excitao, que relacionam o
comprimento de onda capaz de ativar a fluorescncia, e filtros
barreira, que removem interferentes da luz e permitem alta
transmisso da fluorescncia emitida. A lmpada de mercrio
de instalao cara e tem vida mdia de 200 h ou menos. As
lmpadas de quartzo-halognio so baratas, podendo ser ligadas e desligadas, no havendo necessidade de esperar determinado tempo para que resfriem, e no diminuem de eficincia
com a utilizao. Os microscpios podem ser de transiluminao ou de epi-iluminao. Este ltimo tipo apresenta as vantagens de poder combinar a fluorescncia com luz transmitida para exame de contraste de fase; alm disso, os sistemas
intercambiveis de filtros permitem o exame da amostra em
diferentes comprimentos de onda no caso de coloraes com
mais de um fluorocromo.

Teste de imunofluorescncia direta


O teste de imunofluorescncia direta (Figura 2.11)
empregado na pesquisa e localizao de antgenos em clulas ou tecidos, por meio de um anticorpo especfico marcado
com fluorocromo (conjugado). O conjugado se fixa ao antgeno, formando um imunocomplexo estvel. O anticorpo no
ligado removido por lavagens e o preparado observado em
microscpio de fluorescncia. Foi desenvolvido por Coons
et al., em 1942, para demonstrar antgenos microbianos em
tecidos.
O antissoro especfico para o antgeno a ser pesquisado
obtido em espcies heterlogas e deve ser de alta especificidade e elevada potncia. Anticorpos monoclonais podem ser
utilizados.
O teste apresenta elevada sensibilidade e especificidade,
mas requer o preparo de um conjugado para cada sistema que
se queira estudar. Paralelamente ao teste desejado, deve-se
incluir um preparado para avaliar a especificidade, utilizando-se o mtodo de bloqueio (o antgeno incubado com anticorpo especfico, no marcado, antes da adio do conjugado
especfico) ou neutralizao (o anticorpo marcado absorvido
com o antgeno antes de ser adicionado ao preparado).
A principal aplicao da imunofluorescncia direta ocorre
na imunocitoqumica, na demonstrao de vrios antgenos
de clulas e tecidos, principalmente nas doenas imunolgicas
renais e de pele. Nos casos de disfunes glomerulares e tubulointersticiais, doenas do tecido conectivo e outras disfunes,
a imunofluorescncia direta auxilia na avaliao do material de
biopsia do rim ou da pele, possibilitando a demonstrao de
imunoglobulinas ligadas a tecidos, de componentes do complemento, produtos relacionados com a fibrina etc.
Esse teste tambm tem sido utilizado na pesquisa de
Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionnella sp.,
Escherichia coli, estreptococos beta-hemolticos do grupo A e
vrios vrus, como os do herpes simples tipos 1 e 2, o citome-

Mtodo direto

~F
+

-r
~F

Lavagem
--+Ili

Fluorescncia

-f'"Anticorpo
marcado
Antgeno
Mtodo indireto

)1'

Lavagem
.. + (~
Conjugado

"-)--E
"~

JIF
~

Lavagem
Ili

Fluorescncia

Sistema avidina-biotina

,_....

-r

-f'Anticorpo
:A.ntgeno

Lavagem

4F

.. + ,,(~

,~

<!'~

r7'~ Lavagem
..

Ili Fluores-

cenc1a
A

Anticorpo
biotinilado

'

Figura 2.11 Teste de imunofluorescncia. Esquema dos mtodos direto, indireto e com o sistema avidina/estreptavidina-biotina.

Captulo 2

23

Testes Sorolgicos

galovrus, os da influenza tipos A e B, os da parainfluenza 1, 2


e 3, o da varicela-zster e o adenovrus.
Empregando-se anticorpos de diferentes especificidades
marcados com fluorocromos contrastantes, podem-se localizar componentes diferentes dentro de uma clula, diferenciar
uma clula de outra ou localizar a distribuio de antgenos
em clulas ou tecidos.

Teste de imunofluorescncia indireta


O teste de imunofluorescncia indireta tem sido empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade de
deteco. Pode ser empregado na pesquisa de antgenos ou de
anticorpos.

Para apesquisa de antgenos


Consiste na incubao da clula ou tecido em que se quer
pesquisar o antgeno com o anticorpo especfico obtido em
animal conhecido ou monoclonal, levando formao de um
imunocomplexo. Aps a lavagem, a preparao incubada
com um conjugado de anti-imunoglobulina produzida em
outra espcie de animal (Figura 2.11 ).
Essa tcnica apresenta vantagens com relao direta.
mais sensvel, pois o anticorpo no marcado tem mais stios
de ligao que o antgeno, ou seja, ocorre uma amplificao
com o uso de dois anticorpos; mais fcil de ser controlada
e pode-se utilizar um nico conjugado para diferentes sistemas. Por exemplo, se for empregado anticorpo especfico para
o antgeno obtido em coelho, o conjugado ser imunoglobulina anticoelho marcada. Como desvantagens, necessita maior
tempo de reao, mais reagentes e pode ser menos especfica.
O teste pode ser utilizado nos mesmos sistemas que empregam
o mtodo direto, com aumento de sensibilidade. A pesquisa de
plasmdios em hemcias um exemplo.

Para apesquisa de anticorpos


O teste de imunofluorescncia, descrito por Weller e Coons
em 1954, tem sido muito empregado na rotina laboratorial
para a deteco de anticorpos no soro e outros fluidos biolgicos. Antgenos padronizados so fixados a lminas de
vidro. O soro do paciente diludo, colocado sobre o antgeno
e incubado para que seja formado o complexo antgeno-anticorpo. Aps lavagens, a preparao incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado
(fluorescena ligada anti-imunoglobulina) reage com o anticorpo especfico para o antgeno (Figura 2.1 1). Utilizando-se
diluies seriadas do soro possvel determinar o ttulo de
anticorpos, que ser o inverso da mxima diluio em que se
observa fluorescncia.
Quando se deseja detectar anticorpos especficos de uma
determinada classe ou subclasse de imunoglobulinas, necessrio utilizar antissoros especficos para as cadeias pesadas das
classes que se quer pesquisar e sem reatividade para cadeias
leves ou para outras cadeias pesadas. Assim, por exemplo,
conjugados anti-IgG cujos antissoros tm reatividade contra
as cadeias leves, K e , detectam anticorpos contra todas as
classes de imunoglobulinas reagentes.
Para a pesquisa de anticorpos durante a fase aguda da
infeco, emprega-se um conjugado anti-IgM que deve ser
especfico para cadeias pesadas. A imunofluorescncia indireta para a pesquisa de anticorpos IgM est sujeita a falsos
resultados positivos devido presena de fator reumatoide
no soro testado. Quando o anticorpo IgG se liga ao antgeno
ocorre mudana conformacional no IgG, que expe novos

antgenos em sua regio Fc aos quais o fator reumatoide se


liga. necessrio utilizar mtodos de absoro ou separao do fator reumatoide. Tambm podem ser observadas
reaes falso-positivas devidas a anticorpos heterlogos.
Podem ocorrer resultados falso-negativos quando anticorpos IgG competem ou inibem IgM na ligao com os
stios do antgeno. Nesses casos, necessrio separar IgG
de IgM.
A maior intensidade de fluorescncia observada nas tcnicas indiretas se deve ao maior nmero de molculas fluorescentes que iro corresponder a cada determinante antignico.
Jancovic, em 1959, empregou a tcnica em camada trplice para
demonstrar antgenos do sistema Rh em hemcias utilizando
anticorpos humanos anti-Rh, anticorpos anti-imunoglobulina
humana, produzidos em coelhos, e anticorpos anti-imunoglobulina de coelho, produzidos em carneiros, marcados pela
fluorescena.
A imunofluorescncia indireta o teste de referncia na
sorologia de muitas doenas. Apresenta vrias vantagens, pois
sensvel, especfica, reprodutvel, de padronizao e execuo simples, o mesmo conjugado pode ser utilizado em sistemas diferentes e podem-se determinar as classes e subclasses de anticorpos empregando-se conjugados especficos. A
necessidade de microscpio de fluorescncia, a subjetividade
na leitura e a no automao representam limitaes do teste.
O teste tem sido empregado para detectar anticorpos em
vrios sistemas, tais como Treponema pallidum (FTA-ABS),
Toxoplasma gondii, vrus da rubola, citomegalovrus, herpesvrus simples, Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum etc.
Outra de suas maiores aplicaes ocorre na pesquisa de autoanticorpos contra diferentes estruturas orgnicas.

Sistema avidina/estreptavidina-biotina
O sistema avidina/estreptavidina-biotina uma tcnica de
amplificao do sinal da reao (Figura 2.11). A forte interao entre a avidina e a biotina foi descoberta em 1941 por
Snell. Essa ligao, com constante de associao da ordem de
1015 M- 1, tem sido considerada como a interao biolgica
no covalente mais forte que se conhece. A avidina uma
glicoprotena tetramrica, com 66 a 69 kDa (10% so carboidratos), encontrada na albumina do ovo de pssaros, rpteis
e anfbios. As quatro subunidades da avidina so idnticas e
cada uma pode se ligar biotina. A biotina uma vitamina
do complexo B encontrada em todas as clulas. A estreptavidina uma protena bacteriana tetramrica de 60 kDa, composta de subunidades idnticas, homloga avidina, isolada
do Streptomyces avidinii, e mais utilizada do que a avidina.
Tambm tem quatro stios de ligao de alta afinidade para a
biotina (10 15 M- 1), porm tem um ponto isoeltrico aproximadamente neutro e livre de cadeias laterais de carboidratos,
apresentando menor tendncia de se ligar inespecificamente.
Pesquisas realizadas na dcada de 1970 estabeleceram o
sistema avidina-biotina como uma ferramenta poderosa em
cincias biolgicas. Logo depois, pesquisadores como Bayer e
Wilchek desenvolveram novos mtodos e reagentes com anticorpos biotinilados e outras biomolculas.
Os compostos da biotina, disponveis no mercado, contm
um domnio quimicamente ativo, como N-hidroxissuccinimida
ou sulfo-N-hidroxissuccinimida, que se liga diretamente aos
grupos E dos aminocidos. A avidina/estreptavidina pode
ser saturada com molculas de fluorescena sem perder sua
capacidade de ligao biotina, fornecendo um conjugado
cuja fluorescncia especfica bem intensa. A biotina pode
ser ligada covalentemente a um anticorpo e, em uma segunda

24
etapa, reagir com a avidina/estreptavidina conjugada a um
fluorocromo. Aps a reao do antgeno com o anticorpo no
marcado, a biotina, marcada com o segundo anticorpo, adicionada. Como muitas molculas de biotina podem se ligar
a um anticorpo, a adio da avidina/estreptavidina marcada
resulta em amplificao da fluorescncia.
O sistema tem outras vantagens, pois h um mnimo de
inespecificidade de ligao do conjugado a outros substratos
e pode-se empregar o conjugado de avidina/estreptavidina na
deteco de anticorpos marcados com biotina, independentemente da espcie de origem ou istipo. O mesmo anticorpo
biotinilado pode ser utilizado com diferentes conjugados
de avidina/estreptavidina, como fluorescena (fluorescncia verde), ficoeritrina (fluorescncia vermelha), peroxidase
(microscopia ptica) ou ferritina (microscopia eletrnica).
Esse sistema tambm til com anticorpos monoclonais, pois
a biotinilao rpida, branda e eficiente, no alterando a
capacidade de ligao do anticorpo ao antgeno.
Atualmente, a tcnica tem ampla aplicao em pesquisa e
diagnstico. Alm da imunofluorescncia, tem sido empregada no immunoblotting, ELISA, ELISPOT, imunoperoxidase
etc. Tambm pode ser empregada em ensaios de purificao
para capturar biotina marcada com protenas ou molculas de
cido nucleico.

..,. Tcnicas com marcadores radioativos


Radioimunoensaio
O radioimunoensaio um dos mtodos mais sensveis para
a anlise quantitativa das reaes antgeno-anticorpo, permitindo medidas rpidas e precisas; mesmo em preparaes
no purificadas, apresenta limiar de deteco da ordem de
nanogramas ou picogramas. Como limitaes destacam-se o
custo do teste, a meia-vida dos reagentes e o r isco operacional.
Apesar das limitaes inerentes ao emprego de radioistopos,
ainda muito utilizado principalmente na pesquisa, embora
na rotina laboratorial a tendncia seja a substituio por mtodos que utilizam marcadores no radioativos.
A base para o desenvolvimento do radioimunoensaio veio
dos estudos in vivo de Berson, Yalow et al., em 1956, que descobriram a possibilidade de deteco de anticorpos anti-insulina
em pacientes tratados com o hormnio, por meio da medida
da ligao de insulina marcada a esses anticorpos. A insulina
no marcada, competitivamente, inibia a ligao da insulina
marcada ao anticorpo. Em 1960, Yalow e Berson desenvolveram um ensaio para detectar e quantificar insulina no soro
de pacientes utilizando anticorpos anti-insulina. No mesmo
ano, Ekins desenvolveu um ensaio para tiroxina humana. O
princpio bsico era o mesmo, embora Ekins empregasse uma
globulina carregadora do hormnio em vez de anticorpo. Em
1977, Yalow foi indicado para o Prmio Nobel de Medicina
pelo "desenvolvimento do radioimunoensaio para hormnios
peptdicos':
O radioimunoensaio tem aplicao muito ampla na toxicologia, farmacologia, endocrinologia, imunologia etc. Pode ser
utilizado para quantificar hormnios, frmacos, substncias
ilcitas, marcadores tumorais, alergnios e anticorpos associados alergia, e antgenos e anticorpos em infeces por vrus,
bactrias etc. H muitas variaes, mas o princpio o mesmo:
a quantidade de reagente marcado (antgeno ou anticorpo)
quantifica o antgeno ou o anticorpo no marcado na amos-

Diagnstico Laboratorial
tra. O ensaio pode ser competitivo ou apresentar excesso de
reagente.
O anticorpo empregado pode ser um antissoro policlonal, preparado por imunizao com a substncia que se quer
determinar purificada, ou pode ser um anticorpo monoclonal produzido in vitro. No radioimunoensaio de competio,
a quantidade de reagente limitada e a diluio de anticorpo
utilizada deve ser determinada por titulao com pequena
quantidade da substncia que se quer determinar marcada. O
ttulo do antissoro funo da concentrao mnima da substncia que pode ser medida, depende da avidez do anticorpo
ou populaes de anticorpos presentes e varia, de acordo com
a natureza do ensaio, de 1:105-1:106 ou mais.
Vrios radioistopos podem ser utilizados, mas os marcadores para reagentes sorolgicos devem apresentar meia-vida
compatvel. Istopos como 125I (meia-vida de 57,5 dias) e 131I
(meia-vida de 8 dias) so os mais empregados na Imunologia.
Como qualquer ensaio com ligantes, o radioimunoensaio
compreende trs estgios: construo de curva de calibrao,
interpolao dos resultados e controle de qualidade. A curva
de calibrao construda a partir de uma srie de diluies
com concentraes conhecidas da substncia a ser determinada, que so chamadas de padres ou calibradores. Aps a
realizao dos ensaios, a medida da resposta feita por contagem radioativa, cujo mtodo depende do tipo de radiao
emitida. Para radiaes alfa e beta utiliza-se um contador de
cintilaes, e, para radiao gama, um contador gama de cristal slido. Aps a contagem, constri-se uma curva de calibrao que expressa a relao entre a concentrao do calibrador
e a resposta. Estima-se a concentrao da substncia em teste
processando a amostra do mesmo modo que os calibradores e
fazendo-se a interpolao da concentrao que corresponde
resposta observada. Visto que qualquer medida envolve erros,
os resultados do ensaio devem ser acompanhados de limites de confiana determinados estatisticamente. Tambm
importante fazer um controle dos erros sistemticos e ocasionais, incluindo amostras de concentrao conhecida em cada
partida de ensaios.
Uma etapa crtica e que introduz a maior fonte de erro do
radioimunoensaio a separao das fraes livre e ligada da
substncia marcada. Essa separao pode ser realizada por
vrios processos, porm nenhum dos mtodos perfeito,
tendo cada um suas vantagens e desvantagens, dependendo
da diferena de tamanho entre a substncia marcada livre e
a ligada. As tcnicas mais empregadas so a imunoprecipitao (precipitao do duplo anticorpo), a separao qumica
(sulfato de amnio, etanol, polietilenoglicol etc.) e as tcnicas
com adsorventes (talco, slica, resinas, protena A, celulose
etc.). Uma alternativa separao das fraes livre e ligada
a imobilizao de um dos reagentes a uma fase slida, tanto
por adsoro quanto por conjugao covalente, tornando mais
rpida e fcil a separao e permitindo que grande nmero de
amostras seja processado rapidamente. H dois tipos de sistemas de fase slida, com matrizes particuladas (celulose, agarose) ou com superfcie contnua (tubos, discos, placas).

Radioimunoensaio de fase slida


No radioimunoensaio de fase slida, um dos reagentes
imobilizado nas cavidades de placas plsticas de microtitulao. O emprego desses ensaios de fase slida facilita a lavagem,
eliminando a necessidade de centrifugao, especialmente no
passo em que necessrio remover todos os traos de material
radioativo no ligado. Essa tcnica mais rpida e necessita de
menor quantidade de reagentes.

Captulo 2

25

Testes Sorolgicos

As placas so sensibilizadas com antgeno ou anticorpo,


cuja concentrao tima deve ser empiricamente determinada
para cada sistema. A placa deve ser bloqueada para evitar a
adsoro no especfica dos reagentes. Aps as incubaes,
so feitas lavagens das placas com tampes apropriados a fim
de remover as substncias no ligadas ao suporte. H diversas
variaes no radioimunoensaio, adaptadas de acordo com o
objetivo do teste. Sero comentados os mtodos de competio com antgeno marcado, de competio com anticorpo
marcado e o ensaio imunorradiomtrico (IRMA) para a pesquisa de antgeno.

Radioimunoensaio de competio com antgeno marcado


No radioimunoensaio de competio com antgeno
marcado (Figura 2.12), uma quantidade fixa e limitada de
anticorpo ligada a um suporte slido. Adiciona-se uma
quantidade fixa e pequena de antgeno marcado, misturada com a amostra em teste ou com as solues padro
que contenham concentraes conhecidas do antgeno
no marcado. Aps um perodo de incubao, remove-se o
antgeno no ligado e faz-se a medida da radioatividade da
fase slida. O antgeno da amostra ou das solues padro
inibe, por competio, a ligao do antgeno marcado ao
anticorpo imobilizado na fase slida, de modo que, quanto
maior a quantidade de antgeno na amostra ou no padro,
maior a frao de antgeno marcado livre. A quantidade
de antgeno que se liga depende tanto de sua concentrao quanto da afinidade do anticorpo pelo antgeno. Os
resultados das solues padro de concentrao conhecida
so utilizados para construir a curva de inibio da res-

posta radioativa em funo da concentrao do antgeno.


A partir da resposta obtida, a concentrao do antgeno em
teste estimada por interpolao na curva.

Radioimunoensaio de competio com anticorpo marcado


No radioimunoensaio de competio com anticorpo marcado
(Figura 2.12), uma quantidade fixa do antgeno imobilizada em
um suporte slido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo
marcado especfico, misturada com a amostra em teste ou uma
srie de solues padro com concentraes variadas do antgeno
solvel. Aps um perodo de incubao, o anticorpo marcado
que no se ligou fase slida e o antgeno solvel so removidos
por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase slida. O
anticorpo especfico pode ser marcado diretamente ou pode estar
ligado a uma anti-imunoglobulina marcada. O antgeno solvel da
amostra ou das solues padro inibe, por competio, a ligao
do anticorpo especfico ao antgeno imobilizado na fase slida, de
modo que, quanto maior a concentrao de antgeno na amostra em teste, ou nas solues padro, menor ser a quantidade de
anticorpo marcado ligada fase slida. Os resultados das solues
padro de concentrao conhecida so utilizados para construir
a curva de inibio da resposta radioativa em funo da concentrao do antgeno. A partir da resposta obtida, a concentrao do
antgeno em teste estimada por interpolao na curva.

Ensaio imunorradiomtrico
Miles e Hales, em 1968, descreveram um sistema alternativo do radioimunoensaio em que anticorpos monoespecficos marcados so utilizados para quantificar o antgeno. No
radioimunoensaio convencional, a quantidade do anticorpo

Mtodo de competio
com antgeno marcado

Anticorpo

Antgeno marcado +
no marcado (amostra)

_)-


Antgeno
fase slida

~.

_)\_

_)~

Anticorpo marcado +
antgeno (amostra)

Medir
radioatividade

~'f' ~l

..A--

Mtodo de
competio
com anticorpo
marcado

Medir
radioatividade

IRMA

Anticorpo

Antgeno (amostra)

Anticorpo marcado
(antiantgeno)

Medir
radioatividade

Figura 2.12 Radioimunoensaio. Esquema dos mtodos de competio com antgeno marcado, de competio com anticorpo marcado e do
ensaio imunorradiomtrico (IRMA) para a pesquisa de antgenos.

26
na fase slida limitada, sendo um reagente proporcional, e
o antgeno fica em excesso. No ensaio imunorradiomtrico, o
anticorpo deve estar em excesso na fase slida. O emprego de
anticorpos monoclonais facilita e refina o ensaio, tornando-o
til para a deteco de antgenos proteicos.
No ensaio imunorradiomtrico que utiliza o sistema de
"sanduche" de dois stios ou duplo anticorpo (Figura 2.12), uma
quantidade fixa de anticorpo imobilizada em um suporte. A
soluo teste, com quantidade desconhecida de antgeno, ou as
solues padro, com concentraes conhecidas do antgeno,
so adicionadas. Aps a incubao, remove-se o antgeno no
ligado e adicionam-se anticorpos marcados especficos para o
antgeno, com stio de ligao diferente do stio do anticorpo
de fase slida. O anticorpo marcado no ligado removido
por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase slida.
Quanto maior a concentrao de antgeno na amostra ou nas
solues padro, maior a quantidade de anticorpo marcado
ligado e maior a radioatividade. Os resultados das solues
padro de concentrao conhecida so utilizados para construir a curva de ligao do anticorpo marcado em funo da
concentrao do antgeno. A partir da resposta obtida, a concentrao do antgeno em teste estimada por interpolao
na curva. Comparado ao radioimunoensaio de competio, o
IRMA tem tempos de incubao menores, maior preciso e,
teoricamente, maior sensibilidade.

Autorradiografia
A autorradiografia ou radioautografia um mtodo que
utiliza uma emulso sensvel radiao para registrar a distribuio espacial de istopos radioativos em determinado
tecido, clula, organela ou molcula, podendo localizar substncias, estruturas ou processos biolgicos.
Alm de ser til em uma srie muito grande de aplicaes,
como na microscopia eletrnica e na cromatografia, a autorradiografia pode ser utilizada na revelao da reao antgenoanticorpo em vrias tcnicas, como immunoblotting e dot-blot,
e na visualizao de precipitados em gel, como nas tcnicas de
imunodifuso, imunoeletroforese e imunofixao. Os radioistopos mais comumente utilizados na autorradiografia para
marcar antgenos ou anticorpos so 3 H, 45Ca, 1251, 32P ou 35S.
Com exceo do 1251, que emite radiao gama, os demais emitem partculas beta.
Os filmes de radiografias de alta velocidade so os mais
empregados nos mtodos de deteco de radioistopos em
superfcies planas, tais como gis de agarose ou acrilamida, filtros de nitrocelulose etc. Utilizam emulses sensveis quanto
capacidade de reagir efetivamente luz (ftons) e a radiaes
ionizantes como raios gama, eltrons e partculas beta, fornecendo uma boa combinao de sensibilidade e resoluo. Ao
mesmo tempo, no necessitam de investimento em equipamentos caros. Os filmes de raios X comumente utilizados so
formados por uma camada de emulso sensvel radiao e
um suporte flexvel. A camada de emulso feita de pequenos
cristais de haletos de prata (brometos, cloretos ou misturas de
haletos, incluindo iodetos), suspensos em gelatina.
Para a realizao da autorradiografia os preparados devem
ser secos. Os gis de agarose e poliacrilamida podem ser utilizados sem secar, porm apresentam sensibilidade e resoluo
menores. Alm disso, a secagem evita a difuso das bandas.
Em linhas gerais, o processo da autorradiografia constitudo por trs etapas bsicas: aplicao da emulso, exposio
e desenvolvimento ou revelao. Aps a aplicao da emulso, o tempo de exposio varia de acordo com o istopo

Diagnstico Laboratorial
empregado. Durante esse perodo de exposio, a radiao
ionizante emitida pelo decaimento da substncia radioativa
interage com cada cristal de haleto de prata individualmente,
promovendo a liberao de eltrons no cristal e dando origem
a imagens latentes (invisveis), que, na revelao da emulso,
promovem a reduo do haleto de prata para prata metlica.
Apenas os cristais de haleto de prata que foram atingidos por
uma partcula so reduzidos prata metlica, enquanto cristais no expostos no se transformam em grnulos de prata.
Essas alteraes na emulso so semelhantes s que ocorrem
em um processo fotogrfico comum. Aps o desenvolvimento
do processo fotogrfico, os pontos pretos ou grnulos da imagem autorradiogrfica formada localizam o stio da emisso
radioativa.
Trs mtodos de exposio podem ser utilizados com gis
ou membranas: autorradiografia direta, fluorografia e telas
intensificadoras. O mtodo de escolha depender do nvel de
penetrao da radiao do istopo empregado. H diferenas
entre a sensibilidade e a resoluo desses mtodos. A maior
resoluo obtida na autorradiografia direta, em que partculas beta ou raios gama interagem diretamente com os cristais do haleto de prata na emulso do filme radiogrfico. A
fluorografia e as telas intensificadoras so mtodos indiretos
que promovem aumento de sensibilidade pela converso das
emisses radioativas em luz.

Autorradiografia direta
Na autorradiografia direta, o filme de radiografias colocado o mais prximo possvel da amostra, em um recipiente
prova de luz, e exposto a qualquer temperatura conveniente.
Aps a exposio, o filme removido e processado de acordo
com as instrues do fabricante, manual ou automaticamente.
Esse mtodo simples e fornece tima resoluo, com moderada sensibilidade para istopos emissores de beta de alta
ou mdia energia (exceto 3H, que emissor de beta de baixa
energia). Produz imagens quantitativas, em que a absorbncia
da imagem do filme diretamente proporcional radioatividade, at o limite de saturao do filme. o mtodo de escolha
quando a resoluo espacial mais importante do que a sensibilidade. Necessita de um tempo maior de exposio do que
os outros mtodos.
Esse mtodo recomendado com 14C ou 35S, em gis de acrilamida ou agarose e com 32P e os emissores gama, em qualquer
tipo de amostra plana, quando se necessita de maior resoluo.
Com 14C ou 35S, em papel ou membrana de nitrocelulose, tanto
a resoluo quanto a sensibilidade so elevadas nessa tcnica.

Fluorografia
A eficincia de deteco de radioistopos, que emitem
partculas beta de baixa energia, depende tanto da energia de
emisso do istopo quanto da proporo de acessibilidade
das molculas radioativas na amostra. Assim, quando emissores de beta de baixa energia, como 3 H, 14C ou 35S, esto
localizados em agregados ou gis de acrilamida ou agarose,
ou amostras similares, as partculas beta so absorvidas pela
amostra e no conseguem reagir com o filme. Para solucionar
esse problema pode-se empregar a fluorografia, mtodo que
aumenta a deteco do sinal radioativo utilizando a impregnao da amostra com um cintilador orgnico, como o PPO
(2,5-difeniloxazol).
Na fluorografia as partculas beta da amostra excitam o cintilador, de modo a emitir luz ultravioleta ou azul, que no
absorvida pela amostra, podendo ser liberada mais livremente
e produzindo uma imagem fotogrfica, em vez de autorradio-

Captulo 2

Testes Sorolgicos

grfica, no filme de radiografias. Vrios reagentes fluorogrficos e procedimentos tm sido descritos. Eles diferem na sensibilidade, qualidade da imagem, tempo de preparao, custo
." .
e conven1enc1a.
Esse mtodo necessita de menor tempo de exposio e
mais sensvel, porm apresenta menor resoluo da imagem e necessita de exposio a baixa temperatura (-70C).
Alm disso, para obter uma resposta quantitativa do filme
e mxima sensibilidade com pequena quantidade de radioatividade, necessrio pr-expor o filme a um flash de luz
.
"
instantaneo.
A maioria das aplicaes da fluorografia refere-se principalmente a gis de poliacrilamida, sendo tambm aplicada em papel, membrana de nitrocelulose etc. A eficincia de deteco de 14 C e 35S em gis de poliacrilamida pode
ser at 10 vezes maior do que no mtodo direto, porm,
quando esses istopos so utilizados em marcaes em
membranas de nitrocelulose, como no immunoblotting, o
mtodo direto eficiente, no sendo necessrio empregar
fluorografia.
Esse mtodo recomendado com 3 H, em gis de acrilamida e agarose, papel e membrana de nitrocelulose e com 14C
ou 35S, em gis de acrilamida ou agarose, quando se necessita
de maior sensibilidade.

Telas intensificadoras
Os raios gama, como os emitidos pelo 1251, e as partculas beta de alta energia, como as emitidas pelo 32 P, tm
alto poder de penetrao, no sendo absorvidos eficientemente pelo filme de radiografias. Consequentemente,
atravessam e ultrapassam o filme, de modo que a maior
parte da energia emitida se perde, sem ser registrada. Para
solucionar esse problema pode-se colocar o filme entre a
amostra e uma tela intensificadora, constituda de uma
substncia fluorescente inorgnica de alta densidade. Essa
tela absorve mais eficientemente a radiao que passa
atravs do filme e a converte em luz azul ou ultravioleta,
que enviada de volta para o filme, havendo a formao
de uma imagem fotogrfica, que se sobrepe autorradiogrfica. Essa converso utilizada rotineiramente na
radiologia mdica.
Do mesmo modo que na fluorografia, h necessidade de
exposio a - 70C e de pr-exposio do filme a um breve
flash de luz, quando se detectam pequenas quantidades de
radioatividade, em longos perodos de exposio, para superar a fase inicial da formao da imagem fotogrfica pela luz,
que reversvel. Embora as telas de intensificao aumentem
muito a sensibilidade de deteco do 32 P e dos emissores gama,
h diminuio na resoluo devido ao espalhamento das emisses primrias e secundrias.
Entre as telas intensificadoras disponveis, a de tungstato de clcio a mais utilizada, pois fornece maior resoluo e menor reao de fundo na deteco de radioistopos. Telas que contm fluorocloreto de brio ativado
com eurpio ou oxissulfeto de lantnio, gadolnio ou trio
ativado com trbio podem ser mais sensveis, porm fornecem menor resoluo e maior reao de fundo devido
necessidade da exposio a - 70C e pr-exposio do
filme.
Esse mtodo recomendado com 32P e os emissores
gama, em qualquer tipo de amostra plana, quando se necessita de maior sensibilidade, e no tem efeito na deteco
de emisses de menor energia, como no caso de 3 H, 14C ou
3ss.

27

..,. Tcnicas imunoenzimticas


As tcnicas imunoenzimticas tm base na utilizao de
antgenos ou anticorpos marcados com enzimas e permitem a
deteco, titulao e quantificao de substncias de interesse
biolgico. Vrios mtodos imunoenzimticos foram desenvolvidos:
Para a localizao de constituintes celulares
Para a medida de pequenas quantidades de antgenos, haptenos e anticorpos
Para a deteco de imunoprecipitados.
Nessas tcnicas, um dos fatores mais import antes a
eficincia do conjugado empregado e, consequentemente, a
escolha de trs componentes: anticorpo ou antgeno, enzima
e processo de conjugao, cujas caractersticas, por sua vez,
variam de acordo com a tcnica empregada.

lmunoperoxidase
A tcnica de marcao de anticorpos com enzimas foi
introduzida por Avrameas e Uriel e por Nakane e Pierce, em
1966, para detectar e localizar antgenos celulares empregando
microscopia ptica comum. Como a enzima utilizada foi a
peroxidase, a tcnica ficou conhecida como imunoperoxidase.
As tcnicas para localizar constituintes celulares seguem
o mesmo princpio da imunofluorescncia, com a diferena
de que, em vez do fluorocromo, emprega-se a enzima, que
tem maior capacidade de amplificao. A enzima converte o
componente cromgeno (substrato+ doador de hidrognio)
em um produto insolvel que precipita no stio da reao.
Esses precipitados podem ser visveis ao microscpio ptico
comum e, adicionando-se tetrxido de smio, ao microscpio eletrnico. Alm da peroxidase, outras enzimas, como a
fosfatase alcalina e a glicose oxidase, podem ser empregadas na localizao de antgenos. A peroxidase a enzima de
escolha porque a colorao de fcil realizao e fornece
resultados satisfatrios e reprodutveis; alm disso, seu baixo
peso molecular permite que o conjugado penetre com maior
facilidade no interior de clulas fixadas, definindo melhor as
estruturas. Dependendo do cromgeno utilizado, podem ser
obtidos produtos de reao com coloraes diferentes, o que
permite a deteco simultnea de dois ou mais constituintes
celulares.
Uma variao do teste a tcnica PAP (peroxidase-antiperoxidase), que compreende trs estgios. O anticorpo especfico, obtido em coelho, reage com o antgeno da lmina. A
seguir, coloca-se uma anti-imunoglobulina de coelho obtida
em cabra. Finalmente, adiciona-se um complexo solvel
que consiste em peroxidase combinada com antiperoxidase,
obtida em coelho. Esse complexo se liga anti-imunoglobulina de coelho j fixada ao primeiro anticorpo, incorporando a
peroxidase ao sistema. Adiciona-se o cromgeno e obtm-se o
precipitado marrom.
A tcnica da imunoperoxidase pode ser u tilizada na
pesquisa de anticorpos, com o mesmo princpio utilizado na imunofluorescncia indireta. Antgenos so fixados lmina e incubados com diluies do soro onde se
quer pesquisar os anticorpos especficos. Aps lavagem,
incuba-se com uma anti-imunoglobulina marcada com a
peroxidase. Depois, adiciona-se o substrato cromognico,
como a diaminobenzidina/H20 2 que, sob a ao da enzima,
forma um precipitado. Com relao imunofluorescncia,

28
a imunoperoxidase tem a vantagem de fornecer preparaes duradouras e de no necessitar da microscopia de fluo" .
rescenc1a.
O sistema de amplificao da avidina/estreptavidinabiotina pode ser utilizado na tcnica da imunoperoxidase,
em que a enzima conjugada avidina e o anticorpo, biotina. Esse sistema tem sido utilizado em vrios estudos de
imunocitoqumica e imuno-histoqumica. Em tecidos que
contm altos nveis de biotina endgena, o que pode resultar
em alto nvel de colorao de fundo, necessrio bloquear a
molcula endgena antes de adicionar os reagentes biotinilados.

Enzimaimunoensaio
O enzimaimunoensaio um mtodo quantitativo em que
a reao antgeno-anticorpo monitorada pela medida da atividade enzimtica. Desempenha papel muito importante no
laboratrio clnico, pois, alm de elevada sensibilidade, comparvel do radioimunoensaio, apresenta as vantagens de utilizar reagentes estveis, estar livre das exigncias de trabalhar
com radioistopos e poder ser adaptado tanto a testes simples
quanto automao. O ensaio pode ser empregado com uma
variedade de sistemas de deteco, que vo de leituras visuais a
fotomtricas, com substratos coloridos, fluorescentes ou luminescentes, fato que tem contribudo para a multiplicao de
seus mtodos e aplicaes.
Uma caracterstica comum entre radioimunoensaio e enzimaimunoensaio que ambos medem, diretamente, a interao entre o antgeno e o anticorpo, no dependendo de um
segundo fenmeno como precipitao, aglutinao ou fixao
de complemento. Este segundo fenmeno requer a formao
de complexos antgeno-anticorpo maiores, o que diminui o
seu limiar de sensibilidade.
Rubenstein, em 1972, classificou o enzimaimunoensaio
em dois tipos: homogneo e heterogneo. Nos ensaios homogneos, no necessrio separar os complexos antgenoanticorpo e o antgeno e/ou o anticorpo livres, pois a interao antgeno-anticorpo modula a atividade da enzima. Nos
ensaios heterogneos a separao necessria, pois a atividade
da enzima no alterada pela reao antgeno-anticorpo. Os
ensaios homogneos so mais utilizados para detectar haptenos e os heterogneos, para detectar molculas maiores.
Para ser utilizada em imunoensaio, a enzima deve preencher os seguintes requisitos: ter alta atividade especfica, sendo
o produto da reao enzimtica estvel, de fcil quantificao e
com alto coeficiente de extino molar, facilitando a deteco
de pequenas quantidades de enzima; ser estvel; ser facilmente
obtida em forma purificada; ser facilmente conjugada a vrios
antgenos, anticorpos e haptenos, sem perda da sua atividade;
ter preo acessvel. Entre as enzimas, a mais empregada a
peroxidase, que, alm desses requisitos, pode ser conjugada
por vrios processos e ser revelada por vrias substncias cromognicas. Quando o antgeno tem atividade de peroxidase, a
fosfatase alcalina uma boa alternativa.
Nos ensaios heterogneos, alm da peroxidase, as enzimas
mais utilizadas so fosfatase alcalina, 13-galactosidase, glicose
oxidase, glucoamilase, anidrase carbnica e acetilcolinesterase. Nos ensaios homogneos, so lisozima, maiato desidrogenase, glicose-6-fosfato desidrogenase, ribonuclease A e
13-galactosidase.

Diagnstico Laboratorial

ELISA
O termo ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) foi
utilizado pela primeira vez por Engvall e Perlmann, em 1971, e
identifica um ensaio heterogneo, diferente dos mtodos enzimticos at ento utilizados, que envolviam coloraes imunohistoqumicas pela tcnica de imunoperoxidase. O conceito de
enzimaimunoensaio heterogneo foi apresentado por Miles e
Hales, em 1968, mas o emprego de conjugados enzimticos em
imunoensaios foi relatado, independentemente, por Engvall e
Perlmann (Sucia), com o termo ELISA, e por Van Weemen e
Schuurs (Holanda), com o termo EIA (enzimaimunoensaio),
em 1971. Esse teste foi desenvolvido, como uma alternativa
ao radioimunoensaio, para detectar antgenos e anticorpos.
O seu princpio bsico a imobilizao de um dos reagentes
em uma fase slida, enquanto outro reagente pode ser ligado
a uma enzima, com preservao das atividades enzimtica e
imunolgica do anticorpo. A fase slida pode ser constituda
por partculas de agarose, poliacrilamida, dextrana, poliestireno etc. Placas plsticas so as mais difundidas, por permitirem a realizao de mltiplos ensaios e automao. O teste
detecta quantidades extremamente pequenas de antgenos ou
anticorpos, podendo ter elevada preciso se os reagentes e os
parmetros do ensaio forem bem padronizados.
Especial ateno deve ser dada fase slida, cujas propriedades podem variar de acordo com a composio. Os materiais plsticos disponveis para essa finalidade so poliestireno, polipropileno, policarbonato e polivinil. O poliestireno
o mais adequado para protenas. composto por uma longa
cadeia de carbono com anis de benzeno, o que o torna muito
hidrofbico. H placas de poliestireno com alta, mdia e baixa
capacidade de ligao de protenas.
Protenas e outras biomolculas ligam-se s placas por
vrios mecanismos. A adsoro passiva consiste em interaes hidrofbicas (mdia ligao) ou interaes hidrofbicoinicas (alta ligao), entre os resduos apoiares das protenas
e a superfcie da placa, embora foras eletrostticas tambm
possam contribuir. Em placas que tm a superfcie modificada
por grupos amina ou carboxil, a ligao biomolcula se faz
covalentemente.
Placas de mdia capacidade de ligao so recomendadas
para a imobilizao de molculas grandes, como anticorpos
ou antgenos > 20 kDa, que apresentam grandes reas hidrofbicas capazes de reagir com a placa. A capacidade de ligao
dessas placas de 100 a 200 ng IgG/cm2
Placas de alta capacidade de ligao so modificadas por
radiao que incorpora grupos carboxlicos ao anel benznico,
permitindo interaes hidrofbicas e inicas com os grupos
com carga positiva das biomolculas. So indicadas para ligao de biomolculas de tamanho mdio a grande(> 10 kDa)
com carga positiva com ou sem grupos hidrofbicos. A capacidade de ligao de 400 a 500 ng IgG/cm2
Em casos especiais, podem ser necessrias placas prativadas. Por exemplo, placas pr-revestidas com protena A
ou protena G para a sensibilizao com anticorpos; placas
pr-revestidas com estreptavidina para amostras ou anticorpos biotinilados; placas revestidas com nquel ou cobre para
protena com cauda de histidina ou anticorpos IgG que tm
uma sequncia rica em histidina em seu domnio Fc; placas modificadas pela substituio do anel benzeno por grupos amina carregados positivamente para a ligao inica de
molculas pequenas com carga negativa por meio dos grupos
funcionais amina, carboxil ou tiol.

Captulo 2

Testes Sorolgicos

As placas de poliestireno podem ser modificadas introduzindo-se grupos funcionais que permitem a imobilizao
covalente de biomolculas. Assim, h placas ativadas com
anidrido maleico ou maleimida para a ligao covalente de
molculas por meio de aminas ou tiis; placas ativadas com
N-oxissuccinimida para a ligao covalente de grupos amina;
placas ativadas com hidrazida para a ligao covalente de carboidratos ativados por periodato. Para escolher uma dessas
placas, necessrio conhecer a estrutura da molcula que ser
imobilizada na fase slida e que esse processo no interfira
com a atividade imunolgica ou enzimtica da molcula.
As placas podem ser de fundo plano, arredondado ou plano
com cantos chanfrados (easy wash). As placas de fundo plano
so mais adequadas para a leitura colorimtrica, pois possibilitam alta transmisso ptica e baixo background, embora possa
haver reteno de lquido nos cantos; nas de fundo arredondado no h reteno de lquido, mas so menos adequadas
para a leitura colorimtrica. As placas chanfradas so uma
alternativa, embora seu uso seja menos difundido. As placas
claras feitas de poliestireno puro so as mais indicadas devido
s caractersticas de ligao e so ideais para leituras colori' .
metr1cas.
Embora algumas molculas necessitem de condies especiais ou pr-tratamento antes de serem imobilizadas, o mtodo
mais utilizado de sensibilizao de placas emprega concentraes de protenas entre 2 e 10 g/m.f diludas em soluo
salina tamponada por fosfatos (PBS), pH 7,4, ou em tampo
carbonato-bicarbonato, pH 9,6. A soluo alcalina auxilia
na solubilizao de vrias protenas e peptdios, e a maioria
das protenas se liga mais fortemente s placas em condies
alcalinas. O PBS recomendado quando as placas forem secas
para utilizao posterior, pois o fosfato estrutura as molculas
de gua ao redor das molculas, diminuindo a desnaturao. A
incubao das placas deve ser feita overnight (16 h) a 4C, para
permitir o equilbrio entre as molculas livres e as ligadas.
O grau de pureza do antgeno ou do anticorpo da fase
slida muito importante, pois qualquer material heterlogo
competir pelo espao na placa. Para a pesquisa de antgeno,
o anticorpo utilizado na sensibilizao deve ter alta afinidade
e curva dose-resposta com grande inclinao. Para a pesquisa de anticorpos, o antgeno deve estar livre de impurezas,
podendo-se utilizar antgenos purificados por cromatografia
de afinidade com anticorpos monoclonais, peptdios sintticos
ou antgenos recombinantes.
Aps a sensibilizao da placa com o antgeno ou o anticorpo, todos os stios reativos da placa devem ser bloqueados
com uma alta concentrao de protena, como leite desnatado,
soroalbumina bovina, gelatina, casena e soro fetal bovino. Essa
soluo de bloqueio tambm pode ser utilizada como diluente
nas fases subsequentes do teste para diminuir o background e
estabilizar as molculas ligadas placa. As placas sensibilizadas podem ser utilizadas imediatamente ou secas e conservadas a 4C para serem utilizadas posteriormente, dependendo
da estabilidade da protena ligada.
Quanto amostra, importante que seja ensaiada na
faixa de concentrao em que a curva dose-resposta do teste
ELISA tenha grande inclinao, ou seja, na regio em que
pouca variao na concentrao resulta em grande aumento
na densidade ptica. Para tanto, necessrio diluir a amostra. A adsoro no especfica de componentes da amostra
na placa pode ser reduzida incluindo-se um detergente no
inico, como o Tween 20, e/ou protena (leite desnatado, gelatina, soroalbumina bovina, casena, soro fetal bovino etc.) no
diluente da amostra. Na pesquisa de anticorpos, diluies da

29
amostra da ordem de 100 vezes ou mais auxiliam a diminuir
as reaes inespecficas; o emprego de uma nica diluio da
amostra pode levar a resultados falso-negativos ou subestimados quando os anticorpos so de baixa afinidade.
As lavagens entre os perodos de incubao do teste so
feitas, geralmente, com tampo fosfato contendo Tween 20 a
0,05%, que promove a dissociao das ligaes mais fracas e
age como um bloqueador hidrofbico, bloqueando stios na
superfcie da placa que podem ficar livres devido lavagem.
Para promover a dissociao de anticorpos de baixa avidez,
pode-se realizar a lavagem com soluo de ureia ou de aminas
bsicas.
Os conjugados devem ser preparados com anticorpos de
alta afinidade e maximamente purificados. Melhores resultados so obtidos com anticorpos purificados por cromatografia
de afinidade ou com anticorpos monoclonais, mas anticorpos
produzidos em animais ou hibridomas diferentes, embora
reagentes contra o mesmo eptopo, podem variar. O mtodo
de conjugao, os diluentes e as condies de armazenamento
podem influenciar o desempenho do conjugado.
As enzimas mais utilizadas no teste ELISA so a peroxidase
e a fosfatase alcalina. Cada uma tem as suas vantagens e desvantagens. Ambas so estveis, podem ser estocadas a 4C por mais
de 6 meses e so relativamente baratas. A principal vantagem da
peroxidase ser uma molcula pequena (40 kDa), e, por isso,
raramente causa problemas de impedimento estrico. A principal desvantagem ser incompatvel com preservantes como a
azida sdica. A fosfatase alcalina mais estvel do que a peroxidase, porm uma molcula maior ( 140 kDa) e um pouco mais
cara. Entretanto, sua principal desvantagem ser inativada por
agentes quelantes, pH cido e fosfatos inorgnicos.
Para a revelao da reao so utilizados substratos cromognicos que, por sua ao enzimtica, do origem a produtos
solveis coloridos (Figura 2.13). Para a peroxidase, o substrato
o perxido de hidrognio (H20 2 ) e os cromgenos ou doadores
de hidrognio mais utilizados so ortofenilenodiamina (OPD),
cido 5-aminossaliclico, ortotoluidina, 2,2'-diazino do cido
etilbenzotiazolino sulfnico (ABTS) e tetrametilbenzidina
(TMB). A peroxidase reduz a H 20 2, o que leva oxidao do
segundo substrato e d origem a um produto de reao solvel
e colorido. A escolha do cromgeno, embora dependa da prefe-

Figura 2.13 Placa de ELISA em que se empregou OPD/H 20 2 na revelao da reao.

Diagnstico Laboratorial

30
rncia do laboratrio, deve levar em considerao vrios fatores,
como sensibilidade, reao de fundo, estabilidade do composto,
toxicidade e custo. ABTS menos sensvel que OPD e TMB, o
que pode ser uma vantagem no caso de ensaios com elevada
colorao de fundo. TMB muito sensvel e pode originar elevada colorao de fundo quando se utiliza muito antgeno ou
anticorpo. A concentrao tima do substrato (H20 2 ) o fator
mais importante no desenvolvimento da cor e depende do cromgeno empregado e da fase slida, devendo ser estabelecida
preliminarmente. Aps o desenvolvimento da colorao, sua
determinao pode ser feita visualmente, para resultados qualitativos, ou medindo-se a densidade ptica da soluo, espectrofotometricamente. Este o mtodo de escolha, e h vrios tipos
de fotmetros multicanal, especficos para a leitura de placas de
ELISA. Variaes dirias nas condies do teste tornam necessria a correo dos valores das amostras ensaiadas com relao
a amostras de referncia.
O objetivo do ensaio a quantificao ou verificao da
presena de um antgeno ou anticorpo. Os vrios mtodos de
expresso dos resultados do teste se enquadram em duas categorias: quantificao da concentrao da amostra em anlise
(geralmente para antgenos ou haptenos) ou relato dos valores
da absorbncia obtida ou outra unidade arbitrria (geralmente
para anticorpos). No caso de antgenos bem definidos, possvel obter as concentraes em mg/mf, sendo necessria uma
amostra de referncia para construir uma curva dose-resposta
para calibrao (concentrao do padro versus absorbncia).
Na pesquisa de anticorpos a quantificao mais complexa,
pois, alm de serem heterogneos quanto sua afinidade e
propriedades fsico-qumicas, so, geralmente, ensaiados em
uma faixa de concentrao mais ampla do que a dos antgenos.
Alm disso, a afinidade dos anticorpos varia com a concentrao, sendo maior em amostras mais diludas. Essas diferenas devem ser consideradas ao se expressar os resultados,
mas, independentemente do mtodo escolhido para relatlos, necessrio determinar o limiar de reatividade ou cut-off.
Valores acima do limiar de reatividade so considerados positivos. Vrios mtodos podem ser utilizados para expressar os
resultados obtidos no teste ELISA:

Titulao simples: aps diluies em srie da amostra,

determina-se o ttulo com relao ao limiar de reatividade


Mtodo da dose efetiva: compara a curva dose-resposta
da amostra com a de um soro positivo de referncia. Este
mtodo mais reprodutvel do que o anterior porque as
leituras so feitas no ponto de inflexo e no na cauda da
curva, como na titulao simples
Absorbncia: necessita de uma s diluio da amostra
Curva de unidade padro: os valores da absorbncia so
transformados em unidades que fornecem uma escala
contnua, proporcional quantidade de anticorpos.
Considerando-se que as curvas dose-resposta para vrios
soros sejam paralelas, necessria apenas uma diluio da
amostra
Mtodos proporcionais: empregam a razo entre os valores
da amostra e um valor mdio de um grupo de amostras no
reagentes. Razes acima de duas ou trs vezes so consideradas positivas
Mltiplo da atividade normal: considera-se a metade final
das curvas dose-resposta e calcula-se o expoente da curva
parablica dessa parte. Neste modelo, as curvas dose-resposta so consideradas paralelas. Apresenta as vantagens
da proporcionalidade, da comparao direta com o soro
negativo e de necessitar uma nica diluio

Determinao do limiar de reatividade a partir do clculo da


mdia das absorbncias de amostras de indivduos normais
acrescida de 2 ou 3 desvios padres: amostras com absorbncia acima desse valor so consideradas reagentes. Este
mtodo requer uma nica diluio da amostra, porm, do
ponto de vista estatstico, pode no ser correto aplicar a
mdia e o desvio padro a dados que frequentemente no
tm distribuio normal
Soro limiar de reatividade: um pool de soros padro positivos diludo em pool de soros normais titulado, escolhendo-se uma diluio que fornea densidade ptica prxima
considerada limiar de reatividade. Este mtodo utiliza
uma nica diluio da amostra.
Devido s caractersticas de elevada sensibilidade e especificidade, bem como de rapidez, baixo custo, simplicidade
tcnica, versatilidade, objetividade de leitura e possibilidade
de adaptao a diferentes graus de automao, o teste ELISA
empregado na deteco de antgenos ou anticorpos em um
nmero muito grande de sistemas. A extensa utilizao dos
testes ELISA deve-se tambm grande disponibilidade de
anticorpos monoclonais e ao desenvolvimento de antgenos
recombinantes especficos para um grande nmero de doenas autoimunes e infecciosas. O teste ELISA substituiu o radioimunoensaio, pois, alm de ter sensibilidade comparvel, no
apresenta os problemas decorrentes da utilizao de radioistopos. Tambm vem substituindo vrias outras tcnicas, como
a imunofluorescncia e a aglutinao.
A seguir, so descritos os mtodos empregados para a pesquisa de anticorpos e antgenos pelo teste ELISA. Por se tratar
de um ensaio heterogneo, aps cada etapa, como sensibilizao, incubao com amostra e com o conjugado, as cavidades
das placas so lavadas para efetuar a remoo do material no
ligado fase slida.

Ensaios para anticorpos


~

Mtodo indireto. O mtodo indireto tem sido amplamente

empregado na pesquisa de anticorpos e apresenta como vantagens a possibilidade de utilizar um nico conjugado, em
diferentes sistemas, e conjugado classe-especfico na determinao de anticorpos de diferentes classes.
No mtodo bsico (Figura 2.14), placas plsticas so sensibilizadas com o antgeno que, aps bloqueio, reage com os
anticorpos da amostra. O conjugado anti-imunoglobulina
humana reage com o anticorpo capturado pelo antgeno e a
reao revelada com a soluo cromgena. A reao interrompida, e a intensidade de cor estimada a olho nu ou fotometricamente. O grau de degradao do substrato, geralmente
indicado pela intensidade de cor da soluo, proporcional
concentrao de anticorpo. Vrias modificaes podem ser
feitas no mtodo bsico:
Se o antgeno no for suficientemente puro, um anticorpo
especfico pode ser ligado fase slida, seguido pelo antgeno bruto. Neste caso, necessrio que o anticorpo que
sensibiliza a fase slida no reaja com o conjugado
Aps se colocar a amostra, em vez de fazer a incubao com
o conjugado, pode-se colocar anti-imunoglobulina no
marcada e, em seguida, conjugado anti-imunoglobulina.
Essa tcnica empregada na pesquisa de anticorpos antissubclasses. No caso de IgG 1, por exemplo, aps a incubao
com a amostra, coloca-se um monoclonal anti-IgGl e, em
seguida, um conjugado anticamundongo

Captulo 2

Testes Sorolgicos

31

Mtodo indireto

E
Q)

Q)

Q)

C>

C>

C>

ro

ro

....J

....J

...


Antgeno

1~
1~

Anticorpo
(amostra)

...

)t )t
1~1~

Anti-imunoglobulina
marcada

ro

....J

...

)t )t
1~1~

Substrato
cromogen1co
A

Mtodo de captura para lgM

Anti-lgM

lgM (amostra)

Antgeno

Anticorpo marcado
(antiantgeno)

Substrato
cromognico

Figura 2.14 ELISA para a pesquisa de anticorpos. Esquema do mtodo indireto e de captura para lgM.

Em vez do conjugado enzimtico com antiglobulina,


pode-se utilizar protena A (que se liga poro Fc de IgG
com grande afinidade) marcada com enzima.

""' Mtodo de captura para anticorpos lgM. Na deteco de IgM


pelo mtodo indireto podem ocorrer falsos resultados positivos devido presena simultnea de anticorpo IgG e fator
reumatoide (anticorpo IgM anti-IgG), que pode reagir com o
conjugado anti-IgM. Podem ocorrer falsos resultados negativos se houver excesso de IgG, geralmente de maior afinidade,
que compete pelo antgeno imobilizado. Esses problemas
podem ser solucionados em parte absorvendo-se os soros
com anti-IgG para remover os anticorpos IgG, ou com IgG
agregada pelo calor para remover o fator reumatoide. Uma
alternativa o teste de captura de IgM (Figura 2.14).
A fase slida sensibilizada com anti-IgM especfico para a
regio Fc. Os soros em teste so incubados, havendo a captura de
qualquer IgM da amostra. A seguir, incuba-se com antgeno marcado ou antgeno no marcado, seguido de anticorpo especfico
marcado. Essa tcnica no necessita de antgeno purificado.
O teste de captura indicado para anticorpos IgM, pois,
durante a fase aguda das infeces, a maioria do IgM presente
especfica. Porm, para anticorpos IgG, o teste de captura
no conveniente porque a quantidade de anticorpo IgG especfico pode representar at menos de 10% do total de IgG.

Ensaios para antgenos


""' Mtodo de captura. O mtodo imunoenzimomtrico
(Figura 2.15) ou de captura, com excesso de anticorpo marcado, o mais utilizado para antgenos polivalentes, pois
apresenta sensibilidade 2 a 5 vezes maior do que os mtodos
em que o antgeno ligado fase slida. Este mtodo semelhante ao imunorradiomtrico de dois stios ou duplo anticorpo. Tambm conhecido como ELISA de "sanduche". A
fase slida sensibilizada com anticorpo especfico. A amostra
em teste, na qual ser pesquisado o antgeno, incubada com

a fase slida e, a seguir, incubada com o excesso de anticorpo especfico marcado com enzima. A reao revelada
pela adio do substrato. A taxa de degradao proporcional
concentrao do antgeno.
Nos sistemas ELISA de "sanduche': podem ser empregados anticorpos monoclonais ou policlonais tanto para a captura quanto para a deteco. Os anticorpos monoclonais permitem a deteco de pequenas diferenas entre os antgenos.
Geralmente, emprega-se anticorpo policlonal para a captura
da maior quantidade de antgeno e o monoclonal para a deteco mais especfica. importante que os anticorpos de captura
e deteco reconheam eptopos diferentes e no sobrepostos,
pois o uso do mesmo anticorpo na captura e deteco diminui
a sensibilidade do ensaio. Vrias modificaes so possveis:
A placa pode ser sensibilizada com anticorpo monoclonal,
com especificidade para um determinado eptopo do antgeno, e o conjugado pode ser preparado com a marcao de
um monoclonal, com especificidade para outro eptopo do
mesmo antgeno. A principal vantagem deste mtodo que
permite incubar a amostra com antgeno e o conjugado ao
mesmo tempo, tornando o ensaio mais rpido
Se o anticorpo ligado placa de uma espcie (carneiro)
e um anticorpo no marcado de uma segunda espcie
(coelho), pode-se introduzir um passo extra em que um
conjugado enzimtico anticoelho usado. Embora este
procedimento envolva um passo a mais, s necessita um
reagente antiespcie (anticoelho), e esse reagente pode ser
usado com antissoro de qualquer especificidade produzido
naquela espcie. Este procedimento importante se os
antissoros tiverem ttulos baixos e se houver vrios antgenos a serem detectados
A sensibilizao da placa pode ser feita com fragmento
F(ab )2 do anticorpo. A amostra ento adicionada, seguida
de antissoro no marcado. No lugar do conjugado antiespcie, pode-se utilizar conjugado com protena A

32

Diagnstico Laboratorial
Mtodo de captura

E
Q)

E
Q)

E
Q)

O>

Cl

Cl

~
....J

j[

~
....J

r~
~
~2 ~ .

lr lr

Antgeno
(amostra)

Anticorpo

E
Q)

O>

Cl

C1l
....J

C1l
....J

~
.r~.
~

Substrato
cromognico
Mtodo de competio com
anticorpo marcado

Antgeno (amostra)+
anticorpo marcado

Antgeno

Antiantgeno
marcado

E
Q)
~

j[

C1l
....J

Substrato cromognico
Mtodo de competio com
antgeno marcado

Antgeno marcado e
no marcado (amostra)

Anticorpo

Substrato cromognico
Mtodo de inibio para haptenos

E
Q)

E
Q)

E
Q)

E
Q)

O>

Cl

Cl

O>

C1l
....J

C1l
....J

C1l
....J

...

Haptenocarregador


~ ...

~~

Anticorpo+
hapteno (amostra)

-1~

~~
Anti-imunoglobulina
marcada

C1l
....J

-1~
-1~

--

Substrato
cromogen1co
A

'

Figura 2.15 ELISA para a pesquisa de antgenos. Esquema dos mtodos de captura, competio com anticorpo marcado, competio com antgeno marcado e inibio para haptenos.

O sistema avidina/estreptavidina-biotina tem sido empregado


para awnentar a sensibilidade do enzimaimunoensaio. O
mtodo de captura pode ser efetuado do mesmo modo at a
incubao da amostra, sendo ento adicionado anticorpo marcado com biotina e, em seguida, avidina/estreptavidina marcada
com enzima. Alternativamente, o mesmo procedimento pode
ser efetuado com anticorpo marcado com biotina, seguido de
avidina/estreptavidina e de biotina marcada com enzima.

.,.. Mtodo de competio com antgeno marcado. As placas so


sensibilizadas com anticorpo especfico e incubadas com o
conjugado antgeno-enzima na presena da amostra em que
se quer pesquisar o antgeno ou um padro de antgeno. Aps
a obteno do equilbrio da reao antgeno-anticorpo, incuba-se o preparado com uma soluo do substrato da enzima.
A reao enzimtica interrompida e faz-se a leitura espectrofotomtrica. H wna relao inversamente proporcional entre
a concentrao de antgeno, na amostra ou no padro, e as
densidades pticas obtidas. Esse mtodo anlogo ao radioimunoensaio. A reao est esquematizada na Figura 2.15.

.,.. Mtodo de competio com anticorpo marcado. Nessa tcnica (Figura 2.15), o antgeno ligado placa e a ligao
do anticorpo marcado , competitivamente, inibida pela
adio de antgeno padro ou da amostra. As demais etapas so semelhantes s do mtodo com antgeno marcado.
As densidades pticas obtidas so inversamente proporcionais concentrao do antgeno na amostra ou no
padro.
.,.. Mtodo de inibio para haptenos. As placas sensibilizadas com hapteno-carregador (Figura 2.15) so incubadas com a amostra em que se quer pesquisar o hapteno,
misturada com anticorpo produzido pela inoculao do
hapteno-carregador. Aps a lavagem, adiciona-se anticorpo anti-imunoglobulina marcado com enzima. Ao
mesmo tempo, executa-se um ensaio de referncia com
uma amostra sem hapteno. A diferena entre a absorbncia na amostra e na referncia reflete o nvel de hapteno
na amostra. Alternativamente, pode-se realizar um ensaio
clssico de competio em que o hapteno marcado com

a enzima.

Captulo 2

Testes Sorolgicos

Enzimaimunoensaio homogneo
Rubenstein et al., em 1972, descreveram um sistema homogneo do enzimaimunoensaio em que a atividade da enzima
conjugada a um ligante diminua quando o anticorpo se complexava ao ligante. Atualmente h vrios tipos de enzimaimunoensaios homogneos, tanto quantitativos como semiquantitativos, cuja caracterstica a modulao da atividade da
enzima na presena do substrato, pela interao antgeno-anticorpo, refletindo o grau de reao. Embora o ensaio homogneo necessite de reagentes complexos, dispensa a separao em
fases, rpido, de fcil execuo e bem adaptvel a diferentes
graus de automao. indicado para medir frmacos e outros
haptenos, mas pode apresentar problemas para a medida de
protena devido ao impedimento estrico.

lmmunodot
Este teste, tambm conhecido como dot-ELISA, dot-immunobinding assay, dot-blotting assay e dot-blot ELISA, utiliza
uma membrana de nitrocelulose em que pequenas quantidades de amostra so aplicadas como gotas. Foi desenvolvido
por Hawkes et al., em 1982, que verificaram que o teste poderia ser aplicado a uma srie de antgenos. Os autores testaram
e obtiveram excelentes resultados com protenas solveis, cidos nucleicos, membranas, organelas, fungos, protozorios,
bactrias e vrus.
As membranas de nitrocelulose adsorvem protenas com
grande eficincia (praticamente 100%), sendo muito teis,
como fase slida, em ensaios qualitativos, quando o volume da
amostra muito pequeno (menos de 1 f), ou com antgenos
solubilizados em detergentes inicos. Devido a essa elevada
capacidade de adsoro de protenas pela membrana, volumes
de 0,1 a 1 e, contendo 100 a 400 pg de imunorreagente, so
suficientes.
O dot-ELISA tem sido empregado na deteco de anticorpos em vrios sistemas e na caracterizao de anticorpos
monoclonais devido sua simplicidade, rapidez e sensibilidade. A membrana que contm o antgeno bloqueada com
protenas e detergente (geralmente, leite desnatado e Tween
20) para evitar ligaes inespecficas, e a amostra incubada.
Sucedem-se a lavagem, a incubao com conjugado anti-imunoglobulina marcada, a lavagem e a adio de substrato para o
desenvolvimento de cor.
As enzimas mais utilizadas so peroxidase, fosfatase alcalina e glicose oxidase. No caso da peroxidase, os substratos
empregados so diaminobenzidina/H20 2 e 4-cloro-1-naftol/
H 20 2 que, sob a ao da enzima, do origem a um precipitado
colorido. Alm dos substratos coloridos, outros sistemas de
deteco podem ser empregados com substratos fluorescentes
ou luminescentes, fato que tem contribudo para uma ampla
aplicao em diferentes sistemas.
O immunodot tambm pode ser realizado utilizando-se
conjugados marcados com radioistopos, sendo as bandas
detectadas pela autorradiografia.

Western blotting
Um dos mtodos mais utilizados para identificar protenas e glicoprotenas especficas, reconhecidas por anticorpos,
tem sido o immunoblotting, western blot ou western blotting,
para diferenciar do Southern e Northern blotting, que se referem identificao de cidos nucleicos. um mtodo em
que as protenas so separadas, de acordo com seu tamanho,

33
por eletroforese em gel de poliacrilamida, contendo dodecil
sulfato de sdio (SDS-PAGE) e, aps a separao, so transferidas, eletroforeticamente, do gel para uma membrana de
nitrocelulose, ou outra equivalente, onde ficam imobilizadas, como uma rplica do padro de bandas do gel. Aps
o bloqueio da membrana, a identificao imunolgica das
fraes separadas e transferidas feita imergindo-se as tiras
de nitrocelulose em soluo contendo os anticorpos especficos para as fraes. Os anticorpos se ligam aos antgenos imobilizados e so revelados ao se colocar a membrana
em soluo contendo anti-imunoglobulina marcada com a
enzima. Para a visualizao adiciona-se o cromgeno que,
sob a ao da enzima, d origem a um precipitado colorido
(Figura 2.16).
O western blotting combina a seletividade da eletroforese
em gel especificidade do imunoensaio, permitindo que
protenas individuais, em misturas complexas, sejam detectadas e analisadas. um mtodo qualitativo; o aparecimento de
uma banda em um blot indica a presena de um antgeno na
mistura que foi submetida eletroforese ou de um anticorpo
na amostra ensaiada na membrana.
Weber e Osborn (1969) e Laemmli (1970) utilizaram a tcnica de SDS-PAGE para determinar a mobilidade de vrias
protenas e verificaram que essa mobilidade era uma funo
linear dos logaritmos de seus pesos moleculares. O SDS, um
detergente aninico, liga-se s regies hidrofbicas das protenas em quantidade proporcional ao seu peso molecular e
confere-lhes carga negativa, de modo que elas migram para
o polo positivo e so facilmente separadas por eletroforese de
acordo com sua carga total. O SDS tambm provoca a ruptura
de pontes dissulfeto, promovendo o dobramento das subunidades em forma de hastes semirrgidas de tamanho proporcional ao peso molecular. Assim, a migrao dessas protenas
em um campo eltrico funo da sua massa e depende do
tamanho dos poros do gel, que proporcional concentrao
de acrilamida-poliacrilamida: as protenas menores migram
mais rpido. A SDS-PAGE pode ser empregada para estimar
o peso molecular de uma protena, comparando-se a sua distncia de migrao de padres de peso molecular em linhas
paralelas de um mesmo gel; para estimar o grau de pureza de
uma amostra etc. Glicoprotenas com alto teor de carboidratos
tm uma mobilidade menor do que se esperaria pelo seu peso
molecular, devido ligao a uma menor quantidade de SDS
quando comparada a outras protenas de igual massa.
O preparo da amostra para ser submetida SDS-PAGE
uma das etapas mais import antes para a obteno de resultados satisfatrios ao final do processo. Esse preparo visa
solubilizao das protenas da amostra. O processo de solubilizao envolve certo grau de desnaturao das protenas,
podendo-se empregar ureia, detergentes no inicos (Triton
X-100, Nonidet P-40), detergentes aninicos (SDS, desoxicolato de sdio) ou agentes redutores de pontes dissulfeto
(13-mercaptoetanol, ditiotreitol). O emprego de um desses
agentes ou de combinaes depende das propriedades fsicoqumicas das protenas em anlise e dos objetivos do estudo.
Para a transferncia as membranas de nitrocelulose (celulose esterificada com cido ntrico) so as mais utilizadas, pois
tm alta capacidade de ligao a protenas, principalmente
por interaes hidrofbicas, embora a formao de pontes de
hidrognio entre as cadeias de aminocidos e o grupo nitro da
membrana possa estar envolvida. Essa adsoro de protenas
instantnea, quase irreversvel e quantitativa em uma ampla
faixa de concentrao de protenas, 80 a 250 g/cm 2, dependendo da protena. Alternativamente, outros tipos de mem-

Diagnstico Laboratorial

34
A

B
Ctodo

Mistura de
antgenos
proteicos

nodo

Ctodo

Papel de filtro
Membrana

Migrao
eletrofortica

Gel
A

nodo
Tampo de
transferncia

C Reao imunoenzimtica

Reao antgeno-anticorpo

.\
.\
y
y

Reao com conjugado


Revelao com substrato
cromognico

~ ~~

~o
m~

~w

o~

Conjugado

o o Substrato
o

o o

.- o

Visualizao dos complexos


antgeno-anticorpo formados

cromogen1co
A

'

- - -

Figura 2.16 Western blotting. A. Separao das protenas, na presena de SDS, de acordo com seu tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida. B. Transferncia das fraes proteicas separadas, do gel para a membrana de nitrocelulose. C. Reao imunoenzimtica para a identificao das fraes separadas (antgenos) ou pesquisa de anticorpos em amostras. Exemplo de amostra com anticorpos contra as trs fraes do
antgeno (A) e contra duas fraes do antgeno (B).

branas, como, por exemplo, membranas de nilon carregadas


positivamente ou membranas de difluoreto de polivinilideno
(PVDF), podem ser empregadas em casos em que a nitrocelulose no tem bom desempenho. O PVDF um polmero do
tipo Teflon com o qual as protenas interagem no covalentemente, por meio de interaes dipolares e hidrofbicas, com
fora de ligao seis vezes maior que a da nitrocelulose. As
membranas de PVDF tm sido muito empregadas devido
sua resistncia a condies qumicas drsticas, em que a nitrocelulose se dissolveria. Quanto capacidade de reter protenas, nas membranas de nilon de 150 a 200 g/cm 2 e nas de
PVDF de aproximadamente 170 g/cm 2
Entre os vrios mtodos que tm sido empregados para a
transferncia das protenas de gis para membranas, o mais
eficiente o eletrofortico, que reproduz uma rplica fiel na
membrana mantendo a resoluo do gel. H dois tipos principais de aparelhos para transferncia: cuba com tampo e

sistema semisseco. As cubas de transferncia so de plstico


e tm um dispositivo que mantm a membrana em contato
direto com o gel, que colocado transversalmente ao campo
eltrico e submerso no tampo condutor. Geralmente, necessrio refrigerar o sistema. No sistema semisseco o gel e amembrana ficam, horizontalmente, entre dois pedaos de papel de
filtro umedecidos em tampo, em contato direto com dois eletrodos, que so placas condutoras que devem ter, no mnimo,
o mesmo tamanho do gel para que forneam um campo
eltrico homogneo. O termo semisseco se refere limitada
quantidade de tampo do papel de filtro. Ambos os mtodos
tm vantagens e desvantagens. O emprego das cubas permite
melhor controle da temperatura devido ao grande volume de
tampo da cuba, que ajuda a dissipar o calor gerado, sendo a
transferncia mais eficiente, principalmente para gis grandes.
No caso de minigis de acrilamida-poliacrilamida, o sistema
semisseco apresenta bom desempenho, de fcil manuseio,

Captulo 2

Testes Sorolgicos

permite transferncia rpida e consome pouco tampo. Alm


disso, podem-se empregar tampes diferentes no ctodo e no
nodo para melhorar a transferncia. A proximidade entre
os eletrodos fornece alto gradiente com pequena voltagem e,
assim, a transferncia rpida, no h aquecimento e no
preciso resfriar o sistema.
No mtodo de transferncia, originalmente descrito por
Towbin et al. em 1979, os complexos protena-SDS eram
transferidos por eletroforese com tampo sem SDS e com
metanol. Posteriormente, verificou-se que pequenas concentraes de SDS no tampo de transferncia melhoram o rendimento. Em geral a transferncia pode ser controlada, mas
h vrios parmetros que afetam a sua eficincia. O tampo
de transferncia varia em diferentes protocolos e depende da
natureza do experimento. Assim, a escolha do tampo e sobre
utilizar ou no metanol depende de vrios fatores, tais como o
tamanho do gel, a natureza das protenas, o tipo de membrana
e a necessidade de tampes especiais para renaturar protenas.
A adio de metanol ao tampo de transferncia aumenta a
ligao das protenas, principalmente as de baixo peso molecular, s membranas de nitrocelulose e de PVDF, no tendo
efeito com membranas de nilon positivamente carregadas.
O metanol facilita a dissociao dos complexos SDS-protena
e aumenta a interao hidrofbica entre a protena e a membrana. Por outro lado, o metanol pode provocar a precipitao
de algumas protenas e diminuio nos poros do gel, e pode
reduzir a eficincia de eluio de protenas de elevado peso
molecular por desnaturao, pois, como o SDS um detergente aninico, ajuda na transferncia de grandes protenas,
principalmente bsicas. Protenas de alto peso molecular no
precisam de metanol para se ligar adequadamente membrana. O metanol tambm impede o inchao do gel durante
a transferncia, o que levaria perda da nitidez das bandas.
Mesmo na ausncia do metanol, o inchao do gel pode ser evitado com a refrigerao do sistema de transferncia. A adio
de SDS aumenta a mobilidade devido carga maior, mas diminui a ligao s membranas de nitrocelulose e PVDF. Portanto,
recomendam-se baixas concentraes de SDS (em torno de
0,05% ), dependendo da natureza das protenas.
A eficincia da transferncia depende do tamanho da
protena, da porcentagem de acrilamida no gel, da corrente
eltrica utilizada, do tempo de transferncia, da membrana, do
pH do tampo e da presena de metanol ou SDS no tampo.
Empregando-se tampo com pH acima do ponto isoeltrico
da maioria das protenas, estas tero carga negativa e migraro, independentemente da presena de SDS, para o polo positivo, no qual a membrana est colocada.
Para avaliar a eficincia da transferncia e tambm localizar bandas ou padres, pode-se realizar uma colorao de
todas as protenas do blot. Para esse fim, Ponceau S o corante
recomendado, pois fornece um padro claro e a colorao
reversvel, permitindo a utilizao da membrana para posterior reao. A principal desvantagem sua baixa sensibilidade. Utilizando-se uma tira, uma parte ou uma duplicata da
membrana, pode-se realizar a colorao com corantes mais
sensveis, como ouro coloidal, prata, negro de amido e azul
de Coomassie R-250, dentre outros. Esses corantes podem
ser empregados com as membranas de nitrocelulose e PVDF.
Como alternativa, podem-se incluir padres de peso molecular pr-corados ou marcados com radioistopos. No caso
das membranas de nilon carregadas positivamente, deve-se
utilizar um corante como Ferridye, pois os outros coram a
prpria membrana.

35
Aps a transferncia, a membrana processada por ensaio
imunoenzimtico in situ, conforme descrito por Towbin et al.
em 1979, como ocorre no mtodo da imunoperoxidase e do
immunodot. Antes da reao, importante que as membranas
sejam incubadas com uma soluo de protena inerte (leite
desnatado, BSA, gelatina) para evitar a adsoro inespecfica. Aps o bloqueio a membrana incubada com a amostra em que se quer pesquisar anticorpos, ou com anticorpos
monoclonais ou policlonais especficos para os antgenos em
estudo. Sucede-se a lavagem, a incubao com o conjugado
enzimtico anti-imunoglobulina especfico ou com protena
A marcada com enzima, outra lavagem e a adio de substrato cromognico, especfico para a enzima. As incubaes
e as lavagens devem ser feitas sob agitao leve, para garantir
maior uniformidade de contato entre as solues e a membrana. Para minimizar adsoro no especfica, deve-se adicionar Tween 20 e uma protena inerte ao tampo de diluio.
Alm disso, o Tween 20 tem efeito renaturante de protenas. As
condies timas relacionadas a tempo de incubao, diluio
dos anticorpos para a deteco das bandas, diluio dos conjugados, e tempo de lavagem, variam de um sistema para o outro
e devem ser bem padronizadas.
Entre os vrios sistemas de deteco que podem ser utilizados no western blotting, os mais empregados so os conjugados
enzimticos e as sondas radioativas. Nos conjugados enzimticos, as enzimas mais utilizadas so peroxidase, fosfatase alcalina, 13-galactosidase e glicose oxidase. No caso da peroxidase,
os substratos empregados so diaminobenzidina, tetramatilbenzidina e 4-cloro-1-naftol que, sob a ao da enzima, do
origem a substncias que precipitam e se ligam membrana
nos locais onde h enzima, produzindo uma banda colorida.
Com a fosfatase alcalina, o substrato de escolha uma mistura de fosfato de 5-bromo-4-cloro-indolil (BCIP) e nitroblue
tetrazlio (NBT). O BCIP defosforilado pela enzima e oxidado enquanto o NBT se reduz, dando origem a um produto
de cor roxa. Esse substrato o mais eficiente devido sua estabilidade e resistncia ao desbotamento quando exposto luz.
Com os conjugados enzimticos podem-se empregar sistemas de amplificao, como a avidina/estreptavidina-biotina.
Alm dos substratos que do produtos coloridos, podem-se
utilizar outros sistemas de deteco, com substratos fluorescentes ou luminescentes, que permitem a quantificao das
bandas. Utilizando-se sondas marcadas com radioistopos, as
bandas so detectadas por autorradiografia com grande sensibilidade.
O western blotting pode ser empregado na pesquisa de
antgenos ou de anticorpos, sendo um importante auxiliar no
diagnstico de doenas infecciosas. Assim, pode-se determinar se h antgeno ou anticorpo em uma amostra e qual a sua
especificidade; se o preparado puro ou no; quais protenas
esto sendo reconhecidas por um anticorpo; podem-se distinguir diferentes perfis de anticorpos, de acordo com a fase da
doena ou infeco, ou de acordo com a presena ou no da
infeco, e diferenciar entre cepas patognicas e no patog
nicas.
Uma variao tcnica o western ligante blotting, que permite a anlise de qualquer interao especfica entre uma
protena e seu ligante. Esse mtodo tem sido aplicado a vrios
ligantes especficos, como DNA ou RNA, heparina, toxinas,
hormnios, fator de crescimento, outras protenas, clcio e
outras. Tambm tem sido aplicado a uma srie de receptores
de membrana.

Diagnstico Laboratorial

36

Deteco de imunoprecipitados
Anticorpos marcados por enzimas podem ser utilizados
para amplificar a visualizao de imunoprecipitados, substituindo-se a colorao para protenas pelo conjugado enzimtico. Em relao colorao de protenas, esta tcnica aumenta
em vrias vezes a sensibilidade de deteco de um imunoprecipitado. Pode ser aplicada a qualquer tcnica de precipitao
em gis ou membranas, como imunodifuso, imunoeletroforese, eletroimunodifuso e imunofixao.

..,. Ensaios quimioluminescentes


A quimioluminescncia o fenmeno em que se obtm
energia luminosa a partir de uma reao qumica. Nas reaes de quimioluminescncia, a energia qumica gerada como
resultado da dissociao de ligaes fracas produz compostos
intermedirios em um estado eletronicamente excitado que,
quando retornam ao estado de energia inicial, emitem luz.
importante fazer distino com a fluorescncia, em que a
fonte de energia que promove a excitao das molculas uma
radiao incidente, e com a bioluminescncia, em que a energia provm de uma reao biolgica, sendo a emisso de luz
facilitada por uma enzima (luciferase) ou uma fotoprotena.
A quimioluminescncia pode ser utilizada como sistema
de monitoramento e amplificao em uma grande variedade
de testes, estando o enzimaimunoensaio e o immunoblotting
entre os de maior aplicao clnica. As principais vantagens
dessa metodologia so:
A elevada sensibilidade de deteco, que atinge a ordem de
atomol at zeptomol (10- 18 at 10-21 M)
A linearidade da curva dose-resposta, j que a emisso de
luz geralmente proporcional concentrao a partir do
menor nvel detectvel at o ponto de excesso relativo da
substncia em anlise
A rapidez, pois o sinal gerado em poucos segundos e em
alguns casos permanece estvel por vrias horas
O custo, devido ao emprego de reagentes em pequenas
quantidades
A utilizao de reagentes no perigosos e de procedimentos
simples
A possibilidade de aumento da sensibilidade com o emprego
de compostos amplificadores do sinal luminoso e reaes
em cascata com mais de uma enzima e de um substrato
A possibilidade de aplicao em sistemas automatizados.

Enzimaimunoensaio quimioluminescente
O princpio bsico do imunoensaio quimioluminescente
consiste na deteco da reao antgeno-anticorpo utilizando
uma enzima e uma molcula sintetizada ou uma mistura de
molculas que atuar como substrato para a enzima e como
emissor de luz. H muitas variaes da tcnica, e a utilizao
de cada uma depende da enzima e da substncia quimioluminescente utilizadas, ou do emprego ou no de compostos
amplificadores. Os ensaios podem ser homogneos ou heterogeneos.
Vrias enzimas tm sido empregadas, como peroxidase,
fosfatase alcalina, 13-D-galactosidase, glicose-6-fosfato desidrogenase, xantina oxidase, aril sulfatase e 13-D-glicosidase. A
peroxidase a enzima mais utilizada e a que dispe de maior
nmero de substratos quimioluminescentes: luminol (5-amiA

no-2,3-di-hidro-1,4-ftalazinediona), isoluminol, polifenis


(pirogalol, purpurogalin, cido glico e umbiliferone) e steres de acridina, dentre outros. O substrato mais utilizado em
imunoensaios o luminol, que oxidado e forma um produto
excitado que emite luz durante o seu decaimento ao estado
fundamental. A emisso de luz ocorre apenas durante a reao
enzima-substrato e, portanto, quando o substrato se esgota, o
sinal cessa. As placas devem ser brancas, opacas, com a superfcie altamente reflexiva. O fundo pode ser transparente ou
opaco.
O princpio da quimioluminescncia vem sendo utilizado
em tcnicas semi e no automatizadas, alm de ser bastante
aplicado em sistemas automatizados, que sero abordados na
seo "Tcnicas empregadas na automao'.
Ensaios que utilizam a quimioluminescncia tm recebido
diferentes denominaes que variam no s de acordo com a
metodologia, mas com o laboratrio onde foram desenvolvidos. No teste CELIA, por exemplo, complexos covalentes de
um composto luminescente (derivado do luminol) tm sido
utilizados como antgeno marcado de modo semelhante que
um marcador radioativo no radioimunoensaio. O complexo
ligado ao anticorpo emite luz quando tratado com perxido de
hidrognio e acetato de cobre em pH alcalino.
O teste ELISA quimioluminescente pode ser empregado
na pesquisa de anticorpos especficos, por exemplo, da classe
IgG, utilizando-se anti-IgG conjugado peroxidase, cuja ligao ao complexo antgeno-anticorpo detectada por meio
de um substrato luminescente, como o p-iodofenol-luminolperxido. Pela ao da peroxidase, o perxido de hidrognio
promove a oxidao do luminol, formando um radical luminol. Esse radical forma um endoperxido que, por decomposio, d origem ao dinion 3-aminoftalato, eletronicamente
excitado. Este dinion, quando retorna ao estado basal, emite
luz que detectada por fotodectores, como filme fotogrfico (luminmetro de cmera) ou tubos fotomultiplicadores
(luminmetros convencionais ou leitores de placa para luminescncia). Os derivados do fenol (p-iodofenol e p-fenilfenol)
e derivados do 6-hidroxibenzotiazol amplificam a emisso de
luz atuando como mediadores da transferncia de eltrons
entre a peroxidase e o luminol. A emisso de luz diminui lentamente e sua intensidade pode ser 1.000 vezes maior do que
sem a amplificao. Esse ensaio apresenta elevada sensibilidade, podendo ser utilizado para detectar antgenos, haptenos
e anticorpos especficos.
H vrios ensaios que utilizam a enzima fosfatase alcalina
e o substrato adamantil 1,2-dioxetano aril fosfato. Pela ao
da enzima, o substrato defosforilado e fornece um fenxido intermedirio que se decompe em adamantanona e aril
ster (emissor). A luz emitida a 477 nm persiste por mais de
uma hora, podendo ser amplificada por vrios compostos,
incluindo polmeros, que fornecem um ambiente hidrofbico,
e por fluorescena na presena de detergentes, pela transferncia de energia.
Arakawa et al., em 1998, desenvolveram um enzimaimunoensaio quimioluminescente da 13-D-galactosidase (betagal)
com base na quimioluminescncia do indol. Como substrato
da betagal e emissor de luz foi empregado o 5-bromo-4-cloro3-indolil-13-D-galactopiranosdeo (X-gal). O X-gal hidrolisado pela betagal e libera indoxil livre que se oxida em corante
ndigo e, simultaneamente, produz perxido de hidrognio
(H20 2 ), que reage com o X-gal residual na presena de peroxidase, emitindo luz. H uma srie de mtodos que utilizam
a enzima betagal como marcador, incluindo o ensaio fluoromtrico com 4-metilumbeliferil 13-D-galactosdeo, o ensaio

Captulo 2

37

Testes Sorolgicos

colorimtrico com o-fenil-13-D-galactosdeo, o ensaio bioluminescente com luciferase e o ensaio quimioluminescente


com dioxetano, luminol e indol.
Os ensaios quimioluminescentes tm sido empregados na
pesquisa de antgenos, anticorpos e haptenos em uma grande
variedade de patologias, como na deteco de vrus ou antgenos virais (citomegalovrus, rotavrus, herpes simples, hepatite B, hepatite C), bacterianos (leptospiras, Clostridium botulinum); de Chlamydia trachomatis; na pesquisa de anticorpos
em infeces virais (hepatite B, hepatite C, citomegalovrus,
herpes simples, HIV-1, HTLV-1 e li, parvovrus B, rubola),
parasitrias (T. cruzi, Schistosoma mansoni, Toxoplasma gondii), fngicas (P. brasiliensis), bacterianas (Campylobacter); e
na pesquisa de IgE total e especfica para uma grande variedade de alergnios. De modo geral, a quimioluminescncia
considerada mais sensvel do que a deteco colorimtrica.

Enzimaimunoensaio quimioluminescente
com nanopartcu/as
A utilizao de nanopartculas, como o ouro coloidal,
devido s suas propriedades, oferece excelentes perspectivas
para a deteco nos ensaios quimioluminescentes.
Em comparao com outros marcadores, as nanopartculas so mais estveis, mais baratas e de mais fcil purificao.
As nanopartculas de ouro coloidal podem ser facilmente
preparadas em uma gama de tamanhos, entre 2 e 100 nm; a
atividade bioqumica das biomolculas marcadas se mantm
aps o acoplamento ao ouro coloidal. A reao entre o Au3 + e o
luminol um tipo clssico de ensaio quimioluminescente, em
que 10-9 M ons de Au3+ podem ser detectados.
Como as nanopartculas contm milhares de tomos de Au
(uma nanopartcula esfrica de ouro de 20 nm contm 2,3 x
105 tomos de Au), a dissoluo oxidativa do metal em solues
cidas permite detectar concentraes da ordem de pico molar.
Fan et al. (2005, 2006), empregando luminol como agente emissor e soluo oxidante composta por HCl 0,01 M, NaCl 0,5 Me
Br2 0,5 mM, detectaram 3,1x10- 12 M de IgG humana.
Duan et al. (2008) desenvolveram um imunoensaio quimioluminescente em microplaca para IgG humana com um
limite de deteco de 80 pM. Nesse ensaio, AgN03 reduzido
a tomos de Ag pela ao cataltica das nanopartculas de ouro
esfricas de 8 a 68 nm de dimetro. Por sua vez, o luminol
oxidado a radical luminol que, reagindo com o oxignio dissolvido, emite luz forte e rpida a 425 nm.

Western blotting quimioluminescente


A quimioluminescncia tem sido muito aplicada como
sistema de deteco da reao antgeno-anticorpo no western blotting, consistindo em uma tcnica rpida e sensvel de
amplificao do sinal. Neste caso, em vez de utilizar um substrato colorimtrico da enzima, emprega-se um substrato quimioluminescente, sem a necessidade de alterar qualquer outra
etapa dos protocolos.
As tcnicas que utilizam a peroxidase e uma mistura de
luminol, perxido de hidrognio e um amplificador, como o
p-iodofenol, e as que empregam a fosfatase alcalina e adamantil 1,2-dioxetano fenil fosfato como substrato so muito sensveis e promovem a emisso de luz por mais de 30 min, sendo
ideais para os testes que utilizam membranas, como western
blotting e immunodot, em que a emisso de luz detectada
com um filme fotogrfico ou de raios X.

H vrios substratos disponveis comercialmente, base de


luminol/H2 0 2 , com diferentes amplificadores para a peroxidase.
Nos sistemas que utilizam a peroxidase, o tempo de ao do
substrato varia, geralmente, entre 1 e 5 min e o tempo de exposio ao filme de raios X, entre 1O e 60 segundos. Em seguida,
os filmes so processados e as bandas podem ser escaneadas
para quantificao em densitmetro. O sinal detectado proporcional quantidade de antgeno colocado no gel, porm o
coeficiente de correlao difere para cada sistema antgenoanticorpo.
Para aumentar a sensibilidade de deteco, o tempo de ao
do substrato e/ou o tempo de exposio aos raios X podem ser
aumentados, pois os substratos quimioluminescentes podem
emitir luz estvel por at 24 h, fornecendo uma boa definio sem aumentar as reaes de fundo. Por outro lado, o sinal
gerado pelos substratos colorimtricos geralmente atinge o
mximo aps 30 min at poucas horas aps o incio da revelao, e incubaes mais demoradas tendem a apagar sinais
mais fracos devido ao aumento concomitante da colorao
inespecfica. Desse modo, os substratos quimioluminescentes
apresentam uma grande vantagem sobre os colorimtricos em
sistemas com baixos nveis de protenas e quando a quantidade de amostra muito pequena.

lmmunodot quimioluminescente
Utilizando a metodologia do dot-blot ELISA, foi descrita
uma tcnica denominada MABA (multiple antigen blot assay)
para a pesquisa simultnea de anticorpos especficos para espcies diferentes de parasitos, em que os antgenos so distribudos e imobilizados em tiras de nitrocelulose e expostos ao
soro imune. A reao detectada com anticorpos secundrios
conjugados peroxidase e revelada por um substrato quimioluminescente, e os resultados registrados em filme. Este sistema pode ser utilizado para detectar anticorpos e antgenos
circulantes.

..,. Microscopia imunoeletrnica


A microscopia imunoeletrnica uma metodologia muito
importante para a identificao de antgenos e de anticorpos
em nvel ultraestrutural, empregando globulinas conjugadas a
marcadores eletrondensos.
Como nas demais tcnicas utilizadas para a pesquisa de
antgenos, sejam elas imunocitoqumicas ou no, na microscopia imunoeletrnica podem ser utilizados anticorpos policlonais ou monoclonais, sendo obtidos resultados diferentes. Os
antissoros policlonais so mais sensveis, porm menos especficos do que os anticorpos monoclonais, pois o antissoro policlonal contm anticorpos contra vrios eptopos do antgeno,
enquanto o monoclonal monoespecfico. A inespecificidade
ou reao de fundo conferida pelos anticorpos do antissoro policlonal que reagem com outros antgenos. Antissoros
potentes podem ser utilizados em altas diluies, diminuindo
a reao de fundo. O emprego de monoclonal dirigido contra um determinado eptopo produz uma reao praticamente
sem colorao de fundo, porm com menor sensibilidade.
Nas tcnicas que amplificam o sinal, como imunofluorescncia, imunoperoxidase ou avidina/estreptavidina-biotina, esse
efeito da menor sensibilidade no to importante quanto na
microscopia imunoeletrnica. O emprego de misturas de anti-

38

Diagnstico Laboratorial

corpos monoclonais dirigidos contra diferentes eptopos do


antgeno pode aumentar bastante a sensibilidade do sistema.
Quando se empregam anticorpos monoclonais, necessria
uma ponte entre o monoclonal e o sistema de deteco, que
pode ser efetuada por antissoro de coelho anticamundongo.
Do mesmo modo que em outras tcnicas imuno-histoqumicas, necessrio manter um controle de qualidade quanto
especificidade das reaes de imunocolorao. Podem-se
realizar controles externos, internos e negativos no imunes.
Exemplo de controle externo a colorao de outro tecido
que sabidamente contenha o antgeno em estudo (controle
externo positivo), ou que esteja livre do antgeno (controle
externo negativo). Exemplos de controles internos consistem
na identificao no tecido em estudo de stios sem o antgeno
(controle interno negativo) e de outros stios com o antgeno
(controle interno positivo). O controle negativo no imune
consiste na imunocolorao com anticorpo marcado no
especfico ou na colorao com todos os reagentes, exceto o
anticorpo especfico marcado.
H dois tipos bsicos de microscpios eletrnicos. O
microscpio eletrnico de transmisso projeta eltrons atravs de uma camada fina da amostra, produzindo uma imagem em duas dimenses na tela. O microscpio eletrnico de
varredura produz uma imagem em trs dimenses, por meio
de detectores de eltrons que so gerados quando os feixes de
eltrons incidentes colidem com os tomos da amostra. H
microscpios eletrnicos de varredura que apresentam sensores para vrios tipos de radiaes secundrias geradas.
Eltrons secundrios, eltrons backscattered, raios X e catodoluminescncia so alguns dos tipos de radiao gerados
quando os feixes primrios de eltrons colidem com a amostra
e interagem com os tomos dela. Os eltrons secundrios so
liberados pela coliso dos feixes de eltrons incidentes com os
eltrons dos tomos da superfcie da amostra. O nmero de
eltrons detectado depende da topografia da amostra, obtendo-se imagens da superfcie com resoluo muito alta, de aproximadamente 1O nm. Os eltrons backscattered so gerados
pelas colises com os ncleos dos tomos da amostra. Neste
caso, o nmero de eltrons gerado praticamente no depende
da topografia da amostra, mas sim do seu nmero atmico,
obtendo-se imagens das estruturas abaixo da superfcie, com
resoluo entre 50 e 200 nm.

Ferritina

PAP

Ouro coloidal

Figura 2.17 Microscopia imunoeletrnica. Esquema das tcnicas de


imunoferritina, peroxidase-antiperoxidase (PAP) e do ouro coloidal.
DAB = diaminobenzidina; Au = ouro coloidal; P = peroxidase; Fe = ferritina.

A imunocolorao para a microscopia eletrnica deve


resultar na localizao das molculas eletrondensas nos stios
onde se encontram o anticorpo marcado e o antgeno. Para
essa finalidade, os marcadores podem ser classificados em trs
categorias principais:
Molculas orgnicas com eltron-opacidade estrutural: ferritina, hemocianina, vrus de plantas, bacterifagos, esferas de
ltex, esferas de slica coloidal, esferas do copolmero de metacrilato, isotiocianato de fl.uorescena, esferas de dextrana com
ferro, esferas do copolmero de metacrilato com ferro coloidal
Enzimas cujo produto de reao pode ser detectado aps a
adio de um substrato: peroxidase, fosfatase alcalina
Metais pesados que possam ser visualizados diretamente:
ouro coloidal. Na Figura 2.17 esto esquematizados os
principais mtodos.

Mtodo da imunoferritina
Em 1959, Singer utilizou um anticorpo marcado com a ferritina para a localizao de antgenos em nvel ultraestrutural. A ferritina uma protena que contm ferro complexado,
sendo altamente eletrondensa. Sua molcula tem entre 10 e
12 nm de dimetro e peso molecular aproximado de 450.000.
Anticorpos podem ser ligados ferritina por meio de ligantes
divalentes, e esses conjugados podem ser utilizados em mtodos diretos ou indiretos para localizar histoquimicamente
antgenos ou anticorpos por microscopia eletrnica. A conjugao da ferritina ao anticorpo faz com que a atividade deste
diminua, sendo necessrio utilizar anticorpos de alta atividade.
O emprego de anticorpos hbridos, que contm duas especificidades, uma para a ferritina e outra para o antgeno, facilita
o mtodo, diminuindo a colorao no especfica. A ferritina
pode ser utilizada em microscopia eletrnica de transmisso
ou varredura. Este mtodo est sendo substitudo por outros.

Mtodo enzimtico
Em 1966, Graham e Karnovsky desenvolveram mtodos
citoqumicos para localizar a atividade da enzima peroxidase. A partir da, Nakane e Pierce, em 1967, e outros realizaram a conjugao de anticorpos enzima para emprego na
microscopia eletrnica. A peroxidase (peso molecular 40.000)
a enzima utilizada quase que exclusivamente, pois os produtos de oxidao do cromgeno diaminobenzidina formam
um precipitado insolvel que, aps quelao com tetrxido
de smio, torna-se eletrondenso. Em 1970, Sternberger et al.
desenvolveram a tcnica da peroxidase-antiperoxidase (PAP).
O complexo PAP formado por trs molculas de enzima
ligadas por duas molculas de anticorpos antiperoxidase. Este
mtodo tem sensibilidade e resoluo superiores s dos outros
mtodos enzimticos. Os anticorpos marcados com enzimas
tm maior sensibilidade de deteco devido amplificao
do sinal promovida pela enzima, e penetram nos tecidos mais
facilmente, devido ao menor tamanho da enzima. Este mtodo
apresenta vrias desvantagens, como a presena de partculas
nos cromgenos e a possibilidade de formao de precipitados
muito densos que podem obscurecer a preparao.
O mtodo enzimtico pode ser utilizado na visualizao
em microscopia de transmisso ou varredura com sensor para
eltrons backscattered. Como no caso da ferritina, este mtodo
est sendo substitudo por outros.

Captulo 2

Testes Sorolgicos

39
de deteco. O ouro coloidal tambm pode ser ligado diretamente ao anticorpo de deteco, permitindo um mtodo em
uma etapa, porm necessrio utilizar maior quantidade de
anticorpo monoclonal para estabilizar as partculas de ouro.
O ouro coloidal pode ser aplicado tambm para marcar componentes intracelulares. Por ser um grande emissor de eltrons
secundrios, as partculas de ouro coloidal podem ser visualizadas
na microscopia de varredura. As constantes de ligao dos marcadores com ouro coloidal superfcie celular so elevadas, facilitando o processamento para a microscopia eletrnica. O fato de
ser particulado garante maior facilidade na identificao e quantificao da intensidade de marcao das estruturas.
A facilidade no preparo ou aquisio dos marcadores com
ouro coloidal, bem como sua estabilidade, quando armazenados em condies adequadas, so fatores que tm contribudo
para seu grande emprego nos estudos de imunocitoqumica.

Mtodo do ouro coloidal


Anticorpos podem ser conjugados ao ouro coloidal, sendo
empregados principalmente na identificao de antgenos de superficie. A tcnica do ouro coloidal para a localizao de antgenos na
superfcie de clulas foi descrita por Faulk e Taylor, em 1971. Os
autores empregaram anticorpos especficos adsorvidos a partculas
de ouro coloidal para visualizar antgenos de Salmonella utilizando
microscpio de transmisso. Em 1975, Horisberger et al. empregaram o ouro coloidal na microscopia eletrnica de varredura.
um dos mtodos mais utilizados, pois apresenta vrias vantagens. As partculas de ouro podem ser preparadas de vrios
tamanhos (2 a 100 nm), com grande uniformidade; os mtodos
de preparo so simples (disperso ou condensao) e resultam
em suspenses estveis. As partculas de ouro coloidal devem
ser estabilizadas por solues de macromolculas proteicas
(lectinas, glicoprotenas, protena A, avidina, imunoglobulinas,
F(ab')2, enzimas, toxinas, soroalbumina bovina) que, alm de
proteg-las da agregao promovida por eletrlitos, podem ser
utilizadas como marcadores. A ligao entre as partculas de
ouro coloidal que formam uma suspenso hidrofbica carregada negativamente e as macromolculas ocorre por adsoro
eletrosttica no covalente (foras de atrao de van der WaalsLondon), em condies adequadas de pH e concentrao. A
interao estvel e parece no alterar a atividade biolgica
das macromolculas adsorvidas. A protena A uma das mais
empregadas, ligando-se Fc de IgG. Como a protena A no
se liga bem a anticorpos de camundongo, e como os monoclonais, em sua maioria, so preparados nesse animal, deve-se
empregar um anticorpo de coelho anticamundongo para fazer
uma ponte. Uma alternativa ligar o ouro ao antissoro de coelho anticamundongo que, no entanto, diminui a sensibilidade

Cassete

A pesquisa do hormnio gonadotrofina corinica humana


na deteco da gravidez foi a primeira aplicao diagnstica
do teste imunocromatogrfico. A partir da, a necessidade de
testes rpidos para o diagnstico laboratorial e em locais com
poucos recursos, como em situaes de campo, e no ponto de
atendimento (point-of-care) tem elevado o interesse no desenvolvimento de testes imunocromatogrficos de fluxo lateral
para a deteco de antgenos e anticorpos em vrias infeces.
Os testes rpidos podem ser encontrados em quatro formatos
diferentes: cassete, dipstick, carto ou hbrido, que combina
diferentes elementos (exemplos na Figura 2.18).

S ST

1 11

A1

..,. Ensaios imunocromatogrficos

A2.

Dipstick

Carto

r1 7@
T2

C1

C2

c
D
Hbrido

T1
T2

"

"
J_

'

Pf PC

t t
S ST

Figura 2.18 Exemplos de diferentes formatos de testes rpidos ou imunocromatogrficos. A. Cassette. A fita de nitrocel ulose encaixada em um
cassete plstico. Linha controle (C), linha teste (T) e cavidades para amostra de sangue (S) e para soluo tampo (ST) (A 1: exemplo de cassete
com cavidades separadas para amostra de sangue e soluo tampo; A2: exemplo de cassete com cavidade combinada para amostra de sangue
e soluo tampo); B. Dipstick. A fita de nitrocelulose colocada nas cavidades contendo sangue e tampo; C. Carto. A fita de nitrocelulose
montada em um carto. Amostra de sangue e soluo tampo so colocadas em um bloco absorvedor e o carto fechado para leitura (C1:
carto aberto; C2: carto fechado); D. Hbrido. Com elementos combinados de cassete e dipstick, a fita mergulhada nas cavidades e , ento,
colocada no cassete para leitura. Adaptado de WHO, 2011 a.

Diagnstico Laboratorial

40

(antgeno ou anticorpo) e controle do teste. O restante da membrana de nitrocelulose bloqueado com protena inerte, de modo
semelhante ao que ocorre no immunodot ou western blotting.
O reagente de deteco pode ser marcado com corante
coloidal, enzimas ou ouro coloidal. Para a deteco de antgeno
emprega-se um anticorpo de captura, ligado membrana, e um
anticorpo marcado especfico para o antgeno. Para a deteco de anticorpo utiliza-se um antgeno apropriado, ligado
membrana, e um anticorpo anti-imunoglobulina marcado. Na
Figura 2.19 est esquematizado o mecanismo geral do teste
imunocromatogrfico para pesquisa de antgeno.

Esses mtodos podem ser empregados em soro diludo, para


a pesquisa de anticorpos, ou em soro, sangue, saliva, urina ou
fezes, para a deteco de antgenos. Fornecem um teste qualitativo, de fcil execuo, simples, rpido (10 a 15 min) e barato
para detectar antgenos e anticorpos. Seus resultados so de
fcil interpretao e incluem controles positivos e negativos,
no havendo necessidade de aparelhos ou instrumentos para
realizar a leitura, dispensando tambm eletricidade e treinamento prolongado.
Em geral, utilizam uma matriz de membrana de nitrocelulose
que contm um nmero apropriado de reas para cada reagente

Linha controle
(Ac ligado no visvel)
Linha teste
(Ac ligado no visvel)

Agente de lise
eAc marcado

Ac ligado

.A..__'-


Membrana de nitrocelulose

Ac livre
marcado

Tampo/
Soluo de corrida

'
B

Sangue parasitado

1
/

Ag capturado
pelo Ac marcado

__
/

Sangue e anticorpo marcado


migram ao longo da tira
Complexo
Ag capturadoAc marcado

Ac marcado
capturado

1
ComplexoAc
marcado-Ag
capturado pelo
Ac da banda teste

Ac marcado
capturado
peloAc da
banda controle

Figura 2.19 Componentes e mecanismo gera 1dos testes imunocromatogrficos para pesquisa de antgeno. A. Oanticorpo ma reado (Ac marcado),
especfico para o antgeno-alvo, est na parte inferior da fita de nitrocelulose ou em uma cavidade do sistema. O anticorpo de captura, especfico
para o antgeno-alvo, est ligado membrana na linha "teste'~ O anticorpo (especfico para o Ac marcado) ou antgeno est ligado membrana na
linha "control e'~ Antes da reao, essas linhas no aparecem. B. Amostra (sangue, soro, saliva, urina) e tampo so colocados no local indicado. Pela
adio da amostra edo tampo, o Ac marcado solubilizado e migra no fluxo da amostra. Se o antgeno-alvo estiver presente na amostra, vai se ligar
ao Ac marcado, formando um complexo antgeno-Ac marcado. C. Ao passar pela regio da membrana em que o anticorpo de captura est imobilizado, o complexo antgeno-Ac marcado ser retido na linha "teste" e haver desenvolvimento de cor proporcionalmente quantidade de antgeno
presente na amostra. O anticorpo marcado livre ser retido na linha "controle': havendo desenvolvimento de cor. Adaptado de WHO, 2011 b.

Captulo 2

Testes Sorolgicos

Os ensaios imunocromatogrficos tm sido aplicados em


vrios sistemas, como sfilis, malria, tuberculose, leishmaniose visceral, tripanossomase africana, HIV, influenza, dengue e outras doenas.

~ Tcnicas empregadas na automao


Nas ltimas dcadas, houve grande desenvolvimento na
automao dos processos do laboratrio clnico, principalmente na bioqumica clnica e na hematologia, sendo a imunologia clnica uma das ltimas reas a ser automatizada.
A automao de laboratrios clnicos j percorreu um
longo caminho desde os primeiros sistemas desenvolvidos.
Atualmente esto disponveis inmeras opes, grandes e
pequenas, a partir de uma variedade de fornecedores para
atender s necessidades, que vo desde a automao de tarefas
simples para vrias funes at a automao total com aparelhos interfaceados. A automao dos imunoensaios muito
til em bancos de sangue, laboratrios grandes, mdios e at
pequenos, pois fornece resultados rpidos, minimiza as variaes inerentes aos processos manuais, aumenta a segurana,
diminui os custos e melhora a qualidade e o desempenho do
laboratrio. O desenvolvimento tecnolgico que levou automao de vrias tcnicas no laboratrio clnico tem como
desafio a busca de maior eficincia.

Nefelometria
A nefelometria um mtodo direto de medida do espalhamento, em um determinado ngulo, de uma luz incidente, por partculas em suspenso, e uma tcnica sensvel
para quantificar as reaes de precipitao entre antgenos e
anticorpos. A quantidade de complexo formado pela reao
antgeno-anticorpo quando, a uma concentrao constante e
em excesso de anticorpo, se vai adicionando antgeno depende
diretamente da concentrao do antgeno e caracterizada
por uma curva parablica que foi descrita por Heidelberger e
Kendall, em 1935. A interao entre antgeno e anticorpo, em
soluo, depende de muitos fatores, como concentrao relativa, avidez e afinidade do antissoro, tampo, pH, fora inica
da soluo e presena de polmeros no inicos e hidroflicos,
como o polietilenoglicol, que aumenta a sensibilidade, a faixa
de deteco e a velocidade do ensaio.
A formao de imunocomplexos em soluo provoca espalhamento, absoro, reflexo e altera a transmisso de uma luz
incidente que atravesse a soluo. Esses fenmenos so proporcionais ao tamanho, forma e concentrao das partculas. Com o aumento da precipitao entre antgeno e anticorpo, aumenta o espalhamento e a reflexo da luz e diminui a
transmitncia. Em solues diludas, a formao de complexos
entre antgeno e anticorpo pode ser medida pelo espalhamento
de uma luz incidente, que ocorre como resultado das colises
elsticas das partculas de todos os tamanhos com os ftons de
luz. A quantidade e a natureza do espalhamento dependem do
tamanho e forma das partculas, da concentrao, do comprimento de onda da luz e do ndice de refrao do meio.
Para a pesquisa de antgeno os ensaios devem ser realizados na
regio de excesso de anticorpo, onde ocorre relao linear entre
a concentrao do antgeno e a densidade ptica e, para tanto, as
amostras devem ser diludas a vrias concentraes diferentes.
O antissoro empregado deve ser potente, altamente purificado e
opticamente lmpido, com especificaes uniformes.

41
H duas variaes principais no ensaio de nefelometria, de
acordo com o mtodo de determinao utilizado:

Nefelometria de ponto final, em que a leitura feita na regio


de plat da precipitao. Necessita de correes, a fim de
minimizar o efeito de reaes de fundo, e de um tempo
maior de incubao (10 mina 1 h), porm permite a realizao de um nmero maior de testes por hora. O tempo de
incubao e a altura do plat em cada ensaio dependem da
avidez e afinidade do antissoro. Quando o espalhamento
da luz medido antes ou imediatamente aps a adio do
antissoro (branco) e aps um intervalo de tempo constante,
tem-se o mtodo de quase equilbrio. A diferena entre os
valores correlacionada com uma curva de concentrao
de referncia

Nefelometria cintica ou "nefelometria de taxa de aumento",


em que h monitoramento contnuo da reao e o nefelmetro subtrai eletronicamente a reao de fundo. No h
necessidade de esperar at que o plat seja alcanado, diminuindo o tempo de incubao, porm permite o processamento de um nmero menor de amostras. Este mtodo
mede o pico da taxa de aumento do espalhamento, que
ocorre no perodo de 1O segundos a 1 ou 2 min na maioria
dos casos. A relao entre a quantidade de espalhamento e
o tempo, aps o incio da reao, sigmoidal, pois o espalhamento depende do tamanho relativo dos complexos e
da concentrao do antgeno. No incio, os complexos so
pequenos e no espalham a luz. Aps um limiar, o espalhamento aumenta proporcionalmente ao tempo. Conforme os
reagentes se esgotam, a taxa de aumento do espalhamento
diminui e este se aproxima do valor mximo. Na regio de
excesso de anticorpo, o ponto de inflexo da curva da taxa
de aumento fornece a taxa mxima (ou pico) de formao
do complexo e proporcional concentrao do antgeno.
A taxa mxima de aumento para cada reao convertida
em concentrao, empregando-se curvas de referncia prcalculadas. Se comparado com a nefelometria de ponto
final, o mtodo de escolha.
Na determinao de compostos de baixo peso molecular
(com menos de 1 kDa), como hormnios, frmacos e outros
haptenos, utiliza-se a nefelometria de inibio, em que os haptenos a serem dosados competem com haptenos conjugados
a protenas carregadoras pelos stios no anticorpo especfico,
havendo inibio na formao dos precipitados. Pode-se utilizar o mtodo cintico ou de ponto final.
O emprego de micropartculas inertes aumenta a sensibilidade dos ensaios nefelomtricos. Neste caso, as partculas so
utilizadas como suporte para os reagentes, amplificando aprecipitao e o espalhamento da luz. Para essa finalidade, as caractersticas mais importantes de uma partcula so o tamanho e
o ndice de refrao. O tamanho ideal depende do mtodo de
medida. Partculas pequenas so indicadas para ensaios cinticos e partculas grandes, para ensaios de ponto final. O espalhamento da luz aumenta com o ndice de refrao do material
da partcula. Vrios tipos de partculas tm sido empregados
como suporte, entre elas as de ltex. Partculas de ltex (esferas
de poliestireno) com dimetros da ordem de 0,1a0,2 m, contendo grupos qumicos reativos, so recobertas com antgeno
ou anticorpo. Assim, a presena do anticorpo ou antgeno na
amostra promove a aglutinao coloidal do sistema. Pode-se
ligar haptenos ou fragmentos de anticorpos para emprego em
ensaios diretos ou de inibio. As tcnicas de amplificao
com partculas de ltex tm sido as mais utilizadas, tanto na
determinao de frmacos, hormnios e peptdios quanto na

42
de protenas e lipoprotenas, devido sua maior sensibilidade.
A sensibilidade, a reprodutibilidade e os limites de deteco
desse ensaio dependem da tcnica utilizada para detectar o
produto agregado. Alm da nefelometria, a aglutinao de
partculas de ltex pode ser monitorada por outras tcnicas,
como turbidimetria, anisotropia angular (mudana do ngulo
de polarizao da luz, sendo o espalhamento medido em dois
ngulos, acima e abaixo de 90) e espectroscopia de correlao de ftons (ou espalhamento dinmico da luz, com base
no princpio de que, quando um laser atinge uma partcula,
a mudana da frequncia da luz resultante do espalhamento
est correlacionada com a velocidade da partcula, que tanto
menor quanto maior o grau de agregao).
Yang et al., em 2006, utilizaram nanopartculas magnticas
com ncleo de Fe30 4 em vez de partculas de ltex e obtiveram sensibilidade trs vezes maior na deteco de avidina e
protena e reativa.
Os nefelmetros podem utilizar, como fonte de luz, lmpadas de tungstnio, mercrio, xennio, hlio-nenio (laser) etc.
Os raios de luz do laser, ou de outra fonte de luz de alta intensidade, so coletados por lentes focalizadoras e passam atravs
de um tubo que contm a amostra. Outras lentes coletam a luz
emergente, em ngulo de 70, e a focalizam para um detector eletrnico, que amplifica o sinal. Este convertido em um
registro digital, em unidades arbitrrias, que so relacionadas
com a concentrao do antgeno ou do anticorpo na amostra.
Basicamente, os nefelmetros necessitam dos mesmos componentes que um fluormetro, que pode ser utilizado na nefelometria com o mesmo filtro ou comprimento de onda, tanto
para a luz incidente quanto para a resultante do espalhamento.
Outros tipos de analisadores, como os de fluxo contnuo, de
centrifugao, de polarizao da fluorescncia, ou espectrofotmetros de alta potncia podem ser adaptados para ensaios
nefelomtricos.
A nefelometria apresenta vrias vantagens, pois precisa,
rpida, de fcil realizao e totalmente automatizada. Entre
suas limitaes esto o alto custo do antissoro, a reao inespecfica resultante de soros lipmicos ou hemolisados e a
necessidade de mltiplas diluies para antgenos muito concentrados.
Essa tcnica pode ser empregada para quantificar protenas,
como imunoglobulinas, componentes do complemento, fator
reumatoide, fatores de coagulao, protena C reativa, imunocomplexos ou hormnios, frmacos e outros haptenos. Alm
de ter aplicaes clnicas, a nefelometria til para monitorar a qualidade de imunorreagentes, para determinar ttulos
e avidez de antissoros, na avaliao de monoclonais etc. Com
controle de qualidade adequado e reagentes e calibradores de
boa qualidade, fornece resultados altamente confiveis, com
sensibilidade de deteco da ordem de 1 g/mf e de 1 ng/mf
com partculas amplificadoras.

Turbidimetria
A turbidimetria um mtodo de medida da diminuio
da intensidade da luz transmitida, em relao incidente, por
meio de uma suspenso de partculas, devido reflexo,
absoro ou ao espalhamento. As leituras so feitas em unidades de absorbncia, que refletem a relao entre a luz incidente
e a transmitida. Em relao nefelometria, a questo sobre
qual dos dois mtodos oferece melhores resultados tem sido
muito debatida. Entretanto, a qualidade do aparelho parece
ser mais importante do que o mtodo. Espectrofotmetros
que utilizam grade de difrao monocromtica so os ideais,

Diagnstico Laboratorial
podendo tambm ser empregados aparelhos que utilizam filtros dicroicos ou de interferncia. As leituras das absorbncias
devem ser realizadas em comprimentos de onda das faixas prximas do UV, entre 290 e 410 nm, regio em que os complexos
imunes, com dimetros entre 35 e 100 nm, absorvem mais. Os
fotodetectores dos aparelhos devem medir a luz transmitida
em ngulo de 0 com a luz incidente para reduzir o efeito do
espalhamento da luz sobre a medida da transmitncia.
Os reagentes devem ser misturados rpida e completamente
a fim de eliminar concentraes localizadas de antgeno ou de
anticorpo, que podem afetar os resultados. Analisadores por
centrifugao so ideais para essa finalidade, pois os reagentes
so pipetados em cmaras separadas e colocados na clula de
reao por fora centrfuga, sendo misturados por mudanas
na acelerao aps 3 a 5 segundos de contato. Os efeitos da
fora centrfuga podem provocar a sedimentao de grandes
agregados, formados por reagentes concentrados. Muitos analisadores utilizam um sistema de agitao constante em vez da
fora centrfuga.
As medidas de turbidimetria podem ser realizadas de dois
modos: fazendo duas leituras, uma antes de colocar o antissoro e outra aps um perodo de tempo prefixado; e realizando
a medida cintica da mudana da absorbncia aps a adio
do antissoro.
A incluso de polmeros amplificadores, como o polietilenoglicol 8000, no tampo de reao aumenta significativamente a formao dos complexos, reduzindo o espao vibracional e aumentando a interao entre as molculas.
O emprego de partculas amplificadoras aumenta a sensibilidade do ensaio, como ocorre na nefelometria. Entre os
vrios tipos de partculas, as de poliestireno (ltex) tm sido
as mais utilizadas como suporte de protenas ou de haptenos.
Para que haja maior sensibilidade, o tamanho das part culas
deve ser o menor possvel e as leituras devem ser feitas no
menor comprimento de onda possvel. Os testes denominados
PETIA (imunoensaio turbidimtrico com partculas de ltex
amplificadoras) e PETINIA (imunoensaio turbidimtrico de
inibio com partculas de ltex amplificadoras) apresentam
elevada preciso, especificidade e podem ser aplicados a vrios
sistemas. Os testes de inibio so utilizados para frmacos,
hormnios e outros haptenos.
Beumer et al. desenvolveram, em 2009, um imunoensaio
turbidimtrico com nanopartculas para a dosagem do frmaco 5-fluorouracil, com base na mudana da disperso da
luz quando as nanopartculas formam agregados. O tempo
para leitura do resultado de 1Omin, com fluxo de 400 amostras por hora. Na ausncia de 5-fluorouracil formam-se grandes agregados, com aumento da turbidez da soluo. Quando
se introduz a amostra contendo 5-fluorouracil, a aglutinao
parcialmente inibida e a turbidez da soluo diminui. Esse
mtodo apresenta as vantagens de ser rpido, exigir pequeno
volume de amostra e permitir monitoramento eficiente do frmaco na prtica clnica.
Alm da qualidade do espectrofotmetro, muito importante considerar a amostra e os reagentes utilizados. As amostras muito turvas no devem ser ensaiadas por esse mtodo, os
antissoros e demais reagentes devem ser opticamente claros.
A turbidimetria, como a nefelometria, apresenta vrias
vantagens: no necessita de separao entre as fases, as amostras podem ser ensaiadas diretamente sem a necessidade de
pr-tratamento e o teste rpido, preciso, econmico e facilmente automatizado.
A nefelometria uma tcnica mais sensvel do que a turbidimetria, porm mais sensvel s reaes de fundo, no especfi-

Captulo 2

43

Testes Sorolgicos

cas, por isso necessrio que as amostras sejam muito diludas,


o que reduz os limites de deteco aos nveis da turbidimetria.
Assim, os mtodos turbidimtricos tendem, em alguns casos,
a ser mais precisos do que os nefelomtricos. H autores que
consideram a turbidimetria mais reprodutvel e mais simples.
Alm disso, pode utilizar o espectrofotmetro, que um aparelho mais comum maioria dos laboratrios clnicos.
Essa tcnica pode ser empregada para quantificar antgenos, anticorpos, lipoprotenas, como Lp(a), protena C reativa,
albumina, pr-albumina, hemoglobina A, protenas ligantes
de cidos graxos (FABP), teofilina, gentamicina, tobramicina
e digoxina.

Enzimaimunoensaio
Existem sistemas e estaes de trabalho (workstations) que
realizam roboticamente os testes ELISA em microplacas, com
a vantagem de poderem executar grande nmero de amostras.
H outros que utilizam sistemas homogneos, como o Enzymemultiplied immunoassay - EMIT. Neste imunoensaio ocorre
a inibio da atividade da enzima, conjugada a um antgeno
ou hapteno, aps a combinao com o anticorpo, devido ao
impedimento de mudanas conformacionais necessrias para
a atividade da enzima.
O hapteno conjugado a uma enzima, que permanece
ativa. A ligao do anticorpo inativa a enzima. Se houver hapteno na amostra, ele competir com o conjugado pelos stios
do anticorpo. O resultado o aumento da atividade enzimtica, que ser aproximadamente proporcional concentrao
do hapteno. A mediao da atividade da enzima pelo anticorpo pode ser explicada pelo impedimento estrico para a
ligao do substrato aps a reao do anticorpo especfico com
o hapteno.
Quando as enzimas so conjugadas a molculas de protenas, a ligao do anticorpo especfico pode acontecer em um
local do antgeno distante da enzima e a modulao enzimtica no ocorre. Entretanto, se o substrato for macromolecular,
a ligao do anticorpo protena pode levar inibio estrica
da ligao ao substrato.

lmunoensaio quimioluminescente
Quimioluminescncia (ou bioluminescncia) o sinal
ptico intrinsecamente mais sensvel. O princpio bsico do
imunoensaio quimioluminescente consiste na deteco da
reao antgeno-anticorpo utilizando-se uma enzima e uma
molcula sintetizada ou mistura de molculas que atuaro
como substrato para a enzima e como emissor de luz. H
muitas variaes da tcnica, e elas devem ser empregadas de
acordo com a enzima e a substncia quimioluminescente utilizadas, ou dependendo da utilizao ou no de compostos
amplificadores.
As molculas quimioluminescentes, as enzimas e os compostos amplificadores empregados como marcadores, bem
como o princpio da quimioluminescncia, os mecanismos
simplificados das reaes e as aplicaes da tcnica foram discutidos anteriormente.
A medida da luz emitida pelos compostos quimioluminescentes chamada de luminometria e, por isso, os aparelhos
que realizam essa medida so denominados luminmetros.
Alguns so totalmente automatizados e outros permitem a
utilizao manual. Os reagentes marcados e os amplificadores,
em muitos sistemas, so de propriedade do fabricante.

Vrios sistemas automatizados tm sido desenvolvidos com


o emprego da quimioluminescncia em enzimaimunoensaios.
Podem executar uma grande variedade de ensaios, em sistemas de competio ou de duplo anticorpo, para a pesquisa de
antgenos, anticorpos, haptenos, frmacos, enzimas, hormnios, vitaminas, marcadores tumorais, marcadores de doenas
etc. H sistemas abertos que podem ser utilizados na pesquisa
de qualquer macromolcula, e outros que se destinam, principalmente, triagem de doadores em bancos de sangue.

lmunoensaio fluorescente
O imunoensaio fluorescente ou fluoroimunoensaio um
mtodo que detecta e quantifica antgenos e anticorpos utilizando conjugados fluorescentes cuja emisso de luz, de um
determinado comprimento de onda, medida com preciso
em um fluormetro. utilizado para detectar e quantificar frmacos, hormnios, protenas e peptdios em fluidos biolgicos. O ensaio, rpido, sensvel e adaptvel automao, uma
alternativa ao radioimunoensaio e ao enzimaimunoensaio.
Quando certos tipos de molculas interagem com ftons de
radiao eletromagntica, pode ocorrer a emisso de luz, fenmeno chamado de fotoluminescncia. Fluorescncia, fosforescncia e fluorescncia tardia so tipos de fotoluminescncia. Na
fluorescncia a liberao da energia luminosa imediata, com um
intervalo de 0,1 a vrias centenas de nanossegundos entre a absoro e a emisso. Na fosforescncia h demora na liberao da luz,
e, na fluorescncia tardia, o tempo de liberao intermedirio.
Os compostos fluorescentes ou fluorforos so, em sua
maioria, compostos orgnicos com estrutura em anel. Quando
o composto absorve luz, os eltrons se tornam excitados e oscilam em ressonncia. Aps a absoro da luz de um comprimento de onda menor (maior energia), ao retornar ao estado
basal, a energia emitida sob a forma de luz de um comprimento de onda maior (menor energia), pois uma parte da
energia se perde nas transies moleculares internas do processo. Nesse processo, o tempo entre a absoro e a emisso
pequeno: com o isotiocianato de fluorescena, esse intervalo
dura menos de 10-9 segundos.
O imunoensaio fluorescente pode ser heterogneo ou de
fase slida e homogneo ou de fase fluida.

lmunoensaio fluorescente heterogneo


O teste de imunofluorescncia indireta o precursor do
fluoroimunoensaio de fase slida, e a diferena entre eles consiste no sistema de leitura. A imunofluorescncia baseia-se na
observao visual comparativa, por meio de microscpio de
fluorescncia, enquanto o imunoensaio fluorescente baseia-se
na medida objetiva e quantitativa da intensidade de fluorescncia obtida pelo emprego de um sistema fotomultiplicador.
O sistema heterogneo envolve a separao dos reagentes
marcado e no marcado, eliminando em grande parte a fluorescncia de fundo. Vrios sistemas foram desenvolvidos, como
os utilizados para medir anticorpos anti-DNA, antincleo,
antirrubola, antitoxoplasma e muitos outros antgenos virais.
Empregando-se aparelhos de boa qualidade adequadamente
calibrados, o ensaio de fase slida permite obter medidas de
excelente preciso quando comparado imunofluorescncia,
em que a leitura subjetiva. A maioria dos ensaios disponveis
comercialmente utiliza o sistema de fase slida.
Pode-se empregar o mtodo de competio, o indireto, o de
duplo anticorpo ou o imunomtrico.

44
Mtodo de competio
Na quantificao de imunoglobulinas, por exemplo, haver
competio entre a imunoglobulina da amostra (livre) e a
ligada fase slida (fixada em superfcie hidrofbica polimrica) pelo anticorpo especfico marcado com fluorocromo. A
quantidade de anticorpo fluorescente ligado imunoglobulina
da fase slida medida em um microfluormetro e convertida
em mg/df, a partir da curva padro de inibio.

Mtodo indireto
Por este mtodo podem ser medidos anticorpos contra
vrios antgenos. O antgeno fixado a uma superfcie polimrica e incubado com o soro. Adiciona-se conjugado antiimunoglobulina marcado com fluorocromo e a fluorescncia
quantificada.

Mtodo do duplo anticorpo ou do "sanduche"


O antgeno reage com o anticorpo da fase slida e aps
lavagem, com o anticorpo marcado. Aps lavagem, a fluorescncia quantificada. Esse mtodo no se aplica a haptenos.

Mtodo tluoroimunomtrico
O antgeno reage com o anticorpo marcado em soluo. O
anticorpo marcado residual se liga ao antgeno da fase slida,
em que, aps lavagem, se quantifica a fluorescncia. Pode ser
aplicado a haptenos e protenas complexas.

lmunoensaio fluorescente homogneo


O sistema homogneo no requer a separao entre o reagente marcado e o no marcado. A intensidade de fluorescncia
pode aumentar ou diminuir aps a reao antgeno-anticorpo.
Este mtodo tem sensibilidade de deteco, em condies timas, perto de 10-10 M; necessita de reagentes imunoqumicos
relativamente puros; impurezas nas amostras podem aumentar a interferncia das reaes de fundo, e necessita de aparelhos especiais, a fim de obter maior sensibilidade.
Uma srie de variantes foi desenvolvida:
No ensaio de aumento, o antgeno marcado apresenta
aumento da fluorescncia quando ligado ao anticorpo.
A principal desvantagem deste mtodo a fluorescncia
intrnseca do soro
No ensaio direto de inibio da fluorescncia, a ligao
do hapteno cromofbico pelo anticorpo marcado provoca
diminuio da fluorescncia
No ensaio de inibio indireto, o antgeno marcado
com fluorescena e o anticorpo especfico para o antgeno
inibe estericamente a ligao da fluorescena ao anticorpo
antifluorescena, o qual, por sua vez, quando se liga
fluorescena, inibe a fluorescncia. Pode ser empregado na
determinao de antgenos e de anticorpos. No ensaio para
a pesquisa de anticorpos, o anticorpo especfico protege o
conjugado antgeno-fluorescena de ser inibido pelo anticorpo antifluorescena. O nvel de anticorpo na amostra
proporcional intensidade da fluorescncia. No ensaio
para a pesquisa de antgenos, o antgeno da amostra se liga
ao anticorpo especfico, deixando o complexo antgenofluorescena livre para se ligar ao anticorpo antifluorescena.
O nvel de antgeno na amostra proporcional diminuio da fluorescncia
O mtodo de transferncia de energia emprega dois marcadores e pode ser direto ou indireto. No mtodo de transferncia direto, o antgeno marcado com fluorescena e o
anticorpo, com rodamina. O isotiocianato de fluorescena

Diagnstico Laboratorial
tem pico de emisso a 525 nm e a tetrametilrodamina tem
pico de absoro a 525 nm. A ligao do anticorpo ao antgeno provoca uma inibio na fluorescncia da fluorescena.
Em ensaio para a quantificao de um antgeno, este no
marcado compete pelo anticorpo marcado com a rodamina
e diminui a inibio da fluorescncia da fluorescena
No mtodo de transferncia indireto, o antgeno marcado
indiretamente pela ligao a um anticorpo ou a fragmentos
Fab marcados com fluorescena. Este mtodo aplicvel a
antgenos que apresentam determinantes antignicos multivalentes. Os anticorpos ou fragmentos Fab so separados
em duas pores, que so marcadas, separadamente, por
fluorescena e rodamina. A mistura do antgeno com os
anticorpos marcados em proporo adequada provoca uma
reduo na intensidade da fluorescncia da fluorescena. A
adio da amostra com antgeno no marcado altera o equilbrio do complexo antgeno-anticorpo marcado, sendo o
grau de fluorescncia na soluo diretamente proporcional concentrao do antgeno no marcado. Este mtodo
necessita de anticorpos purificados para evitar reaes de
fundo inespecficas. Pode ser aplicado pesquisa de haptenos e antgenos macromoleculares. A sensibilidade deste
ensaio para IgG humana da ordem de 100 pmol.

lmunoensaio de polarizao da fluorescncia


No ensaio de polarizao da fluorescncia, o antgeno marcado com o fluorocromo compete com o antgeno da amostra por um nmero limitado de stios do anticorpo especfico.
Quanto maior a concentrao do antgeno na amostra, haver
menos anticorpo ligado ao antgeno marcado com o fluorocromo e a polarizao da fluorescncia diminui. A sensibilidade do mtodo depende da afinidade do anticorpo, podendo
chegar a menos de 1 ng/mf, para a pesquisa de gonadotrofina
corinica humana. aplicvel apenas pesquisa de haptenos.
A tecnologia de polarizao da fluorescncia utilizada
para quantificar frmacos e haptenos em ensaio de competio
direto. O frmaco marcado com fluorescena utilizado como
marcador, que absorve e emite luz polarizada proporcionalmente ao seu tamanho. Quando livre em soluo, o marcador se movimenta rapidamente e, absorvendo luz polarizada,
emite luz despolarizada. Quando o marcador se liga ao anticorpo, o complexo se move mais lentamente e emite luz mais
polarizada (ou menos despolarizada). O grau de polarizao
reflete a quantidade de marcador que est ligado e inversamente proporcional quantidade de frmaco na amostra. A
sensibilidade para digoxina de 0,2 ng/mf.
Para a pesquisa de macromolculas (IgM), foi desenvolvido
um imunoensaio em que o marcador constitudo de fragmentos Fab marcados com fluorocromo. O limite de deteco
de IgM pelo mtodo de 0,8 g/mf.

lmunoensaio fluorescente de tempo controlado


O imunoensaio fluorescente de tempo controlado (timeresolved fluorometry) emprega aparelhos e reagentes especiais
a fim de aumentar a sensibilidade do ensaio, cujo limiar de
deteco pode chegar a 10- 15 M.
Os marcadores fluorescentes convencionais, como fluorescena e rodamina, so indicados para a determinao de
antgenos, anticorpos, frmacos e outros haptenos em concentraes de ordem micromolar, porm no tm a atividade
especfica necessria para a determinao em concentraes
da ordem de nano e picomolar.
Os quelatos de lantandeos, em combinao com o fluormetro de tempo controlado, eliminam as reaes de fundo

Captulo 2

Testes Sorolgicos

que interferem quando se utilizam fluorforos convencionais,


como o isotiocianato de fluorescena, o que aumenta a sensibilidade de deteco.
Os fluormetros de tempo controlado permitem medidas
cinticas da reao antgeno-anticorpo, minimizando a interferncia da fluorescncia de fundo e aumentando a sensibilidade e especificidade do ensaio. No fluormetro de tempo
controlado, um pulso rpido de luz excita o fluorforo, que
deve ter meia-vida longa, e a fluorescncia medida depois de
transcorrido um perodo da excitao.
As sondas fluorescentes empregadas nesse ensaio podem
ser utilizadas com o cido pirenobutrico, que tem meia-vida
de 100 ns, ou com os quelatos de eurpio ou de trbio. O
eurpio complexado ao isotiocianatofenil-DTTA utilizado
para marcar anticorpos do mesmo modo que os derivados da
fluorescena e da rodamina. Os quelatos de eurpio apresentam propriedades que os tornam indicados para esse tipo de
ensaio, pois a diferena entre o comprimento de onda de excitao e o de emisso de, aproximadamente, 300 nm e a meiavida da ordem de 1 ms, enquanto o tempo de decaimento da
fluorescncia inespecfica geralmente menor, variando entre
5 e 20 ns.
Nos fluormetros de tempo controlado, o quelato de eurpio excitado por flashes rpidos, com durao de menos de
0,5 s e, durante os 400 s seguintes a cada flash, o fotodetector
fica fechado enquanto a fluorescncia inespecfica emitida.
Nos 400 s seguintes a fluorescncia do quelato de eurpio
medida. Aps 1 ms, um novo ciclo se inicia. Os ciclos so repetidos mil vezes por segundo.
Devido s diferenas no tempo de decaimento dos quelatos de lantandeos, possvel desenvolver ensaios para a pesquisa de mais de um antgeno ou hormnio simultaneamente,
empregando a fluorometria de tempo controlado e diferentes
fluorforos.
Os sistemas comerciais baseiam-se em ensaios de competio e duplo anticorpo. Este mtodo tem sido utilizado na
determinao de hormnios, frmacos, antgenos etc. com
alta sensibilidade.

Enzimaimunoensaio fluorescente
O imunoensaio fluorescente com enzimas ou enzimaimunoensaio fluorescente pode ser homogneo ou heterogneo.

lmunoensaio fluorescente com substrato marcado


O imunoensaio fluorescente com substrato marcado (do
ingls substrate-labelled fluorescent immunoassay - SLFIA)
um sistema homogneo, em que um substrato da enzima
ligado covalentemente a um hapteno de modo que a ligao do anticorpo ao hapteno inibe a ao da enzima sobre o
substrato. Em um ensaio tpico para a pesquisa de haptenos,
um substrato fluorognico da 13-galactosidase, o 13-galactosil umbeliferone, ligado covalentemente ao hapteno, formando um substrato no fluorescente. Se o anticorpo especfico reage com o hapteno, a enzima 13-galactosidase no cliva
o substrato por impedimento estrico. Se a amostra tiver
hapteno, este se ligar ao anticorpo e o substrato ligado ao
hapteno ficar livre e reagir com a enzima para formar um
produto fluorescente. O grau de fluorescncia proporcional
quantidade de hapteno na amostra. A excitao feita a 400
nm e a emisso da fluorescncia medida a 453 nm. Detecta
nveis de 1 g/ mf .
Pode ser utilizado para detectar reagentes de alto e baixo
peso molecular, tais como anticorpos, frmacos e outros haptenos.

45

Enzimaimunoensaio fluorescente heterogneo


O enzimaimunoensaio fluorescente heterogneo (do ingls
enzyme linked fluorescent immunoassay) utilizado na pesquisa de antgenos e anticorpos em uma ampla variedade de
sistemas. O ensaio para a pesquisa de lipoprotena (a) [Lp(a)],
por exemplo, utiliza um anticorpo monoclonal anti-Apo A
incorporado na fase slida e um anticorpo policlonal anti-Apo
B marcado pela fosfatase alcalina. O substrato empregado o
fosfato de 4-metil umbeliferil que, sob a ao da enzima, fornece o composto fluorescente 4-metil umbeliferone. A intensidade da fluorescncia diretamente proporcional concentrao de Lp(a), que expressa em g/f .

Enzimaimunoensaio fluorescente para a pesquisa de lgE


um enzimaimunoensaio fluorescente heterogneo que
mede a concentrao de IgE especfica contra mais de 450
alergnios e permite o diagnstico diferencial da sensibilizao atpica por alergnios inalantes comuns. Para a pesquisa
de anticorpos da classe IgE especficos para um determinado
alergnio esse sistema utiliza uma tcnica em que o alergnio
est ligado covalentemente fase slida. Se na amostra houver IgE especfico, este se liga ao alergnio e a reao detectada pela adio de um anticorpo anti-IgE marcado pela
enzima 13-galactosidase. O substrato empregado o metil
umbeliferil-13-D-galactosdeo, que, sob a ao da enzima,
fornece o composto fluorescente 4-metil umbeliferone. As
concentraes de IgE na amostra so calculadas a partir de
curvas de calibrao.

Citometria de fluxo
A citometria de fluxo uma tcnica que permite realizar
medidas rpidas em partculas ou clulas enquanto elas passam, uma a uma, por um sensor, sendo as medidas realizadas
em uma partcula de cada vez e no como valores mdios da
populao total. O citmetro de fluxo analisa eletronicamente
os sinais gerados pelas clulas em suspenso quando elas so
interceptadas por um feixe de luz. Conforme as clulas passam
atravs do feixe de luz, espalham a luz em todas as direes,
em um padro que depende de seu tamanho, forma e estrutura, e as molculas marcadas com fluorocromos so excitadas
e fluorescem.
A interao entre as clulas e uma luz intensa permite realizar vrias medidas de significado biolgico, como o espalhamento frontal e lateral da luz e as emisses de fluorescncia.
A luz decorrente do espalhamento frontal (forward scatter cell
- FSC) coletada por lentes posicionadas em ngulos relativamente pequenos ( 1 a 20) em relao ao feixe incidente.
Geralmente, clulas maiores provocam maior espalhamento
de luz do que as menores, por isso essa medida se correlaciona com o tamanho da clula. Lentes colocadas em ngulo
de 90, em relao ao feixe incidente e ao fluxo celular, coletam
a luz resultante do espalhamento lateral e da fluorescncia. A
medida do espalhamento lateral (side scatter cell - SSC) utilizada para discriminar a granularidade da clula. As emisses
fluorescentes decorrem das molculas marcadas com fluorocromos, que se ligaram s clulas especificamente. A luz
coletada dividida por refletores dicroicos para tubos fotomultiplicadores separados; estes convertem os ftons emitidos
ou resultantes do espalhamento em pulsos eletrnicos, que so
amplificados e digitalizados. So feitos histogramas e anlise
estatstica das medidas, sendo os resultados comparados com
histogramas-controle.

Diagnstico Laboratorial

46
A citometria de fluxo permite medir vrios parmetros
celulares simultaneamente e separar subpopulaes de clulas.
Diferentes ligantes, como anticorpos monoclonais e policlonais, lectinas, hormnios, avidina e estreptavidina, podem ser
conjugados a fluorocromos e permitem o estudo da distribuio de determinantes antignicos e receptores de clulas e a
identificao e separao de subpopulaes celulares.
As aplicaes e a utilizao da citometria de fluxo e da
separao celular em biologia e medicina tm sido cada vez
mais numerosas, mas, como os citmetros de fluxo no so
aparelhos simples, necessrio um conhecimento bsico dos
princpios de operao a fim de obter resultados precisos e
significativos. So fundamentais a qualidade da preparao e
colorao da amostra, o fluido e os componentes eletrnicos e
pticos do aparelho.
As medidas realizadas pelos citmetros de fluxo utilizam
a luz como fonte de excitao. Assim, a iluminao deve ser
intensa, pois as clulas so pequenas e passam atravs do
ponto de deteco rapidamente, e a fonte de luz deve ser capaz
de produzir comprimentos de onda especficos que excitem os
fluorocromos. Os dois tipos de fonte de luz mais utilizados nos
citmetros de fluxo so lmpadas de arco voltaico e laser (light
amplification by stimulated emission of radiation ), que emite
luz linearmente polarizada e a mais utilizada. As lmpadas
de mercrio so menos utilizadas, pois requerem sistemas
pticos mais sofisticados do que o laser. Os lasers podem ser
atmicos (hlio-nenio), inicos (on argnio ou criptnio),
moleculares (hlio-cdmio), lquidos ou slidos.
Os citmetros atuais podem ser equipados com dois ou
mais lasers, o que aumenta a capacidade de anlise multiparamtrica, pois aumenta a diversidade de fluorocromos disponveis. Alguns citmetros mais modernos podem detectar
at 17 cores diferentes. Pode ser medida a fluorescncia verde
(FLl); a fluorescncia amarela (FL2); a fluorescncia laranja
(FL3); a fluorescncia vermelha (FL4) e a fluorescncia roxa
(FLS).
importante conhecer o comprimento de onda de excitao de cada fluorocromo e de emisso do laser. O laser de
on argnio o mais utilizado justamente por ter emisso a
488 nm, capaz de excitar uma grande variedade de fluorocromos. Alm dos lasers, componentes eletrnicos, computadores e filtros pticos tm um papel essencial no funcionamento
dos citmetros de fluxo. A funo de alguns filtros absorver alguns comprimentos de onda e deixar passar a luz com o
comprimento de onda que interessa. A qualidade de tais filtros
da maior importncia na citometria de fluxo. Deve-se sempre mant-los em timo estado.
A principal funo de um citmetro de fluxo detectar a fluorescncia. Atualmente, as palavras-chave para se definir um
sistema ideal de deteco de fluorescncia so sensibilidade
e medidas multiparamtricas. A sensibilidade significa que
os reagentes e o aparelho devem permitir a obteno de uma
relao sinal/rudo (reao especfica/reao inespecfica) elevada. As medidas multiparamtricas correspondem anlise
simultnea de vrios marcadores diferentes empregando fluorocromos distintos, que podem ser quantificados independentemente. Essas medidas permitem a correlao de marcadores
biolgicos mltiplos em clulas individuais.

Separao de clulas ativadas por fluorescncia


O separador de clulas ativadas por fluorescncia (FACS)
um citmetro de fluxo que, alm de medir a intensidade da
fluorescncia de cada clula marcada, separa as subpopulaes
de clulas com diferentes antgenos de superfcie, marcados

pelos anticorpos fluorescentes distintos, de acordo com sua


fluorescncia caracterstica.
Nos ltimos anos, foi desenvolvido um nmero muito
grande de anticorpos monoclonais especficos para molculas de superfcie de clulas humanas. Esses anticorpos
podem ser marcados com fluorocromos direta ou indiretamente e ser empregados para caracterizar subpopulaes
de clulas.
A separao celular permite que subpopulaes de clulas ou partculas sejam separadas da amostra com alto grau
de pureza, que pode chegar a 95% ou mais, sendo possvel o
exame morfolgico ou o emprego em ensaios funcionais ou
outros, o que a torna um mtodo til na pesquisa e no diagnstico de muitas patologias, incluindo cncer e AIDS.
A separao de clulas pelo FACS pode apresentar
limitaes quando se deseja fazer separaes seriadas
em um grande nmero de clulas ou separao de clulas pouco frequentes. Nesses casos, pode-se combinar a
tcnica de separao de clulas ativadas por fluorescncia com outros mtodos capazes de separar com rapidez
grande nmero de clulas. Exemplos dessas tcnicas so
filtrao por tamanho, separao por densidade no Ficoll
e separao magntica. A aplicao desses mtodos de
pr-enriquecimento apresenta vrias vantagens: reduz o
tempo de processamento da amostra; permite a diminuio do fluxo, aumentando a preciso e o rendimento da
separao devido a menor taxa de coincidncia, e facilita
a identificao de clulas por diminuir a quantidade das
clulas predominantes e a sobreposio com as pequenas
populaes.

Ensaios multiparamtricos
Em geral, os testes sorolgicos clssicos permitem a medida
de antgenos ou anticorpos individualmente. Porm, h circunstncias em que desejvel medir mais de uma substncia
em uma amostra biolgica, e essa necessidade tende a aumentar com a heterogeneidade molecular e a complexidade dos
sistemas biolgicos.
Painis de testes frequentemente so solicitados pelos clnicos como auxiliares ao diagnstico e no acompanhamento de
doenas em vrias reas da Medicina. Exemplos desses painis
de testes incluem a anlise simultnea de tiroxina e tirotropina (tireoide), lutropina, folitropina e prolactina (gnadas),
vitamina B12 e folato (hematopoese). No diagnstico de disfunes endcrinas, a necessidade de medir vrios hormnios
ou iso-hormnios relacionados aumenta conforme os mecanismos complexos de interao entre os componentes do sistema endcrino so elucidados. Do mesmo modo, em outras
reas da Medicina, como Virologia, Hematologia, Gentica
e Alergologia, frequentemente necessrio medir uma srie
de substncias diferentes ou identificar qual entre vrias est
presente. Na pesquisa de antgenos ou anticorpos em doenas infecciosas ou autoimunes, na quantificao de citocinas,
no monitoramento de substncias teraputicas ou de abuso e
na pesquisa de marcadores tumorais tambm h situaes em
que essa determinao simultnea de grande importncia.
Embora os painis de testes sejam frequentemente solicitados, h laboratrios clnicos que, por no disporem da tecnologia necessria, analisam as amostras separadamente para
cada tipo de substncia.
O desenvolvimento de mtodos multiparamtricos,
que possibilitam a realizao de mltiplos ensaios, em um
nico tubo, com a mesma amostra e ao mesmo tempo, tem

Captulo 2

47

Testes Sorolgicos

constitudo um grande desafio. Esses sistemas so especialmente indicados para substncias que normalmente so agrupadas em painis e apresentam vantagens bvias, pois possibilitam a simplificao do trabalho e o aumento do desempenho
dos testes, diminuem o tempo de reao e dos volumes da
amostra e dos reagentes, facilitando a distino de substncias
que tm composio molecular heterognea ou isoformas e
permitindo a reduo dos custos.
Vrios tipos de ensaios foram desenvolvidos na tentativa de
conseguir um ensaio multiparamtrico. As tentativas convencionais de ensaios multiparamtricos tm como princpio a
combinao de dois, trs ou quatro imunoensaios diferentes no
mesmo sistema de reao, marcando o reagente de deteco de
cada sistema com um marcador diferente. Por exemplo, foram
desenvolvidos ensaios para a pesquisa de hormnios empregando-se como marcadores 1251e 1311ou 1251e 57Co, que so medidos
independentemente. Do mesmo modo, tm sido desenvolvidos
ensaios com marcadores enzimticos, quimioluminescentes ou
fluorescentes. Os lantandeos so marcadores fluorescentes promissores, tendo sido utilizados eurpio, trbio, samrio e disprsio, em fluorometria de tempo controlado, com diferentes
comprimentos de onda, para a pesquisa de quatro substncias
em ensaio nico. Entretanto, a dificuldade na obteno de combinaes de marcadores, cujos sinais possam ser quantificados
individualmente em uma mistura, tem mostrado, na prtica,
que um nmero limitado de imunoensaios simultneos pode ser
realizado utilizando-se o princpio de marcadores diferentes.
Assim, embora a ideia de medir mltiplas substncias na
mesma amostra date do incio do radioimunoensaio, nos ltimos dez anos a pesquisa de novas metodologias para a realizao de ensaios multiparamtricos tem se intensificado.
Uma alternativa tem sido separar espacialmente as reaes
individuais, permitindo a utilizao do mesmo marcador. Um
exemplo dessa estratgia o sistema descrito por Ekins et al. em
1990, utilizando a separao espacial de vrios imunoensaios
em uma sonda pequena e slida, com a obteno de um teste
altamente sensvel, que emprega quantidades muito pequenas
(10- 13 mol/.t') de anticorpos, os quais podem ser imobilizados
em microreas de poucos m 2 Essa tecnologia miniaturizada
possibilita a construo de arranjos de microreas, cada uma
contendo anticorpos de captura especficos para uma substncia diferente, e permitindo, em princpio, a medida simultnea
de milhares de substncias diferentes em um pequeno volume
de amostra, como, por exemplo, uma nica gota de sangue.
Utiliza um anticorpo de captura e um reagente de revelao
marcados com dois fluorforos diferentes. Quando a substncia em anlise uma macromolcula, o reagente de revelao
pode ser um anticorpo marcado especfico para um segundo
epitopo da substncia em anlise, e, quando um hapteno,
pode ser a prpria substncia, um anlogo ou anticorpo antiiditipo marcados, que se ligaro aos stios no ocupados do
anticorpo de captura. A aplicabilidade desse modelo foi exemplificada com o teste para tirotropina (TSH). O anticorpo
de captura anti-TSH marcado com vermelho de Texas e o
anticorpo de revelao, com fluorescena. A concentrao dos
reagentes escolhida de modo que a ocupao parcial dos
stios do anticorpo de captura imobilizado seja dependente da
concentrao de TSH. Uma estimativa do grau de ocupao
parcial derivada da razo entre o sinal de fluorescncia dos
anticorpos de captura marcados e o sinal do conjugado ligado
e proporcional concentrao de TSH na amostra. A leitura dos sinais fluorescentes feita em microscpio confocal
de varredura a laser, com dispositivos para a medida de dois
tipos de fluorescncia, e que permite a quantificao de sinais

gerados em uma microrea inteira ou em partes de qualquer


tamanho selecionado. Embora, teoricamente, um nmero ilimitado de substncias possa ser ensaiado empregando-se esse
sistema, devido ao volume fixo da amostra, a otimizao dos
limites do ensaio para todas as substncias mais difcil.
Outra proposta de ensaio multiparamtrico, descrita por
Kakabakos et al. em 1992, baseia-se na sensibilizao de discos de poliestireno com anticorpos monoclonais especficos.
Esses discos so colocados em tiras onde os ensaios so realizados. Os anticorpos monoclonais reagem com a substncia
em anlise e a imobilizam em uma rea especfica enquanto
outro anticorpo biotinilado reage com a substncia formando
um "sanduche". Aps a adio de estreptavidina marcada com
quelato de eurpio formam-se reas fluorescentes, cuja intensidade se relaciona com a quantidade de substncia presente
na amostra. As reas fluorescentes so quantificadas na fase
slida seca empregando-se fluorometria de tempo controlado.
O ensaio sensvel, preciso e exato. Esse sistema potencialmente pode ser utilizado na Endocrinologia, em doenas
infecciosas, na Hematologia e na Oncologia.
reas reativas separadas espacialmente tambm podem ser
conseguidas imobilizando-se diferentes antgenos em membranas adequadas com tcnicas de dot, atrao ou ligao qumica.
Um imunoensaio multiparamtrico prtico utiliza a nitrocelulose como fase slida, que contm distintas regies cobertas com vrios antgenos de agentes infecciosos. Quando se
adiciona o soro, os anticorpos especficos se ligam aos respectivos antgenos. Adiciona-se conjugado de peroxidase com
anti-imunoglobulina humana e, aps, um substrato que d
origem a um precipitado colorido. As regies coloridas so
quantificadas por espectroscopia de reflectncia.
Uma tecnologia para sintetizar e testar molculas biolgicas
em um formato miniaturizado utiliza luz para dirigir a sntese
qumica combinatria de biopolmeros em um suporte slido.
A identidade e a localizao de cada biopolmero so conhecidas e a sua interao com um agente de ligao molecular
pode ser medida. Esses chips podem ser utilizados em uma
srie de ensaios multiparamtricos, incluindo mapeamento de
eptopos, desenvolvimento de anlogos qumicos e em biologia molecular.
H grande interesse em sistemas simples de imunoensaios
nos quais a reao antgeno-anticorpo monitorada por um
transdutor eletrnico ou ptico. Um cristal piezoeltrico funciona como uma microbalana, e as mudanas na massa devidas reao antgeno-anticorpo na superfcie do cristal produzem diminuio na frequncia de ressonncia.
Atualmente, existem duas plataformas principais em relao
aos testes multiparamtricos: microarrays com protenas ligadas (chips) e microarrays com micropartculas (suspenso).

Microarranjos com protenas ligadas


Microarranjos (microarrays) com protenas ligadas so sistemas de ensaio altamente miniaturizados, em que as molculas de captura so imobilizadas em micropontos (< 300 mm)
de um suporte slido, com alta densidade < 2.000/cm2 A
nanotecnologia tem permitido a produo de nanoarrays de
protenas altamente densos ( < 106 pontos/mm2 ) . Os reagentes
de captura podem ser anticorpos monoclonais, ligantes no
proteicos (p. ex., aptmeros) e protenas que mimetizam anticorpos (p. ex., affibodies). Os mais comumente utilizados so
os anticorpos.
Essa tecnologia apresenta vrias vantagens, pois, em princpio, milhares de protenas podem ser detectadas em uma nica
lmina, permitindo pesquisar simultaneamente a presena

Diagnstico Laboratorial

48
de muitas protenas diferentes com um consumo mnimo
de amostra. Alm disso, podem ser produzidas centenas de
cpias de uma matriz, permitindo que as mesmas protenas
sejam testadas repetidamente com diferentes molculas de
diferentes amostras.
Esses sistemas so utilizados no s para a deteco simultnea de mltiplos alvos, mas tambm para a sua anlise funcional. H vrios sistemas disponveis comercialmente para
a pesquisa de marcadores tumorais, cardacos, de doenas
autoimunes, de doenas infecciosas.

Microarranjos com micropartcu/as


Nos microarranjos com micropartculas (beads), as molculas de captura so imobilizadas em microesferas e as biomolculas so detectadas principalmente pela citometria de
fluxo. Representam, provavelmente, o formato mais utilizado
na atualidade.
De modo geral, para preparar o ensaio multiparamtrico
conjuntos individuais de microesferas so conjugados com as
molculas-alvo necessrias para cada reao. Molculas-alvo
podem ser antgenos, anticorpos, oligonucleotdios, receptores, peptdios, substratos de enzimas etc. Um reagente fluorescente, que pode ser oligonucleotdio, antgeno, anticorpo,
receptor, preparado para cada molcula-alvo.
Sondas de antgenos ou anticorpos fluorescentes fornecem
sinais especficos para cada reao no ensaio multiparamtrico.
O sistema apresenta vrias vantagens para a anlise de
molculas relevantes na Biologia e Medicina, incluindo elevada sensibilidade, preciso, rapidez, economia e grande
capacidade analtica. Alm de reduzir o tempo do teste por
realizar mltiplos ensaios simultaneamente em vez de sequencialmente, a cintica rpida das reaes que utilizam microesferas permite tempos de incubao menores. Os custos so
reduzidos tanto pelo tempo menor de reao quanto pela
utilizao de menores quantidades de reagentes e de amostra. Permite a anlise de interaes moleculares que podem
ser realizadas apenas no formato multiparamtrico, podendo
ser aplicado virtualmente a qualquer ensaio que necessite de
anlise de interaes moleculares, incluindo pesquisa bsica,
diagnstico clnico, triagem e monitoramento de frmacos
etc. A maioria desses ensaios, seno todos os ensaios para
molculas de interesse biolgico, pode ser adaptada ao sistema, que tem sido empregado para realizar imunoensaios
qualitativos e quantitativos de mltiplas protenas sricas em
ensaios de captura e de competio.
Recentemente, uma srie de imunoensaios multiplex de
fluxo (MFI) foi descrita para a avaliao sorolgica de vrias
doenas infecciosas. Essa abordagem semelhante ao enzimaimunoensaio tradicional, mas permite a deteco e identificao simultnea de mltiplas biomolculas em um nico
ensaio. Essa tecnologia utiliza como matriz uma suspenso
lquida de at 100 microesferas (de poliestireno ou magnticas)
diferentes (5 a 6 m), cada uma conjugada com uma molcula
de captura diferente. Cada biomolcula detectada e quantificada aps a adio de uma sonda marcada por fluorforo
(p. ex., ficoeritrina), cuja emisso medida por um detector
de fluxo. Esse sistema foi validado para a pesquisa de IgM e
IgG na deteco de infeces congnitas por Toxoplasma gondii, vrus da rubola e citomegalovrus (ToRC); na deteco de
infeces pelo vrus Epstein-Barr e pelos herpes-vrus simples
(HSV-1 e HSV-2); na deteco de autoanticorpos em doenas
autoimunes e em vrios outros imunoensaios.

No sistema MAP (Multianalyte Profiling) so utilizadas


partculas de poliestireno ou magnticas, incorporando dois
fluorforos em 100 diferentes propores. Vrias molculas
podem ser ligadas superfcie da partcula. So utilizados dois
lasers. O primeiro laser (vermelho) excita o fluorforo interno
e identifica a biomolcula pesquisada. O segundo laser (verde)
excita o fluorforo (ficoeritrina) da sonda e permite a quantificao. Em geral, as partculas apresentam uma grande superfcie de anlise (em torno de 106 molculas de captura por
partcula). Entretanto, nos imunoensaios, o nmero de alvos
simultneos menor. No sistema FlexMAP 3D foi colocado
um terceiro laser, que teoricamente possibilita a deteco de
500 biomolculas.
Outro sistema que utiliza a plataforma de citometria de
fluxo realizado na superfcie de microesferas de poliestireno marcadas internamente com quantidades diferentes de
fluorforo. Anticorpos de captura revestem a superfcie das
microesferas. Imunoensaios separados podem ser realizados
simultaneamente em cada tipo de microesfera. No ensaio de
"sanduche': por exemplo, o antgeno na amostra capturado
pelo anticorpo da microesfera e detectado por meio de anticorpos biotinilados. Aps a adio de estreptavidina marcada
com outro fluorforo (que emite luz em comprimento de onda
diferente do fluorforo da microesfera), gerado um sinal.
Com a utilizao de microesferas de diferentes tamanhos,
aumenta-se o nmero biomolculas que podem ser detectadas. Tambm podem ser realizados ensaios de competio
incorporando-se um antgeno marcado pelo fluorforo, que
competir com o antgeno da amostra testada pela ligao ao
anticorpo de captura. A plataforma foi validada para citocinas,
marcadores de inflamao, protenas intracelulares de choque
trmico, protenas de sinalizao celular.

Agradecimentos
A Andr Arroyo Ruiz e Sandra do Lago Moraes, por terem
colaborado na elaborao das figuras.

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Captulo 2

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Captuo 3

Jos Eduardo Levi

Referncias bibliogrficas, 57

Captulo 3

Diagnstico Molecular

55

Adenina pareia com timina e citosina pareia com guanina.


Esse fato, elucidado experimentalmente por Watson e Crick
na dcada de 1950, contm a explicao bioqumica de como
o DNA capaz de preservar a informao gentica, em que
parear significa estabelecer ligaes fracas (pontes de hidrognio) entre as bases nitrogenadas. Quando o DNA submetido a temperaturas altas (> 90C) ele desnatura, ou seja,
ocorre a quebra das pontes de hidrognio e as fitas se separam, e, quando h o resfriamento, as fitas voltam a se ligar.
Nas clulas, a separao das fitas, essencial ao processo de
cpia e duplicao celular, feito por enzimas como a helicase.
Esse fenmeno da desnaturao reversvel forma a base terica de todos os testes moleculares, que se valem destes dois
princpios: complementaridade e desnaturao, ilustrados na
Figura 3.1.
Nas dcadas seguintes, a manipulao de cidos nucleicos
foi facilitada pelas tcnicas de clonagem, principalmente usando-se as enzimas de restrio, o que permitiu inserir segmentos especficos de DNA em plasmdios bacterianos e repliclos nas bactrias hospedeiras. A capacidade de "marcar,, os
cidos nucleicos com compostos radioativos como o 32P deu
origem s chamadas sondas, que, por meio da desnaturao e
hibridizao, permitiram os testes moleculares pioneiros para
diagnstico. A primeira dessas tcnicas foi batizada como
Southern blot1 em homenagem ao seu inventor, o bioqumico
ingls Edwin Mellor Southern (Figura 3.2). Quando usada
para a deteco de RNA se chama Northern blot e, quando
aplicada deteco de protenas, chama-se Western blot.
Essa tecnologia foi inicialmente aplicada na arena diagnstica para a identificao pessoal e testes de paternidade,2 substituindo imediatamente as metodologias ento empregadas,
como a comparao de grupos sanguneos e os polimorfismos proteicos e de HLA, j que a acurcia muito superior e
importantssima nesta situao em que inadmissvel conviver com um resultado "indeterminado':
Na dcada de 1980 foi inventado o mtodo de reao em
cadeia da polimerase (PCR) por Kary Mullis,3 que recebeu por
seu feito o Prmio Nobel de Qumica em 1993. A PCR revolucionou as cincias biolgicas e tornou possvel a enorme evoluo nas tcnicas de clonagem e sequenciamento, que culminaram nos animais e plantas transgnicos e no sequenciamento
de genomas completos de diferentes organismos, incluindo o
homem (Projeto Genoma Humano).

CT G T

G TA A

GA

CATT

CCAA

G T T

C G TA

CA

G T T

C T

G T A

G T

CAT
G T A

C A T

C A

G A

e
A

r e e

A
A

Figura 3.1 A. Trecho de DNA de duplafita complementar. B. DNA desnaturado, com as fitas separadas e a hibridizao de uma sequncia
complementar fita preta representando uma sonda ou primer (vermelho).

4333

993

526

GAa

3GAa

3GAa

Figura 3.2 Teste de Southern blot. O DNA submetido fragmentao


com enzima de restrio, depois transferido para uma membrana de
nitrocelulose e hibridizado com sondas radioativas (32P). A membrana
exposta a um filme de raios X que , depois, revelado.

Por sua praticidade e facilidade, diversos mtodos com


base em PCR passaram a ser desenvolvidos com aplicaes
especficas, tais como a RT-PCR para alvos RNA e a random
amplification of polymorphic DNA (RAPD, Figura 3.3) para
investigaes de relaes epidemiolgicas e filogenticas entre
indivduos.
Na dcada de 1990 foi demonstrado que a carga viral de HIV
era um excelente marcador prognstico, que pode ser utilizado no monitoramento da eficcia da terapia antirretroviral,4
impulsionando o surgimento do primeiro teste comercial com
base em PCR. Outros testes se seguiram na rea das doenas
infecciosas, como aqueles voltados para as hepatites B e C, e,
logo aps, testes para doenas genticas e importantes aplicaes em oncologia, para alguns tumores de base gentica
conhecida.
Como a PCR produz uma amplificao gigantesca do alvo,
da ordem de 1 bilho de vezes, uma metodologia muito sensvel, detectando quantidades de microrganismos que no
eram detectveis por outros mtodos. Organismos de cultivo
difcil ou de crescimento lento, que demandam longos perodos em cultura, passaram a ser identificados em horas, o que
levou substituio de tais mtodos por tcnicas moleculares
de amplificao, como a PCR e outras, nos laboratrios diagnsticos.
Diversas metodologias de amplificao foram inventadas, e podem ser divididas entre mtodos que amplificam
um segmento gnico do alvo e mtodos que amplificam
um sinal obtido por hibridizao. No primeiro grupo esto,
entre outras, a PCR, a nucleic acid sequence based amplification (NASBA), tcnica que gera RNA como produto5 em vez

Diagnstico Laboratorial

56

1 li
1

'

1
1
1 1
1

DLP
DLP
DLP
DLP

1600
1363
1374
1666

DLP 1333
DLP 1659
Controle 1
Controle 2
MV

1 1 1
1

Figura 3.3 RAPD-PCR de DNA de isolados bacterianos em um surto


hospitalar. O perfil de fragmentos gerados aleatoriamente permite inferir relaes epidemiolgicas e temporais entre as cepas.

de DNA, e a ligase chain reaction (LCR), que muito semelhante PCR, mas tem como enzima catalisadora uma ligase
que acopla oligonucleotdios justapostos.6 No segundo grupo
esto o branched DNA (bDNA)7 e a captura hbrida. 8 Os mtodos que amplificam o material gentico em geral apresentam
maior sensibilidade, enquanto os que amplificam o sinal so
mais vantajosos por terem menor chance de contaminao,
uma vez que no ocorre amplificao do alvo. Ambos os grupos de testes so utilizados hoje rotineiramente na patologia clnica. A captura hbrida o mtodo de referncia para
o diagnstico do papilomavrus humano (HPV); o bDNA
usado para a determinao da carga viral das hepatites B e
C, alm do H IV. J a PCR o mtodo utilizado em dezenas
de kits comerciais, disponveis para vrios agentes infecciosos, como os j citados HBV, HCV e HIV, mas tambm para
citomegalovrus (CMV), muitas outras viroses, infeces
bacterianas, fngicas e por protozorios, alm de rearranjos
gnicos caractersticos de algumas neoplasias. Sem dvida, a
altssima sensibilidade agrega grande valor a esses mtodos
no manejo clnico. Em muitas situaes mdicas a informao
da ausncia de um alvo, abaixo de um limite baixssimo de
deteco, de suma import ncia, como na deciso do final de
tratamento das hepatites virais e na doena residual mnima
oncolgica. Por outro lado, esta enorme capacidade de amplificao tambm o maior problema com a tcnica, uma vez
que o produto de amplificao, o amplicon, pode ser carregado
para as reas de extrao e pr-amplificao do laboratrio,
por meio de maanetas, canetas, celulares, roupas etc. Uma
amostra com quantidade inicial de mil cpias de um determinado gene ter gerado, ao final da PCR, bilhes de cpias. A
necessidade de abrirem-se os tubos de PCR para a separao
dos produtos por eletroforese em gel gera aerossol, que poder
espalhar pelo ambiente algumas poucas cpias do amplicon,
suficientes para contaminar uma prxima reao, o que leva
a resultados falso-positivos. Por esta razo, preconiza-se um
fluxo unidirecional de trabalho, sempre do ambiente "limpo"

(pr-PCR) para o "sujd' (que contm os amplicons), com salas


separadas para cada etapa. Igualmente importante o treinamento dos operadores, que devem respeitar essa caracterstica
da reao e evitar o refluxo e o transporte de materiais do ps
para o pr-PCR. Engenhosos sistemas qumicos de controle
dos amplicons foram desenvolvidos, tais como a substituio
do dTTP pelo dUTP em PCR, levando sntese de produtos
de PCR com o nucleotdio uracila incorporado, que passvel
de degradao por uma enzima que reconhece DNA contendo
U, a uracila DNA glicosilase.9
Afora a sensibilidade, os mtodos moleculares apresentam
uma segunda caracterstica marcante que os diferencia de
qualquer outra famlia de metodologias laboratoriais: a versatilidade. Uma vez que os cidos nucleicos esto presentes
em todo material biolgico celular, e muitas vezes tambm de
forma residual, mas analisvel, em fluidos acelulares como o
liquor, a urina e o plasma, possvel realizar a anlise molecular a partir de qualquer fonte biolgica. Alm de transformar o
laboratrio clnico, cuja rea de biologia molecular vem crescendo e ocupando aquelas anteriormente destinadas a formas
tradicionais de diagnstico, como cultura de clulas e bacteriana, sorologia e citologia, outras reas do conhecimento
sofreram enorme impacto com a introduo da PCR, como
a paleontologia e a histria. Resduos de DNA foram amplificados a partir de insetos preservados em mbar por milhes
de anos, de fragmentos de tecidos de mmias, entre muitas
diferentes fontes, o que permitiu a obteno de novos dados de
origem e evoluo das espcies, o reconhecimento da histria
de patgenos e at mesmo o sonho de recriarem-se espcies
extintas, ilustrado pelo conhecido livro/filme Jurassic Park.
Uma importante evoluo recente da PCR a possibilidade
de observao e registro, em tempo real, da formao do produto por meio de sensores que detectam a fluorescncia emitida por cada tubo/poo de PCR a cada ciclo, o que foi denominado PCR em tempo real. Os termocicladores recebem um
mdulo que contm as unidades que captam a fluorescncia e
transformam este sinal luminoso em eletrnico para o computador. Assim, no necessrio abrir os tubos aps a reao,
o que diminuiu muito o problema de contaminao j apontado. Por ser possvel medir a quantidade de fluorescncia,
em ltima anlise proporcional quantidade inicial de alvo,
na fase exponencial de amplificao, a PCR em tempo real
uma tcnica quantitativa, enquanto a PCR convencional um
mtodo que analisa apenas o ponto final (Figura 3.4).
Uma vez eliminada a necessidade de realizao da anlise por
eletroforese em gel, procedimento artesanal e de baixa capacidade
de troughput (processividade), a automao dos mtodos moleculares tornou-se factvel. No entanto, a etapa de extrao de cidos nucleicos mostrou-se a mais desafiadora tecnologicamente.
No momento de finalizao deste livro, em 2012, j havia muitos
modelos e equipamentos que faziam extrao automatizada de
um grande nmero de amostras simultaneamente. Porm, esses
equipamentos manipulavam volumes de amostras muitas vezes
maior do que aquele de fato utilizado nas anlises. Colhia-se um
tubo de 5 m.t' de sangue do paciente, do qual eram retirados 100 a
500 .t' para a extrao, dos quais seria empregado apenas o equivalente a 1 a 5 .t' na reao de amplificao. Isso significa que
ainda no avanamos suficientemente no processo de miniaturizao desta etapa, problema refletido no tamanho dos equipamentos disponveis. Alm de grandes e pesados, costumam ser
lentos, tomando 2 a 4 h apenas para a etapa de extrao.
Ainda assim, o acoplamento dessas plataformas com as plataformas de amplificao/deteco em tempo real, ocorrido nos
ltimos anos, culminou no aparecimento de mtodos 100%

Captulo 3

Diagnstico Molecular

5
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25

30

35

40

45

50

um procedimento simples e de rpida execuo. Hoje a lei de


Moore da informtica vlida tambm para o sequenciamento,
ou seja, a cada 2 anos h um salto no rendimento no nmero
de bases obtido em uma corrida de sequenciador, realizado em
plataformas tambm semi ou totalmente automatizadas. Com o
conhecimento das sequncias genmicas de inmeros organismos e microrganismos, e a existncia de bancos contendo essas
informaes acessveis pela Internet, o diagnstico das doenas
infecciosas passar, em breve, a ter uma abordagem totalmente
diferente daquela que praticamos nos ltimos cem anos. Em vez
de se criar uma hiptese diagnstica com base em sintomas,
dados clnicos e epidemiolgicos, ser feito um sequenciamento
de todo o material gentico contido em uma determinada
amostra, e o software do sequenciamento nos informar quais
microrganismos conhecidos e desconhecidos esto nela presentes. I4 Tal abordagem j se mostrou eficiente na elucidao,
em uma rapidez jamais imaginada, do agente etiolgico associado ao surto de uma cepa muito agressiva de E. coli que causou vrios bitos na Alemanha. Is Assim, prev-se que, em um
futuro prximo, todo o arsenal hoje utilizado nos testes moleculares, como as sondas, os compostos fluorescentes que magnificam o sinal, as enzimas de restrio e outros se tornaro obsoletos, pois visam, em ltima anlise, identificar e/ou quantificar o
agente infeccioso de uma amostra por meio do reconhecimento
de assinaturas genticas dele, o que ser obtido diretamente pelo
sequenciamento. Obviamente este admirvel mundo novo traz
implicaes ticas importantes, uma vez que muitas informaes sobre o genoma do hospedeiro sero obtidas em concomitncia, o que levantar dvida de como lidar com elas.

N do ciclo

Figura 3.4 Ilustrao explicativa da deficincia da PCR convencional para


a quantificao absoluta de genomas. A parte superior da figura mostra
um gel de produtos de amplificao de quantidades iniciais decrescentes
do vrus da hepatite B(A = 106 cpias/mi ; B= 105 cpias/mi ; C= 104 cpias/mi ; D= 103 cpias/mi ; E= 102 cpias/mi ; F= controle negativo). A
parte inferior mostra a mesma reao realizada em PCR em tempo real,
quando, na etapa exponencial, possvel distinguir as amostras com
maior carga virai das de menor carga virai por meio do valor de Ct (cycle
threshold).J na anlise visual do gel as amostras A, BeCso indistinguveis,
embora apresentem diferena de 10.000 vezes na concentrao de HBV.

automatizados. Provavelmente, o exemplo aplicado hoje em


maior escala o dos chamados testes NAT (nucleic acid tests)
usados na triagem de doadores de sangue para HBV, HCV e
HIV para evitar a transmisso desses agentes por doadores em
janela imunolgica quando o teste sorolgico com base em anticorpos negativo. II Outro exemplo em vias de implantao o
uso de plataformas semelhantes para o rastreio do cncer cervical com testes que detectam o DNNRNA dos HPV, presentes
em 100% dos casos de cncer do colo uterino, em substituio
aos testes de citologia onctica (Papanicolaou).I2
A nanotecnologia trouxe a promessa de miniaturizao das
trs etapas (extrao-amplificao-deteco). Comeam a surgir
dispositivos diminutos utilizando minsculas bombas que fazem
os reagentes flurem atravs de microcanais esculpidos em lminas e outros substratos, o que resulta de fato no conceito de lab
in a chip, semelhante aos testes rpidos imunocromatogrficos
existentes. Esses testes podero se tornar uma alternativa para
o diagnstico molecular no chamado point-of-care, ou seja, que
pode ser feito no consultrio mdico ou mesmo em casa. I3
Outra linha de evoluo dos testes moleculares fundamentase no sequenciamento de cidos nucleicos. Com a exploso dos
mtodos de sequenciamento, s possvel pelo uso da PCR, esta
tcnica, antes extremamente artesanal e laboriosa, tornou-se

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Se o 2

Vrus

Captulo 4

Cludio Srgio Pannuti

Introduo, 62
Caractersticas do vrus, 62
Aspectos clnicos e epidemiolgicos, 62
Diagnstico laboratorial, 63
Correlao clnico-laboratorial, 65
Referncias bibliogrficas, 67

62

. .,. Introduo
O citomegalovrus (CMV) tem sido considerado um dos
principais causadores de doenas no homem. O risco de infeco por esse agente comea j na vida intrauterina e no perodo
perinatal, podendo ocorrer tambm como infeco adquirida
na infncia ou na idade adulta. Estudos soroepidemiolgicos
demonstram que at 85% da populao adulta no estado de
So Paulo j foi infectada pelo CMV. 12 Alm disso, esse vrus
tem a capacidade de ficar latente no organismo humano, reativando-se na vigncia de doenas imunodepressoras.

. . . Caractersticas do vrus
O CMV est includo na famlia Herpesviridae, subfamlia 13-herpesvirinae. um DNA vrus, de simetria icosadrica,
com 162 capsmeros, envolvidos por um envelope lipdico.
Sua vida mdia a 37C de apenas 45 min. Alm de infectar o homem, os citomegalovrus so encontrados no mundo
animal em camundongos, cobaias e macacos, mas essas cepas
so espcie-especficas, de modo que os CMV de animais no
infectam o homem. As eventuais diferenas antignicas observadas no CMV humano no so suficientes para caracterizar
subtipos do CMV. 3

. . . Aspectos clnicos e epidemiolgicos


Infeco congnita
O CMV considerado a causa mais comum de infeco
congnita no homem. Diferentes estudos tm apresentado
taxas de infeco variando de 0,2 a 2,2%,2 admitindo-se que s
nos EUA nascem, a cada ano, cerca de 40.000 crianas infectadas congenitamente.4 Estudos realizados em uma mesma rea
geogrfica demonstraram que a incidncia de infeco congnita pelo CMV pelo menos duas vezes maior nas populaes
de baixo nvel socioeconmico - justamente as com maior prevalncia de anticorpos. Em So Paulo, demonstraram-se taxas
variando de 0,49 a 0,98%, dependendo do nvel socioeconmico da populao estudada.2 A explicao para as altas taxas
de infeco congnita pelo CMV e para a relao entre incidncia de infeco congnita e nvel socioeconmico da populao encontra-se na capacidade que o CMV tem de infectar
o feto mesmo quando a me j apresentava anticorpos antes
da concepo, ao contrrio do que ocorre com a rubola e a
toxoplasmose. 5 A anlise do DNA das cepas de CMV isoladas
de casos em que se documentou infeco congnita em duas
gestaes sucessivas sugerem que o mecanismo fundamental envolvido na infeco intrauterina de mes previamente
imunes a reativao do vrus latente da me. importante
ressaltar, porm, que a absoluta maioria dos recm-nascidos
(RN) que vm ao mundo com sintomas de doena congnita
so de mes que tiveram infeco primria durante a gestao.
Desse modo, os anticorpos maternos acabam desempenhando
importante efeito protetor no feto, pois ainda que os mesmos
no impeam a ocorrncia da infeco congnita, impedem
que a doena se manifeste clinicamente. Estudo prospectivo
analisando 197 RN com infeco congnita pelo CMV revelou
que somente as crianas cujas mes tiveram infeco primria durante a gestao apresentaram sintomas ao nascimento

Diagnstico Laboratorial
(18%). Nesse grupo, aps acompanhamento mdio de 5 anos,
25% das crianas apresentaram uma ou mais sequelas. Por
outro lado, embora todas as crianas infectadas congenitamente por reativao de infeco materna fossem assintomticas ao nascerem, 8% desenvolveram sequelas.6
A infeco pode ocorrer em qualquer poca da gestao.
Embora estudos experimentais em cobaias tenham demonstrado que a gravidade da infeco maior quando a infeco
materna ocorre no incio da gestao, no homem, essa relao
no est estabelecida, j que a maioria absoluta das infeces
maternas so assintomticas.
A forma mais grave, originalmente denominada "doena
de incluso citomeglic' caracteriza-se clinicamente por ictercia, hepatoesplenomegalia, petquias, microcefalia, coriorretinite e calcificaes cerebrais. A absoluta maioria dos RN
com essa apresentao clnica iro desenvolver sequelas graves
na evoluo, incluindo surdez, perda da viso, retardo mental
e dficits neurolgicos. Felizmente, somente 1 a 2% dos RN
infectados apresentam essa forma clnica. Entre os extremos
representados por recm-nascidos totalmente assintomticos
e a forma mais grave da doena, existe um amplo espectro de
manifestaes clnicas, por exemplo, a ocorrncia isolada de
hepatoesplenomegalia, com ou sem ictercia, ou de petquias,
ou a combinao desses sintomas. De modo geral, as crianas
com quadro clnico mais leve tm maiores chances de evoluir
sem sequelas tardias.

Infeco perinatal
O CMV tambm pode infectar o recm-nascido durante
o trabalho de parto, pelo contacto dele com secrees uterinas maternas contaminadas pelo CMV durante sua passagem
pelo canal de parto, ou nas primeiras semanas de vida, pela
contaminao com leite materno contendo CMY. 78 A incidncia de infeco perinatal tem variado nos diversos estudos, de 7 a 38%. Em So Paulo, estudo prospectivo realizado
em um hospital pblico revelou que o risco de infeco foi de
24,3%, situando-se entre os mais altos do mundo.9 As taxas de
infeco dependem das taxas de excreo do CMV em crvice
uterina no momento do parto, ou leite materno nas primeiras
semanas de amamentao. Em ambos os casos, a possibilidade
de ocorrer infeco do RN quando a me excretora do vrus
de cerca de 50%. Em estudo realizado em So Paulo, isolou-se
o CMV de 29,8% das amostras de leite obtidas de purperas
assintomticas. 10
O perodo de incubao da infeco perinatal estimado
entre 4 a 12 semanas, sendo em mdia de 8 semanas. Esse tipo
de infeco, embora muito frequente, , em geral, totalmente
assintomtico, embora raros relatos de pneumonites deem
conta de certa gravidade.

Infeco adquirida
Aps o perodo neonatal, a infeco se d por transmisso
horizontal do vrus, por meio de secrees que o contenham.
A urina e a saliva so as fontes mais importantes de disseminao do CMV, por isso as taxas de infeco adquirida costumam ser muito altas em berrios e creches devido ao contato
ntimo entre crianas excretoras e crianas suscetveis. Do
mesmo modo, em populaes de nvel socioeconmico mais
baixo, como consequncia das condies adversas de higiene
e moradia, a infeco mais precoce e frequente. Existem evidncias de que a transmisso do CMV tambm possa ocorrer
por via sexual, j que excreo viral frequente e prolongada do

Captulo 4

63

Citomegalia

vrus no smen frequentemente observada, alm de ter-se


documentado a presena de cepas geneticamente idnticas no
smen e secrees uterinas de parceiros sexuais.II
A maioria absoluta das infeces adquiridas assintomtica. Entretanto, quando ocorrem manifestaes clnicas, estas
assumem caractersticas de um quadro de mononucleose infecciosa-"smil:I2 O paciente apresenta quadro febril prolongado
(na maioria das vezes com 10 dias ou mais de durao), sensao de fraqueza, sudorese, e, eventualmente, hepatoesplenomegalia. Ao contrrio do que acontece na mononucleose infecciosa clssica, provocada pelo vrus Epstein-Barr, a presena de
linfonodomegalia cervical rara no adulto com citomegalomononucleose. Contudo, na infncia, a linfonodomegalia cervical comum, ocorrendo em cerca de 90% dos casos. I3
Laboratorialmente, o que chama mais ateno o hemograma com linfocitose relativa e absoluta importante, bem
como a presena de grande nmero de linfcitos atpicos. As
enzimas hepticas (TGO e TGP) esto moderadamente elevadas em cerca de 80% dos casos. I3

Citomegalovrus no paciente
imunocomprometido
A grande expanso da tcnica de transplante de rgos
(rim, corao, fgado, medula ssea), a introduo de novos
quimioterpicos para tratamento de neoplasias, bem como o
advento da sndrome da imunodeficincia adquirida (AIDS)
teve como consequncia o aumento do nmero de pacientes
imunocomprometidos, passveis de sofrerem infeces oportunistas, como o caso do CMV. Embora possa ocorrer infeco primria, a maioria das infeces pelo CMV no paciente
imunocomprometido se devem reativao de uma infeco
latente, previamente existente.
Hoje, admite-se que de 70 a 90% dos receptores de transplante renal iro apresentar, em algum momento do psoperatrio, evidncias de infeco pelo CMV, podendo, de
modo geral, estender-se essa projeo para os outros tipos de
transplante. I4,Is Do mesmo modo, nos pacientes com AIDS,
frequente a deteco de infeco ativa (ou seja, evidncias
laboratoriais de replicao viral) durante a evoluo da doena.
Estudo realizado em So Paulo demonstrou que, durante
perodo mdio de acompanhamento de 2 meses, 30/50 (60%)
dos pacientes com AIDS internados por qualquer causa em
dois hospitais pblicos de So Paulo apresentaram evidncias
de infeco ativa pelo CMV. I6 Muitos dos pacientes imunodeprimidos que venham a apresentar infeco ativa pelo CMV
iro apresentar tambm sintomas e sinais de doena por esse
vrus. As manifestaes mais comumente observadas so
quadros febris prolongados com alteraes hematolgicas ou
hepticas (tambm conhecidos como "sndrome do citomegalovrus"), de grande incidncia em transplantados renais, quadros de pneumonia intersticial (mais comum em receptores de
transplante de medula), retinite e lceraes gastrintestinais,
ambas com ampla prevalncia em pacientes com AIDS. So
doenas que preocupam bastante pela gravidade e, muitas
vezes, se no forem tratadas rpida e adequadamente, levam o
paciente a bito.I7

. . . Diagnstico laboratorial
O diagnstico laboratorial da infeco pelo CMV pode ser
feito por diferentes mtodos, que incluem exame direto de
amostras (por microscopia eletrnica, demonstrao de clu-

las com corpsculos de incluso caractersticos, e deteco de


antgenos ou DNA viral), isolamento viral em culturas celulares, e vrios testes sorolgicos.
Para cada apresentao clnica, h necessidade de se escolher este ou aquele recurso laboratorial. Alm disso, a escolha
do teste a ser utilizado vai depender da experincia do laboratrio executante com determinada tcnica, da disponibilidade
de equipamentos, do custo, e da necessidade ou no de um
resultado rpido.
Os testes atualmente disponveis para deteco de infeco
pelo CMV so descritos a seguir.

Pesquisa direta
Microscopia eletrnica
Por meio da pseudorrplica, a microscopia eletrnica tem
sido empregada para detectar CMV em amostras de urina e
secrees de orofaringe em recm-nascidos.Is A vantagem
desse mtodo a rapidez, pois poderia dar um resultado positivo em 15 a 30 min, alm de poderem-se examinar materiais
eventualmente contaminados por fungos ou bactrias, que
no so apropriados para isolamento viral. Contudo, alm de
necessitar de equipamento sofisticado e caro, bem como pessoal altamente treinado, tem sensibilidade relativamente baixa,
detectando o CMV apenas em amostras com altas concentraes virais. No se trata de um exame usado na rotina.

Exame histopatolgico ecitolgico


O CMV leva, in vivo, formao de clulas grandes, com
incluses intranucleares (e, eventualmente, citoplasmticas)
caractersticas, e podem ser facilmente visualizadas quando
coradas com hematoxilina-eosina, Papanicolaou, ou Giemsa.
As clulas de incluso citomeglica podem ser demonstradas em fragmentos de tecidos (fgado, rim, pulmo etc.), em
sedimento urinrio, lavado gstrico e broncoalveolar, dentre
outros materiais. Quando presentes, tm considervel valor
diagnstico. As grandes vantagens dessa tcnica so sua simplicidade, rapidez e baixo custo, podendo ser executada em
qualquer laboratrio. Contudo, a alta incidncia de resultados
falso-negativos limita muito seu uso, devendo, por isso, ser
complementada com outras tcnicas mais sensveis.I9

lmuno-histoqumica eimunocitologia
O advento de anticorpos monoclonais para diversas protenas do CMV contribuiu muito para o progresso do diagnstico laboratorial das citomegaloviroses, permitindo a deteco
de antgenos especficos em fragmentos de tecidos obtidos por
biopsia, ou em necropsia, e em amostras de urina, lavado bron coalveolar, bem como em preparaes de leuccitos.20- 24 Esse
mtodo mais sensvel que o exame histopatolgico comum,
e essa caracterstica fica ainda ainda mais latente quando se
usam misturas de monoclonais, dirigidos a diferentes epitopos
do CMV. 23 A revelao pode ser feita por imunofluorescncia
ou por tcnicas imunoenzimticas. Embora seja rpida e relativamente simples, considerada menos sensvel que o isolamento viral clssico.I9

Deteco do antgeno pp65 em neutrfilos (antigenemia)


Embora a demonstrao direta ou indireta da presena do
vrus no rgo acometido seja o melhor meio de comprovar
laboratorialmente a participao do CMV naquele determinado quadro clnico, muitas vezes no se dispe de biopsias

Diagnstico Laboratorial

64
para executar essa pesquisa. Uma alternativa para esses casos
a pesquisa do CMV no sangue, pois foi demonstrado em
receptores de transplante de medula ssea e tambm em outros
tipos de transplante que existe uma boa correlao entre viremia positiva e doena invasiva pelo CMV.24 Entretanto, o isolamento do vrus por tcnica clssica no de utilidade, pois
pode demorar at 4 semanas para dar essa informao, inviabilizando qualquer tipo de interveno para preveno da
doena invasiva. Por essa razo, emprega-se, nesses casos, uma
tcnica rpida. Dentre essas tcnicas, encontra-se a pesquisa
direta do antgeno pp65 do CMV em neutrfilos circulantes
com anticorpos monoclonais (tcnica da antigenemia). Alm
de ser altamente especfica, permite a quantificao dos neutrfilos contendo o antgeno do CMV no seu interior2526 e tem
sido amplamente utilizada, tanto em centros de transplante de
clulas-tronco hematopoticas como de rgos slidos.

Reao em cadeia da polimerase 1Polimerase


em tempo real
Essa reao ganhou grande impulso nos ltimos anos por
ser extremamente sensvel, permitindo detectar quantidades
muito pequenas de DNA viral em amostras clnicas. Tem sido
utilizada em amostras de urina,27 leuccitos perifricos,28 fragmentos de tecidos 29 e amostras de lavado broncoalveolar, 30
contudo, ainda no pode ser considerada um exame de rotina,
pois sua execuco complexa, e sua aplicao clnica ainda
no est totalmente definida. Isso ocorre principalmente em
pacientes imunocomprometidos, os quais, frequentemente,
apresentam infeco ativa pelo CMV, que pode ou no vir
acompanhada de doena invasiva. Como existe uma relao
entre carga viral e presena de doena clinicamente manifesta
e reao em cadeia da polimerase (PCR) pode detectar quantidades mnimas de vrus, frequentemente esse exame apresenta resultado positivo em indivduos que no tm doena
pelo CMV, fazendo com que seu valor preditivo positivo para
doena invasiva seja relativamente baixo. 2830-32 A utilizao de
PCR em combinao com outras tcnicas e, principalmente,
o desenvolvimento de tcnicas capazes de quantificar o DNA
viral presente nas amostras testadas, como a PCR em tempo
real,29,33- 35 apresentam-se como a melhor alternativa para o
diagnstico rpido, sensvel e especfico da citomegalovirose
em pacientes imunocomprometidos atualmente.

Isolamento do citomegalovrus
em culturas celulares
O isolamento do CMV em culturas, por sua alta especificidade e boa sensibilidade, continua sendo uma tcnica fundamental para o diagnstico desse tipo de infeco. 19 O vrus
pode ser isolado a partir de diferentes materiais, tais como
urina, secrees de orofaringe, sangue, smen e fragmentos de
rgos obtidos por biopsia ou necropsia.
Aps a coleta, o material deve ser encaminhado no menor
tempo possvel ao laboratrio, em meio de transporte adequado (soluo salina balanceada, com soro fetal bovino e
antibiticos). Urina e lquido cefalorraquidiano (LCR) no
precisam de meio de transporte, e as amostras de sangue para
deteco de viremia s necessitam de anticoagulante. Desde
a coleta at a inoculao no laboratrio, o material deve ser
conservado a 4C ou em banho de gelo. O material nunca deve
ser congelado a -20C pela grande labilidade do CMV nessa
temperatura. Os fibroblastos humanos constituem-se na nica
linhagem celular que permite sua replicao in vitro, e o apa-

recimento de efeito citoptico caracterstico, que possibilita a


deteco da presena do vrus na cultura, pode demorar at 4
semanas para aparecer, sendo este um dos principais bices
em relao sua aplicao clnica.

Tcnica do shell-via/
Basicamente, consiste em um isolamento viral clssico no
qual diferentes materiais clnicos so inoculados em trs lamnulas contendo fibroblastos humanos em cultura. Contudo,
para aparecimento do efeito citoptico caracterstico do CMV,
adiciona-se a essas lamnulas uma mistura de anticorpos
monoclonais, em intervalos de 24, 48 e 72 h, contra diferentes
antgenos do vrus, sendo a revelao feita por meio da imunofluorescncia indireta. 3637 Assim, chega-se ao resultado de
uma cultura viral em poucos dias, motivo pelo qual o mtodo
empregado com frequncia quando necessrio um diagnstico rpido, como ocorre em pacientes imunodeprimidos.

Pesquisa de anticorpos
Existem vrios testes disponveis para o diagnstico sorolgico das infeces por CMV. A escolha do teste depende
basicamente do tipo de informao que se quer buscar, mas
o custo, a necessidade de equipamentos, o tempo de execuo
e a facilidade de execuo sempre devem ser levados em considerao.

Fixao do complemento
Durante muitos anos, a reao de fixao do complemento
(RFC) foi o nico teste disponvel para detectar anticorpos
anti-CMV. A RFC foi amplamente usada para estudos soroepidemiolgicos38 e para o diagnstico de infeco adquirida
(citomegalomononucleose), a partir da ascenso de ttulos
entre a fase aguda e a convalescena. Nesse ltimo caso, o nvel
mximo de anticorpos s atingido de 4 a 6 semanas aps o
incio do quadro clnico.
Embora no exija equipamentos dispendiosos, e se disponha de reagentes comerciais, um mtodo que exige padronizao muito rgida, tcnicos altamente treinados, sendo
tambm um pouco demorado. Alm disso, a RFC menos
sensvel que outros mtodos disponveis para deteco de
anticorpos anti-CMV, sendo, por essa razo, cada vez menos
usada na rotina. 19

Aglutinao passiva de partculas de ltex


Nesse mtodo, partculas de ltex so revestidas com antgenos do CMV e aglutinadas na presena de anticorpos especficos. A leitura feita por inspeo visual, e a reao completa
pode ser feita em 15 min, j que no exige lavagens, longas
incubaes ou tratamentos adicionais. Trata-se de mtodo
bastante sensvel e especfico.394 Analogamente RFC, pode
ser utilizado para inquritos soroepidemiolgicos, triagem de
doadores de sangue ou aumento do ttulo de anticorpos em
amostras pareadas de sangue. 39- 41

Reao de imunofluorescncia indireta


Tem como grande vantagem a possibilidade de permitir
a deteco separada de anticorpos IgM.42 Esse teste exige a
manuteno de fibroblastos humanos em cultura no laboratrio, que so inoculados com cepa padro do CMV (em geral, a
cepa AD169). Quando aparece efeito citoptico caracterstico,
as clulas so fixadas em acetona e utilizadas para pesquisa dos
anticorpos.

Captulo 4

Citomegalia

A pesquisa de anticorpos IgM pode ser empregada para o


diagnstico de infeces congnitas, j que estes no cruzam
a barreira placentria, sendo tambm extremamente til para
diagnosticar quadros de infeco primria pelo CMV (citomegalomononucleose) em pacientes imunocompetentes.

Testes imunoenzimticos
Os ensaios imunoenzimticos, principalmente o ELISA, tm
substitudo os mtodos tradicionalmente usados para deteco de anticorpos anti-CMV nos ltimos anos. Apresentam
sensibilidade e especificidade semelhantes s da imunofluorescncia indireta,43 mas tm como vantagem a possibilidade
de permitir o processamento de grande nmero de amostras.
O teste feito utilizando-se placas plsticas com cavidades revestidas com antgenos purificados do CMV. O soro do
paciente adicionado a essas cavidades, e os anticorpos IgG ou
IgM anti-CMV, se presentes, ficaro ligados aos antgenos. A
revelao feita com anticorpos anti-imunoglobulina humana
anti-IgG ou IgM (dependendo do tipo de anticorpo que se quer
pesquisar), conjugados a enzimas, e o respectivo substrato da
enzima utilizada. A intensidade da cor que se desenvolve com
a reao enzima-substrato depende da quantidade de enzima
presente, que, por sua vez, depende da quantidade de anticorpos, sendo a leitura feita com um espectrofotmetro. Existem
diferentes kits comercialmente disponveis, e o resultado pode
ser dado em poucas horas.

. .,. Correlao clnico-laboratorial


Infeco congnita
Classicamente, o teste de eleio para diagnstico de infeco congnita pelo CMV o isolamento do vrus na urina, 44
embora possa ser isolado da orofaringe e outros fluidos. A
excreo viral prolongada, podendo durar meses ou mesmo
anos. Para se ter certeza de que a infeco congnita e no
perinatal, o isolamento deve ser feito nas 2 primeiras semanas
de vida. Os fibroblastos humanos constituem a nica linhagem
celular que permite a replicao e identificao do CMV in
vitro; o aparecimento do efeito citoptico caracterstico pode
demorar at 4 semanas, sendo este um dos principais obstculos para o uso rotineiro dessa tcnica. O shell-via[ representa uma alternativa mais rpida de diagnstico, sendo sua
sensibilidade semelhante ao isolamento clssico. 36 Contudo,
mais recentemente, o PCR tem substitudo o isolamento viral
por apresentar sensibilidade semelhante com a vantagem de
permitir um diagnstico mais rpido que o isolamento viral.
Alm disso, a determinao de DNA do CMV por PCR no
sangue do RN ao nascimento parece ser to sensvel e especfica quanto a PCR da urina para o diagnstico de infeco
congnita pelo CMV.28
A pesquisa de anticorpos IgG no tem grande aplicao
devido passagem passiva de anticorpos IgG maternos pela
placenta. Por outro lado, a persistncia desses anticorpos ou
o aumento do ttulo dos mesmos durante os meses seguintes
sugere infeco congnita. No entanto, nesse caso fica difcil
excluir a possibilidade de infeco perinatal. medida que os
anticorpos maternos passivos fossem desaparecendo, surgiriam os anticorpos produzidos pelo RN ao sofrer infeco no
momento do parto ou nas semanas imediatamente seguintes.
Como os anticorpos IgM no ultrapassam a barreira placentria, sua deteo no RN possibilita o diagnstico de infec-

65
o congnita. Entretanto, sua sensibilidade inferior ao isolamento viral, pois so detectados em apenas 50 a 70% dos
recm-nascidos infectados. 2 A competio dos anticorpos IgM
do RN com os anticorpos IgG maternos pelos antgenos presentes na lmina de imunofl.uorescncia ou na placa do ELISA
pode contribuir para os resultados falso-negativos. A separao das fraes IgG e IgM do soro antes do teste pode diminuir
consideravelmente esse problema, existindo vrias maneiras
de se fazer essa separao no laboratrio. 19 A utilizao do
teste ELISA de captura de IgM tambm representa um meio
efetivo de diminuir os casos falso-negativos. Nesse teste, o orifcio da placa recoberto com anticorpos anti-IgM humanos,
que vo "capturar,, somente as molculas de IgM presentes no
soro a ser testado. Assim, todos os anticorpos IgG e eventuais complexos IgG-fator reumatoide sero eliminados com a
lavagem inicial da reao. A seguir, adicionam-se antgenos
do CMV, que se ligaro somente se houver molculas de IgM
anti-CMV "capturadas': e depois um conjugado anti-CMV
secundrio e substrato. Por outro lado, pode haver resultados
de IgM falso-positivos, devido eventual presena no sangue
no recm-nascido de fator reumatoide, que uma imunoglobulina de classe IgM com atividade inespecfica contra IgG
humana. 45 Desse modo, os anticorpos passivos IgG anti-CMV
presentes no soro do RN, ao se ligarem aos antgenos do CMV
presentes nas lminas de IFI ou nas placas de ELISA, sero
"reconhecidos,, pelo fator reumatoide, o qual, por sua vez, ser
"reconhecido,, pelo conjugado anti-IgM humano utilizado em
ambas as reaes. Por esse motivo, obrigatria a pesquisa
e, se positiva, a remoo do fator reumatoide sempre que se
tenha uma amostra de sangue positiva para IgM.
Existem outras alternativas para contornar o problema do
fator reumatoide, como a separao da frao IgM por diferentes mtodos, e a utilizao do teste ELISA de captura de
IgM.19
A exemplo da excreo viral, a positividade do IgM antiCMV pode persistir por muitos meses.

Infeco congnita intrauterina


Frente a uma suspeita consistente de infeco aguda pelo
CMV na gestante ou quando se detecta alguma anormalidade
no ultrassom fetal compatvel com esse diagnstico (retardo
do crescimento, ventriculomegalia cerebral, ascite, calcificaes intracranianas, ou volume diminudo de lquido amnitico), existe indicao de investigar a possibilidade de infeco
intrauterina pelo CMV. Como a absoluta maioria das infeces
maternas pelo CMV subclnica, a hiptese de infeco aguda
pelo CMV durante a gestao ocorre, em geral, em consequncia da deteco na gestante de IgM para o CMV durante
exames pr-natais de rotina. O problema que surge a partir
desse resultado est relacionado com o baixo valor preditivo da
deteco de IgM para o CMV na gestao para infeco congnita. Na fase inicial da infeco primria, as concentraes de
IgM podem ser muito baixas, confundindo a sua interpretao clnica. A resultante que somente 10% das gestantes com
IgM positivo daro luz uma criana com infeco congnita
pelo CMV.4647 Por isso, nesses casos, est indicada a pesquisa
da avidez de anticorpos IgG. Esse teste baseia-se na dinmica
da maturao dos anticorpos IgG, que cursa com baixa avidez
(< 30%) nas primeiras 8 a 12 semanas da infeco primria.
Assim, percentuais inferiores a 30% sugerem que a infeco
primria aguda tenha ocorrido h menos de 2 meses. Por
outro lado, na reinfeco ou na reativao da infeco, a resposta de anticorpos IgG rpida e feita basicamente custa
de anticorpos de alta avidez. Assim, o teste de avidez de IgG

66
tem sido amplamente utilizado para sugerir a diferenciao de
infeces agudas primrias das infeces secundrias. O teste
de avidez de IgG tem valor preditivo negativo prximo a 100%
em casos de gestantes com IgM positivo nas primeiras semanas da gestao. Contudo, embora o teste de avidez de anticorpos IgG possa afastar, com boa margem de segurana, uma
falsa infeco primria, quando aponta para uma infeco
primria verdadeira, seu valor preditivo para infeco congnita confirmada de apenas 25%, j que nem sempre ocorre
infeco fetal durante a infeco primria materna.48
O passo seguinte consiste em demonstrar a presena do
CMV no lquido amnitico. A pesquisa - por PCR ou por isolamento viral em culturas celulares - est indicada a partir da
21 semana de gestao. Em gestantes com infeco primria
confirmada, a demonstrao do CMV no lquido amnitico
tem valores preditivos negativos prximos de 100% tanto com
o isolamento viral quanto com a PCR. Contudo, diferentes estudos mostram valores preditivos positivos (VPP) prximos de
100% com o isolamento viral, mas as taxas variam de 50 a 100%
com a PCR, talvez pela maior sensibilidade desta tcnica.47
Alguns autores recomendam a confirmao da deteco do
CMV no lquido amnitico por pelo menos duas tcnicas diferentes para maior segurana diagnstica. 49

Infeco perinatal
A exemplo da infeco congnita, as tcnicas mais utilizadas para o diagnstico de infeco perinatal so o isolamento
viral ou a PCR em amostra de urina. No entanto, esse diagnstico s pode ser feito se tivermos uma amostra de urina
colhida nas primeiras 2 semanas de vida negativa para o CMV
e outra positiva a partir da quarta semana de vida. 7- 9 A negatividade de anticorpos IgM ao nascimento com posterior positivao tambm confirma esse diagnstico.
Assim como na infeco congnita, a excreo viral na
urina e orofaringe prolongada, bem como a positividade do
IgM.

Infeco adquirida {citomegalomononucleose)


Para o diagnstico de infeco adquirida pelo CMV, a tcnica de eleio a sorologia. No caso de empregar-se uma
tcnica para deteco de anticorpos IgG, deve-se demonstrar
viragem sorolgica (soro colhido na fase aguda negativo e, na
convalescena, positivo) ou aumento de ttulo de 4 vezes ou
mais no soro de convalescena em relao ao soro colhido na
fase aguda.
No caso de utilizar-se tcnica que permita a deteco de
IgM, geralmente uma nica amostra colhida na fase aguda
da doena j suficiente para fazer o diagnstico, desde que
afastada a possibilidade de reao falso-positiva pela presena
de fator reumatoide. Entretanto, importante salientar que,
algumas vezes, o IgM pode demorar 2 ou at 3 semanas para
positivar-se, sendo, por isso, recomendvel a repetio do
exame negativo se ele foi colhido mais precocemente. Uma
vez presentes, esses anticorpos permanecem na circulao por
algumas semanas e desaparecem, geralmente, aps 3 meses.
Nas infeces adquiridas, a deteco do CMV por meio
da PCR ou do isolamento viral na urina e outras secreces,
incluindo o smen, frequente. No entanto, essas tcnicas no
so utilizadas rotineiramente nesses casos, no s pela facilidade diagnstica oferecida pela sorologia, como tambm pela
presena, na populao geral, de excretores assintomticos do
CMV.

Diagnstico Laboratorial

Pacientes imunocomprometidos
O diagnstico de citomegalovirose no paciente imunocomprometido complicado pelo fato de que a grande parcela
deles - se no todos -, desde que sejam previamente soropositivos, iro apresentar, em alguma poca de sua evoluo, evidncias de infeco ativa (replicao viral), sem que haja, na
maioria das vezes, presena de doena clinicamente manifesta.
A infeco ativa pode ser identificada por sorologia, ou pelo
isolamento do vrus ou presena de antgenos ou DNA viral
em diferentes locais do organismo.
Desse modo, para atribuir ao CMV determinada manifestao clnica, fundamental demonstrar, direta ou indiretamente, a presena do vrus no local afetado, sendo a nica
exceo a retinite pelo CMV, por apresentar leses caractersticas que podem ser visualizadas por meio de exame de fundo
de olho. H vrias tcnicas que podem ser usadas para deteco do CMV nos tecidos, como o exame histopatolgico e o
exame imuno-histoqumico empregando anticorpos monoclonais anti-CMV, sendo esta ltima mais adequada por apresentar maior sensibilidade. A PCR no indicada com essa
finalidade porque seu valor preditivo positivo baixo, principalmente na vigncia de viremia pelo CMV.
Alm disso, importante salientar que o comportamento
do CMV diferente conforme a doena imunodepressora em
questo. Assim, enquanto a demonstrao do CMV no pulmo ou lavado broncoalveolar de um paciente submetido a
transplante de medula indica, com grande probabilidade, que
existe ou existir, em breve intervalo, pneumonite,so o mesmo
no acontece em pacientes portadores de AIDS.5152
Do mesmo modo, em alguns tipos de transplante de rgos
(p. ex., rim e fgado) importante diferenciar a infeco primria da reativao ou da reinfeco pelo CMV, j que no primeiro caso a probabilidade de adoecimento muito maior. 15
O mesmo no acontece em transplantes de medula, em que
essa diferena, em relao ao CMV, no tem a mesma impor" .
tanc1a.
Dentre as particularidades desse grupo de pacientes, destaca-se tambm o fato de que, ao contrrio do que ocorre no
paciente imunocompetente, no imunodeprimido a existncia
de IgM no significa obrigatoriamente infeco primria, j
que relativamente frequente observarem-se pacientes previamente soropositivos que, ao apresentarem reativao ou
reinfeco pelo CMV durante a doena imunodepressora,
positivam o IgM. 1653 Assim, a sua ocorrncia no pode ser
utilizada isoladamente para diferenciar a infeco primria da
reativao ou da reinfeco.
Embora a demonstrao direta ou indireta da presena do
vrus no rgo acometido seja o melhor meio de comprovar
laboratorialmente a participao do CMV naquele determinado quadro clnico, muitas vezes no se dispe de biopsias
para executar essa pesquisa. Uma alternativa para esses casos
a pesquisa do CMV no sangue, pois est demonstrado que
existe uma boa correlao entre viremia positiva, carga viral
elevada e doena invasiva pelo CMV. Essa correlao a base
do que atualmente denomina-se "vigilncia viral ps-transplante", na qual feito o monitoramento sistemtico da viremia pelo CMV no perodo ps-transplante, introduzindo-se,
dependendo do resultado, tratamento anti-CMV antes do incio dos sintomas (tratamento pr-sintomtico ou preemptive).
Hoje, existe um consenso de que a vigilncia viral em receptores de transplantes deve ser feita empregando-se uma das
tcnicas quantitativas disponveis, pois est bem estabelecido
que o risco de adoecimento maior quando a carga viral do

Captulo 4

Citomegalia

CMV no sangue maior.54 Dentre as tcnicas rpidas quantitativas utilizadas atualmente> encontram-se a pesquisa direta
do antgeno pp65 do CMV em neutrfilos circulantes (tcnica
da antigenemia) e a PCR em tempo real. Diversos estudos tm
mostrado uma boa correlao entre a PCR em tempo real e
a antigenemia pp65.293335 Contudo> valores de corte especficos para iniciar a teraputica pr-sintomtica devem ser
determinados de acordo com o teste utilizado (PCR em tempo
real ou antigenemia pp65) e tipo de transplante. Se possvel>
validado em cada centro por meio de estudos prospectivos>
j que a maioria dos centros de transplante utiliza tcnicas in
house no comerciais. A escolha de um ou outro mtodo vai
depender das facilidades encontradas nos diferentes centros
de transplante e da experincia da equipe com um ou outro
mtodo. Isso deve ser estabelecido prospectivamente> pois
ainda no est totalmente definido> em relao a cada subgrupo de doenas imunodepressoras> qual dessas tcnicas tem
o melhor valor preditivo para adoecimento.

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Captulo 5
Dengue

Antonio Walter Ferreira

Diagnstico laboratorial, 70
Bibliografia, 72

Diagnstico Laboratorial

70
A dengue (DEN) uma doena infecciosa provocada por
um vrus da famlia Flaviviridae, genoma de RNA, que apresenta quatro sorotipos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4)
e est relacionada no apenas com as condies sociais da
populao, mas tambm com os descuidos e desmandos no
armazenamento ou descarte de produtos que podem acumular gua. Pequenos volumes de gua so suficientes para
a multiplicao de larvas de mosquitos, Aedes albopictus e
Aedes aegypti, principais responsveis por sua transmisso.
A transmisso da doena pelo controle dos vetores meta
que est muito longe de ser atingida. Nenhuma iniciativa foi
capaz, ainda, de estabelecer o controle da doena visando
sua erradicao. Os objetivos no foram alcanados com
a utilizao de procedimentos simples, como a conscientizao da populao sobre guas paradas, nem por meio de
pesquisas complexas, como o uso da engenharia gentica na
modificao dos vetores.
A Organizao Mundial da Sade (OMS) estima que no
mundo ocorram aproximadamente 100 milhes de casos
anualmente, com cerca de 20.000 mortes, e que mais de dois
bilhes de pessoas transitem em reas de risco de contrair a
doena. Esses dados esto subestimados por falta de informaes concretas sobre a ocorrncia da doena em muitas
regies da frica e do Sudeste Asitico. Dados concretos
para as Amricas foram apresentados por Guzman, em 201 1,
ao comentar os casos notificados pela PAHO/OMS para o
perodo de 1980 a 2010. Em 1981, Cuba foi o pas responsvel pelo maior nmero de casos clnicos da doena, com
344.203 dos quase 400.000 casos que foram notificados na
regio. Durante o perodo de 1982 a 1997, o nmero total de
casos oscilou entre 300.000 e 400.000, sem destaque individual para nenhum pas. Essa oscilao, considerada normal,
mostrava que a transmisso vetorial estava parcialmente controlada com a conscientizao da populao para os riscos da
expanso da doena. Porm, a partir de 1998 tivemos uma
drstica mudana nesse quadro, com quase 800.000 casos
da doena, principalmente no Brasil, com 535.338 casos,
seguido da Colmbia, Venezuela e Mxico, com cerca de
50.000 casos cada um. Esses dados provocaram um alarme
geral e diferentes medidas sanitrias foram adotadas nos pases envolvidos, o que representou uma queda significativa do
nmero total de casos para patamares considerados dentro
da normalidade. Com a falta de cobrana efetiva das medidas implantadas, a doena recrudesceu em 2002, quando o
Brasil novamente liderou a lista de pases acometidos, com
780.644 dos mais de 1.000.000 dos casos notificados, seguido
da Colmbia, Venezuela e Honduras. Aps mais um perodo
de normalidade entre 2002 e 2007, vimos aumento significativo no nmero de casos, com destaque para o ano de 2009,
com 1.700.000 (Brasil, 528.883; Mxico, 165.748; Bolvia,
82.159; Colmbia, 71.079; Venezuela, 65.869; e Argentina,
26.612), e 2010, com quase 2.000.000 de casos, dos quais
1.004.392 ocorreram no Brasil. A maior incidncia de casos
no Brasil notificada no estado do Rio de Janeiro. Diante
desses nmeros, no h como negar o descaso dos governos
com os programas de controle da dengue. A vigilncia sanitria precisa estar sempre atenta aos criadouros dos mosquitos para elimin-los, mesmo que seja desgastante para os
governos implementar as aes que devem ser realizadas.
A apresentao grave da doena, a dengue hemorrgica
(DH), ocorre em mais de 100 pases, aumentando o risco de
bitos na populao atingida. No Quadro 5.1 apresentamos
dados da PAHO/OMS sobre a ocorrncia de bitos por dengue hemorrgica nas Amricas no perodo de 2001a2010.

Quadro S.1 Regies afetadas pela dengue, no perodo de 2001 a


201 O, nmero total de casos, poKentagem de dengue hemorrgica
e de bitos.
Regio

Total de casos

DH

bitos

Amrica do Norte
Amrica Central eMxico
Regio Andina

553
952.903
1.411.524

36.603 (3,8%)
74.909 (5,3%)

441 (1,2%)
599 (0,8%)

Cone Sul
Caribe

4.930.788
318.771
7.614.539

30.703 (0,6%)
5.160 (1,6%)
158.788(2,1%)

1.265 (4,1%)
493 (9,5%)
2.798 (1,8%)

Total
DH = denguehemorrgica.

Est demonstrado que o aumento da gravidade nos casos de


dengue est relacionado com o constante aumento da circulao dos quatro sorotipos do vrus em reas urbanas densamente
povoadas, que podem provocar dengue, dengue hemorrgica
e sndrome do choque (DC). Uma observao epidemiolgica
relacionada com o sorotipo responsvel pela infeco primria mostrou que sorotipos dos grupos 1 e 3 frequentemente se
relacionam com complicaes mais graves do que infeces
primrias provocadas por sorotipos dos grupos 2 e 4.
A patogenia da doena e sua evoluo para formas graves ainda
est longe de ser esclarecida, embora existam numerosos estudos
a respeito. Em geral, as infeces so assintomticas ou subclnicas
e provocam leves sintomas. Quando a doena se instala temos um
quadro clnico constitudo por febre alta, intensa dor de cabea,
dores musculares, dores articulares e rash cutneo. Em alguns
~sos, os pacientes podem apresentar petquias e trombocitopema. Uma porcentagem no definida, mas estimada, de pacientes
po~e evoluir para formas graves da doena, dengue hemorrgica
e s1ndrome do choque, na qual ocorre o comprometimento do
sistema hematolgico com falha na circulao sangunea.
Tambm ainda no dispomos comercialmente de vacinas
eficazes e medicamentos especficos que possam ser utilizados quando existe suspeita clnica da doena. No ano de 2012
foram avaliados, pelo menos, 12 produtos candidatos a base de
vacina. Expectativas otimistas esto relacionadas com os produtos desenvolvidos por Sanofi-Pasteur em colaborao com
uma universidade na Tailndia e GlaxoSmithKline, em colaborao com Walter Reed Army Institute, que se encontra em
fase mais adiantada do estudo. No Brasil, o Instituto Butant
est desenvolvendo uma vacina contra os quatro sorotipos do
vrus da dengue que se encontra na fase de pesquisa e desenvolvimento, sem previso para entrar em comercializao.
Normalmente o diagnstico da dengue se baseia em achados clnicos, epidemiolgicos ou laboratoriais, incluindo
exame hematolgico, dosagem de albumina, prova de funo
heptica e exame de urina para pesquisar a presena de hematria, sendo a febre, durante o surto epidmico, a informao
clnica mais relevante a ser considerada. A prova do lao, para
verificar a formao de petquias, amplamente utilizada
durante os surtos epidmicos, embora no seja especfica.

. .,. Diagnstico laboratorial


O diagi:stico laboratorial da dengue complexo e exige
metodologia capaz de diferenciar as fases clnicas da doena,
principalmente a infeco primria, de curta durao e difcil
de ser diagnosticada clinicamente.

Captulo 5

Dengue

71

Assim, os mtodos de laboratrio devem ser padronizados


para realizar o diagnstico da infeco primria durante a fase de
viremia (microbiolgico - isolamento do vrus; biologia molecular - reao em cadeia da polimerase [PCR] e PCR em tempo real
[RT-PCR]; e imunolgicos - pesquisa de componentes antignicos do vrus) e confirmar a infeco viral e, durante a fase secundria, para pesquisar anticorpos IgM e IgG contra sorotipos do
vrus. O aumento do ttulo de anticorpos IgG entre duas coletas
de sangue, avaliado por teste imunoenzimtico - ELISA, inibio
da hemaglutinao ou neutralizao, confirma infeco anterior
pelo vrus. Como espcimes clnicos podem ser utilizados sangue total, ideal para inquritos soroepidemiolgicos e para testes
rpidos, soro, plasma e fragmentos de rgos colhidos post mortem para isolamento e identificao do vrus e seu sorotipo.
A Figura 5.1 mostra a evoluo da infeco primria desde
o perodo febril at a presena de anticorpos IgG em altos ttulos que permanecem positivos por muitos anos como memria da infeco viral. Nessa fase, mtodos de biologia molecular tm sido padronizados para a pesquisa do DNA viral e
comparados com mtodos imunolgicos para a pesquisa da
protena no estrutural NSl e/ou para outros componentes
antignicos do vrus. Embora demande custos mais elevados,
o mtodo de PCR em tempo real tem apresentado resultados
promissores, mas ainda no instaura nenhuma perspectiva de
termos no mercado um produto para ser comercializado. A
presena de anticorpos IgM em uma nica amostra de soro do
paciente confirma a infeco na fase inicial da doena, mas sua
deteco ocorre apenas aps o incio da doena.
Em 201 O, Peeling et al. publicaram uma excelente avaliao
dos diferentes testes utilizados para o diagnstico da dengue.
Inicialmente, apresentaram os requisitos para um teste ideal
levando em considerao as necessidades para o diagnstico
precoce, surtos epidmicos, inquritos soroepidemiolgicos e
avaliao da eficcia vacinal. Os requisitos apresentados pelos
autores no diferem dos requisitos necessrios para o diagnstico de qualquer processo infeccioso, seja de origem viral, bacteriana, fngica ou parasitolgica. No caso especfico da dengue,
os testes devem ser padronizados para o diagnstico durante
o perodo febril da doena, como j dito anteriormente. Um
Outros
antgenos
do vrus
Presena da
protena NS1
T (C)

Presena de
DNA

+
.---.. Isolamento

39,5 !===---~~
39,0
38,5
38,0

do vrus

'\
\,

37,5
37,0
-4 -3 -2 -1

Dias de febre
temperatura
vrus na circulao

anticorpos lgM
anticorpos lgG

Figura 5.1 Marcadores imunolgicos, moleculares e microbiolgicos


da infeco por dengue durante o perodo febril. Adaptada de Vaughn
et ai., 1997.

aspecto interessante que deve ser lembrado durante o perodo


febril, em reas endmicas da doena, a possibilidade de isolar
o vrus para identificar o sorotipo que est circulando.
Nessa fase, os testes devero ser muito sensveis e capazes de
diferenciar as infeces por vrus da dengue de outros processos
infecciosos com quadro clnico semelhante. Alm disso, os testes
devero ser de fcil execuo, para serem realizados em diferentes locais de reas rurais ou urbanas, onde muitas vezes a infraestrutura fsica precria e os recursos humanos so limitados.
O isolamento do vrus para a caracterizao dos sorotipos
requer condies especiais de infraestrutura fsica e humana.
Para a cultura do vrus da dengue normalmente so utilizadas
clulas de mosquitos ou clulas de linhagem contnua, VERO
ou LLCMK2, com sangue total, soro ou plasma como material
biolgico. Normalmente, os sorotipos so assim identificados:
por meio de anticorpos monoclonais especficos para os diferentes sorotipos marcados com isotiocianato de fluorescena para a
imunofluorescncia direta e por meio de anticorpos anti-imunoglobulinas de camundongos marcados com isotiocianato de fluorescena para a imunofluorescncia indireta. A caracterizao dos
sorotipos por biologia molecular tem apresentado bons resultados
quando a RT-PCR utilizada, pois essa tcnica permite, alm da
quantificao da carga viral, o processamento de grande nmero
de amostras simultaneamente. Resultados falso-positivos, a falta
de padronizao e industrializao de um reagente definitivo e a
ausncia de registro do produto nos rgos competentes de sade
de cada pas limitam o uso dessa tcnica para produtos feitos in
house em laboratrios especializados em virologia.
Os mtodos imunolgicos para a deteco de componentes
antignicos do vrus so padronizados para serem utilizados
na fase precoce da infeco. Um antgeno-alvo interessante que
est sendo exaustivamente estudado a protena no estrutural NS 1, que se apresenta em altas concentraes no soro de
pacientes durante a fase primria da infeco. O tempo de clareamento desse antgeno varivel, sendo em mdia de 9 dias aps
o incio da doena. Anticorpos monoclonais contra o antgeno
NS 1 foram produzidos e esto sendo usados em testes rpidos
imunocromatogrficos e em testes imunoenzimticos. A protena
NS 1 est presente nos quatro sorotipos do vrus e sua deteco
no permite a diferenciao do tipo de vrus que est circulando
e causando a doena. A possibilidade de falsos resultados negativos pode ocorrer quando a protena NSl est complexada com
anticorpos. Esse fato pode ocorrer, principalmente, no incio da
fase secundria da doena e pode ser evitado pelo tratamento dos
soros com substncias qumicas que dissociam o complexo.
O diagnstico sorolgico da dengue fundamenta-se na pesquisa de anticorpos IgM e IgG contra componentes antignicos
do vrus. Durante a fase primria da infeco, anticorpos IgM
so detectados aps o incio dos sintomas e permanecem elevados at o quinto dia da doena, quando comeam a declinar.
Na fase secundria da doena os anticorpos IgM so detectados
em baixos ttulos sem apresentarem valor clnico a no ser que
se elevem significativamente, o que pode estar relacionado com
uma nova infeco provocada por outro sorotipo do vrus.
Anticorpos IgG antivrus da dengue esto presentes em altos
ttulos na fase secundria da doena, o que confere ao paciente uma
certa proteo se tiver novo contato com vrus do mesmo sorotipo.
Reaes inespecficas, com falsos resultados positivos, esto presentes entre os quatro sorotipos e outras flaviviroses. A importncia
clnica da pesquisa de anticorpos IgG est relacionada com inquritos soroepidemiolgicos, com o diagnstico da infeco (quando
se observa o aumento significativo de ttulos entre duas coletas de
sangue do mesmo paciente) e com a avaliao da eficcia vacinal.
Os testes que esto disponveis comercialmente no Brasil so
os ensaios imunoenzimticos do tipo ELISA e os testes rpidos

Diagnstico Laboratorial

72
Quadro S.2 Produtos disponveis no Brasil, tempo necessrio para a realizao, prindpio da tcnica e fabricante.
Produto

Tempo{min)

Princpio

Fabricante

Kit Platelia Dengue NS1 Ag


Kit Dengue NS1 Ag Strip (Teste Rpido)

120

Deteco qualitativa ou semiquantitativa do antgeno NS1 por ELISA

Bio-Rad Laboratories lnc. - Frana

15

Deteco qualitativa do antgeno NS1 do vrus da dengue no soro ou plasma


humano por imunocromatografia de fluxo lateral

Bio-Rad Laboratories lnc. - Frana

Simplexatm Dengue kit

60

PCR em tempo real para reao multiplex desenvolvido edestinado deteco


qualitativa ediferenciao in vitro dos sorotipos dos vrus DENV 1, 2, 3e4

Focus Diagnostisc lnc. - EUA

Dengue lgG lgM Teste rpido

15

lmunocromatografia para deteco da infeco pelo vrus da dengue


diferenciando as infeces primria esecundria

PanBio

Dengue lgG Indireto

130

Mtodo ELISA para deteco dos sorotipos DENV 1, 2, 3e4. Faz adistino
entre as infeces primria esecundria

PanBio

Dengue lgM Captura

130

PanBio

Dengue NS1

130

Dengue NS1 - Teste Rpido

15

Mtodo ELISA para deteco de anticorpos lgM. Detecta os sorotipos DENV 1, 2, 3e4
Mtodo ELISA para deteco qualitativa do antgeno NS1 da dengue. Auxilia
no diagnstico precoce das infeces primria e secundria
Ensaio imunocromatogrfico para deteco qualitativa de antgeno NS1

Dengue Duo Dengue NS1 + Ac Combo

20

Mtodo de imunocromatografia de passo nico para deteco qualitativa e


diferencial do antgeno NS1 eanticorpos lgG e lgM

Dengue NS1 Ag

20

Mtodo de imunocromatografia de passo nico para deteco qualitativa do


antgeno NS1

SD Bioline

Dengue lgG/lgM Sangue Total

20

Mtodo de imunocromatografia em fase slida para diagnstico in vitro, para


deteco qualitativa ediferencial de anticorpos lgG e lgM contra ovrus da
dengue, sorotipos DEN-1, 2, 3e4

SD Bioline

SD Dengue NS1 Ag ELISA

130

Mtodo imunoenzimtico para deteco qualitativa do antgeno NS1

SD Bioline

Dengue lgG/lgM ABON

10

Mtodo de imunocromatografia para deteco de anticorpos lgM e lgG nas


infeces primria e secundria

Abon

Dengue Duo Test Bioeasy

20

Mtodo de imunocromatografia para deteco do antgeno NS1 eanticorpos


lgM e lgG nas infeces primriaesecundria

Bioeasy Diagnstica Ltda.

Pathozyme Dengue lgM Captura (ELISA)

130

Mtodo imunoenzimtico para deteco de anticorpos lgM

Omega Diagnostics Ltd.

Visitect Dengue

20

Mtodo de imunocromatografia qualitativo rpido para a deteco simultnea


de anticorpos lgM elgG para todos os quatro sorotipos do vrus da dengue

Omega Diagnostics Ltd.

Dengue lgG/lgM Teste Biocon

15

Teste rpido qualitativo para deteco diferencial de anticorpos lgG elgM


contra os 4 sorotipos do vrus da dengue (DEN1, DEN2, DEN3, DEN4)

Biocon

imunocromatogrficos, devidamente registrados na Anvisa para


serem utilizados no diagnstico de casos suspeitos e monitoramento de pacientes. A soroconverso ou o aumento de ttulos
entre duas coletas confirmam a infeco. Um fator que dificulta
esse aspecto do diagnstico a coleta de duas amostras de sangue
do mesmo paciente. Por diversos motivos, geralmente o paciente
no retorna aos servios para a segunda coleta de sangue, principalmente se as reas em estudo forem de poucos recursos sociais.
Um formato interessante de teste baseia-se na deteco
simultnea de antgeno (NSl) e anticorpos IgM e IgG. Vrias
empresas de biotecnologia tm explorado esse modelo visando
ao diagnstico precoce da doena. Os reagentes disponveis
apresentam bons ndices de sensibilidade, especificidade e,
principalmente, reprodutibilidade entre sucessivos lotes.
Os testes imunocromatogrficos rpidos tm sido padroni~dos
para serem utilizados com diferentes amostras biolgicas, como
sangue total, soro e plasma No existem estudos do uso de amostras
de sangue colhidas em papel de filtro com reagentes comerciais.
Como limitaes dos testes rpidos, destacamos: o custo
por teste maior do que o dos testes convencionais; os resultados so qualitativos; a leitura subjetiva, levando a um grande
nmero de resultados inconclusivos; no so recomendveis
para grandes rotinas; h persistncia de reao positiva em
amostras de sangue de um nmero no determinado at o
momento, alm do perodo estimado na literatura mdica.
Estudos comparativos de testes rpidos com RT-PCR ou
cultura do vrus mostraram sensibilidade de 93% e especificidade de 98%. Comparado com o teste de hemaglutinao
indireta, apresentou sensibilidade de 99,5% e especificidade de

PanBio
PanBio
SD Bioline

95%. Em relao ao teste imunoenzimtico, ELISA, para a pesquisa de IgG, IgM e NSl, a concordncia de resultados ficou
prxima a 99% de sensibilidade e 98,5% de especificidade.
No Quadro 5.2 apresentamos produtos disponveis no mercado
brasileiro e devidamente registrados na Anvisa. Os produtos da BioRad so distribudos por Bio-Rad Laboratrios Brasil Ltda, com
preo mdio por teste de U$ 3 para o kit Platelia e U$ 6 para o reagente imunocromatogrfico. Os produtos da FOCUS Diagnostics
e da PANBIO so distribudos por Bio-Rad Laboratrios Brasil
Ltda. com preos variveis entre U$ 3 e U$ 7 por teste.

. .,. Bibliografia
Adams P. Dengue: neglected no more. TropIKA Blog Portal Tropical Diseases
Research to Foster lnnovation & Knowledge Application, 2011. Disponvel
no site oficial da Anvisa: http://-anvisa.gov.br.
Guzman MG et al. Dengue in American region. An update. Disponvel no site
TropIKA.net- Tropical Diseases Research to Foster lnnovation & Knowledge Application: http://www.tropik.a.net.
Guzman MG, Jaenisch T, Gaczkowski R et al. Multicountry evaluation of the
sensitivity and specificity of two commercially-available NS 1 ELISA assays
for dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis Aug 312010;4(8).
1 International Symposium on Dengue FMUSP: Changes in Epidemiology
and Challenges in Diagnosis and Prevention. Rev lnst Med Trop S Paulo
August 2012; 4(suppl. 18).
Peeling RW, Artsob H, Pelegrino JL et al. Evaluation of diagnostic tests: dengue.
Nat Rev Microbiol Dec 8 2010; (12 Suppl):S30-8.
Vaughn et al. Dengue in the early febrile phase: viremia and antibody responses.
J InfectDis 1997; 176:322-30.
WHO/TDR. Dengue guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. New edition. Geneva: WHO Press, 2009.

Captulo 6
Hepatites Virais

Angela Maria Egydio de Carvalho Barreto,


Joo Renato Rebello Pinho e
Ester Cerdeira Sabino
Hepatite A, 74
Hepatite B, 76
Hepatite C, 82
Hepatite delta, 87
Vrus da hepatite E, 89
Hepatites no A, no B, no C, no D, no E
(no A-E), 91
Sumrio do diagnstico laboratorial das
hepatites virais, 92
Referncias bibliogrficas, 94

74
As hepatites virais constituem uma das principais preocupaes de sade no mundo, com maior incidncia nos pases
em desenvolvimento do que nos desenvolvidos. Embora seja
uma doena antiga, foi classificada apenas no sculo 20 como
"hepatite infecciosa" ou "hepatite sric: 1 com base em vrios
estudos epidemiolgicos. Essas duas formas de hepatite foram
distinguidas de acordo com o seu modo de transmisso, ou
seja, oro-fecal a tipo A e parenteral a tipo B, respectivamente.
Em 1963, Blumberg, analisando o sangue de um aborgene
australiano, encontrou uma partcula que foi denominada de
antgeno Austrlia (AU), e posteriormente ela foi relacionada
com a hepatite B.1 A etiologia virai da hepatite B foi estabelecida por meio de estudos com microscopia eletrnica por
Dane em 1970, e essa partcula passou a se chamar partcula
de Dane,2 que corresponde partcula virai completa do vrus
da hepatite B (HBV). Entre as hepatites virais humanas, a causada pelo HBV foi a primeira a ter o genoma de seu agente
causal identificado e caracterizado.
Essas descobertas possibilitaram o desenvolvimento de
testes sorolgicos para a pesquisa do vrus, e, com isso, na
dcada 1970 foi introduzido na triagem sorolgica de doadores de sangue um teste para detectar o antgeno de superfcie
do HBV (HBsAg). Com essa medida, houve diminuio das
hepatites ps-transfusionais (HPT), que antes ocorriam em
at 20% dos casos. 1 Com o aumento da sensibilidade dos testes de radioimunoensaio (RIA) e imunoenzimticos (ELISA)
para deteco do AgHBs, os casos de hepatite B foram drasticamente reduzidos, embora ainda continuassem a ocorrer em
pequena proporo. Durante duas dcadas, todas as hepatites
que no puderam ser identificadas pela utilizao dos marcadores sorolgicos das hepatites A e B passaram a ser rotuladas
de hepatites ps-transfusionais no A no B. Em 1989, Choo
et al. 3 descobriram o vrus da hepatite C (HCV) que pode ser
associado maioria dos casos ps-transfusionais de hepatite
no A no B, os quais passaram a ser muito raros. Outros
agentes, tais como o vrus da hepatite G (HGV) e o vrus TT,
foram descobertos, porm nenhum que pudesse ser associado
de modo definitivo hepatite.

..., Hepatite A
Caractersticas e constituio genmica
do vrus da hepatite A
O vrus da hepatite A (HAV) foi identificado, pelo mtodo
de imunoeletromicroscopia (Figura 6.1),4 em 1973 por
Feinstone et al. nas fezes de indivduos infectados experimentalmente, e sua propagao em cultura de clulas foi feita, com
sucesso, em 1979.5
O agente etiolgico da hepatite A foi inicialmente classificado como enterovrus, e em 1991 foi subclassificado em
seu prprio e nico gnero: Hepatovirus. Pertence famlia
Picornaviridae.,6 e at o momento foi identificado somente um
sorotipo do HAV humano. As cepas isoladas do HAV possibilitaram classific-lo em sete gentipos que diferem de 15 a
25% em sua homologia. Entre eles, quatro gentipos infectam
o ser humano (I, II, III e VII), sendo os mais prevalentes o I
e o III,7 e trs infectam naturalmente primatas no humanos
(IV, V e VI). A caracterizao dos gentipos pode ser utilizada
para rastrear a transmisso da infeco.
A partcula virai pequena, esfrica, com simetria icosadrica, de dimetro entre 27 e 32 nm, no envelopada, e consiste

Diagnstico Laboratorial

Figura 6.1 Microscopia eletrnica do HAV isolado em fezes humanas.

em somente dois componentes, a protena do capsdio e o RNA


virai (Figura 6.2). O genoma constitudo por uma molcula
de RNA positivo, fita simples, linear, de aproximadamente
7,5 kilobases (kb) de comprimento, com uma fase de leitura
aberta que codifica uma poliprotena de 250 kilodltons (kDa).
O genoma do HAV consiste em uma regio no codificadora na extremidade 5' (NCR) de 732 a 740 nucleotdios,
que est ligada covalentemente protena VPg. Nessa regio
podem ser encontradas as seis principais estruturas secundrias dominantes.9 A regio NCR na extremidade 3' tem 40 a
80 nucleotdios ligados a uma cauda poli A. A regio codificante do genoma virai composta de uma fase de leitura
aberta (ORF) que traduzida em uma poliprotena (PO) de
2.227 aminocidos, que, por meio de clivagem por protelise
se transforma na protena virai madura. Essa regio dividida
em Pl, que compreende as protenas do capsdio IA (VP4),
lB (VP2), lC (VP3) e l D (VPl) e em regies P2 e P3, que
englobam as protenas no estruturais (2A, 2B, 2C e 3A, 3B
e 3C), reguladoras da expresso gnica e que so necessrias
para a replicao virai (Figura 6.3).9
Dentro do citoplasma inicia-se a montagem do vrion pela
associao das protenas estruturais VPO (formado pelo VP2
e pelo VP4), VPl e VP3, que formam um complexo iniciador
com coeficiente de sedimentao 5S. A unio dessas estruturas
forma um pentmero de 14S, 70S (capsdio completo) e 140S
(partcula completa). Depois dessa fase h formao de anticorpos neutralizantes contra os principais epitopos conformacionais das protenas estruturais. 10
Em animais de experimentao, vrus vazios (partculas de
14S e 70S) mostraram-se antignicos, induzindo a formao
de anticorpos neutralizadores, e eficazes quando usados em
testes imunoenzimticos para diagnstico da infeco. O uso
desses antgenos parece ser promissor na produo de vacinas
e testes imunoenzimticos com protenas recombinantes. 11

Capsdio - - - + . .

ssRNA ----T----::;r--(7.478 bases)

27nm

VPg

Figura 6.2 Representao esquemtica do HAV.8

Captulo 6

Hepatites Virais

75

RNAdo HAV

5'
VPg

Evoluo clnica
3'

>----Regio aberta para leitura--__,

Translao

No codificante

AAA

No codificante

Polipeptdio do HAV
Estrutural

No estrutural

NH 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ._ cooH
P1
P2
P3

..

Protenas

_ vP4
. . VP2
-

VP3
VP1

2A
- 2s

3A (pr-VPg)
38 (VPg)
___ c
3C (protease)
2
30 (RNA polimerase)

Figura 6.3 Esquema do RNA do HAVe as suas principais protenas. 10

A hepatite A tem um perodo de incubao de aproximadamente 15 a 45 dias. A infeco pode ocorrer de maneira
espordica, endmica ou epidmica. A maneira espordica
pode ocorrer em crianas e adultos; no caso da epidmica, em
regies de maior prevalncia, as crianas so as mais atingidas,
e nas regies de menor prevalnca, as infeces predominam
em jovens e adultos. A infeco pode ser assintomtica ou sintomtica, ictrica ou anictrica. Quando surgem os sintomas,
so indistinguveis dos outros tipos de hepatites, com exceo da diarreia que ocorre na fase aguda em 60% das crianas e 20% dos adultos. O vrus excretado nas fezes, no final
do perodo de incubao e na primeira semana da doena,
alcanando uma concentrao de 108 partculas infecciosas
por mf .15 Essas partculas permanecem viveis nas fezes por
30 dias depois de secas e aps congelamento.13
O HAV relativamente resistente ao calor, ter ou cido.
inativado pela fervura (20 min), pela formalina (1: 4.000 a
37C por 72 h) por micro-ondas, pela utilizao de cloro (1
ppm por 30 min) e pela radiao ultravioleta.8

Transmisso

Epidemiologia

Aps ingesto do HAV, supe-se que ele seja conduzido


atravs do epitlio intestinal por um processo de transporte
vetorial ainda no bem conhecido. O fgado somente um
rgo-alvo de leso e a replicao genmica ocorre no
citoplasma do hepatcito por um mecanismo que envolve
uma RNA polimerase RNA-dependente. Do fgado o HAV
transportado atravs dos duetos biliares para o intestino
e, por ser resistente inativao pelas enzimas proteolticas, biliares e intestinais, alcana as fezes facilitando a
transmisso oro-fecal. Essa a principal via de transmisso e ocorre pela gua e por alimentos contaminados por
fezes de indivduos infectados pelo vrus. Essa via acomete
normalmente crianas que desenvolvem a doena no tipo
subclnico, sendo por esse motivo os principais reservatrios desse agente. A transmisso do vrus mais comum
quando h contato ntimo e prolongado de doentes com
indivduos suscetveis infeco. Os adultos, na maioria
das vezes, podem adquirir a doena quando em contato
com crianas infectadas em regies nas quais h falta de
infraestrutura, com comprometimento do saneamento
bsico e, consequentemente, da higiene. Com a melhoria
da infraestrutura, diminui a contaminao infantil, e o
perfil da infeco passa a ser deslocado para indivduos
de outras faixas etrias, nos quais a doena sintomtica.
A transmisso sangunea rara, pois o doador deve estar
na fase virmica prodrmica da infeco ao doar sangue. 8
Pode ocorrer a transmisso em hemoflicos que receberam
fator VIII, pois o processo de inativao com detergentes e solventes no atua por completo no vrus. 12 Como a
VO a principal fonte de infeco e o vrus resistente ao
pH cido para sobreviver no trato gastrintestinal, o tratamento das verduras com cido actico (vinagre) no elimina o vrus. 13 A vacinao contra o HAV, paralelamente
a melhores condies de higiene, pode prevenir e impedir sua disseminao. Aos viajantes para reas de grande
endemicidade, recomendam-se medidas gerais de higiene
tais como higienizao das mos, cuidados com gua,
gelo, frutas, verduras cruas e mariscos inadequadamente
cozidos, 14 alm da vacinao especfica, a melhor maneira
de se prevenir a doena.

O HAV encontrado mundialmente, e a prevalncia da


infeco est diminuindo em pases com alto padro de higiene.8 Em reas urbanas de pases com boas condies sanitrias, apenas 30% dos adultos tm anticorpos IgG contra
HAV; j em pases subdesenvolvidos, 90% das crianas com
aproximadamente 1O anos apresentam imunidade. Segundo a
Organizao Pan-Americana da Sade (OPAS), a estimativa de
infeco pelo HAV no Brasil de aproximadamente 130 casos
novos por 100.000 habitantes ao ano. 16 Com a melhoria das
condies sanitrias no Brasil, o nmero de crianas suscetveis tem aumentado entre todas classes sociais. Essa mudana
no padro epidemiolgico da hepatite A acontece tambm
em vrias regies do mundo, o que tem levantado a discusso sobre a vacinao em adolescentes e adultos jovens, j que
clinicamente essa hepatite branda em crianas e grave e prolongada em adultos.10

Diagnstico
O HAV induz respostas imunes humoral (anticorpos)
e celular, ambas importantes nos mecanismos de defesa. 17
Ensaios sorolgicos comerciais esto disponveis para o diagnstico da infeco pelo HAV. Esse diagnstico realizado
pela pesquisa de anticorpos especficos anti-HAV IgM (infeco aguda) e anti-HAV IgG (infeco corrente ou passada) em
soro ou plasma humano. Os testes mais utilizados so os imunoenzimticos (ELISA), de micropartculas (MEIA), imunofl.uorescentes (ELFA) e os quimioluminescentes.
No incio da infeco os pacientes so reagentes para anticorpos IgM anti-HAV e permanecem positivos por cerca de
4 meses, portanto, na fase aguda, a presena de IgM especfica para HAV confirma o diagnstico. Os anticorpos IgG
anti-HAV so detectados tambm no incio da infeco,
assim como aps imunizao, e permanecem por toda a vida
(Figura 6.4).
Os kits disponveis detectam anticorpos totais anti-HAV
(IgG e IgM), portanto resultados positivos para esse kit e negativos para IgM anti-HAV significam infeco passada ouresposta vacinal. Ausncia de qualquer tipo de anticorpos antiHAV indica suscetibilidade infeco. 8

Diagnstico Laboratorial

76
Durao

-~

Aguda
Incubao recente
(15-45 dias) (0-14 dias)

-c~o

1'4

CO

~
e

Recuperao e
longa imunidade
1
(anos)

Convalescena
(3-6 meses)

lsintomasl

<>
Q)

l 1gG Anti-HAV

~~@!&f[,]a. [:i 1u!i1.!ij@t. ttJ

HAVAg

lgM Anti-HAV

Marcador de imunidade

Figura 6.4 Marcadores da infeco pelo HAV.

Preveno
A preveno da hepatite A depende de cuidados gerais de
higiene e de imunoprofilaxias passiva e/ou ativa. A profilaxia
passiva feita com injeo intramuscular de gamaglobulina
A, antes da exposio, que evita 85 a 95% dos casos, ou at
2 semanas aps a exposio, para prevenir ou atenuar a infeco. A imunoprofilaxia ativa feita com a utilizao de vacina
produzida com vrus inativado pela formalina. Atualmente, j
existe uma vacina que associa os antgenos virais dos vrus A
e B com eficcia comprovada. 11 A vacina da hepatite A uma
das mais imunognicas e de excelente eficcia em profilaxia
pr-exposio. A vacinao tem sido utilizada em surtos epidmicos e na preveno de casos secundrios. A implementao dessa vacina em crianas e adolescentes parece ser o
meio mais eficaz de controle da infeco, principalmente em
regies nas quais os surtos recorrentes representam um grave
problema de sade pblica.

. .,. Hepatite B
A hepatite B uma das doenas infecciosas mais prevalentes no mundo. Estima-se que 2 bilhes de pessoas tenham
sido infectadas pelo vrus da hepatite B (HBV) e mais do que
350 milhes tenham infeces hepticas crnicas a longo
prazo. Cerca de 1 milho de pessoas morrem de doena heptica crnica, incluindo cirrose e cncer. 18
A infeco pelo HBV ficou conhecida por resultar em uma
doena aguda e crnica do fgado e, por volta de 1970, esse
vrus foi considerado como a possvel causa do cncer heptico. classificado dentro da famlia Hepadnaviridae e esse
nome se deve ao HBV ser hepatotrpico e ter um genoma
constitudo por DNA. 19 Os membros dessa famlia no so
citotxicos e as infeces aguda e crnica do HBV so resultantes do mecanismo de defesa do hospedeiro contra o vrus,
resultando na morte das clulas que expressam as protenas
do HBV. Muitos pacientes com hepatite crnica recuperam-se
espontaneamente, enquanto outros desenvolvem doena
heptica grave e progressiva. Outros ainda adquirem a doena
de maneira silenciosa, que pode ou no progredir lentamente.

ximadamente 3.200 pares de bases (Figura 6.5). O capsdio


icosadrico, envelopado por dupla camada lipdica na qual
esto ancoradas as trs diferentes protenas de superfcie.21
Alm disso, apresenta partculas esfricas e cilndricas de 22
nm de dimetro, constitudas apenas pelo envelope viral. A
cadeia mais longa (negativa) completa e a menor (positiva),
incompleta.
O HBV pequeno e apresenta quatro cadeias de leitura
aberta (ORF, open reading frames) codificadas pelos genes S
(superfcie), P (polimerase), C (core) e X. O gene S constitudo
por trs regies: pr-SI ou p39, pr-S2 ou p33, S ou p25, que
codificam a principal protena do invlucro do vrus (HBsAg).
As protenas L (large) e M (medium) contm os antgenos correspondentes s regies pr-S 1 e pr-S2 do genoma viral, alm
de compartilharem as regies antignicas do S (small). O gene
C codifica duas protenas: na regio pr-C/C uma protena
solvel, antgeno e (HBeAg), e na regio C a protena do nucleocapsdio (core) (HBcAg). O gene P codifica enzimas essenciais
para replicao viral, como a DNA polimerase e a RNase H.
A funo da regio X ainda desconhecida (Figura 6.6). A
partcula viral completa denominada partcula de Dane, que
o tipo infectante encontrado no plasma (Figura 6.7A).2 As
formas circulares e tubulares produzidas durante a replicao
viral so constitudas apenas de HBsAg e no so infectantes,
j que no tm outros componentes genticos (Figura 6.7B).
HBsAg

HBcAg

~.,...:....-DNA

Polimerase
Dup1a fita --->..:=:t1-----,
DNA

HBeAg

Caractersticas e constituio genmica do HVB


O HBV uma partcula esfrica de 42 nm de dimetro, envelopado, que apresenta em seu interior um genoma constitudo
por DNA circular, fita dupla parcial e fita dupla simples, que
replica por intermdio de um RNA intermedirio,20 com apro-

Parcial fita dupla de


DNA em forma circular
Um membro da famlia Hepadnaviridae

Figura 6.5 Representao esquemtica do HBV.2

Captulo 6

Hepatites Virais

77

Subtipos do HBsAg

Eco RI
3221, 1

DR1

DR2

DNA
pol imerase

Logo aps a descoberta do HBsAg, a heterogeneidade


sorolgica tornou-se aparente. Os quatro principais determinantes antignicos do HBsAg podem ser distinguidos pelos
anticorpos que reconhecem os diferentes epitopos das partculas formadas pelo HBsAg (SHBs). Todos os subtipos conhecidos contm o determinante ": uma sequncia peptdica do
HBV localizada entre os resduos de aminocidos 121 a 149
(Figura 6.8). A diferena entre os determinantes subtipo-especficos d/y e w/r gerada pela troca de aminocidos dos resduos 122 e 160 de K a R, respectivamente. Subdeterminantes
adicionais possibilitaram a diferenciao de quatro sorotipos
de ayw e dois de adw e foram estabelecidos oitos sorotipos
(adr, ayr, aywl, ayw2, ayw3, ayw4, adw2 e adw4) presentes nos
vrios gentipos do HBV.22

Ciclo de replicao virai

HBcAg

A via de entrada nas pessoas suscetveis, aps exposio


ao vrus, a corrente sangunea, por onde ele atinge o fgado,
primeiro stio de replicao do HBV. No h nenhuma evidncia de replicao na superfcie da mucosa. 19 A replicao viral
ocorre no citoplasma da clula, onde o RNA pr-genmico
se associa ao HBcAg e polimerase do HBV para formar a
partcula do nucleocapsdio.23 O HBV, depois de se ligar no
hepatcito e penetrar as clulas por intermdio da endocitose,
perde seu envoltrio e o seu DNA genmico entra no ncleo
da clula. A cadeia pequena completada pelo DNA endgeno e a cadeia longa covalentemente fechada para a rcDNA
(DNA circular relaxed) que posteriormente convertida para

HBeAg

Figura 6.6 Genoma do HBV. 20

D
(Soma)

E,F,H

T/N
~

P/LT

S/TM
/

Vrus

pr-S1
Filamentos

LHBs

1----SHBs

A,F,H

F/Y
A,B,F,H 161

B
17-25 nm

Figura 6.7 A. HBV: partcula de Dane (1 ); esfricas (2); filamentosas ou


tubulares (3). B. Diagrama esquemtico das partculas do HBV.31

Figura 6.8 Modelo hipottico do determinante "a".22 O determinante


"a" formado pela menor protena de superfcie do HBV. Resduos de
aminocidos conservados so mostrados em preto e os no conservados em cinza. Se os resduos estiverem variando especificamente
no subtipo o gentipo indicado em negrito ao lado do aminocido.
A posio G145, frequentemente descrita como variante de escape,
representada no crculo e semicrculos brancos (R). Resduos 122 e 160,
os quais conferem mudanas nos subtipos d/y e w/r, respectivamente.
A figura est baseada no alinhamento de sequncias de 166 HBs traduzidas a partir de 166 HBV tipo selvagem dos genomas do "GenBank'~

78

Diagnstico Laboratorial

cccDNA (covalently closed circular DNA, ou seja, DNA circular covalentemente fechado), as quais representam as formas
replicativas do DNA HBV.24
O cccDNA, junto com as histonas celulares e outras protenas nucleares, forma minicromossomos no integrados que
servem como molde para a transcrio dos genes virais. O
RNA pr-genmico, alm de ser traduzido nas protenas do
nucleocapsdio e na DNA polimerase, encapsulado e transcrito reversamente para formar o DNA genmico. Uma peculiaridade do ciclo de vida desse vrus que os nucleocapsdios
recm-formados podem voltar para o ncleo para amplificar
e manter o pool de cccDNA ou serem envelopados e secretados para o sangue, onde novas partculas virais podem
infectar outros hepatcitos.25 Durante a infeco, o cccDNA
se acumula no ncleo das clulas, em mdia de 5 a 50 cpias
por clula. Como o cccDNA um molde transcricional da
infeco pelo HBV, tem papel primordial na persistncia viral,
tanto na reativao da replicao aps o trmino da terapia
antivira! como na falha teraputica. 26
O HBV no diretamente citoptico, as leses hepticas
que aparecem durante a infeco crnica em geral so atribudas resposta imunolgica do hospedeiro, pois tanto os componentes celulares quanto humorais so necessrios para a
eliminao do vrus, principalmente a ao de linfcitos T
citotxicos (CDS+) dirigidos contra os antgenos do core.27

Marcadores virais
Os antgenos que compem o HBV, assim como seus respectivos anticorpos produzidos durante o curso da infeco,
so conhecidos como marcadores do HBV e auxiliam na
compreenso da evoluo da infeco. O HBsAg o primeiro
marcador a aparecer e detectado de 35 a 45 dias aps a infeco. Na parte central do vrus encontra-se o HBcAg e dentro dele o DNA e a enzima DNA polimerase. O HBcAg no
detectado livre no soro. O anticorpo IgM anti-HBc aparece na
fase aguda da infeco, caracterizando, portanto, indivduos
recentemente infectados. O anticorpo IgG anti-HBc aparece
em seguida ao IgM e pode permanecer por toda a vida.28
O HBeAg secretado pelo antgeno do core uma protena
solvel no estrutural que exportada para circulao perifrica
aps o processo de traduo e est associada replicao viral.
Pode ser detectado logo aps o aparecimento do HBsAg. O anticorpo contra o HBe (anti-HBe) produzido para neutralizar o
HBeAg, e o seu aparecimento indica diminuio da replicao

viral. O anti-HBe torna-se detectvel aps o desaparecimento


do HBeAg.29 O anti-HBs um anticorpo neutralizante e seu
aparecimento indica imunidade para a infeco do HBV, seja
pela aquisio da infeco ou devido imunizao.20

Polimorfismo gentico do HBV


Como o HBV se replica assimetricamente por meio de
transcrio reversa de um RNA intermedirio, ele se torna
propenso a mutaes. Entre as principais mutaes do HBV de
interesse clnico esto as do gene core/pr-core, do core promoter, do gene da polimerase e da regio do envelope. As variantes mais comuns que ocorrem naturalmente no HBV incluem
a mutao pr-core no stop codon (G 1896A), que suprime a produo do antgeno "e" (HBeAg), e a dupla mutao no ncleo
na regio promotora do core (A1762 T e G 1764A) que estabelece
e regula sua produo.20 Essas variantes so encontradas em
pacientes com hepatite crnica negativos para o HBeAg, em
que a replicao do HBV e a inflamao heptica persistem
apesar da ausncia de HBeAg. A seleo da variante pr-core
dependente do gentipo, sendo mais comum na variante D
e rara em pacientes com gentipo A.30 J a frequncia de antiHBe positivo na hepatite B crnica determinada pela troca
C/U na posio 1858. A troca de C 1858 para U1858 favorece
a mutao de G1896 para A1896. Essa dupla mutao pode
formar uma base estvel entre estes dois nucleotdios no steam
loop no sinal de encapsulao do vrus pr-genmico. Essas
mudanas no cdon 28 na posio A1896 do pr-core no stop
codon impedem a traduo do HBeAg (Figura 6.9).22
Outra mutao importante ocorre no gene S, no determinante
onde o aminocido (aa) glicina substitudo pela
arginina no cdon 145 (G 145R) (Figura 6.10). O paciente que
tem essa mutao pode apresentar o teste sorolgico para
HBsAg negativo. Outras mutaes nessa regio podem se
manifestar da mesma maneira. As vacinas no so capazes de
proteger os indivduos com essas variantes do HBV, j que os
anticorpos neutralizantes so direcionados ao determinante
"' (Figura 6.8).
Na regio da polimerase frequentemente tm sido encontradas mutaes, mas seu significado clnico permanece incerto.
Entretanto, algumas mutaes selecionadas pelo uso de antivirais resultam no aparecimento de formas do HBV circulantes com reduzida sensibilidade resposta ao tratamento com
anlogos de ncleos(t)dios (AN). O padro de mutantes resistentes do HBV varia pela classe qumica dos AN, que podem

"a:

cUG
G
U
AA, 'ccG
CD ' U

U ' 'GU

GG

cC,
AG 'GGu

u e
G
A
U
' uU
CA - U
nt.1858 u - G nt.1896

''e

cd15

8=8
cd28
U- G
G- C

Cdon 28

Cdon 28

Cdon 15

Cdon 15

Cdon 15

Gentipo
selvagem
B, (C), D, E e F

Gentipo
selvagem G

U- A
A- U
C- G

U- G
U- A
G- C

5,U - A 3'

Gentipo
selvagem
A, (F2) e H

Figura 6.9 Mutao pr-core no stop codon (G 1896A), que suprime a produo do antgeno "e" (HBeAg).

Captulo 6

79

Hepatites Virais
Tipo selvagem glicina em 145

com HBV. O gentipo A subgentipo A (AA) tem sido o mais


comum (81,81 %), seguido pelo gentipo F subgentipo F2
(13,63%) e depois pelo gentipo D subgentipo Dl (4,54%). 34

Transmisso
A transmisso do HBV ocorre por via sangunea, por meio
de relaes sexuais e transmisso vertical, assim como por
contato pessoa a pessoa, presumivelmente por cortes e feridas
abertas, especialmente entre crianas em reas hiperendmicas.I 9 O HBV 50 a 100 vezes mais infeccioso do que o vrus
do HIV e pode sobreviver pelo menos 7 dias fora do organismo
humano. Is Nesse perodo o vrus pode ainda causar infeco
se entrar em contato com algum no infectado. A hepatite B
pode ser prevenida com vacina segura e eficaz.Is

Diagnstico
Infeco aguda pelo HBV

Mutante arginina em 145

Figura 6.1 OMutao importante no determinante "a" do gene S, em


que ocorre uma substituio do aminocido glicina pela arginina no
cdon 145 (G 145R).

ser classificados em L-nucleosdios (p. ex., lamivudina), fosfonatos de nucleosdios acclicos (p. ex., adefovir e tenofovir)
e ciclopentenos (p. ex., entecavir). A mutao de resistncia
tpica da lamivudina envolve as substituies na regio conservada tirosina-metionina-aspartato-aspartato (YMDD) da
regio responsvel pelo stio cataltico da transcriptase reversa
para "YIDD" e comumente encontrada em pacientes em
teraputica prolongada com a lamivudina. 32
O HBV apresenta substancial heterogeneidade gentica. Os
gentipos do HBV humano diferem entre si em mais de 8% na
sequncia de nucleotdios do genoma total e/ou acima de 4%
no gene do HBsAg. A anlise gentica permitiu classificar o
HBV em oito gentipos distintos (A-H) que apresentam diferentes distribuies geogrficas e associaes com diferentes
grupos de risco para infeco.33
Na regio oeste da Amaznia brasileira, a endemicidade
da infeco pelo HBV muito alta e a distribuio dos gentipos varia de acordo com a situao geogrfica do paciente

Nos indivduos infectados pelo HBV, o primeiro marcador


a ser detectado o DNA viral, que pode aparecer at 23 dias
antes do aparecimento do HBsAg. O perodo de incubao da
hepatite B aguda varia de 30 a 180 dias, 35 com durao mdia
de 75 dias, e caracteriza-se pela presena do HBsAg e ausncia de sintomas clnicos. O anti-HBc aparece dias depois do
HBsAg. No momento em que surgem sintomas inespecficos,
ocorre elevao das transaminases e os anticorpos IgM e IgG
anti-HBc esto presentes no soro. 36 Caso a infeco se resolva,
cessa a replicao viral com eliminao do HBeAg e aparecimento do anti-HBe. Em geral o HBsAg desaparece at o 3 ms
de doena e o anti-HBs, anticorpo neutralizante, passa a ser
detectado. A infeco aguda pelo HBV pode apresentar dois
perodos de janela imunolgica: o primeiro quando ainda
no se detecta nenhum marcador imunolgico, ou seja, antes
do aparecimento do HBsAg, e apenas o DNA viral detectado;
e outro perodo uma janela imunolgica do HBsAg, quando
este j no mais detectado, mas ainda no se detecta o antiHBs, nesta fase apenas o anticorpo IgM anti-HBc detectado
(Figura 6.11). Esse perodo tem diminudo com a melhora dos
kits de deteco dos marcadores virais, mas importante ressaltar que a pesquisa de IgM anti-HBc necessria para que

Sintomas
HBeAg

Anti-HBeAg
Total anti-HBc*

.Q

:::i

f--

Anti-HBc lgM

HBsAg

Anti-HBs

- ,11,,.___
I 52
100

L---...i..--'-'----.--------i..---.-~.-------1,,.____,...I

12 16 20 24 28 32 36
Semanas aps infeco

Figura 6.11 Evoluo da hepatite B aguda.

Diagnstico Laboratorial

80
se faa o diagnstico de hepatite B aguda, na qual altos ttulos
desse anticorpo podem ser detectados. Na hepatite crnica,
baixos ttulos de IgM anti-HBc podem ser encontrados, principalmente na fase de exacerbao da infeco.

Infeco crnica pelo HBV


A infeco crnica tem vrias fases distintas sorolgicas e
virais. Nos estgios em que a replicao viral baixa a incidncia de leses hepticas est significativamente diminuda.
A infeco crnica caracterizada pela persistncia do HBsAg
por um perodo maior ou igual a 6 meses, pela presena do
DNA-HBV e do HBeAg no soro.37 O antgeno "e" e os anticorpos especficos (AgHBe/anti-HBe) esto relacionados com o
ndice de replicao viral e tm sua maior utilidade no estudo
das formas crnicas de hepatites pelo vrus B. Pode ocorrer posteriormente a soroconverso do HBeAg para anti-HBe durante
a evoluo da doena. Os pacientes com infeco persistente
pelo HBV so classificados como portadores sos quando no
h inflamao e doena heptica presentes, HBeAg negativo,
anti-HBe detectvel e DNA-HBV/mf menor que 106 cpias,
transaminases normais e nenhum sinal histolgico de HBV
crnica. A infeco pelo HBV pode ocorrer sem manifestaes aparentes conhecidas, na qual possvel a deteco do
DNA-HBV com sorologia negativa para o HBsAg.37
A infeco crnica pelo HBV em crianas, adquirida no
perodo perinatal, inicia-se por uma fase de imunotolerncia
que pode perdurar por 15 a 35 anos e caracteriza-se por elevados nveis de replicao do HBV, sem doena heptica ativa,
altas concentraes de HBsAg e HBeAg no soro e DNA-HBV
maior que 109 cpias/mi. O HBV no diretamente citoptico, e a leso hepatocelular causada pela atividade do sistema
imunolgico. Como nessa fase o sistema imune tolerante,
no h inflamao heptica mesmo com alta replicao viral
e os nveis de transaminases so, portanto, normais.36 Isso se
deve provavelmente induo de tolerncia imunolgica aos
antgenos virais, pela passagem transplacentria do HBeAg da
me para o feto, o que, associado imaturidade imunolgica,
torna o feto/recm-nascido incapaz de montar uma resposta
efetiva e eliminar o vrus. 28 A evoluo dos marcadores de
hepatite B crnica est ilustrada na Figura 6.12.
Os marcadores utilizados na triagem sorolgica para prevenir a transmisso do HBV so o HBsAg e o anti-HBc. Os

Agudo
6 meses

Crnica
anos
HBeAg

Anti-HBe
HBsAg*
Total anti-HBc*

Ttulo

Preveno

lgM anti-HBc

O 4 8 12 16 20 24 28 32 36

11

52

testes para deteco do HBsAg permanecem de primeira linha


para a triagem de doadores de sangue. Os mais utilizados so
os imunoensaios, incluindo ensaios imunoenzimticos e quimioluminescentes (CLIA). Esses ensaios tm um limiar de
deteco entre < 0,1 e 0,62 ng de HBsAg por mf (1 ng/mf
corresponde a aproximadamente 2 UI/mf) 38 Nos EUA obrigatrio que os testes de HBsAg tenham um limiar de deteco
de pelo menos 0,2 ng/mf. Tem sido observado que ocorrem
diferenas na sensibilidade analtica e na especificidade de testes ELISA para a deteco do HBsAg entre os diferentes gentipos e subtipos.38 Resultados falsos-negativos nesses testes
tambm podem ser causados pela ocorrncia de mutaes na
regio do antgeno S com reduo da sntese ou secreo do
HBsAg ou pela presena concomitante de anticorpos contra o
HBsAg (anti-HBs) que permitem a formao de imunocomplexos circulantes e impedem a captura do HBsAg pelos testes
usuais. 39
Pessoas que se vacinam contra o HBV devem ficar 1 ms
sem doar sangue, pois o HBsAg proveniente da vacina pode
ser detectado pelos testes de triagem. 40 O risco residual de
transmisso do HBV por transfuso sangunea relatado principalmente em doadores negativos para HBsAg que tenham
coletado o sangue na fase de pr-soroconverso (janela imunolgica), perodo entre a infeco e a deteco do antgeno
viral ou anticorpos.
Os kits sorolgicos produzidos para a deteco do HBsAg
utilizam anticorpos monoclonais dirigidos para o epitopo
":28 Testes sorolgicos aprimorados, com anticorpos contra
outros epitopos do HBsAg, permitem a deteco de mutaes
que possam ocorrer no gene S41 e, provavelmente, vacinas com
outros antgenos do HBV, alm do HBsAg, devem ser protetoras contra esses mutantes. A infeco causada por vrus
mutantes derivados do vrus da HBV, na qual no se consegue
detectar o HBsAg, atualmente conhecida como hepatite B
oculta ou crptica.42
A reduo do risco residual pode ser obtida pela implantao de testes mais sensveis para a deteco do HBsAg, do
anti-HBc e do teste de cido nucleico (NAT) para HBV. O
NAT-HBV, alm da reduo da janela imunolgica, possibilita
a deteco da "infeco ocult' pelo HBV. O teste de anti-HBc
utilizado na triagem sorolgica de doadores de sangue tem o
potencial de excluir a maioria dos casos de infeco oculta,
restando apenas os casos mais raros ou de mutantes de escape
imune associados ao anti-HBs isolado. Contudo, no consegue
detectar infeces na fase de janela imunolgica. Em mdia
0,5% das pessoas que apresentam sorologia positiva para o
anti-HBc e negativa para o HBsAg tm resultados positivos
na deteco do DNA viral e, por isso, tal teste utilizado na
triagem de bancos de sangue. 38
A erradicao da infeco viral pode tambm ser dificultada pelo tipo infectante do vrus, o cccDNA, um tipo intermedirio do ciclo de replicao que durante a mitose tende a
se acumular no ncleo de hepatcitos e ser repartido entre as
suas clulas-filhas. 43

11

Anos

Semanas aps exposio

Figura 6.12 Evoluo da hepatite Bcrnica.

Tanto a profilaxia passiva quanto a ativa, ps-exposio ao


HBV, usando HBIG e vacina ou somente a vacina para o vrus
B, so altamente eficazes na preveno da infeco. 19 A imunizao ativa ao HBV tem sido associada diminuio acentuada de sua incidncia e constitui tambm o melhor procedimento para a reduo da prevalncia e incidncia da infeco
pelo vrus da hepatite delta (HDV).44

Captulo 6

81

Hepatites Virais

Esquema vacinai

sustentada: ou seja, a supresso da replicao viral do HBV


e remisso da doena heptica46 ativando a resposta imunolgica. Para tal, deve ocorrer soroconverso do HBeAg para
anti-HBe, queda ou diminuio dos nveis do DNA do HBV
e soroconverso do HBsAg para anti-HBs. 45 O medicamento
indicado para o tratamento da HBV a interferona-a (IFN-a)
que tem efeitos antivira! e imunomodulatrio. J o Ministrio
da Sade no Brasil preconiza como primeira escolha a
IFN-a2a e IFN-a2b. As IFN peguiladas a2a e a2b apresentam-se como alternativas interessantes para o tratamento da
hepatite B por suas vantagens em relao IFN convencional
pelo prolongamento de sua meia-vida, podendo ser utilizadas apenas 1 vez/semana. O tratamento com IFN contraindicado em pacientes com doena heptica descompensada,
para os quais deve-se indicar preferencialmente os anlogos
de nucleos(t)deos (AN). O mais utilizado para o tratamento
da hepatite B a lamivudina, um medicamento muito barato,
mas para o qual aparecem mutaes de resistncia em at 70%
dos pacientes submetidos a tratamento prolongado. Portanto,
muitas vezes substitudo por outros AN (4). O adefovir dipivoxila uma substncia inibidora da replicao viral usada
como alternativa IFN ou lamivudina para o tratamento da
infeco crnica do HBV, apesar de seu efeito sobre esse vrus
no ser to potente. A escolha do tratamento com um desses
frmacos deve ser baseada no estado individual do paciente.37
Dois AN tm se mostrado bastante efetivos para o controle da
infeco do HBV: o entecavir e o tenofovir, que so muito mais
potentes que a lamivudina e o adefovir. Ademais, o aparecimento de mutaes de resistncia contra entecavir e tenofovir

O esquema habitual de vacinao para indivduos imunocompetentes consiste em trs doses, com intervalos de 1 ms
entre a primeira e a segunda dose e 6 meses entre a primeira
e a terceira dose (O, 1 e 6 meses). Para prevenir a transmisso
do HBV perinatal, a primeira dose da vacina deve ser dada
logo aps o nascimento, de preferncia dentro de 24 h (WHO,
2001). Prematuros menores de 33 semanas ou cujo peso no
ultrapasse 2.000 g devero receber uma dose extra com 2 meses
de idade (O, 1, 2 e 6 meses). 44
Em crianas as vacinas contra hepatite B devem ser administradas por via intramuscular, na regio deltoide ou no vasto
lateral da coxa. No devem ser aplicadas na regio gltea, pois
a adoo desse procedimento se associa a menor imunogenicidade. Excepcionalmente, em pessoas com doenas hemorrgicas, a via subcutnea (SC) pode ser utilizada44 (Figura 6.13).
Trs doses de vacina contra hepatite B induzem ttulos protetores de anticorpos (anti-HBs > 10 UI/mf ) em mais de 90% dos
adultos e jovens sadios, e em mais de 95% dos lactentes, crianas e adolescentes. A eficcia diminui em torno de 40 a 60%
com o avanar da idade, principalmente a partir dos 40 anos. 44

Tratamento para hepatite B


Vrios fatores podem influenciar a prescrio do tratamento, como, por exemplo, estgio da doena, deteco ou
no do HBeAg, resistncia ao medicamento, principalmente
nos estgios finais da doena crnica do fgado45 e persistncia
do cccDNA. O objetivo do tratamento alcanar a "resposta

Vacina contra hepatite B


3 doses

i
Teste sorolgico (anti-HBs)

< 10 mUl/m e

> 10 mUl/me

Encerrar

O teste foi realizado h mais de 6


meses aps a ltima dose?
Sim

No

Aplicar uma dose de vacina e


repetir o anti-HBs
aps 4 a 12 semanas
> 10 mUl/m e

< 10 mUl/me

Administrar 2 esquema
(3 doses)

+
Encerrar

Completar 2
esquema

+
Repetir o anti-HBs
aps 4 a 12 semanas
< 10 mUl/me

Verdadeiro no respondedor

Figura 6.13 Esquema de vacinao para hepatite B.44

> 10 mUl/m e

Encerrar

Diagnstico Laboratorial

82
ocorre de modo muito menos frequente que as que aparecem
com o uso de lamivudina e adefovir, sendo que essas substncias devem ser incorporadas como primeira opo no tratamento da hepatite B. Em particular, as mutaes de resistncia
ao entecavir so muito mais raras quando esse medicamento
utilizado como primeira opo de tratamento, mas tornam-se
frequentes em pacientes previamente tratados com lamivudina. J as mutaes de resistncia ao tenofovir ainda no
esto muito bem definidas, mas esse um medicamento de
grande potencial para o tratamento da hepatite B, mesmo em
pacientes que j tenham apresentado resistncia prvia lamivudina. Por enquanto o tratamento da hepatite B, ao contrrio
do tratamento de HIV/AIDS, ainda feito preferencialmente
com apenas um AN, exceto para pacientes com resistncia
lamivudina, quando indicado outro medicamento, o adefovir.
O tratamento da hepatite B pode, portanto, comear com
IFN ou AN. Alguns autores tm proposto que o tratamento
inicial de casos infectados com gentipos A e B deva ser feito
com IFN, enquanto para os gentipos C e D a primeira opo
deve ser um AN, de preferncia de maior potncia, como o
entecavir ou o tenofovir. Assim, tem sido proposta por alguns
autores a realizao de exames de genotipagem do HBV e de
determinao do aparecimento de mutaes de resistncia
aos antivirais, para a indicao e acompanhamento do tratamento antivira!, em conjunto com a realizao da carga viral
do HBV.
As diretrizes mais recentes indicam o tratamento da hepatite B para todos os pacientes com carga viral maior que 2.000
UI/mf que apresentem ALT elevada e alteraes na biopsia heptica maiores que A2 ou F2 pelo ndice METAVIR.47
J os casos com cirrose heptica devem ser tratados sempre
que o DNA viral for detectado no soro. A queda da carga
viral deve ser monitorada pelo menos no terceiro e no sexto
ms, bem como aps 1 ano do tratamento, e a interpretao
da resposta ao tratamento deve ser feita como apresentado no
Quadro 6.1.

. .,. Hepatite C
Desde o descobrimento dos agentes virais que causavam
infeces conhecidas como hepatites A e B, a hepatite causada por outro agente viral era reconhecida por excluso e
chamada de hepatite no A no B (HNANB). A existncia de
um agente viral associado HNANB foi reconhecida, experimentalmente, por Alter et al. em 1978,48 quando, inoculando
chimpanzs com plasma ou soro de pacientes com HNANB
ps-transfusional, verificaram que eles reproduziam alteraes bioqumicas e histolgicas compatveis com a HNANB.

No ano de 1989, Choo et al.,3 pesquisadores da empresa Chiron


Corporation (EUA), em colaborao com os Centros de
Controle e Preveno de Doenas (Centers for Disease Control
and Prevention - CDC, EUA), obtiveram uma protena desse
vrus que foi utilizada para a produo de um banco genmico
de DNA complementar (cDNA). A partir de ento foi possvel conhecer o genoma do vrus que foi denominado vrus
da hepatite C (HCV) e produzir antgenos recombinantes e
peptdios sintticos que foram utilizados na produo de kits
sorolgicos.

Transmisso
O HCV um patgeno transmitido mais eficientemente
pela exposio percutnea direta com o sangue infectado que
pode ocorrer por vrias vias, principalmente a parenteral. A
transmisso por intermdio de transfuso de sangue e derivados, pelo transplante de rgos, teve diminuio acentuada
no Brasil aps a introduo dos testes de anti-HCV em 1991.
A transmisso sexual parece no ser muito eficiente e a vertical tambm de baixo risco ( < 6%), mas ambas so facilitadas na coinfeco com o HIV, mesmo em indivduos sem
fatores de risco. 49 O HCV no tem sido encontrado no leite
materno.50

Patognese
Cerca de um tero dos adultos desenvolvem sintomas clnicos e ictercia em torno de 3 a 12 semanas da infeco. 51 A infeco aguda autolimitada, os sintomas permanecem por vrias
semanas e desaparecem com a reduo dos nveis da alanina
aminotransferase (ALT). ORNA do HCV pode ser detectado
no sangue, pelas tcnicas moleculares, em aproximadamente
15 dias aps incio da infeco.52 Uma pequena porcentagem
de pacientes (10 a 25%) clareia o vrus durante a fase aguda
(6 primeiros meses aps a infeco). Nessa fase, somente 50 a
70% dos pacientes so detectados por meio de anticorpos contra o HCV, pelas tcnicas imunoenzimticas, chegando a 90%
em 3 meses. Portanto, durante a chamada janela sorolgica ou
perodo pr-soroconverso, um resultado sorolgico negativo
no exclui a possibilidade de infeco pelo HCV. 53
A persistncia do RNA do HCV por mais de 6 meses aps a
infeco caracteriza a infeco crnica. 54 O determinante mais
importante para a infeco tornar-se crnica parece ser o aparecimento da quase espcies, uma populao complexa que
consegue evadir da resposta imune resultando na persistncia do vrus. Este um processo natural do H CV assim como
de outros vrus RNA.55 Alm disso, verificou-se que nos soros
humanos havia anticorpos neutralizantes para HCV, mas que

Quadro 6.1 lnterpretaso da resposta ao tratamento para hepatite B.


'

Terapia

Perfil de resposta

Definio

Anlogos de
nucleos(t)dios

Sem resposta primria


Resposta virolgica

Reduo no nvel do DNA-HBV srico< 1 log10 Ul/m.e em relao ao valor inicial no 3 ms de terapia
DNA-HBV indetectvel dentro das 48 semanas de terapia

Resposta virolgica parcial

Reduo do DNA-HBV srico> 1 log10 Ul/m.e em relao ao valor inicial, mas DNA-HBV detectvel, nas semanas 24 ou 48

Recidiva virolgica

Aumento do DNA-HBV srico durante aterapia em > 1 log10 Ul/m.e em comparao ao nadir

Sem resposta primria

Reduo do DNA-HBV srico< 1 log10 Ul/m.e em relao ao valor inicial no 3 ms de terapia

Resposta virolgica

DNA-HBV < 2.000 Ul/m.e no 6 ms de terapia

Resposta sorolgica

Soroconverso para anti-HBe em pacientes HBeAg-positivos

IFN-cx

Captulo 6

83

Hepatites Virais

eles eram altamente especficos para a cepa infectante e no


protegiam contra outras variantes virais.56 Aproximadamente
15 a 20% dos indivduos infectados pelo HCV tm recuperao
espontnea, geralmente dentro do primeiro ano da infeco,
como demonstrado pela ausncia do RNA do HCV em amostras sequenciais e normalizao dos nveis de ALT.55
Na infeco crnica, o RNA viral atinge altos nveis plasmticos57 e normalmente assintomtica, apresentando-se de
forma clnica moderada e silenciosa, que dificulta o controle
da doena, facilitando a disseminao do vrus na comunidade, j que medidas preventivas no sero utilizadas. Dos
indivduos que evoluem para as formas crnicas, cerca de 20 a
30% desenvolvem quadro de cirrose heptica aps um perodo
de 20 anos de contgio, e cerca de 2 a 5% desenvolvem carcinoma hepatocelular (HCC).58

1a

1b

Norte (n=85)

Nordeste (n=247)

Os

Centro-Oeste (n=79)

Epidemiologia
Estima-se que 170 milhes de pessoas estejam infectadas pelo HCV e que a prevalncia mundial seja de 3 a 5%.59
Estudos epidemiolgicos com doadores de sangue e pacientes
com hepatite C revelaram que 75 a 85% dos indivduos infectados no resolvem a infeco, tornando-se crnicos.55 Segundo
estimativa do Ministrio da Sade, entre 1 e 2 milhes de
brasileiros esto cronicamente infectados pelo H CV e apenas 5.000 deles esto em tratamento.60 Apesar da dificuldade
de se estimar a prevalncia da infeco pelo HCV, no Brasil
observou-se um grande declnio a partir de 1989, quando
alguns servios de banco de sangue passaram a utilizar marcadores indiretos, entre os quais dosagem da ALT e pesquisa
de anticorpos contra o HBcAg (anti-HBc). Esse procedimento
diminuiu as hepatites em aproximadamente 50% e a queda foi
intensificada com a introduo de testes especficos para antiH CV na triagem de doadores de sangue, em 1991.48 A partir
de 1993, tanto a pesquisa da ALT quanto a de anti-HBc passaram a ser de realizao obrigatria para a triagem de doadores
de sangue, conforme as normas tcnicas do Ministrio da Sade.61 A soroprevalncia do HCV varivel entre doadores de
sangue no Brasil, de acordo com as regies investigadas, sendo
de 0,21 % em So Paulo, na Fundao Pr-Sangue/Hemocentro
de So Paulo (FPS/HSP).62 Na populao geral de So Paulo,
Focaccia et al. encontraram uma prevalncia de anti-HCV de
1,4%, sendo a distribuio similar entre homens e mulheres.63
Segundo dados do Ministrio da Sade, de 1994-2005 foram
diagnosticados 52.489 casos e os dados obtidos nesses inquritos sorolgicos apontam para taxas de prevalncia variando
de 0,28 a 2,61 %. Um estudo no Brasil sobre a distribuio dos
gentipos entre pacientes com hepatite C crnica obteve uma
frequncia de 64,9% para o gentipo 1; 4,6% para o gentipo
2; 30,2% para o gentipo 3; 0,2% para o gentipo 4 e 0,1 % para
o gentipo 5. O gentipo 1 foi o mais frequente em todas as
regies, sendo maior na Regio Norte e menor na Regio Sul
do pas. J na Regio Centro-Oeste prevalece o gentipo 2 e na
Regio Sul o gentipo 3. 64 (Figura 6.14)

Caractersticas e constituio genmica do HCV


O HCV um membro da famlia Flaviviridae.65 Nessa
famlia, os vrus esto associados a zoonoses e doenas que
acometem humanos. So classificados em pelo menos trs
diferentes gneros: Pestivirus (vrus da diarreia bovina e da
febre suna), Flavivirus (vrus da dengue e da febre amarela), que se relacionam com as mais importantes doenas transmitidas por art rpodes e, atualmente, o gnero

Sudeste (n=1.114)

Sul (n= 175)

Figura 6.14 Distribuio dos gentipos do HCV nas diferentes regies


brasileiras.

Hepacivirus, cujo nico membro o HCV. 66 O HCV tem


formato esfrico, com 55 a 65 nm de dimetro e envoltrio
lipdico de aproximadamente 7 nm de espessura. O genoma
constitudo por uma fita simples de RNA, com polaridade positiva, contendo aproximadamente 9.400 nucleotdios. A regio codificante do genoma viral compe-se de
uma fase de leitura aberta (ORF) traduzida em uma poliprotena precursora de, aproximadamente, 3.000 aminocidos (aa),367 sendo tambm utilizada como molde para
replicao do RNA viral. A partir do segmento N -terminal
da poliprotena so processadas as protenas estruturais do
nucleocapsdio (core), as protenas do envelope viral (El e
E2) e a protena de canal inico p7. As protenas no estruturais (NS) so processadas a partir da poro C-terminal
e so codificadas para proteases NS2, NS3, helicase (NS3),
NS4A, NS4B, NS5A e NS5B (RNA polimerase dependente de RNA) .68 O genoma viral est representado na
Figura 6.15.

Gentipos do HCV
Com base na sequncia de nucleotdios, o estudo dessa
heterogeneidade resultou na classificao do HCV em seis
gentipos principais. Eles so identificados com algarismos
arbicos, de acordo com a ordem em que foram sendo descobertos e nomeados como "tipo''. Alguns tipos tm sequncias
estritamente relacionadas e so classificados como subtipos,
identificados por letras minsculas (la, lb, lc, 2a, 2b, 3a, 3b
etc.). Os diferentes gentipos so resultantes do acmulo de
mutaes que ocorrem na evoluo viral. Entre os d iferentes
gentipos a similaridade da regio no estrutural do HCV
inferior a 68% e de 77 a 80% entre os diferentes subtipos de
um mesmo gentipo.69 A composio da quase espcie do
HCV refere-se variabilidade gentica dentro do indivduo
infectado, como resultado de nova infeco com populao
viral heterognea e acmulo de mutaes durante o curso da
infeco.70

Diagnstico Laboratorial

84
Estrutural
p21

gp31

5' UTR

gp70

'~

No estrutural

p7 p23

p70

p8

'

E1
'

NS2

E2
,.

"'

Core

NS3

'
'
Metaloprotease
).

RHV1
~

p58

p68
3' UTR

p27

NS4
B

NS5
A

NS5
B

...

,_

Protease/helicase

Envelope

Inibidor
da PKR

Protena F?

5-1-1r

RNA polimerase
dependente de
RNA

Domnio
V3

Testes de
1 gerao
c100-3r
Testes de
2 gerao
c22r

c33cr

c100-3r
Testes de
3 gerao

c22-p

c100p

c33r

1.000

2.000

NS5r

3.033

-9,4 kb

Figura 6.15 Representao esquemtica do genoma do HCV com as regies no traduzidas (UTR), estruturais e no estruturais (NS) e as protenas utilizadas como antgenos nos testes sorolgicos. RHV1 = regio hipervarivel 1.21

Diagnstico laboratorial da hepatite C


o diagnstico da hepatite e geralmente casual, j que a
maioria dos indivduos infectados apresenta a forma crnica
e assintomtica da doena. Assim, os testes de triagem sorolgica e a deteco molecular do HCV so mais importantes na identificao desses recursos. Desde 1990, quando os
testes de triagem para deteco de anticorpos contra o HCV
foram licenciados e comercializados, surgiram vrias verses
de ensaios com o intuito de torn-los mais sensveis e especficos. Apesar disso, os testes imunoenzimticos utilizados
para a triagem de anti-HCV apresentam srias limitaes pela
alta frequncia de resultados inespecficos. Para a triagem
sorolgica em bancos de sangue, procura-se utilizar testes
com elevada sensibilidade por causa da janela imunolgica e,
como consequncia, pode resultar em uma parcela de resultados falso-positivos. O primeiro marcador a ser detectado no
plasma de indivduos aps a infeco o RNA viral, seguido
do antgeno do core do HCV (HCVcAg). O pico da alanino
aminotransferase (ALT) observado em mdia 8 semanas
aps o incio da infeco, poca em que os anticorpos contra o
antgeno do core tornam-se detectveis. Os anticorpos especficos contra as protenas virais aparecem cerca de 50 dias aps
o aparecimento do RNA viral (Figura 6.16).
Os anticorpos anti-HCV podem se tornar indetectveis
aps a infeco ser controlada, definindo um fenmeno chamado de sororreverso. A sororreverso pode ser completa ou

parcial. A primeira definida como a perda total de anticorpos


especficos detectveis, como por exemplo, mudana de resultado positivo para negativo no ELISA anti-HCV. A sororreverso parcial caracterizada pelo desaparecimento ou diminuio de um ou vrios, mas no de todos os anticorpos contra
os antgenos do HCV. Essa sororreverso tem sido relatada em
pacientes hemodialisados, 72 imunodeficientes73 e indivduos
imunocompetentes depois de resposta completa terapia com
interferona-a.74
O immunoblot (IB) um ensaio qualitativo utilizado para
detectar anticorpos especficos para cada frao antignica
do HCV separadamente no soro ou plasma, e foi desenvolvido para ajudar a resolver o problema dos resultados falsopositivos que poderiam ser gerados em um ELISA. Assim, os
IB tambm foram desenvolvidos como de primeira (IB-1 ),
segunda (IB-2) e de terceira (IB-3) gerao, com os mesmos
antgenos utilizados no ELISA das respectivas geraes. As
novas verses do IB incluem tambm antgenos recombinantes e sintticos provenientes das regies mais conservadas do
genoma viral de outros gentipos, entre os quais os tipos 2 e
3, alm do 1. Esses antgenos, dispostos de modo linear ou
em bandas sobre uma fita de nitrocelulose, so oriundos do
core (4 epitopos), NS4 (3 epitopos), NSS (3 epitopos) e E2/
NSl.75 Nos testes de terceira gerao, a substituio de alguns
antgenos recombinados por peptdios sintticos resultou
em importante melhora na sensibilidade e na especificidade
do teste, com uma reduo de resultados indeterminados.

Captulo 6

85

Hepatites Virais

Anti-HCV
Sintomas
ALT
Ul/f
500-----t

0011

Janela

250 ~imunolgica

Meses
Infeco

Anos

Tempo aps exposio

Figura 6.16 Evoluo dos marcadores da hepatite C.71 RNA HCV = cido
ribonucleico do vrus da hepatite C; ALT = alanina aminotransferase;
tarja branca = PCR negativo; tarja azul = PCR positivo.

Apesar da melhora dos antgenos utilizados, o IB anti-H CV


apresenta, ainda, menor sensibilidade em relao aos testes de
ELISA,76 alm de no apresentar especificidade tima. Ambos
os testes de triagem e suplementar podem ter resultados falsopositivos em hipergamaglobulinemias, hepatites autoimunes e
falso-negativos em hipogamaglobulinemias, em condies de
imunossupresso, entre outros. 77
O diagnstico molecular da infeco pelo HCV fundamentado na deteco do RNA do HCV e na sua quantificao, por intermdio de tcnicas de biologia molecular, padronizadas in house ou kits comerciais. Para deteco do RNA
viral, a reao em cadeia da polimerase (PCR), qualitativa ou
quantitativa, a mais empregada e considerada hoje a tcnica mais adequada na caracterizao do estado de infeco
pelo HCV, possibilitando a determinao da viremia muito
precocemente, ainda na fase de janela imunolgica, e tambm no acompanhamento da teraputica pela quantificao
da carga viral.
... Testes de triagem. Anticorpos na infeco pelo HCV no
significam proteo, imunidade ou defesa efetiva, como ocorre
em outras doenas virais, embora a presena dos anticorpos
seja a base do diagnstico no acompanhamento laboratorial e
a deteco deles constitua a maneira mais prtica de triagem.78
O ensaio imunoenzimtico mais empregado utiliza antgenos
recombinantes e peptdios sintticos e tem a vantagem de ser
prtico, com possibilidade de automao e custo relativamente baixo. Os resultados positivos ou inconclusivos nesses
testes devem ser confirmados por immunoblots, que, fornecem a positividade individual para cada antgeno utilizado
nas tiras de suporte slido e conferem maior especificidade
reao. Entretanto, recentemente as tcnicas moleculares tm
sido preferidas como teste suplementar, resultando em um
novo algoritmo cuja confirmao feita por testes como, por
exemplo, a reao em cadeia da polimerase (PCR) .
... Kits diagnsticos comerciais. O primeiro teste ELISA
(ELISA-1 ou de primeira gerao), desenvolvido em 1990,
tinha como antgeno somente uma protena recombinante
derivada, por clonagem, do gene NS4 (Cl00-3). Esse teste,
por utilizar um nico antgeno, demonstrou baixa sensibilidade, em torno de 70 a 80%, em regies de alta prevalncia
para o HCV, e baixa especificidade, principalmente em populao de baixo risco, em que se observou um valor preditivo

positivo de 30 a 50%. Alguns autores tm relatado a ocorrncia de at 70% de resultados falso-positivos em amostras de
doadores de sangue.79 Uma das causas da inespecificidade
decorre das reaes cruzadas com superxido dismutase
(SOD), empregada no processo de clonagem da protena.
Com a baixa sensibilidade dos testes de primeira gerao e a
soroconverso tardia, de cerca de 2 a 4 meses aps a infeco em pacientes imunocompetentes e de 6 a 12 meses em
pacientes imunodeficientes, a ocorrncia de transmisso do
HCV pelo sangue ainda se manteve alta.68 Em 1992 surgiu o
ensaio de segunda gerao (ELISA-2) que utilizou as protenas C22-3r da regio do core, C33cr da regio NS3 e C200 das
regies NS3 e NS4 do genoma viral. A sensibilidade e a especificidade aumentaram, com reduo da janela sorolgica
para 88 dias.80 Posteriormente, em 1994, foi desenvolvido o
teste de terceira gerao (ELISA-3), que acrescentou ao teste
anterior a protena NS5 e tambm a utilizao da protena do
NS3 reconfigurada, ou seja, quimicamente modificada para
aumento da reatividade e, consequentemente, para aumentar
a sua sensibilidade. Alm disso, em vrios deles, algumas fraes antignicas foram substitudas, tais como a c100-3r e a
c33cr por peptdios sintticos (Figura 6.15) correspondentes
aos seus epitopos imunodominantes, melhorando tambm
sua especificidade. Entretanto, os testes de terceira gerao
no apresentaram diferenas significativas na sensibilidade
em relao aos de segunda gerao, mas houve discreta diminuio da janela sorolgica para aproximadamente 66 dias.80
Outros testes com o objetivo de diminuir a janela imunolgica
esto disponveis comercialmente. Um deles capaz de detectar o antgeno do core do HCV (HCVcAg) em cerca de 3 a
5 dias aps o surgimento do RNA viral e o outro um ensaio
combinado para deteco simultnea do antgeno do core e de
anticorpos anti-HCV em plasma ou soro humano.
Os testes reativos no ELISA podem ser confirmados pela
PCR ou pelo IB. Devido facilidade de padronizao e de
automao dos testes de ELISA HCVcAg, esta pode ser uma
alternativa eficiente em pases que, por motivos econmicos,
no possam utilizar a tcnica de testes de cidos nucleicos
(NAT) para o HCV na triagem da infeco, principalmente
durante a fase de janela imunolgica.81
Em 2003, os CDC propuseram dois novos algoritmos para
deteco do H CV, sendo um deles o uso de um ndice de reatividade estabelecido pela razo da densidade ptica (DO) da
amostra e o valor de corte do teste (cut-off ou C0). 82 O valor
desse ndice (DO/CO) deve ter correlao com a positividade
no immunoblot de no mnimo 95%, para que o resultado possa
ser considerado como positivo. A DOJCO deve ser estabelecida para cada laboratrio dentro de suas condies de rotina
e os resultados maiores que os valores desse ndice seriam considerados positivos, e abaixo dele teriam de ser confirmados
pelo immunoblot. O segundo algoritmo consiste na utilizao
de um teste molecular (PCR) nas amostras com teste de triagem positivo ou inconclusivo. Nas amostras cujos resultados
da PCR forem negativos, o immunoblot dever ser realizado. O
algoritmo utilizado at ento a realizao do immunoblot nas
amostras reativas pelo teste de triagem (Figura 6.17). A vantagem dos algoritmos alternativos de serem mais econmicos
ou fornecerem um diagnstico mais completo, informando
tambm sobre a presena ou no da viremia (Figura 6.18). 82
Assim, a escolha de um ou outro algoritmo depende do objetivo da realizao do diagnstico, como mostra o trabalho de
Barreto et al. 83 O Quadro 6.2 mostra a interpretao provvel
dos resultados obtidos usando esses algoritmos.

86

Diagnstico Laboratorial
Elisa
(3 gerao)

Triagem anti-HCV

Positivos de
acordo com 1R
No reativo

Negativo

+li>

Positivos

Reativo

NAT
lmmunoblot

(3 gerao)
Positivo IR

Positivo IR ~

Negativo

Positivo

IND

18 anti-HCV

RT-PCR para
confirmao

RT-PCR e
genotipagem

Positivo

Figura 6.17 Algoritmo do diagnstico confirmatrio da hepatite Cutilizando immunoblot para deteco de anticorpos anti-HCV.82

Negativo

Indeterminado

Figura 6.18 Algoritmo alternativo do diagnstico da hepatite C utilizando o ndice de reatividade como cut-off. 82

Quadro 6.2 Recomendaes para liberar os resultados dos testes para deteco de anticorpos anti-HCV ea necessidade de realizao de
testes confirmatrios.82
Resultados do teste de
triagem anti-HCV

Resultados do teste confirmatrio

Interpretao

Comentrios

Negativo

No realizar

Anti-HCV negativo

No infectado peloHCV
Infeco recente
Outra evidncia indicativa de infeco pelo HCV

Positivo com valor altode 00/CO

No realizar

Anti-HCV positivo

Provvel infeco presente ou passada, no realizar teste


suplementar com 00/CO alto. Menos de 5% de falso-positivos,
realizar teste suplementar se necessrio

Positivo

IB positivo

Anti-HCV positivo

Indica infeco presente ou passada

Positivo

IB negativo

Anti-HCV negativo

No infectado pelo HCV


Infeco recente
Outra evidncia indicativa de infeco pelo HCV

Positivo

IB indeterminado

Anti-HCV indeterminado

Resultado no definido
Coletar nova amostra depoisde 1 ms: repetir anti-HCV ou realizar
teste RNA HCV

Positivo

Teste de cido nucleico (NAT) positivo

Anti-HCV positivo
RNA HCV positivo

Infeco ativa pelo HCV

Positivo

NAT negativo
IB positivo

Anti-HCV positivo
RNA HCV negativo

Anti-HCV positivo indica infeco presente ou passada


Um nico teste de HCV RNA negativo no exclui infeco ativa

DO = densidade ptica; CO = densidade ptica corte doteste; 1B= immunob/ot.

Genotipagem do HCV
A PCR permite ainda que se realize a genotipagem do HCV
que avalia a possibilidade de coinfeces ou ainda de reinfeces por cepas virais diferentes. Pode-se caracterizar o genoma
viral classificando-o em diferentes gentipos e subtipos do
HCV pelas tcnicas de RFLP (restriction fragment length polymorphism), de sequenciamento genmico e o mtodo comercial LiPA (Line Probe Assay- Innogenetics, Blgica),84 fundamentado na hibridao dos produtos amplificados da regio 5'
UTR com sondas gentipo-especficas.85 Os mtodos baseados
na regio 5' UTR do VHC permitem que se faa a genotipagem do H CV para a maior parte dos gentipos circulantes, mas

recentemente foi demonstrado que esses mtodos podem no


identificar propriamente o gentipo 6, que no encontrado
em nosso pas, sendo praticamente restrito ao Sudeste Asitico.
Alm disso, a classificao dos subgentipos do HCV, identificados por uma letra minscula aps o gentipo (p. ex., la,
lb, 2a, 2b, 3a, 3b etc.), pode apresentar resultados equivocados
com essa metodologia. Como para efeitos clnicos a classificao do H CV em gentipos suficiente, em nosso pas ainda so
utilizadas metodologias baseadas apenas na regio 5' UTR, mas
novas metodologias de LiPA, que analisam tambm a regio C
ou de sequenciamento da regio NS5B, foram desenvolvidas
para melhorar a classificao dos subgentipos virais, evitando
possveis erros na classificao dos gentipos virais.

Captulo 6

87

Hepatites Virais

Tratamento

..,. Hepatite delta

Atualmente o tratamento para hepatite crnica C fundamenta-se na combinao de interferona-a peguilada (IFN-aPeg), IFN-a2a peguilada ou IFN-a2b peguilada e ribavirina,
sendo que o tratamento de referncia emprega doses semanais de IFN-a peguilada e doses dirias de ribavirina. As tcnicas moleculares so teis no seguimento de todas as fases
do tratamento.84 A quantificao dos nveis de RNA viral
um dos parmetros utilizados para verificar a resposta virolgica sustentada (clareamento do RNA do HCV por 24 semanas depois da suspenso do tratamento), a qual o ponto final
da terapia. 86
Diversos fatores do hospedeiro podem influenciar o
resultado do tratamento, tais como a cintica da reduo da
carga viral com a terapia com IFN, as quase espcies virais
e as mutaes na regio NS5A. Foi observado que pacientes infectados pelo gentipo 1 apresentam pior resposta ao
tratamento com interferona do que aqueles infectados com
gentipos 2 e 3.87 Estudos matemticos mostraram que a
resposta viral precoce, definida como a diminuio de 2 log
na carga viral nas primeiras 12 a 24 h de tratamento, preditiva de resposta virolgica sustentada (RVS) e pode ser
usada para monitorar o tratamento.87 Essas consideraes
permitem afirmar que o tipo do gentipo e a carga viral
pr-tratamento so os mais preditivos na resposta teraputica.58
No Brasil, por meio da Portaria n 863, de 4 de novembro
de 2002, da Secretaria de Assistncia Sade, foi estabelecido um protocolo clnico com diretrizes teraputicas para o
tratamento da hepatite crnica pelo vrus C. Esse protocolo
determina critrios de incluso/excluso de pacientes no
tratamento, critrios de diagnstico, esquema teraputico,
mecanismos de acompanhamento e avaliao desse tratamento.60

Em 1977, Rizzetto et al.92 observaram no ncleo de hepatcitos de pacientes com hepatite B crnica um antgeno desconhecido, semelhante ao antgeno do core (HBcAg). Embora no
coexistisse com ele, foi associado infeco pelo HBV. Esse antgeno foi chamado de delta e pacientes que o acometiam desenvolviam anticorpos antidelta. Somente em 1980 o antgeno delta
(HDVAg) foi reconhecido como componente de um novo vrus,
um agente-satlite e subviral humano, que depende da presena
do HBV para sua replicao e de seu respectivo envelope de
protenas, o HBsAg, para completar seu ciclo biolgico.

Perspectivas de produo de vacinas


Apesar do conhecimento sobre o HCV, por mais de uma
dcada no houve grandes avanos no desenvolvimento de
uma vacina. 88 Os maiores obstculos so a falta de um sistema de cultura adequada para a propagao do vrus e de um
modelo animal de pequeno porte. Estudo recente em animais
de pequeno porte demonstrou que a filogenia do Tupaia belangeri est estritamente relacionada com a dos primatas e esta
espcie pode ser infectada pelo HCV in vivo. 89 Os hepatcitos
do Tupaia belangeri podem representar um novo modelo de
cultura celular para o estudo das importantes etapas do ciclo
de vida viral, incluindo a avaliao funcional do CD81 como
receptor celular do HCV, a existncia de outros receptores e
tambm a neutralizao viral.90
Outro obstculo para a vacina a alta heterogeneidade
do vrus, fazendo supor que deveria ser desenvolvida uma
vacina para cada gentipo, e tambm porque a resposta de
anticorpos aos antgenos recombinantes pobre em humanos. Um fato ainda mais relevante que a imunidade ao HCV
no completa. Aps a recuperao da infeco possvel a
reinfeco como resultado da exposio a cepas diferentes do
vrus ou s mesmas cepas. Esses fatos mostram que o desenvolvimento de uma vacina requer um avano fundamental na
imunologia. No presente momento, o controle da hepatite C
requer medidas de sade pblica e disponibilidade de tratamento a todos os indivduos infectados que apresentem indicao para tal.91

Caractersticas e constituio genmica


do vrus da hepatite delta
A partcula viral do vrus da hepatite delta (HDV) esfrica, envelopada, medindo aproximadamente 36 nm. O seu
genoma no est relacionado com o do hepadnavrus, do qual
o HBV faz parte, e constitudo de uma cadeia simples de
RNA negativa, circular, de aproximadamente 1,7 kb de comprimento, contendo cerca de 60% de C + G.93 A cadeia circular de polaridade positiva contm somente uma fase de leitura
aberta (ORF) que codifica o HDVAg, nica protena conhecida, por meio de transcrio de 0,8 kb de RNA mensageiro.9495
O HDVAg constitudo de duas protenas, uma curta (short)
denominada HDVAg-S (195 aminocidos), requerida para a
replicao viral, e outra longa (long) chamada de HDVAg-L
(214 aminocidos), que inibe a replicao viral e promove o
empacotamento do RNA nos vrions. Esse antgeno localiza-se
no ncleo das clulas hepticas. A exata medida do genoma
mostrou que o HDV no um vrus convencional e bem
menor que o DNA de outros vrus conhecidos, que acometem
animais, com dimenso similar ao tamanho e estrutura dos
virioides de plantas superiores.
O HDV tem sua replicao defectiva, um vrus RNAdependente, que requer o HBsAg do HBV para encapsular seu
prprio genoma. As protenas da membrana externa do HDV
so providas pelo HBV.93 O HBsAg do invlucro do HDV
constitui-se de trs tipos de protena. A primeira codificada
pelo gene S do DNA do HBV; a segunda inclui a sequncia de
55 aminocidos da regio Pr-S2; e a terceira inclui tambm
os 108 a 119 aminocidos da regio pr-Sl. O revestimento
externo do HDV pelo HBsAg impede a hidrlise interna do
RNA do HDV92 (Figura 6.19).
AgHDV
p24 & p27

Produtos do
gene de HBV

s - -ilt
RNA

1~

36 nm

Figura 6.19 Representao esquemtica do HDV.

~1

Diagnstico Laboratorial

88

Transmisso
O HDV transmitido por via parenteral, de modo similar
ao HBV. A transmisso pelo contato sexual pode ocorrer e a
vertical (da me para o recm-nascido) rara. A transmisso
intrafamiliar tambm importante.96 Um fator epidemiolgico para a disseminao do HDV o estado de portador
crnico do HBV em reas endmicas, dependentes de drogas
ilcitas, hemodialisados e politransfundidos. 9297
A infeco pelo HDV pode causar doena heptica grave,
tanto aguda como crnica, com taxa de cronicidade de 70 a 90%
nos casos de superinfeco, levando a cirrose em 30 a 70% dos
pacientes.98 Estima-se que 15 milhes de pessoas estejam infectadas pelo HDV e que 5% dos portadores do antgeno de superfcie da hepatite B (HBsAg) estejam coinfectados com o HDV.99
Um fator que pode influenciar o curso da doena o gentipo do HDV. Esse vrus est dividido em oito principais gentipos que diferem entre si em 40% na sequncia de nucleotdios.100 Enquanto o gentipo do HBV parece no afetar a
interao do HBsAg com o HDV, o gentipo do HDV pode
influenciar a montagem do vrion com o HBsAg. O gentipo
1 o mais frequente no mundo e sua patogenicidade varivel. Um estudo em Taiwan mostrou que pacientes infectados
com gentipo tipo 1 do HDV tiveram menor taxa de remisso
e mais resultados adversos do que o gentipo tipo 2 do HDV.
Os gentipos 2 e 4, encontrados na sia Oriental, foram associados a doena mais branda, no entanto a variante 2b foi associada a maior progresso para cirrose; o gentipo 3 do HDV foi
associado a hepatite fulminante na Amrica do Sul.1
Variaes na sequncia de aminocidos expressas no
HBsAg ocorrem naturalmente e podem diminuir a eficincia
na formao dos gentipos 2 e 4, mas no no gentipo 1,101
levando provavelmente a sua ampla distribuio no mundo. A
infeco delta crnica a principal causa de cirrose heptica
em crianas e adultos jovens em reas endmicas da Itlia, da
Inglaterra e na regio Amaznica do Brasil. Em reas de alta
endemicidade pelo HBV, os portadores crnicos so reservatrios importantes na disseminao do vrus delta. 13

Patognese da hepatite D
Estudos experimentais e clnicos apontam para o carter patognico do HDV. Na fase aguda, o RNA do HDV ou
o HDVAg podem ter um efeito citotxico nos hepatcitos. J
quando expresso em grande quantidade o pequeno HDVAg
diretamente citotxico para as clulas. 99 Na fase crnica, a
inflamao em torno dos hepatcitos infectados e de vrios
anticorpos sugere um modelo de resposta imune na patognese do HDV. O anticorpo mais prevalente implicado nesse
aspecto o anticorpo microssomal fgado-rim tipo 3 (LKM3)
dirigido contra a uridina difosfato glucuronil transferase. 12
A interao entre os dois vrus complexa e o HDV pode
reprimir o aparecimento dos marcadores da hepatite B nas
clulas infectadas e at mesmo levar eliminao da replicao viral ativa. A infeco pelo HDV pode ser adquirida de
dois modos diferentes: coinfeco e superinfeco. A coinfeco simultnea pelos dois vrus (HBV e HDV) e resulta em
infeco aguda, muitas vezes autolimitada. O perodo de incubao depende da concentrao do inculo e, dependendo do
ttulo relativo do HBV ou HDV, um ou dois acessos de hepatite podem ser vistos.93 A possibilidade de um indivduo evoluir para doena crnica na coinfeco similar a quando est
infectado somente pelo HBV. 103 O curso sorolgico da coinfeco HBV e HDV est esquematizado na Figura 6.20.

~ifiit.U,ffeJ>i
ALT elevada

anti-HBs

-o::J

1--

Antidelta lgM

HBsAg

anti-HDV total

Evoluo

Figura 6.20 Curso sorolgico caracterstico da coinfeco pelo HBV


e pelo HDV.

A superinfeco ocorre quando um portador do HBV


crnico adquire o HDV, ocasionando uma hepatite aguda,
grave, com um perodo de incubao curto que induz hepatite D crnica em mais de 80% dos casos. A hepatite crnica
grave frequentemente progride para cirrose. Durante a fase
aguda da infeco pelo HDV a sntese de HBsAg e DNA do
HBV inibida at o clareamento do HDV.93 O curso sorolgico da superinfeco HBV e HDV est esquematizado na
Figura 6.21.

Diagnstico laboratorial da hepatite D


Os testes sorolgicos so teis para distinguir essas duas
formas de infeco do HDV e esto disponveis comercialmente. O diagnstico pode ser feito pela deteco dos anticorpos IgM e IgG contra o HDVAg no soro. Na coinfeco
(HBV + HDV) a fase aguda determinada pela presena do
anti-HBc IgM sem a expresso da antigenemia D. 104 Os marcadores sorolgicos do HDV surgem aps 4 a 8 semanas da
infeco, com o aparecimento inicial do RNA-HDV, seguidos
do HDVAg e, posteriormente, do anti-HDV IgM e anti-HDV
total (Quadro 6.1).
Na superinfeco (portador do HBV e infeco aguda pelo
HDV), a pesquisa do anti-HBc IgM negativa, HBeAg e/ou
anti-HBe so positivos, dependendo do estado do portador, e
anti-HDV IgM e anti-HDV total so positivos (Quadro 6.3).

Ictercia

anti-HDV total

ALT

-_.::Jo

-1HBsAg
lgM anti-HDV
Evoluo

Figura 6.21 Curso sorolgico caracterstico da superinfeco pelo HBV


e pelo HDV.

Captulo 6

89

Hepatites Virais
13

Quadro 6.3 Investigao laboratorial da hepatite delta.


Testes

Interpretao

HBsAg (+)
anti-HBc total (+)e anti-HDV total (+)
anti-HBc lgM (+) anti-HDV lgM (+)

Coinfeco: HBV + HDV


(Encaminhar para servio especializado)

HBsAg (+)
anti-HBctotal (+)e anti-HDV (-)ou(+)
anti-HBc lgM (-)anti-delta lgM (+)

Superinfeco: HBV crnico + HDV


(Encaminhar para servio especializado)

HBsAg (-)
anti-HBc total (-)

Suscetvel infeco pelo HBVe HDV


(Avaliar vacinao para HBV)

Caractersticas e constituio genmica do HEV

Nos tipos crnicos de hepatite D, o diagnstico sorolgico


baseia-se na pesquisa do aticorpo IgM anti-HDV ou total e a
confirmao da presena do Ag-HD no tecido heptico. 104
Tcnicas moleculares como a PCR e hibridizao podem
ser utilizadas para a pesquisa do RNA do HDV no soro ou no
tecido heptico, e sua presena indica alta infectividade e sua
persistncia, progresso para cronicidade. O RNA do HDV
detectvel em 90% dos pacientes na fase sintomtica e torna-se
indetectvel depois da recuperao clnica.105 Durante o seguimento o desaparecimento do anticorpo IgM anti-HDV indica
recuperao da infeco crnica do HDV. Pesquisa de anticorpos anti-HDV deve ser realizada em pacientes com HBsAg
positivos e hepatite crnica ativa. Muitos pacientes com HDV
crnico tm anticorpos anti-HBeAg e nveis reduzidos de
replicao. O RNA do HDV pode ser detectado em 60 a 75%
dos pacientes e normalmente est correlacionado com nveis
elevados de ALT e danos hepticos. 103

Tratamento
A infeco relacionada com o HDV difcil de ser tratada.
Se uma hepatite fulminante ocorrer na fase aguda da hepatite
D o transplante de fgado a nica opo de tratamento. 106
No momento o tratamento feito com IFN-a durante 1 ano
em portadores do HDV. Melhores resultados so obtidos com
IFN-Peg, que proporciona um clareamento viral sustentado
do RNA-HDV no soro. 107
O problema da terapia no HDV que o vrus no tem nenhum
alvo com funo enzimtica especfica, tais como as polimerases
e as proteases do HBV e do HCV. A atividade do HDV depende
do HBsAg e no da replicao do HBV e de seu nvel de RNA. 100
Nos pases em que ocorre o controle da infeco pelo HBV,
houve diminuio na circulao do HDV, mudando o cenrio
clnico da infeco. 108 J nos pases subdesenvolvidos, onde
no h controle do HBV, a HDV continua sendo um grande
problema de sade pblica.

principal causa de hepatite espordica em regies nas quais


o tipo epidmico existia. O agente viral para ET-HNANB foi
clonado, sequenciado e designado como vrus da hepatite E
(HEV).11o,111 Em menos de duas dcadas, desde que foi identificado, seu clone infeccioso de DNA complementar (cDNA)
foi conhecido 112 e muito tem sido feito para o diagnstico da
hepatite E e a produo de uma vacina.

Vrus da hepatite E

No perodo entre 1955 e 1956 ocorreu um surto de hepatite


em Deli, na ndia, que envolveu aproximadamente 29 mil indivduos aps a ingesto de gua potvel contaminada com esgoto.
Pela abrangncia da infeco ela foi considerada uma epidemia
que motivou amplos estudos, levando ao conhecimento de um
agente etiolgico distinto dos demais at ento conhecidos. 109
A primeira evidncia desse outro agente que causava hepa~ite
transmitida pela gua foi observada em 1983 e ficou conhecido
como o agente etiolgico da hepatite no A no B de transmisso entrica (ET-HNANB). Subsequentemente foi associado

O HEV foi identificado pela primeira vez nas fezes de


pacientes com ET-HNANB por meio da microscopia eletrnica113 e, pelas suas caractersticas, foi inicialmente classificado na famlia Caliciviridae dos agentes do grupo dos vrus
Norwalk (Norwalk vrus). Entretanto, aps a anlise genmica
mais detalhada verificou-se que o HEV um vrus filogeneticamente distante dos outros agentes da famlia Caliciviridae. 114
O HEV foi classificado como uma espcie do novo gnero
Herpesvirus na famlia Herpesviridae;115 contudo, novas informaes sobre sua expresso, estratgia de replicao e dos
padres de processamento de seus componentes so necessrias para uma classificao conclusiva.
A partcula viral pequena, esfrica, no envelopada,
medindo de 27 a 34 nm de dimetro. 113 O genoma de aproximadamente 7,2 kb de comprimento consiste em uma fita simples de RNA de polaridade positiva, poliadenilado.116 Contm
duas curtas regies no traduzidas (UTR), 5' e 3' UTR. Os
genes no estruturais esto localizados na regio 5' e os genes
estruturais na regio 3'.117
Com base na anlise molecular de isolados distintos geograficamente, o genoma pode conter trs fases de leitura abertas (ORF) sobrepostas. 118 A ORFl est localizada no final da
regio 5', comea no nucleotdio (nt) 28 e contm 5.979 pa:es
de base (pb) (1.693 aminocidos) de comprimento. E a maior
das trs e codifica uma poliprotena no estrutural. A anlise
das sequncias dos nucleotdios de cepas birmanesas isoladas
revelou a presena de sequncias consensuais na ORFl, da
metiltransferase, da cistena protease semelhante papana,
da RNA helicase e da RNA polimerase dependente de RNA, 117
envolvidas na replicao viral; ORF2 est localizada na regio
3', comea no nucleotdio 5147, contm 1.980 pb e codifica
as principais protenas estruturais do capsdio; compreende
tambm uma protena glicosilada utilizada nos transportes, 119
os principais epitopos imunolgicos e um polipeptdio com
um alto percentual de aminocidos bsicos; ORF3 a menor
delas, est localizada no final da ORFl, engloba 369 pb, sobrepe a ORFl no 5' final por 1 nt, sobrepe-se si~ni~cativan;ei:ite
a ORF2 12 e codifica uma pequena fosfoprotema imunogenica
associada ao citoesqueleto. 121 A regio 5' no traduzida (28 pb)
possivelmente desempenha um papel na transcrio e expresso do vrus. O coeficiente de sedimentao encontrado para
o HEV foi de 183S e algumas vezes em partculas defectivas
de 165S. O HEV resistente a mudanas de pH entre ligeiramente alcalino e cido, mas parece no tolerar altas concen traes de sais.
A estrutura tridimensional de uma automontagem da partcula recombinante do HEV foi feita a 22 A de resoluo por
microscopia eletrnica de varredura (Figura 6.22), e a imagem
tridimensional foi reconstruda, na qual o capsdio dominado
por dmeros que definem as 30 unidades morfolgicas. 122
Anlise filogentica das cepas do HEV provenientes de
regies geogrficas distintas mostrou variaes na sequncia
de seus genomas e os classificou, em funo da divergncia dos
nucleotdios em at 20% da ORF2, em quatro gentipos (1, 2,

90

Figura 6.22 Estrutura tridimensional do HEV. Resoluo por microscopia


eletrnica de varredura e reconstruo de imagem tridimensional. 122

3 e 4) e em 24 subtipos designados pelo nmero do gentipo


seguido de letras (la, lb, lc, ld, le, 2a, 2b, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f,
3 g, 3 h, 3i, 3j, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f e 4 g). 113 O gentipo 1 consiste em uma variedade epidmica em pases em desenvolvimento na sia e frica e previamente acreditou-se que infectava somente seres humanos, mas recentemente foi detectado
em porcos no Camboja.123 O gentipo 2 tem sido encontrado
no Mxico e na frica (Nigria; Chade) apenas em seres humanos.124 O gentipo 3 prevalente em rebanhos de sunos nos
EUA, na Europa, no Canad, no Mxico, na Nova Zelndia,
na Coreia do Sul, no Japo e na Tailndia. As cepas isoladas
do gentipo 3 de vrios pases demonstraram uma forte relao gentica entre sunos e humanos, o que sugere que sunos possam ser o reservatrio do vrus, embora seja possvel
que humanos e sunos possam compartilhar um reservatrio
comum. 125 O gentipo 4 tem sido isolado de vrias regies
da China, incluindo o sul (Guangzhou e Shanghai), o centro
(provncia Henan) e o norte (provncia Liaoning e Beijing) e
tem sido responsvel por uma proporo significante de casos
de hepatite aguda. 112 O gentipo 4 encontrado na China pode
ser uma zoonose de origem suna. Uma nova cepa do HEV
foi isolada de aves (galinhas) com sndrome esplenomeglica
de hepatite e foi proposto um novo gentipo (gentipo 5) ou
classific-la em um gnero separado.124

Transmisso
A principal via de transmisso do HEV a oro-fecal.
Evidncia de contaminao fecal em reservatrios de gua foi
associada a epidemias graves na ndia. Essas epidemias ocorrem principalmente nos meses de inverno, quando h queda
do nvel de gua, concentrando assim os contaminantes, e
durante a estao das mones, quando ocorrem enchentes
e aumenta o risco de contaminao fecal na gua potvel. A
falta de informao adequada pode ser uma via alternativa de
transmisso do HEV. A taxa de transmisso entre os membros
das famlias de pacientes portadores de hepatite E aguda de
1a2% dos casos.126 Infeces pelo HEV por alimentos foram
encontradas em pequenos focos no Japo, 127 assim como o
desenvolvimento de HEV aguda em pacientes japoneses aps
ingesto de fitoterpicos chineses. 128A probabilidade de transmisso parenteral baixa, mas foi associada a funcionrios de
hospitais que transmitiram a infeco depois de atenderam
pacientes com HEV aguda. Estudos sobre a transmisso do
HEV em macacos Rhesus tambm sugerem a possibilidade de
transmisso parenteral. Anticorpos IgG contra o HEV so frequentemente detectados em grupos de risco para transmisso
parenteral, como recipientes de transfuso, pacientes hemodialisados e em usurios de drogas injetveis. 113 No se tem
evidncias da transmisso sexual, mas o alto ndice de anticor-

Diagnstico Laboratorial
pos anti-HEV em homossexuais masculinos, na Itlia, sugere
a possibilidade por essa via. Pode haver tambm a transmisso
vertical pelo HEV, no terceiro trimestre da gravidez, e essa
ocorrncia tem sido relatada em 50% das mulheres grvidas
infectadas pelo HEv.113
O ser humano o hospedeiro natural para o HEV, mas
muito possvel que a hepatite E seja uma zoonose. Animais
podem servir de reservatrio e amplificar o vrus para infectar humanos. Algumas espcies de primatas no humanas
so suscetveis infeco pelo HEV, como micos ( Saguinus
mystax), macacos cynomolgus (Macaca fascicularis), Rhesus
(Macaca mulatta), macacos-coruja (Aotus trivigatus),
chimpanzs (Pan troglodytes), macacos-verdes africanos
(Cercopithecus aethiops) e macacos-rabo-de-porco (Macaca
nemestrina). 129130 O curso da infeco em primatas infectados experimentalmente similar ao de humanos, com
algumas variaes no perodo de incubao. 131 Estudos de
campo em vrias partes do mundo detectaram o RNA viral
nas fezes e os anticorpos no soro de animais domsticos
como sunos, gado, burro, veado, roedores, mulas, mangustos e outros animais.111132- 136 Isolados do HEV de sunos criados no EUA 137 foram infecciosos para primatas, 138e
anlises filogenticas mostraram que eram altamente homlogos aos isolados humanos dos EUA, mas diferentes das
linhagens mexicana e birmanesa.139 Evidncia definitiva da
transmisso do animal para o ser humano foi constatada em
indivduos doentes que consumiram carne de veado, pois o
vrus isolado era idntico ao da carne congelada remanescente.127

Clone de cDNA infeccioso


A primeira cepa proveniente de um animal a ser sequenciada e caracterizada foi isolada de porcos nos EUA em 1997 e
foi designada como HEV suna. Desde ento inmeras cadeias
de HEV foram isoladas de porcos e consideradas zoonticas
nos rebanhos de todo o mundo.140 Assim como a HEV suna,
a de aves tambm est geneticamente e antigenicamente relacionadas com a HEV humana. Diferentes clones de cDNA da
HEV aviria estabeleceram sua infectividade natural in vitro e
in vivo.141

Evoluo clnica
O quadro clnico da hepatite E aguda pode ser dividido
em quatro fases ou perodos: incubao, prodrmico, ictrico e convalescena. O perodo de incubao de 15 a
60 dias, com uma mdia de 40 dias. As manifestaes clnicas
em humanos so semelhantes s das outras hepatites virais e
podem variar de subclnica a doena fulminante. Em alguns
indivduos a hepatite pode ter um curso colesttico prolongado. A fase pr-ictrica pode durar de 1a 10 dias e sintomas
gastrintestinais como dor epigstrica, nuseas e vmito so
frequentemente relatados. A fase ictrica inicia-se abruptamente, com aparecimento de ictercia, urina escura e fezes
cor de argila. Em casos no complicados, esta fase dura de 12
a 15 dias, e a recuperao completa ocorre dentro de 1 ms.
Estudos clnicos mostram que a elevao da ALT ocorre em
nico pico que precede ou coincide com o incio da ictercia, o que similar aos demais tipos de hepatites virais. 113
Durante epidemias de HEV, observaram-se taxas elevadas
de hepatite fulminante e subsequente mortalidade entre
mulheres grvidas. 142 Insuficincia heptica fulminante pode
ocorrer por encefalopatia dentro de 8 semanas do incio dos
sintomas da doena.

Captulo 6

91

Hepatites Virais

Prevalncia
A prevalncia geral de anticorpos anti-HEV raramente
maior que 25% da populao saudvel mesmo em reas endmicas como ndia, Tailndia e Mxico. Na maioria dos pases, incluindo os mais industrializados como EUA, Alemanha
e Japo, a prevalncia de anti-HEV baixa, mas constante.
Contudo, em populaes no doentes, como doadores de sangue, uma prevalncia de anti-HEV de 0,4 a 3% relativamente
alta, considerando a raridade da doena notificada.143
No Brasil a prevalncia da infeco pelo HEV pouco estudada,
pois os testes para o diagnstico dessa infeco foram comercializados apenas recentemente. Nas Regies Nordeste e Centro-Oeste
alguns casos de hepatites virais foram associados ao HEV,144 assim
como entre mineradores de ouro da Amaznia145 e comunidades
isoladas. 146 Na Regio Sudeste, anticorpos anti-HEV foram encontrados em trabalhadores da sade e pacientes dialisados. 147

Replicao virai
O ponto primrio da replicao do HEV no foi identificado at o momento, mas pode ser o trato intestinal. Ainda
no est definido como o vrus chega ao fgado; presume-se
que a porta de entrada seja a veia porta. A replicao ocorre
no citoplasma dos hepatcitos, o vrus liberado para a bile e o
sangue por mecanismos desconhecidos. A viremia detectada
antes do incio da ictercia, podendo durar at 30 dias. 148 A
partcula viral pode ser detectada nas fezes em at 34 dias aps
a exposio. 149 Embora a fase virmica do HEV seja breve,
casos de viremia prolongada foram observados em pacientes
acometidos de HEV aguda 150 e em pacientes submetidos a
transplante renal e terapia imunossupressora, em que a viremia pode ser detectada aps 3 anos da infeco. 151

Diagnstico laboratorial da hepatite E


Pesquisa do RNA virai
O RNA do HEV o primeiro marcador a ser detectado no
soro, em torno de 22 dias aps a infeco, persiste durante a fase
pr-ictrica e desaparece no pico de elevao da ALT.148 Alm
do soro, tambm pode ser detectado na bile e nas fezes. Como
o perodo virmico curto, a pesquisa do RNA no soro deve ser
realizada no incio da infeco e nas fezes, na fase prodrmica.

lmunomicroscopia eletrnica
A imunomicroscopia eletrnica (IEM) pode ser utilizada
para deteco das partculas virais de 27 a 34 nm nas fezes
coletadas durante a fase pr-ictrica e incio da fase ictrica. 152

Pesquisa do antgeno do HEV


O teste imunoenzimtico ELISA foi desenvolvido para a
deteco do antgeno no soro, usando uma combinao de anticorpos monoclonais contra protenas do capsdio dos gentipos 1 e 4. Aps infeco pelo HEV, o HEVAg foi detectado no
soro quase ao mesmo tempo que o RNA do HEV nas fezes, mas
o antgeno persistiu 4 semanas a menos do que o RNA viral. 153
Testes para pesquisa do HEVAg devem ser teis para o diagnstico do HEV durante o perodo de janela sorolgica.

Pesquisa de anticorpos anti-HEV


Anticorpos IgM anti-HEV aparecem no soro de pacientes
infectados no incio dos sintomas e permanecem detectveis por um perodo de 2 semanas a 3 meses, 148 sendo teis
para o diagnstico de infeco aguda. Em algumas epidemias

em vrias partes do mundo a frequncia de anticorpos IgM


variou de 43 a 67% nos pacientes. 113154 A pesquisa de anticorpos IgM anti-HEV necessita ser melhor averiguada em
acompanhamentos clnicos, particularmente em reas endmicas.113 Anticorpos IgG anti-HEV aparecem em seguida
aos IgM, alcanam nveis mais elevados durante a fase aguda,
diminuem na fase de convalescena e permanecem por longo
tempo em aproximadamente 47% dos casos. 155 A presena de
altos ttulos de anticorpos IgG anti-HEV pode presumir fase
aguda da infeco mesmo na ausncia de IgM. Anticorpos IgA
anti-HEV foram encontrados durante infeco recente. 156 Dois
ensaios imunoenzimticos (ELISA) e um imunocromatogrfico esto disponveis comercialmente, embora os parmetros
de sensibilidade e especificidade para avaliao do desempenho desses testes no tenham sido precisamente estabelecidos,
principalmente na fase de convalescena. Sensibilidade e especificidade de 90% foram alcanadas com um teste imunoenzimtico usando uma combinao de trs protenas do HEV. 113
O anticorpo anti-HEV mostrou-se neutralizante, 157 mas
existem controvrsias quanto existncia de imunidade prolongada. Ttulos de anti-HEV podem diminuir progressivamente, possibilitando nova infeco aps reexposio ou se
manter por tempo prolongado aps infeco aguda, sugerindo
a ocorrncia de memria imunolgica. 158

Preveno e tratamento
H pelo menos trs principais abordagens para o controle da
infeco pelo HEV: saneamento, imunoprofilaxia e vacina. Uma
das medidas de saneamento, considerando que a principal via de
transmisso do HEV fecal-oral, seria assegurar a integridade
do abastecimento de gua, tratamento adequado na eliminao
dos dejetos humanos, higiene pessoal, preparao de alimentos
com higiene e evitar o consumo de carnes e vegetais crus e malcozidos. Os primeiros estudos de proteo individual pelo HEV
por meio da imunoprofilaxia passiva no tiveram sucesso. 159
Uma nica dose de imunoglobulina humana com baixos ttulos no conseguiu prevenir a transmisso pelo HEV, mas altos
ttulos de anticorpos anti-HEV transferidos passivamente conseguiram reduzir a quantidade de vrus eliminado nas fezes em
primatas no humanos que foram desafiados com altas doses de
HEV. 131 A produo de uma vacina eficaz para o HEV possvel
devido existncia de somente um sorotipo. Esse fato incentivou vrios grupos de pesquisadores a utilizarem muitas abordagens cientficas reconhecidas para essa finalidade.124

..., Hepatites no A, no B, no
C, no D, no E(no A-E)
Nos anos 1990 ocorreu o desenvolvimento de ensaios bastante
sensveis para a deteco dos vrus causadores das hepatites C
(HCV) e E (HEV). Apesar disso, 20% dos casos de hepatites agudas no A-E no puderam ter suas etiologias determinadas.Ho,161
Isso tambm tem acontecido em significativa proporo de
pacientes com doena heptica crnica e cirrose, os quais tm
sido caracterizados como casos criptognicos.162 Tais evidncias
indicam a existncia de agentes adicionais causadores de hepatites e fortalecem a necessidade de pesquisas para a descoberta
desses agentes. Deste modo, o GB vrus C (GBV-C), inicialmente
chamado vrus da hepatite G (HGV) e o TT vrus (TTV) foram
descobertos em 1995 e 1997, respectivamente, e sugeridos como
agentes causais das hepatites no A-E. No entanto, vrios estudos

92

Diagnstico Laboratorial

posteriores mostraram que nenhum desses dois agentes foi a causa


mais provvel dessas hepatites, portanto no havia mais interesse
para o desenvolvimento de mtodos de triagem na prtica clnica
para detect-los. Em 2000, um novo vrus de DNA, chamado vrus
SEN (SENV), foi identificado. O SENV mostrou ser um membro
do grupo Circoviridae e ser parente distante do TTV. Pelo menos
oito cepas SENV foram isoladas, mas apenas duas delas foram
relatadas como associadas hepatite no A-E. Tassopoulos et al.,
estudando esses vrus, concluram que, embora HGV, TTV e/ou
SENV fossem frequentemente detectados na fase aguda na coorte
de hepatite no A-E, nenhum deles estava associado s caractersticas especficas do paciente ou de progresso para cronicidade.16
A maioria dos dados existentes no mostrou relao causal entre
esses agentes e as hepatites agudas, permitindo concluir que HGV,
TTV e SENV no foram responsveis pela maioria dos casos, e
provavelmente representem transeuntes inocentes. Assim, os
resultados dessa coorte sugerem a existncia de um novo agente de
hepatite, com modos incertos de transmisso.163 Uma frao substancial dos casos de hepatite aguda desse estudo, que evoluram
para uma fase crnica de hepatite, foi consistente com um suposto
agente no A-E que muitas vezes parece ter um curso agressivo
com o rpido desenvolvimento de cirrose.
Nos ltimos anos, vrios agentes virais foram propostos como
agente etiolgico dos poucos casos de hepatite no A-E de provvel etiologia viral, mas nenhum deles conseguiu satisfazer os
requisitos necessrios para que esta associao fosse comprovada.
Alguns autores lanaram a hiptese de que existiria uma chamada
"flora viral" anloga flora bacteriana, formada por agentes no
patognicos que conviveriam com o hospedeiro humano sem causar nenhum prejuzo. Esta hiptese no pode ser desconsiderada,
dado que os mtodos de biologia molecular atualmente utilizados so altamente sensveis e podem mesmo levar descoberta
desse tipo de agente. Entretanto, para cada um desses agentes, so
necessrios estudos cuidadosos antes que eles possam ser declarados definitivamente como inocentes, pois sabemos que alguns
agentes virais s so patognicos em uma pequena porcentagem
de casos, como citomegalovrus, parvovrus B19 e HTLV-I/II.42

Quadro 6.4 Janela imunolgica das hepatites BeC.


Hepatite

Janela imunolgica*

Testes sorolgicos

Testes de biologia molecular

30 a60 dias
33 a 129 dias (ELISA 2 gerao)
49 a70 dias (ELISA 3 gerao)

25 dias
22 dias

*O conceito de janela imunolgica, que o perodo compreendido entre aexposio a uma fonte de infeco eo
aparecimento de um marcadorsorolgico, arigor, no adenominao correta quando oexame de biologiamolecular.
Entretanto, pelafalta de uma nomenclatura adequada ao perodo que corresponde no deteco do vrus, do antgeno
ou do anticorpo, por intermdio dos mtodos diagnsticos sanguneos hoje disponveis, optou-se por mant-lo.

. .,. Sumrio do diagnstico


laboratorial das hepatites virais
Os Quadros 6.4 a 6.12 resumem alguns tpicos do diagnstico laboratorial das hepatites virais.

Quadro 6.5 Hepatite Baguda !Interpretao dos maKadores


sorolgicos.
MaKador

Significado

HBsAg

~o primeiro marcador que aparece no curso da infeco

pelo HBV. Na hepatite aguda, ele declina anveis


indetectveis em at 24 semanas
lgM Anti-HBc

~marcador de infeco recente, encontrado no soro at

32 semanas aps a infeco


Anti-HBc Total

~marcador presente nas infeces agudas pela presena

de lgM ecrnicas pela presena de lgG. Representa


contato prvio com o vrus
~marcador de replicao virai. Sua positividade indica

HBeAg

alta infecciosidade
Anti-HBe

Surge aps odesaparecimento do HBeAg, indicando o


fim da fase replicativa

Anti-HBs

~o nico anticorpo que confere imunidade ao HBV. Est

presente no soro aps odesaparecimento do HBsAg,


sendo indicador de cura eimunidade. Est presente
isoladamente em pessoas vacinadas

Quadro 6.6 Hepatite Banica !Interpretao dos maKadores


sorolgicos.
MaKador

Significado

HBsAg

Sua presena por mais de 24 semanas indicativa de hepatite crnica

HBeAg
Anti-HBe

Est presente enquanto ocorrer replicao virai


Sugere reduo ou ausncia de replicao virai, exceto nas cepas com
mutao pr-core (no produtoras da protena "e")

Quadro 6.7 Hepatite B!Interpretao dos resultados sorolgicos.*


Anti-HBc
Interpretao

HBsAg

HBeAg

lgM

lgG

Anti-HBe

Anti-HBs

Suscetvel

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

Fase crnica (antgeno "e" negativo)

(+)
(+)
(+)
(+)

(-)

(-)

Janelaimunolgica para oanti-HBs

(-)

(-)

Imunidade, infeco passada recente

(-)

(-)

(-)
(-)

(+)
(+)/(-)
(+)

Imunidade, infeco passada

(-)

(-)

(-)

Imunidade, infeco passada


Imunidade resposta vacinai

(-)

(-)

(-)

(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)

(-)

Incubao

(-)
(-)
(+)
(+)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(+)

Fase aguda
Fase crnica (antgeno "e" positivo)

(-)

(+)
(-)

*Perfissorolgicos atpicos podem ser encontrados no curso da infeco pelo HBV; tais circunstncias necessitamda avaliao de um especialista (hepatologista ou infectologista).

(-)
(-)
(-)

Captulo 6

Hepatites Virais

93

Quadro 6.8 Hepatite C!Interpretao do marcador sorolgico.


Marcador

Significado

Anti-HCV

Indica contato prviocom o HCV. No define se foi infeco aguda ecurada espontaneamente ou se houve cronificao da doena

Quadro 6.9 Hepatite delta !Interpretao dos marcadores sorolgicos.


Marcador

Interpretao

HDVAg

Existe controvrsia sobre autilidade desse marcador na deteco de hepatite delta. Segundo alguns autores, aantigenemia permite odiagnstico em
amostras de soro obtidas durante aprimeira semana da doena. Para outros, o HDVAg um marcador inconstante, detectado no soro, especialmente na
superinfeco
Esses anticorpos aparecem com os sintomas agudos da doena e, quando disponveis, servem para odiagnstico; alm disso, so teispara monitorar
os pacientes submetidos terapia com IFN, uma vez que eles desaparecem quando a doena resolvida. Constituem os marcadores mais estveis e so
detectados antes de lgG anti-HDV. Existe forte correlao entre olgM anti-HDV, apresena do RNA do HDV no soro e do HDVAg no ncleo dos hepatcitos

lgM anti-HDV

lgG anti-HDV

Esse anticorpo marcador de infeco passada e de imunidade. Aparece no soro em torno de 12 semanas eum anticorpo instvel

Quadro 6.1 O Hepatite D!Interpretao dos resultados sorolgicos.


Antidelta
Interpretao

HBsAg

lgM anti-HBc

HDVAg

lgM

lgG

Coinfeco* ou superinfeco** recente

(+)
(+)
(+)
(+)
(+)

(-)
(+)

(+)

(-)

(+)
(+)

Coinfeco recente
Superinfeco recente
Superinfeco antiga
Imunidade

(-)

(-)
(-)

(-)

(-)
(+)
(+)
(+)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(+)

(-)
(-)
(-)

*Coinfeco = infeco aguda simultnea pelos HBV eHDV da hepatite.


**Superinfeco = infeco pelovrus HDV em pacientes crnicos do vrus Bdahepatite.

Quadro 6.11 Hepatite E!Interpretao dos maKadores sorolgicos.


Anti-HEVtotal

lgM Anti-HEV

Interpretao

(+)/(-)
(+)

(+)
(-)

Infeco recente pelovrus da hepatite E

(-)

(-)

Nunca teve contato com ovrus da hepatite E

Exposio prviaao vrus da hepatite E

Quadro 6.12 Comparao das caractersticas das hepatites virais humanas.


Vrus

HAV

HBV

HCV

HDV

HEV

Famlia

Picornaviridae

Hepadnaviridae

Flaviridae

"Satlite"

Herpesviridae

Genoma
Genoma - estrutura

RNA

DNA
Circular, d

RNA
Circular, s

RNA
Linear, s

Genoma - tamanho

Linear, s
7,5

RNA
Linear, s

3,2

9,5

1,8

7,2

Gentipos

ORF

Polaridade
Tamanho da partcula (nm)

Pos

Pos/Neg

Pos

Neg

Neg

27

42

55a 65

30a 36

32a34

Envelope

Sim

Sim
Parenteral

Perodo de incubao (dias)b

15 a50

Parenteral
30a 180

Sim
Parenteral

No

Transmisso

No
Entrica

Incio

Abrupto

Insidioso

Cronicidade

Sim

Mortalidade(%)

No
0,5

Vacina
HCC

15a150
Insidioso

30a180 (na superinfeco 14 a56 dias)

Entrica
14a60

Abrupto

Abrupto

Sim

1a2

Sim
0,5a1

Alta

No
1-2b

Sim

Sim

No

Sim

Sime

No

Sim

Sim

Sim

No

s= cadeiasimples; d= cadeia dupla; ORF =fase deleituraaberta; HCC = carcinoma hepatocelular. Gentipos do HAV 1, li, Ili eVII, considerado apenas em humanos. Apaire-Marchais, Robertson eta/. 1995.hAcima de 20%durante oterceiro
trimestreda gravidez. 'Estgiofinal do campo de pesquisa. Mushahwar, 2008.

94
Muitas vezes difcil o diagnstico das hepatites A, B,
C, D e E, sendo necessrio, para diferenci-las, fazer testes
sorolgicos altamente especficos e testes moleculares, apesar das caractersticas individuais entre elas, como listado no
Quadro 6.12.

..,. Referncias bibliogrficas


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Captulo 7

Jos Pascoal Simonetti e


Sandra Regina Rodrigues Simonetti

Consideraes gerais em virologia e


biologia molecular, 98
Epidemiologia, 103
Frmacos antirretrovirais, 105
Diagnstico laboratorial, 108
Bibliografia, 11 O

* Parte deste captulo integra a tese de doutorado em Cincias Mdicas de Sandra R. R. Simonetti, intitulada HIV-1: avaliao da resistncia s drogas
antirretrovirais em pacientes peditricos, defendida e aprovada em 19 de fevereiro de 2009 no Programa de Ps-Graduao em Fisiopatologia Clnica e
Experimental da Faculdade de Cincias Mdicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ).

98

Diagnstico Laboratorial

. . . Consideraes gerais em
virologia e biologia molecular
Os vrus da imunodeficincia humana (HIV), gnero
Lentivirus, famlia Retroviridae, foram classificados, de
acordo com propriedades estruturais e genmicas, em dois
tipos, HIV-1 e HIV-2 (Myers e Pavlakis, 1992). O HIV-1,
originalmente descrito por pesquisadores liderados por Luc
Montagnier e Robert Gallo (Barr-Sinoussi et al. 1983; Gallo
et al., 1984), apresenta trs principais grupos de linhagens
similares, designados M (major ou main), O (outlier) e N (new
ou non-M/non-0) (Gutler et al., 1994; Simon et al., 1998).
A maioria das infeces devidas ao HIV-1 causada por
linhagens agrupadas em M, geneticamente distintas, reconhecidas como subtipos filogenticos ou clades. Para o HIV-1,
essas linhagens se classificam de ''!\' a "H", "J" e "K", e, para o
HIV-2, de''!\' a "E" (Gao et al., 1994). O grupo O formado
por algumas linhagens presentes em Camares, Gabo e Guin
Equatoriana, e o grupo N representado por linhagens observadas, at o momento, somente em Camares.
Em 2009, um novo vrus, associado s linhagens do vrus
da imunodeficincia de smios observadas em gorilas (SIVgor),
foi isolado em uma paciente em Camares. Esse vrus, distinto
dos grupos anteriores do HIV-1, considerado o prottipo de
uma nova linhagem (Plantier et al., 2009).

Morfologia e estrutura virai


Clulas suscetveis, linfcitos ou moncitos, infectadas
pelo HIV-1 e HIV-2 produzem partculas virais bastante similares em sua morfologia e composio (Munn et al., 1985). As
partculas virais completas, vrions, em formato esfrico, com
aproximadamente 11 O nm de dimetro, apresentam envoltrio externo, constituindo uma membrana lipdica de camada
dupla (envoltrio ou envelope) que circunda o capsdio e o
nucleocapsdio virai, em forma de cone (Figura 7.1).
A membrana lipdica, derivada da clula hospedeira, contm aproximadamente 72 espculas com simetria triangular
(Gelderblom, 1991), que se apresentam com 9 a 1Onm de comprimento com terminao distal arredondada, com 14 a 15 nm
de dimetro, contendo quatro heterodmeros da glicoprotena
do envelope, compostos por subunidades de superfcie que
interagem com as subunidades transmembrana. As subuniA

dades de superfcie e transmembrana esto associadas, respectivamente, s glicoprotenas virais gp120 e gp41 para HIV-1
e gp130 e gp41 para HIV-2, ligadas no covalentemente. A
glicoprotena de superfcie (SU) constitui o principal antgeno
virai e a protena transmembrana (TM) forma o componente
interno do envelope glicoproteico.
Durante a etapa de brotamento, no processo de formao
da partcula virai, vrias protenas da membrana celular hospedeira podem ser adquiridas e incorporadas membrana
virai lipoproteica, principalmente f3 2 -microglobulina, protenas HLA das classes 1 e II e ciclofilinas (Arthur et al., 1992).
Protenas de adeso, como a molcula de adeso intracelular
1 (ICAM-1), tambm podem ser incorporadas, o que facilita
a adeso a outras clulas-alvo. Alm disso, pode ocorrer tambm a incorporao de lipdios, e h a seleo, por protenas
virais, de regies especficas da membrana plasmtica celular
para a liberao do nucleocapsdio.
A poro mais estreita do nucleocapsdio, com 20 nm de
largura, est conectada membrana lipdica por meio de uma
estrutura proteica, a ligao cpside-envelope (Hglund et al.,
1992). Cada nucleocapsdio contm duas molculas de RNA
genmico de cadeia simples, protenas de membrana e enzi

mas VIrais.
O nucleocapsdio virai (NC) composto pela protena p17,
que constitui a matriz (MA), e pelo capsdio virai (CA), que
engloba o genoma RNA, as protenas p24, p9, p7, a enzima
transcriptase reversa (RT) (p66/p51 ), essencial ao processo de
replicao virai, a enzima protease (plO), necessria maturao das partculas virais e a enzima integrase (p31), responsvel pela integrao do genoma virai ao DNA da clula
hospedeira. Catalisada pelo polipeptdio ln (parte do complexo RTase), a integrao uma reao altamente especfica
em relao ao provrus, mas aleatria em relao ao DNA da
clula hospedeira. Molculas de tRNA em geral especficas a
triptofano, prolina ou lisina, usadas no incio do processo de
transcrio reversa, tambm so observadas no capsdio virai.

Organizao do genoma virai


O genoma virai, com 9,7 kb de extenso, apresenta-se com
duas fitas simples, positivas, associadas nucleoprotena p7,
formando o complexo ribonucleoproteico. Em ambas as extremidades, so observadas sequncias nucleotdicas repetidas
(long terminal repeat - LTR). A estrutura LTR essencial ao
processo de replicao virai, uma vez que a regio U3 de LTR

..

100 nm

200 nrn

Figura 7.1 A. Microscopia eletrnica de partcula HIV purificada. B. Partculas virais em processo de brotamento em cultura de clula (Barth, 201 1).

Captulo 7

99

Infeco por HIV

contm elementos promotores responsveis pelo incio da


transcrio do genoma viral.
A replicao viral, na maioria dos retrovrus competentes,
depende da participao de genes estruturais (gag, pol, env),
genes reguladores ou regulatrios (tat, rev, nej) e genes acessrios ( vpu, vpr, vif, para HIV-1; vpu, vpr, vpx para HIV-2). Os
polipeptdios precursores de protenas do vrion so codificados por essas regies especficas do genoma viral (Wong-Staal,
1991).
O esquema estrutural clssico do genoma retroviral indicado pela expresso 5'LTR-gag-pol-env-LTR3' . As regies LTR
representam as duas partes delimitantes do genoma viral. So
conectadas ao DNA celular da clula hospedeira, aps a integrao, e no codificam para quaisquer protenas virais.
O gene gag codifica precursores de protenas do capsdio
viral: a protena da matriz (MA), formada pela unidade p17;
a protena do capsdio (CA), formada pela unidade p24, e a
protena do nucleocapsdio (NC), formada pela unidade p7.
O gene pol codifica precursores das enzimas protease,
transcriptase reversa (RT) e integrase, essenciais ao processo
de replicao retroviral.
A enzima protease (PR), composta pela subunidade plO,
atua na maturao das partculas virais, no processo de formao das partculas, e em 11 stios de clivagem de poliprotenas
precursoras do HIV-1, gag e gag-pol, e trs stios envolvem as
ligaes fenilalanina-prolina ou tirosina-prolina, dando origem s protenas estruturais codificadas pelo gene gag e enzimas virais codificadas pelo gene pol (Darke et al., 1988).
A transcriptase reversa transcreve o genoma viral RNA de
cadeia simples em DNA provira! de cadeia dupla e formada
por duas subunidades, pS 1 e p66. A subunidade pS 1 no apresenta o domnio RNase H, que observado somente como parte
da subunidade p66 da enzima transcriptase reversa viral. Esse
domnio apresenta como funo a degradao do RNA viral de
fita simples nos hbridos RNA-DNA, liberando o DNA molde
para a sntese do genoma viral (Telesnitsky e Goff, 1997).
A enzima integrase (ln), formada pela unidade p32, atua
na ligao covalente do DNA viral linear de cadeia dupla ao
genoma da clula hospedeira (Brown, 1997).
O gene env codifica precursores (gp160) das glicoprotenas
de envelope (gp120 ou subunidade SU) com stios especficos
de ligao aos receptores celulares e glicoprotenas transmembrana (gp41 ou subunidade TM) ligadas fuso vrus-clula
e clula-clula (Lifson et al., 1986), responsveis pela induo
de sinccios em culturas de clulas.
Variaes na sequncia do gene env tm revelado um
padro de cinco regies variveis intercaladas com regies
conservadas para a subunidade gp120. Diferentemente, a
subunidade gp41 demonstra menor heterogeneidade e, portanto, mais conservada. Essa variao consiste em alteraes
em nucleotdios, que resultam em substituies de aminocidos, pequenas delees e inseres (Leigh-Brown, 1991). At
25% dos aminocidos codificados por env podem variar em
linhagens HIV-1 de regies separadas geograficamente (variao interpaciente). Anlises de sequncias de isolados HIV-2
tambm demonstram cinco regies variveis, intercaladas
com sequncias conservadas na subunidade gp 120 (Burns e
Desrosiers, 1994).
A seleo de variantes env produz populaes de genomas
virais intimamente relacionadas, mas distintas, designadas
quasispecies (variantes intrapacientes) (Wain-Hobson, 1992).
Variaes nas sequncias env tm import antes implicaes
no s nas respostas imunes antivirais, mas tambm na ligao
ao CD4, tropismo celular e citopatogenicidade.

A heterogeneidade na sequncia genmica pode ocorrer


por presses seletivas: o escape a anticorpos que neutralizam
a atividade viral e a adaptao a diferentes tipos de clulas
(Burns e Desrosiers, 1994).

Genes virais acessrios eregulatrios


Adicionalmente aos genes gag, pol e env, o genoma do HIV
codifica outros genes classificados, anteriormente, como genes
acessrios ou auxiliares, uma vez que no eram requeridos nos
processos de replicao in vitro.
Os genes adicionais codificados pelo HIV-1 so os genes
acessrios vif, vpr, vpu e genes regulatrios tat, rev e nef Para
o HIV-2 so os genes acessrios vif, vpr, vpx e regulatrios tat,
rev e nef
Os genes regulatrios nef, tat e rev so produzidos precocemente durante o ciclo de replicao viral. As sequncias tat
(transativador de transcrio) e rev (regulador da expresso
viral) codificam a produo de pequenas protenas externas ao
vrion, essenciais replicao viral. So protenas regulatrias
que se acumulam no interior do ncleo e se ligam em regies
definidas do RNA viral.
O gene tat se liga regio TAR (elementos de resposta
transativao), encontrada em LTR; controla a transcrio da
expresso gentica, aumentando os nveis de RNA viral e elevando a transcrio inicial e/ou alongamento (Peterlin et al.,
1993). Atua como potente ativador da transcrio da regio
promotora de LTR e essencial para o processo de replicao
viral em quase todos os sistemas de cultura in vitro.
O gene rev se liga regio RRE (elementos de resposta rev),
encontrada no gene env, e controla a replicao viral em nvel
ps-transcrio, regulando o processamento e o transporte do
RNA viral do ncleo ao citoplasma (Parslow, 1993).
Ambos, tat e rev, so fundamentais no processo de replicao viral, uma vez que estimulam a transcrio do DNA
HIV-1 provira! em RNA, promovem o alongamento da cadeia
de RNA, aumentam o transporte do RNA HIV do ncleo para
o citoplasma e so essenciais para a traduo. O gene rev ,
tambm, um fator de exportao nuclear, importante para
a troca de protenas reguladoras de expresso precoce por
protenas estruturais sintetizadas posteriormente.
Todos os lentivrus de primatas codificam nef (fator negativo), ao qual so atribudas diversas funes, tais como
aumento da infectividade viral (Bukrinsky et al., 1991), ativao de clulas T (Baur et al., 1994) e regulao de CD4 (Aiken
et al., 1994). A expresso precoce de nef, no ciclo de replicao
viral, assegura a ativao de clulas Te o estabelecimento de um
estado persistente da infeco. Alm disso, promove a sobrevivncia de clulas infectadas, atuando na expresso de vrias
molculas de superfcie, importantes para a funo do sistema
imune do hospedeiro. Essas molculas incluem o complexo
principal de histocompatibilidade 1 e II (MHC 1 e II), presente
em clulas apresentadoras de antgeno (APC) e clulas-alvo
(linfcitos T CD4+, CD28+) (Collins et al., 1998).
Numerosos estudos tm sido publicados sobre as funes
dos genes acessrios, levando em considerao diversos fatores, como diferenas entre as linhagens virais, multiplicidade
da infeco, tipos celulares selecionados para anlise e mtodos utilizados para avaliar a replicao viral. As atribuies
dadas a esses genes acessrios sero descritas a seguir.
O fator de infectividade viral (vij) participa dos processos
de replicao (Strebel et al., 1987) e maturao viral (Hglund
et al., 1992). Dados da literatura tm ressaltado um importante
papel de vif em relao replicao viral (Mariani et al., 2003).
Isolados HIV-1, deficientes em vif, no replicam em clulas

Diagnstico Laboratorial

100
T CD4+, determinadas linhagens de clulas T no permissivas ou em macrfagos. Esses isolados so capazes de infectar
clulas-alvo e iniciar a transcrio reversa; entretanto, a sntese
do DNA provira! permanece incompleta.
A fuso in vitro de clulas permissivas e no permissivas
leva ao fentipo no permissivo, sugerindo que a replicao do
HIV dependa da presena ou ausncia de um inibidor celular.
Esse fator inibitrio endgeno foi identificado como a enzima
cataltica apolipoprotena B, semelhante ao polipeptdio 3G,
atuando na edio do mRNA (APOBEC3G) (Sheehy et al.,
2002). Essa protena pertence famlia de enzimas intracelulares que, especificamente, desaminam a citosina em uracila
no mRNA ou DNA, resultando no acmulo de mutaes G-A,
que leva degradao do DNA virai.
Por meio da formao de complexos com APOBEC3G, vif
bloqueia a atividade inibitria dessa enzima, prevenindo a sua
incorporao s partculas virais recentemente sintetizadas
(Freed, 2004). Assim, inibidores especficos, que possam bloquear a interao de vif com APOBEC3G, ou que previnam a
degradao intracelular desta enzima, poderiam representar
promissoras opes de tratamentos futuros, pois, a princpio,
o bloqueio de estruturas celulares estaria provavelmente associado ao risco mnimo de desenvolvimento de resistncia, que
pode comprometer a eficcia de agentes antirretrovirais.
Em relao aos genes vprlvpx, est bem definido que o
HIV-1 apresenta o gene vpr (codificante para protena virai R),
enquanto o HIV-2 contm vpx (codificante para protena virai
X), associado o Vpr por homologia de sequncias.
Atribui-se a vpx desempenho na adaptao do vrus a espcies primatas (Clements e Wong-Staal, 1992), e estudos para
o gene vpr tm sugerido sua participao na regulao da
expresso de genes celulares e virais, alterando o mecanismo
da clula hospedeira e facilitando a replicao virai. A protena
Vpr desempenha importante papel na regulao da importao, para o ncleo, do complexo de pr-integrao do HIV-1
e requerida para a replicao virai em macrfagos. Alm
disso, a Vpr tambm capaz de interferir no ciclo de replicao celular, induzindo apoptose e resultando em disfuno
imune. O papel imunossupressor atribudo sua capacidade
de sequestrar ativadores de transcrio proinflamatrios no
citoplasma (Muthumani et al., 2006).
O gene vpu (codificante para protena virai U) est presente em HIV-1 e ausente em HIV-2 e demais lentivrus. Est
envolvido no processo de brotamento das partculas virais e
aumento da liberao de vrions em clulas infectadas. Vrus
deficientes em vpu replicam em clulas T CD4+ e macrfagos;
porm, h declnio acentuado na eficincia da liberao de
vrions no meio extracelular (Klimkait et al., 1990).

Dinmica virai e quasispecies


A infeco pelo HIV-1 um processo dinmico em que se
observa equihbrio entre a produo e eliminao de partculas virais, de acordo com estudos de quantificao da carga
virai em plasma e clulas mononucleares do sangue perifrico
de pacientes nos diferentes estgios de AIDS. Em indivduos
infectados, estimado o valor mdio de 109 novas partculas
virais sendo produzidas e subsequentemente eliminadas por
dia (Ho et al., 1989).
O estado de constante equilbrio e a elevada taxa de mutao
genmica do HIV-1 resultam no desenvolvimento de linhagens virais mutantes, selecionadas de maneira mais eficaz sob
condies de presso seletiva, exercida pelo sistema imunolgico ou pela interveno farmacolgica com antirretrovirais.

Essas variantes no so reconhecidas por anticorpos neutralizantes e linfcitos T citotxicos e podem apresentar mutaes nos genes que codificam para as enzimas envolvidas no
mecanismo de replicao virai, o que resulta na substituio de
aminocidos e seleo das quasispecies resistentes aos antirretrovirais (Wang et al., 2002). Em decorrncia, esses frmacos
no exercem sua funo de maneira adequada e a replicao
virai se processa normalmente.
A resistncia aos antirretrovirais, assim como outros fatores, tais como potncia inadequada da medicao, nveis farmacolgicos inadequados, no adeso e/ou interaes medicamentosas, contribuem para o decrscimo da eficincia da
quimioterapia antirretroviral, dificultando no apenas a con <luta clnica em relao doena virai, mas tambm as opes
de tratamento.

Subtipos genticos do H/V-1


O HIV-1 caracteriza-se por extensa heterogeneidade gentica, resultante da interferncia de vrios fatores, tais como
ausncia da capacidade de edio da enzima transcriptase
reversa (Roberts et al., 1988), elevada taxa da dinmica virai in
vivo (Ho et al., 1995), presses seletivas exercidas pelo sistema
imune do hospedeiro (Michael, 1999) e eventos de recombinao de genes durante o processo de replicao virai (Temin,
1993). No grupo M do H IV- 1, a mdia da variabilidade gentica intersubtipos de 15% para o gene gag e 25% para o gene
env (Janssens et al., 1994; Gao, 1996).
Alm dos subtipos j classificados, possvel identificar,
neles, grupos de isolados virais que formam clades geneticamente relacionadas, denominadas subsubtipos (Robertson
et al., 2000). Esses grupos apresentam-se filogeneticamente
mais relacionadas entre si do que aos outros subtipos. Isso
ocorre com as clades A e F, com cepas virais classificadas em
subsubtipos Al e A2, Fl e F2 (Gao et al., 2001; Triques et al.,
2000).
As clades B e D esto mais intimamente relacionadas entre
si do que aos demais subtipos, e a clade D considerada o
precursor da variante clade B africana, mas suas designaes
originais como subtipos so mantidas pela consistncia de trabalhos publicados (Louwagie et al., 1993).
A classificao de subtipos do HIV-1 foi originalmente
fundamentada em regies subgenmicas de genes individuais.
Entretanto, com o aumento do nmero de isolados virais disponveis em todo o mundo e as melhorias em mtodos de
sequenciamento, a sua classificao filogentica baseia-se,
atualmente, tanto em sequncias de nucleotdios derivadas de
mltiplas regies subgenmicas (gag, pol, env) do mesmo isolado, como na anlise da sequncia do genoma completo.
Esse procedimento tem revelado isolados virais nos quais
as relaes filogenticas, com diferentes subtipos, so trocadas
em seus genomas. Acredita-se que essas formas recombinantes intersubtipos originaram-se em indivduos infectados com
cepas virais de dois ou mais subtipos.
Quando um recombinante virai idntico isolado em, no
mnimo, trs pessoas no relacionadas epidemiologicamente e
caracterizado pelo sequenciamento do genoma completo, ele
pode ser designado com uma forma recombinante circulante
(CRF).
Mais de 20 CRF, cujas origens podem ser rastreadas, em
reas onde linhagens parentais so cocirculantes, tm sido
relatadas. A cocirculao de mltiplos subtipos e CRF nas
mesmas populaes aumenta a probabilidade de que indivduos tornem-se "superinfectados" com diferentes formas
genticas do HIV-1. Essas formas podem sofrer trocas de

Captulo 7

Infeco por HIV

101

segmentos de seu material gentico, o que resulta na gerao


de vrios recombinantes, chamados de formas recombinantes nicas (URF), que, se disseminadas a outras pessoas, iro
gerar as CRF (McCutchan, 2006).

Replicao virai
O ciclo de replicao dos lentivrus de primatas divide-se
em duas fases: inicial e tardia. A primeira inicia-se com a ligao do vrion aos receptores de superfcie celular, por meio
da ligao de gp120 aos receptores de superfcie celular, CD4,
com posteriores processos de internalizao e descapsidao
do nucleocapsdio no citoplasma da clula (Figura 7.2).
O domnio CD4 atua como receptor primrio para o HIV no
processo da infeco viral. Ele consiste em uma glicoprotena
monomrica, com 58 kDa, detectada na superfcie celular de
cerca de 60% dos linfcitos T, em precursores de clulas T na
medula ssea e timo, moncitos, macrfagos, eosinfilos, clulas
dendrticas e clulas da micrglia do sistema nervoso central.
So observadas trs regies distintas em CD4 de clulas
T: o domnio extracelular, composto de 370 aminocidos, o
domnio hidrofbico transmembrana, com 25 aminocidos, e
a parte citoplasmtica, com 38 aminocidos.
No domnio extracelular, foram caracterizados quatro
domnios semelhantes a imunoglobulinas, identificados como
regies D 1-D4. Resduos na regio V2, que compreende os
aminocidos 40 a 55, so importantes para a ligao gp120 e
esta regio se sobrepe parte de CD4 onde ocorre a insero
de seus ligantes naturais (molculas HLA da classe II).
A ligao de gp120 ao CD4 no apenas uma etapa crucial
para a penetrao do vrus nas clulas; ela tambm interfere na
via de transduo de sinal intracelular e promove apoptose em
clulas T CD4+ (Banda et al., 1992).
Receptores de citocinas quimiotticas (quimiocinas) atuam
como correceptores de CD4 na infeco celular pelo HIV. As
quimiocinas e seus receptores tm sido caracterizados em rela o ao seu papel em promover a migrao (quimiotaxia) de
leuccitos e sua atividade proinflamatria. O CXCR4 (a-quimiocina) foi descrito como o correceptor para isolados HIV
com tropismo para clulas T (T-trpicos) (Feng et al., 1996),
e o correceptor CCR5 (3-quimiocina) necessrio para isolados H IV monocitotrpicos (M-trpicos) (Doranz, 1996).
DNA
celular

DNA
provira!
integrado

Brotamento

DNA linear
no integrado

-~
~ ~RNA

R~~
~

@ +-"
Vrion HIV

Molcula
CD4

Transcriptase
reversa

+
-......_,_ ._ "'- h

~RNA
~ o ~ """"""'

Correceptor

N ..."'i

gp120

@l!:-@~
@ HIV

Fuso
Sntese de
protenas,
processamento
e montagem

Figura 7.2 Etapas do ciclo de replicao virai.

A ligao de gp120 ao CD4 e correceptores celulares induz


alterao conformacional em gp120, que promove uma interao mais eficiente da ala V3 de gp120 com o seu respectivo
correceptor. A fuso da partcula viral com a membrana da
clula hospedeira dependente dessa interao e tambm de
gp41, uma glicoprotena transmembrana, parte do envelope
glicoproteico gp160.
Aps os processos de adsoro da partcula viral s clulas suscetveis e fuso com a membrana da clula hospedeira,
ocorre a descapsidao do nucleocapsdio viral no citoplasma
celular, e as enzimas virais transcriptase reversa, protease e
integrase permanecem associadas ao nucleocapsdio.
Ocorre, a seguir, a etapa de transcrio reversa: por meio
da ao da transcriptase reversa, catalisando a sntese e polimerizao do DNA, e da atividade RNAse H da transcriptase
reversa, clivando cadeias de RNA, o RNA genmico de cadeia
simples convertido em DNA de cadeia dupla.
O processo de transcrio reversa ocorre no citoplasma da
clula, em uma srie de etapas, descritas a seguir (Goff, 2001;
Rubbert et al., 2007):
Um tRNA celular especfico de lisina atua como iniciador
(primer) e acopla-se ao stio complementar do genoma viral
denominado stio de ligao do primer (primer binding site,
PBS)
O DNA complementar liga-se regio U5 (regio no codificante) e regio R do RNA viral (uma repetio direta
presente em ambas as terminaes da molcula de RNA)
O domnio da enzima transcriptase reversa denominado
RNAse H degrada a terminao 5' do RNA, removendo
U5eR
O primer desloca-se para a extremidade 3' do genoma viral
e a cadeia de DNA recentemente sintetizada acopla-se
regio R complementar no RNA
A primeira cadeia de DNA complementar (cDNA) estendida
e a maior parte do RNA viral degradada pela RNAse H
Finalizada esta etapa inicia-se, a partir do trato polipurina
(regio PTT), a sntese da segunda cadeia de DNA, que a
cadeia senso (+)
Ocorre uma nova etapa de deslocamento: o PBS da segunda
cadeia acopla-se ao PBS complementar na primeira cadeia
Ambas as cadeias so estendidas, o que resulta no DNA
HIV de cadeia dupla com regies LTR em ambas as extremidades.
Essas formas so mantidas em um complexo nucleoproteico,
que subsequentemente transportado ao ncleo e podem ser
integradas ao genoma hospedeiro pela enzima viral integrase,
produzindo o provrus integrado: a integrase se liga ao DNA
viral transcrito e forma o complexo de pr-integrao (PIC).
Uma vez incorporada ao PIC, a integrase atua no terminal
3' removendo o dinucleotdio GT de ambas as extremidades
do DNA viral. A seguir, o PIC transportado do citoplasma
ao ncleo da clula infectada e a integrase catalisa a reao
de transferncia da cadeia, o que resulta na incorporao do
DNA viral ao DNA celular.
A ativao celular, promovida in vivo por contato com antgenos ou infeces oportunistas, necessria para a integrao
do DNA HIV proviral ao genoma da clula hospedeira aps o
transporte do complexo de pr-integrao ao ncleo.
A segunda fase do ciclo de replicao viral ocorre com a
transcrio e processamento do RNA viral a partir do cDNA
proviral, contendo nas extremidades 5' e 3 ', respectivamente,
as estruturas cape poli-A, finalizando com a liberao de partculas virais pelo processo de brotamento.

Diagnstico Laboratorial

102
Inicialmente, a transcrio resulta na sntese precoce de
protenas reguladoras do HIV-1, como Tat ou Rev (Freed,
2004). Tat liga-se ao stio de elemento de resposta transativao (TAR), no incio da sntese do RNA HIV-1 no ncleo, e
estimula a transcrio e formao de longos transcritos RNA.
Rev ativa a expresso de genes estruturais e enzimticos e
inibe a produo de protenas reguladoras, promovendo, desta
maneira, a formao de partculas virais maduras.
As protenas codificadas pelos genes gag e pol formam o
ncleo das partculas maduras. As protenas codificadas pelo
gene gagderivam de molculas precursoras maiores, com 53kDa,
clivadas, pela enzima viral protease, em p24, p17, p9 e p7.
Os produtos codificados por env formam as espculas gp 120 do
envelope viral, a partir de molculas precursoras maiores, gp 160,
tambm clivadas pela protease do HIV-1 em gp120 e gp41.
A clivagem de molculas precursoras necessria gerao
de partculas virais infecciosas (vrions). O processo de formao de novas partculas ocorre em etapas, descritas a seguir:
(1) o cerne das partculas virais formado por RNA HIV-1,
protenas codificadas por gag e vrias enzimas codificadas por
pol; (2) este complexo migra para a superfcie da clula, em
stios onde houve a deposio de gp120 e gp41; (3) molculas
precursoras maiores so clivadas pela protease, resultando em
partculas virais (vrions) pelo processo de brotamento atravs da membrana da clula hospedeira. Durante esse processo,
membranas lipdicas virais podem incorporar vrias protenas
da clula hospedeira, tornando-se enriquecidas em certos fosfolipdios e colesterol.
Em clulas T, o brotamento das partculas virais ocasiona
sua liberao no espao extracelular e, em moncitos e macrfagos, resulta no acmulo de vrions em vacolos celulares.
A replicao dos retrovrus tendenciosa ocorrncia de
erros e caracterizada por elevada taxa de mutaes espontneas. A enzima transcriptase reversa do HIV-1 no tem funo de edio, e os erros que surgem na formao do DNA de
cadeia dupla constituem a fonte da extensa heterogeneidade
gentica do HIV. Estima-se que a taxa de mutao desse processo seja de 10-4, o que resulta, em mdia, em 1a 10 erros por
genoma a cada ciclo completo de replicao.

Patognese
Infeces causadas por lentivrus cursam, tipicamente,
como doenas crnicas, apresentando longos perodos de
latncia clnica, replicao viral persistente e o envolvimento
do sistema nervoso central. Entretanto, o curso da infeco
pelo HIV-1 em determinados pacientes pode variar dramaticamente, mesmo em casos de infeces primrias provenientes de origens comuns (Liu et al., 1997).
Em alguns indivduos so observadas infeces no progressivas de longo termo, que se caracterizam pela ausncia do
declnio no nmero de clulas T CD4+ ou infeces crnicas
que persistem, no mnimo, por 7 anos sem o desenvolvimento
de AIDS. Nesses pacientes foram observados isolados virais
identificados como vrions defectivos ou com reduzida capacidade de replicao (Kirchhoff et al., 1995). Porm, na maioria
dos casos, a infeco caracteriza-se pela presena de vrus com
efetiva capacidade de replicao e elevada taxa diria de reposio de vrions.
Fatores do hospedeiro tambm podem determinar se o curso
da infeco evoluir, rapidamente, para a imunodeficincia clinicamente manifesta ou para o perfil de no progressores de
longo termo, que representam cerca de 5% de todos os pacientes
infectados (Buchbinder et al., 1994; Lefrere et al., 1997).

A identificao e caracterizao de fatores do hospedeiro


que contribuem para o curso da infeco pelo HIV, incluindo
mecanismos de defesa imunolgicos e fatores genticos, so
cruciais para a compreenso da imunopatognese da infeco
pelo HIV e para o desenvolvimento de estratgias imunoteraputicas e profilticas.

HIV e sistema imune


Aps a penetrao do HIV-1 em clulas T CD4+ quiescentes e a finalizao da etapa de transcrio reversa, o genoma
viral apresenta-se como DNA proviral no integrado. A ativao de clulas T CD4+ necessria para a integrao do DNA
do HIV no genoma da clula hospedeira, preferencialmente
em genes ativos, denominados hot spots (Schrder, 2002), e
pr-requisito para a sntese de novos vrions.
O microambiente dos tecidos linfoides representa o meio
ideal para a replicao de novos vrions, propiciando condies especiais tais como o ntimo contato entre as clulas
T CD4+ e clulas apresentadoras de antgeno, a presena de
vrions infecciosos na superfcie de clulas dendrticas foliculares e a abundante produo de citocinas proinflamatrias,
tais como IL-1, IL-6 e TNFa, que promovem a induo da
replicao viral nas clulas infectadas e aumentam essa replicao em clulas j produtoras de vrus (Rubbert et al., 2007).
A replicao viral em tecidos linfoides , realmente, extensa
nos estgios iniciais da doena (Pantaleo, 1993). Durante a fase
inicial da infeco pelo HIV-1, observa-se enorme quantidade
de partculas virais no plasma, seguindo-se relativo declnio da
viremia na maioria dos pacientes. Uma forte e intensa resposta
de clulas T citotxicas especficas para o HIV-1 gerada,
coincidindo com a supresso da viremia plasmtica.
Os vrions so englobados pela rede de clulas dendrticas
foliculares nos tecidos linfoides e os macrfagos, clulas T
CD4+ ativadas e quiescentes so os principais alvos da infeco. Se uma anlise sequencial do tecido linfoide for realizada
durante o curso natural da doena causada pelo HIV-1, ser
observado que a progresso da doena refletida pela destruio da arquitetura do tecido linfo ide com decrscimo no
englobamento de partculas virais (Rubbert et al., 2007).
Vrios estudos imuno-histolgicos indicam que o paracrtex dos linfonodos representa o stio primrio onde a replicao do HIV-1 iniciada (Pantaleo, 1993). A infeco de clulas
T CD4+ circundantes e o incio da ativao de clulas T por
clulas dendrticas contribuem para a disseminao do HIV-1
no tecido linfoide.
Reservatrios virais permanentes, principalmente em
macrfagos e clulas T CD4+ latentemente infectadas, so
estabelecidos na fase precoce da infeco e, provavelmente,
representam o principal obstculo bem-sucedida erradicao do HIV (Rubbert et al., 2007). A frequncia de clulas que
contm o DNA proviral cerca de 5 a 10 vezes maior em tecidos linfoides em relao s clulas mononucleares do sangue
perifrico, e a diferena na replicao viral em tecidos linfoides excede aquela do sangue perifrico em 1O a 100 vezes.
Linfcitos B e T so considerados as principais clulas efetoras da resposta imune antgeno-especfica. Entretanto, as
suas funes esto sob o controle de clulas dendrticas, capazes de selecionar antgenos no sangue perifrico. O reconhecimento de antgenos por clulas T requer o processamento
prvio e apresentao de peptdios antignicos pelas clulas
dendrticas (Rubbert et al., 2007).
As clulas T expressam diferentes receptores que podem
se ligar a peptdios MHC da classe I na superfcie de clu-

Captulo 7

Infeco por HIV

las dendrticas para permitir a ativao de clulas T CDS+


ou molculas MHC da classe II para a ativao de clulas T
CD4+. Assim, a gerao da resposta imune especfica ao HIV
depende do padro individual do sistema HLA, que pode afetar a resposta imune adaptativa. Dependendo do padro de
secreo de citocinas, as clulas T CD4+ podem diferenciar-se
em clulas T helper, THl e TH2. As clulas T CD4+ THl produzem, primariamente, interleucina 2 (IL-2) e interferona
gama (IFN')'), as citocinas que do suporte s funes efetoras do sistema imune: linfcitos T citotxicos (CTL), clulas
natural killer (NK-cells) e macrfagos. As clulas T H2 produzem, predominantemente, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10, citocinas
que favorecem o desenvolvimento da resposta imune humoral
(Rubbert et al., 2007).
A associao entre a resposta imune humoral especfica ao
HIV e o curso da doena menos caracterizada. Indivduos
no progressores de longo termo tendem a apresentar ampla
atividade de anticorpos neutralizantes dirigidos a uma variao de isolados primrios e mostram a persistncia de anticorpos neutralizantes contra vrus autlogos. Entretanto, ainda
no se sabe se esses anticorpos representam parte da proteo
ou se meramente refletem a integridade de um sistema imune
relativamente intacto. Indivduos com substancial risco para a
infeco pelo HIV, mas que so considerados expostos e no
infectados, representam, por definio, aqueles que no apresentam resposta de anticorpos detectveis contra o HIV-1.
Essa definio implica que a resposta humoral sistmica talvez
no represente um mecanismo crucial de proteo (Rubbert
et al., 2007).

lmunopatognese da infeco pelo HIV em pediatria


Em crianas infectadas pelo HIV por meio da transmisso
vertical, o perodo da infeco aguda o perodo neonatal,
caracterizado por nveis de carga viral extremamente elevados, que declinam mais lentamente do que em adultos nos
prximos 2 anos ou mais, at atingirem um valor de set-point
(Tiemessen e Kuhn, 2006). Set-points virais so maiores em
crianas do que em adultos, consistentes com a progresso
mais rpida da doena (Shearer et al., 1997). Na ausncia de
terapia efetiva, cerca de um quarto das crianas infectadas
progride AIDS e 10 a 15% vo a bito no primeiro ano de
vida (The European Collaborative Study, 1994).
A via de contaminao me-filho envolve, por definio,
a transmisso de vrus entre indivduos geneticamente similares, e essa similaridade pode ser maior para alelos mais
comuns. Uma vez que a resposta imune materna molda a
evoluo de vrus autlogos e me e filho so geneticamente
similares, a criana adquire linhagens virais que j apresentam mutaes de escape resposta imune (Tiemessen e Kuhn,
2006). Crianas que adquirem a infeco pelo HIV por transfuses sanguneas, tendem a apresentar melhor prognstico
do que crianas que a contraem por via vertical (Frederick
et al., 1994). Assim, a similaridade gentica me-filho pode
desempenhar papel importante para a explicao das diferenas observadas na histria natural da infeco pelo HIV entre
crianas e adultos (Tiemessen e Kuhn, 2006).
No incio da vida o sistema imune de crianas imaturo,
pois a resposta imune especfica ou adaptativa, mediada por
clulas T e B, pequena ou quase inexistente, dependendo da
exposio prvia a antgenos. Essa capacidade desenvolve-se
com o aumento da exposio a diferentes estmulos antignicos. O sistema imune inato, em contraposio, designado
para constituir uma resposta imediata aps a exposio a
microrganismos, promovida por clulas dendrticas, clulas

103
natural killer, clulas fagocticas (neutrfilos, moncitos e
macrfagos), mastcitos e protenas humorais tais como complemento, citocinas, quimiocinas e protenas antimicrobianas.
Em decorrncia da alterao do ambiente imune no incio da
vida, tipos celulares ligados imunidade inata e adquirida
emergem como importantes fatores na patognese da infeco
pelo HIV em pediatria (Tiemessen e Kuhn, 2006).
Azzoni et al. (2005) demonstraram que a porcentagem e
funo de clulas NK e plasmacitoides (principal populao
celular produtora de IFNa) e clulas dendrticas mieloides
encontravam-se deterioradas em crianas infectadas pelo HIV,
independentemente da carga viral, em particular naquelas
com histria clnica de porcentagens decrescentes de clulas T
CD4+. Os seus resultados indicaram que podem existir diferenas entre adultos e crianas na reconstituio imune inata,
seguida terapia antirretroviral altamente potente (HAART).
Outras clulas que emergem, de maneira crtica, na ligao
entre a imunidade adaptativa e inata so as clulas T natural
killer, que expressam receptores especficos para antgenos
glicolipdicos e compartilham similaridades fenotpicas e
funcionais com clulas T e clulas NK. Essas clulas tm sido
encontradas como alvo para a infeco produtiva pelo HIV e
so seletivamente depletadas durante o curso da infeco, em
adultos e crianas (van der Vliet et al., 2002).
Estudos sobre a imunidade especfica ao HIV tm demonstrado que apenas a frao de clulas T CDS especficas ao HIV
tem a capacidade de produzir citocinas e quimiocinas importantes em suas funes antivirais (Scott-Algara et al., 2005).
As clulas T CD4 desempenham importante papel auxiliando tanto na resposta de anticorpos como na resposta de
linfcitos T citotxicos. A manuteno da integridade dessas
clulas crucial para o controle da progresso da doena causada pelo HIV. Chakraborty et al. (2005) ressaltaram querespostas de clulas T CD4+ especficas ao HIV so prontamente
detectadas em crianas no progressoras que sobrevivem por
perodos prolongados.

Epidemiologia

Meios de transmisso
Os principais meios de aquisio da infeco pelo HIV so
a transmisso sexual, incluindo a via heterossexual e contato
homossexual; a transmisso parenteral, predominante entre
usurios de drogas ilcitas injetveis, e a transmisso perinatal.
Embora a descrio inicial da doena tenha sido feita em
homens homossexuais, a transmisso heterossexual responde
por mais de 80% das infeces e mais de 50% das pessoas
infectadas pelo HIV, em todo o mundo, so mulheres.
A elevada taxa de infeco em mulheres resultou em
grande nmero de crianas infectadas, pois a contaminao
pelo HIV pode ocorrer in utero, durante o nascimento ou por
aleitamento materno. A transmisso me-filho responde por
90% dos casos de infeco em crianas em todo o mundo. Na
frica Subsaariana, a soroprevalncia para HIV em mulheres
grvidas extremamente elevada, com valores estimados entre
20 e 40%. Mais de 95% das crianas so infectadas por transmisso perinatal. Outros meios de transmisso viral, como
transfuso de sangue e derivados, transmisso sexual e abuso
de drogas ilcitas, so bem menos prevalentes.
Em regies com poucos recursos, a preveno da transmisso pelo aleitamento materno continua sendo o principal foco

104
na pesquisa da transmisso me-filho. Esforos para reduzi-la
incluem a terapia antirretroviral materna e a profilaxia neonatal durante o perodo de aleitamento ou modificaes nas
prticas de aleitamento. Por outro lado, em pases mais desenvolvidos, o advento de uma terapia antirretroviral altamente
potente resultou em reduo bastante significativa nas taxas
de transmisso me-filho, atingindo nveis equivalentes a 1
a 2%. Alm disso, nesses pases, o aleitamento materno por
mes reconhecidamente infectadas fortemente desencorajado (Niehues e Lyall, 2007).
Foram estabelecidos dois padres evidentes de epidemia
para a infeco pelo HIV-1 em pacientes peditricos. Um deles
ocorre em pases mais desenvolvidos ou nos quais tenham sido
adotadas polticas diferenciadas de preveno e tratamento,
e caracteriza-se por baixas taxas de infeco, sobrevida prolongada, complicaes decorrentes da terapia antirretroviral
crnica, aderncia medicao e resistncia antirretroviral.
O oposto a esse padro observado em pases em desenvolvimento, onde a ausncia do diagnstico precoce, o acesso
tardio aos cuidados mdicos e a ausncia de opes de tratamento resultam em elevada e precoce mortalidade (Mofenson,
2008).
Na infeco pelo HIV adquirida por via parenteral, o uso
de drogas ilcitas injetveis responde pelo aumento da epidemia na Europa Central e Ocidental, em alguns pases da sia
e Oriente Mdio e em naes industrializadas, estimando-se
em 15,9 milhes o nmero de pessoas infectadas, usurias de
drogas ilcitas injetveis, em todo o mundo (Arasteh e Jarlais,
2008; Mathers et al., 2008)

Dados estatsticos
At o final de dezembro de 201 O foram estimados
33 milhes de pessoas infectadas pelo HIV/AIDS em todo o
mundo, e o nmero de mortes, desde o incio da epidemia,
em 35 milhes. Na populao peditrica, foram estimados
2,5 milhes de crianas infectadas com menos de 15 anos de
idade, e 25 milhes de rfos (UNAIDS, 2010).
Dos 33 milhes de pessoas infectadas, 22,5 vivem na frica
Subsaariana, com metade deste valor registrado em mulheres. Observou-se, nessa regio, que a taxa de prevalncia em
adultos apresenta-se estabilizada em 5%, atribuindo-se a estabilizao reduo da incidncia e ao aumento no nmero de
indivduos infectados com acesso ao tratamento.
Na sia, foram estimados 4,9 milhes de pessoas infectadas pelo HIV, com metade delas registradas na ndia (Centers
for Disease Control and Prevention, 2006). Aproximadamente
85% dos casos de transmisso do HIV, na ndia, so atribudos
ao contato sexual. Na China, dados governamentais estimam
em 1 milho o nmero de pessoas infectadas pelo HIV, que
equivale, na populao em geral, prevalncia de 0,05% (Gill
e Okie, 2007). Dentre os novos casos de infeco, 49% foram
atribudos ao uso de drogas ilcitas e aproximadamente 50%
transmisso sexual.
Nas Amricas, com 3 milhes de adultos e 58 mil crianas infectados, o Caribe ocupa posio de destaque, apresentando a segunda maior taxa de soroprevalncia mundial (Centers for Disease Control and Prevention, 2006).
Nos EUA, em 2009, foi estimado o total de 1,2 milho de
pessoas infectadas. Observou-se que os homens foram responsveis por cerca de trs quartos do nmero de infeces entre adolescentes e adultos. Entre as mulheres, a
categoria predominante de transmisso do HIV foi o contato heterossexual de alto risco, implicado em 80% dos

Diagnstico Laboratorial
casos de novas infeces (Centers for Disease Control and
Prevention, 2009).
Na Amrica Latina e Caribe, foi estimado o total de
1,6 milho de pessoas vivendo com H IV/AIDS, das quais
57 mil eram crianas abaixo de 15 anos de idade. O Brasil
responde pela maioria do nmero de casos totais, tanto
em adultos quanto na populao peditrica. Desde o incio da epidemia, em 1980, o Brasil registrou, at junho de
2011, 608.230 casos da doena, com taxa de incidncia de
17,9 casos por 100 mil habitantes, estando o maior nmero
de casos acumulados concentrado na Regio Sudeste, com
ndices de 56%. Em nosso pas, embora haja mais casos da
doena em homens do que em mulheres, foi constatado, gradualmente, um aumento proporcional de nmero de casos
em mulheres, tendo sido registrado, em 2010, 1,7 caso em
homens para cada 1 em mulheres. A faixa etria de maior
incidncia a de 25 a 49 anos, com a via sexual como forma
de transmisso mais frequente. Na populao peditrica com
menos de 5 anos de idade, observou-se expressiva reduo
do nmero de casos de AIDS: em 2000, foram registrados
863 casos e, em 2010, 482 casos; a diferena equivale a um
decrscimo de 55%. O resultado decorrente da implantao de medidas governamentais para reduo da transmisso
vertical do HIV.

Distribuio geogrfica dos subtipos do HIV-1


Estudos em epidemiologia molecular tm demonstrado que, com exceo da frica Subsaariana, onde quase
todos os subtipos virais, formas recombinantes circulantes
(CRF) e vrias formas recombinantes nicas (URF) tm
sido detectados, existe um padro especfico para a distribuio geogrfica dos subtipos de HIV-1 (Hemelaar et al.,
2006).
Esse padro de distribuio parece ocorrer tanto em consequncia da migrao viral acidental quanto da via de transmisso prevalente na regio, resultando na predominncia de
determinado subtipo naquela populao.
Em uma escala global, as formas genticas mais prevalentes de HIV-1 so os subtipos A, B e C, com o subtipo
c respondendo por quase 50% das infeces em todo o
mundo.
O subtipo A predominante em reas da frica central e
oriental (Qunia, Uganda, Tanznia e Ruanda) e nos pases da
Europa Oriental que constituam a Unio Sovitica.
O subtipo B a principal forma gentica na Europa Central
e Ocidental, nas Amricas e Austrlia e tambm comum em
vrios pases do Sudeste Asitico, norte da frica e Oriente
Mdio e entre homossexuais masculinos da frica do Sul e
da Rssia.
o subtipo c predomina nos pases que apresentam ndices superiores a 80% de todas as infeces globais pelo HIV-1,
como frica do Sul e ndia.
A relevncia das CRF na pandemia da infeco pelo HIV-1
est bem estabelecida, correspondendo a 18% das infeces.
Essas formas representam as cepas virais predominantes no
Sudeste Asitico (CRFO l -AE) e no oeste e centro-oeste da
frica (CRF02-AG) (Osmanov et al., 2002).
No Brasil, a maioria de isolados de HIV-1 agrupa-se nos
subtipos B e F (Morgado et al., 1994). Entretanto, cepas adicionais, tais como os subtipos A, C e D (Caricie et al., 2001;
Morgado et al., 1998; Soares et al., 2005) e formas recombinantes B/F e CRF_02AG (De S Filho et al., 2006), tambm
tm sido relatadas.

Captulo 7

Infeco por HIV

Frmacos antirretrovirais

Desde 1987, quando a zidovudina foi aprovada pela


Food and Drug Administration (FDA) como o primeiro
antirretroviral a ser utilizado no tratamento de pacientes
soropositivos para HIV, 28 compostos encontram-se, atualmente, licenciados e aprovados, divididos em diferentes
categorias:

Inibidores de RT anlogos de nucleosdio (NRTI): abacavir

(ABC); abacavir/lamivudina/zidovudina (Trizivir); abacavir/lamivudina (Epzicom); didanosina (ddl); emtricitabina (FTC); emtricitabina/tenofovir disoproxil fumarato
(Truvada); lamivudina (3TC); lamivudina/zidovudina
(Combivir); estavudina (d4T); zidovudina (AZT, ZDV)
Inibidor de RT anlogo de nucleotdio (NtRTI): tenofovir
disoproxil fumarato (TDF)
Inibidores de RT no anlogos de nucleosdio (NNRTI): nevirapina (NVP); delavirdina (DLV); efavirenz (EFV); etravirina (TMC125, ETR)
Inibidores de protease (IP): amprenavir (APV); atazanavir
(ATV); darunavir (DRV; TMC 114); fosamprenavir (FPV);
indinavir (IDV); lopinavir/ritonavir (Kaletra); nelfinavir
(NFV); ritonavir (RTV); saquinavir mesilato (SQV); tipranavir (TPV)
Inibidor de fuso (PI): enfuvirtida (Fuzeon; T-20; ENF)
Inibidor de correceptor (CRI): maraviroque (Selzentry)
Inibidor de integrase (INI): raltegravir (MK-0518).

Outros compostos que aguardam aprovao para o tratamento incluem: rilpivirina (NNRTI), vicriviroc (CRI) e elvitegravir (GS9137) (INI).
Em 2008 foi aprovado o composto Atripla, que consiste
na combinao tripla de frmacos antirretrovirais, formulada
como plula nica a ser ingerida 1 vez/dia. O Atripla contm
os frmacos tenofovir disoproxil fumarato (NtRTI), emtricitabina (NRTI) e efavirenz (NNRTI) e age tambm contra o vrus
da hepatite B, devido similaridade enzimtica entre a transcriptase reversa de ambos os vrus, HIV e HBV (De Clercq e
Field, 2008).
No Brasil, a produo de antirretrovirais iniciou-se em 1993
e, atualmente, nove compostos so produzidos: zidovudina,
didanosina, associao zidovudina e lamivudina, lamivudina,
estavudina, indinavir, nevirapina, ritonavir e efavirenz. Em
201 O, o Ministrio da Sade anunciou o incio da produo
de tenofovir.
As classes de frmacos mais frequentemente indicadas
para o tratamento da infeco pelo HIV-1 em humanos so
os inibidores de transcriptase reversa anlogos de nucleosdio e nucleotdio (NRTI e NtRTI), inibidores de transcriptase
reversa no anlogos de nucleosdio (NNRTI) e inibidores de
protease (IP).
Os inibidores de integrase, recentemente introduzidos na
terapia antivira!, atuam diretamente sobre esta enzima, responsvel pela integrao do DNA viral ao genoma da clula
hospedeira. Existem, atualmente, vrios inibidores de integrase sob avaliao em ensaios clnicos, e o raltegravir tornou-se o primeiro composto a receber aprovao para uso no
tratamento antirretroviral, tendo sido licenciado pela FDA,
dos EUA, em outubro de 2007.
Alm dos frmacos citados, que atuam no processo de
replicao viral, tm sido descritos frmacos que previnem
a penetrao do vrus na clula, atuando como inibidores de
fuso e inibidores de correceptor.

105
O enfuvirtida (Fuzeon, T-20), peptdio que corresponde
aos aminocidos 638 a 673 da gp41 (domnio HR2 C-terminal)
do HIV-1 (Kilby et al., 1998), foi aprovado pela FDA como o
primeiro inibidor de fuso vrus-clula para uso na terapia
antirretroviral combinada, no tratamento de adultos e crianas
a partir dos 6 anos de idade, em estgio avanado da doena
(Lalezari et al., 2003). Esse frmaco se liga, competitivamente,
ao domnio HRl promovendo o bloqueio entre ambos os
domnios e a inibio da alterao conformacional em gp41,
necessria fuso vrion-clula hospedeira.
Os inibidores de correceptor previnem a penetrao do
H IV nas clulas-alvo. Os antagonistas do correceptor CCR5
atuam por meio da ligao especfica a essa molcula, impedindo a sua interao subunidade viral gp 120. Assim, as
alteraes conformacionais que levam insero ao peptdio de fuso gp41 so prevenidas, bloqueando a penetrao
viral.

Inibidores da transcriptase reversa


Os primeiros frmacos de uso clnico, desenvolvidos para
o tratamento da doena associada ao HIV-1, foram os NRTI
(Furman et al., 1986), que requerem fosforilao forma trifosfato para inibir a enzima viral.
O mecanismo de ao de todos os compostos anlogos de
nucleosdio semelhante ao da zidovudina (AZT) e consiste
na atuao de formas trifosfato como inibidores ativos da RT
HIV-1, desempenhando a funo de finalizadores de cadeia
do processo de transcrio reversa e, assim, inibindo a sntese
do cDNA viral (Schinazi, 1993).
A didanosina (ddl) um pr-produto da didesoxiadenosina (ddA) e evita a toxicidade observada para ddA administrada oralmente. Na clula, ddl convertida a ddA e o inibidor ativo da RT HIV , de fato, a didesoxiadenosina trifosfato
(ddA-TP).
Os compostos ddA, didesoxicitidina ( ddC), didesidrodesoxitimidina (d4T) e tiacitidina (3TC) so fosforilados por
enzimas quinase celulares a trifosfato e competem com dATP,
dCTP, dTTP e dCTP, respectivamente, pela ligao RT HIV.
O abacavir um anlogo de guanosina e compete com dGTP
pela incorporao (Hanna e Hirsch, 2000).
Os NNRTI no requerem o processo de ativao metablica e no competem com o substrato natural para a ligao
RT HIV-1, mas so capazes de inativar diretamente a enzima
por alosteria, ligando-se ao stio hidrofbico na subunidade
p66 de RT, prximo ao stio enzimtico cataltico (DeClercq,
1997).
Esse stio especfico em RT funcionalmente relacionado
com o stio de ligao do substrato natural (dNTP), e a ligao dos NNRTI pode, indiretamente, afetar a conformao de
resduos aspartato (Asp- 185, Asp-186 e Asp-110), prximos ao
stio ativo da polimerase (Kroeger et al., 1995), levando a um
reposicionamento desses resduos. Assim, os NNRTI podem
inibir a RT H IV por bloqueio do stio ativo em uma conformao inativa, remanescente da conformao da subunidade
p51 da RT HIV (Tantillo et al., 1994).
Os NNRTI no apresentam os riscos de efeitos colaterais
txicos, decorrentes da interferncia com o metabolismo dos
nucleotdios e biossntese de cidos nucleicos, que esto associados aos NRTI, tais como anemia e neutropenia, e podem
atuar logo no incio da replicao viral, inativando a RT dentro
do prprio vrion (Zhang et al., 1996).
Mais de 25 subclasses diferentes desses compostos tm
sido descritas e mostram grande variedade de estruturas

106
qumicas. A hidroxietoximetil fenotiotimina (HEPT) foi
o primeiro composto NNRTI a ser identificado como inibidor especfico de HIV-1 (Baba et al., 1989), e o MKC442 o seu derivado clinicamente ativo (Baba et al., 1994).
Entretanto, a nevirapina (NVP) foi o primeiro NNRTI
aprovado para uso clnico, aps ensaios clnicos multicntricos demonstrarem o benefcio de sua adio aos regimes
com AZT e ddl (D'.Aquila et al., 1996), o que melhorou os
parmetros virolgicos e imunolgicos da doena causada
pelo HIV.
Outros NNRTI aprovados para uso clnico so delavirdina
(bis-heteroarilpiperazina, BHAP, DLV), efavirenz (DMP266, EFV) e etravirina (TMC125, ETR). Entretanto, a rpida
emergncia de resistncia a DLV e EFV (Saag et al., 1993)
e o elevado nvel de resistncia a ETR, observado em estudos in vitro (Brillant et al., 2004), limitaram o seu uso como
monoterapia: cada composto deve ser usado em conjunto
com outros frmacos antirretrovirais para que haja benefcio
substancial.

Inibidores de protease
Os IP so anlogos sintticos e assemelham-se aos aminocidos, que so reconhecidos e especificamente clivados pela
enzima. A forte ligao desses compostos ao substrato enzimtico inibe a atividade da protease, impedindo a maturao
de partculas virais infecciosas.
Todos os IP atuam no centro ativo enzimtico, que pode
acomodar sete aminocidos, responsveis pela definio da
sequncia de reconhecimento requerida pela protease do
HIV-1 para proceder clivagem no ciclo de replicao viral.
Essa regio de ligao consiste em sub-regies menores, designadas Sl , S2 e S3, e cada inibidor da protease liga-se, preferencialmente, a uma ou mais dessas sub-regies.
A ligao dos IP, interagindo com vrios aminocidos desta
regio especfica, dependente do tamanho de sua molcula.
As mutaes selecionadas pelos antirretrovirais afetam, diretamente, o stio cataltico enzimtico, causando resistncia aos
inibidores pelo decrscimo da capacidade de ligao desses
quimioterpicos. O indinavir o maior deles e interage com
o maior nmero de aminocidos no dmero protease. O composto que apresenta a menor estrutura molecular conhecida
o amprenavir (Flexner, 1998).
O primeiro IP aprovado para uso humano foi o saquinavir,
em 1995, e, em 1996, foram aprovados ritonavir e indinavir.
Todos os IP inibem as enzimas citocromo P450, que metabolizam esses frmacos, sendo o ritonavir o inibidor enzimtico mais potente (Denissen et al., 1997). Quando o ritonavir
administrado com outros inibidores de protease, um considervel aumento farmacocintico observado, o que eleva significativamente o nvel plasmtico de outros IP (Kempf et al.,
1997).

Terapia antirretroviral altamente potente


O HIV foi descoberto em 1982, mas as estratgias para a
interveno farmacolgica foram introduzidas somente 5 anos
depois, com a aprovao, pela Food and Drug Administration,
dos EUA, do AZT para o tratamento da sndrome da
imunodeficincia adquirida (AIDS).
Os regimes teraputicos iniciais perduraram como monoterapia com AZT at 1991, com a liberao da didanosina para
o tratamento. A seguir, novos frmacos inibidores da enzima
transcriptase reversa viral foram aprovados e o esquema tera-

Diagnstico Laboratorial
putico passou a consistir na associao de dois compostos.
Entretanto, esses esquemas resultavam, frequentemente, em
falha no tratamento.
Em 1995, com a aprovao do primeiro composto inibidor
da protease viral, saquinavir, deu-se incio terapia antirretroviral altamente potente (HAART), que consiste na administrao de, no mnimo, trs agentes antirretrovirais, sendo dois
inibidores da TR e um inibidor de protease.
A partir dessa modificao, considervel melhoria foi constatada no estado de sade de pacientes submetidos terapia
antirretroviral, caracterizada por nveis indetectveis da carga
viral que perduravam por perodos prolongados de tempo
(Gulick et al., 1997), elevao nos nveis de clulas T CD4+
revelando melhor estado imunocompetente e melhor expectativa de sobrevida e qualidade de vida dos pacientes (Palella
et al., 1998).
Entretanto, a administrao inicial da terapia antirretroviral altamente potente geralmente inclua frmacos com
esquemas de dosagem complexos, requerimentos de restrio
alimentar, efeitos adversos relacionados com o tratamento e a
necessidade da ingesto diria de 16 a 20 comprimidos. Essas
barreiras resultavam, frequentemente, em fraca adeso dos
pacientes ao tratamento, com subsequente falncia teraputica
e o desenvolvimento de linhagens virais resistentes aos compostos inibidores da RT e protease.
Normas atuais e informaes contidas em manuais especficos sugerem o incio da terapia em pacientes que apresentem sinais e sintomas clnicos definindo a sndrome da
imunodeficincia adquirida, independentemente da contagem de clulas T CD4+ ou da carga viral, ou, em pacientes
assintomticos, com contagem de clulas T CD4+ equivalente
a 350 clulas/mm3 ou abaixo deste valor.
Em pacientes que apresentem contagens superiores a 350 clulas/mm3 e valores de carga viral acima de
100.000 cpias/mf , a deciso de incio da terapia fica a critrio do mdico responsvel pelo atendimento ao paciente.
Alguns preferem retardar o tratamento e outros consideram o seu incio imediato. O tratamento dever ser postergado em pacientes que apresentem contagens de clulas T
CD4+ acima de 350 clulas/mm3 e cargas virais abaixo de
100.000 cpias/mf .
Quando h indicao para o incio da terapia, a seleo dos
frmacos apropriados baseia-se em diferentes fatores, como
gravidez, presena de comorbidades (doena heptica, depresso, doenas cardiovasculares), potencial de aderncia (regimes de dosagem, quantidade de comprimidos, frequncia das
doses), restries alimentares (dosagens em relao s refeies), efeitos adversos dos frmacos e potencial de interao
dos antirretrovirais includos no tratamento.
Nos ltimos 10 anos, novos agentes antivirais foram introduzidos no esquema teraputico, visando propiciar melhorias na aderncia dos pacientes submetidos ao tratamento,
tais como dosagens mais convenientes, com menor nmero
de comprimidos a serem ingeridos; alteraes na formulao
e farmacocintica, resultando em reduo na frequncia das
dosagens ou na quantidade de plulas; e dosagens coformuladas, contendo dois ou mais frmacos em um nico comprimido.
Outros aperfeioamentos incluram o aumento da potncia de novos agentes, frmacos eficazes contra linhagens virais
altamente resistentes, melhorias no perfil de efeitos adversos
(diminuio de efeitos gastrintestinais, melhoria do perfil
lipdico) e o reforo dos inibidores de protease com ritonavir,
potente inibidor da ao do citocromo p450.

Captulo 7

Infeco por HIV

Mutaes e resistncia aos antirretrovirais


Mutaes relacionadas com a resistncia aos antirretrovirais tm sido relatadas para todos os compostos usados no tratamento de pacientes infectados e, mesmo antes da administrao da terapia antivira!, linhagens resistentes podem estar
presentes em nveis reduzidos.
Durante a terapia, a manuteno da supresso viral depende
do nvel preexistente de linhagens resistentes, da taxa de replicao viral e da frequncia de mutaes necessrias ao desenvolvimento de resistncia.
A resistncia primria aos frmacos ou resistncia transmitida definida como a resistncia observada em indivduos
previamente no tratados. Uma vez que a resistncia aleatria
aos frmacos ocorre sem exposio aos medicamentos, este
tipo de resistncia implica a transmisso de vrus mutantes
resistentes, tanto diretamente como por meio de um ou mais
intermedirios, a partir de indivduos com resistncia adquirida.
Indivduos no tratados previamente incluem pessoas
sem tratamento com evidncias laboratoriais para a infeco
recente (geralmente no perodo precedente de 6 a 18 meses),
os recentemente diagnosticados com infeco de durao
incerta e aqueles previamente diagnosticados com infeco de
durao incerta.
A infeco primria pelo HIV-1 deve ser distinguida da
resistncia primria aos frmacos. Na infeco, o termo "primri' usado para descrever pessoas que tenham sido recentemente infectadas e, na resistncia, refere-se a indivduos com
resistncia viral transmitida.
A resistncia secundria aos frmacos ou resistncia adquirida definida como a forma de resistncia desenvolvida em
pessoas que tenham sido submetidas terapia antirretroviral. A resistncia adquirida resulta do surgimento da variao gentica da populao de vrus no indivduo infectado,
seguida pela seleo das variantes resistentes aos frmacos
durante a terapia.

Padres de resistncia virai


Padres de mutao no gene pol do HIV-1 tm sido relatados para os compostos NRTI, NNRTI e IP usados no tratamento de pacientes infectados, na vigncia da terapia antirretroviral prolongada (Brenner et al., 2002) ou em pacientes
que no apresentam tratamento prvio (Njera et al., 1995;
Simonetti et al., 2003).
O nvel de resistncia aos inibidores de RT anlogos de
nucleosdio proporcional ao nmero de mutaes ocorridas
na regio que codificam para a enzima do HIV-1 (Richman
et al., 1991) e, em geral, os efeitos clnicos decorrentes de muitas dessas mutaes se sobrepem. Para os no anlogos, uma
nica mutao suficiente para conferir resistncia aos compostos atualmente utilizados no tratamento antivira!.
As mutaes primrias so, geralmente, selecionadas no
incio do processo de acmulo de mutaes que conferem
resistncia aos antirretrovirais; so relativamente especficas
aos inibidores e podem atuar na suscetibilidade viral ao frmaco.
As mutaes secundrias acumulam-se em genomas virais
que j apresentem uma ou mais mutaes primrias. Algumas
mutaes secundrias podem apresentar pouco ou no apresentar, individualmente, efeito considervel sobre a resistncia viral; entretanto, a seleo pode ocorrer mais pelo fato de
poderem estimular a capacidade de replicao viral do que
pelo decrscimo de ligao do frmaco s enzimas-alvo.

107

Mutaes de resistncia aos NRTI


Em 2007, Shafer et al. propuseram consideraes para
o desenvolvimento de uma lista de mutaes de resistncia
viral para estimativas epidemiolgicas, incluindo mutaes
que causem ou contribuam para a resistncia, que sejam
desenvolvidas em indivduos em tratamento e aplicveis a
todos os subtipos virais do grupo M. Essas mutaes foram
agrupadas em:

Mutaes aos anlogos de timidina (TAM): tambm deno-

minadas mutaes de exciso de nucleotdio, promovem


o desbloqueio de cadeias de DNA viral interrompidas por
ao dos NRTI, por meio de fosforlise via ATP
Mutaes aos no anlogos de timidina: referem-se a regimes teraputicos que incluem abacavir, didanosina ou
tenofovir
Mutaes de resistncia a mltiplos NRTI: ocorrem nos
cdons 62, 75, 77 e 116, associadas s mutaes no cdon
151, e conferem elevados nveis de resistncia a abacavir,
didanosina, estavudina e zidovudina
Mutaes acessrias: ocorrem com as TAM e esto associadas a redues na suscetibilidade a mltiplos NRTI
Mutaes de hipersuscetibilidade: vrias mutaes esto
associadas suscetibilidade aumentada aos NRTI.

Mutaes de resistncia aos NNRTI


As mutaes de resistncia aos NNRTI so encontradas
prximo ao stio hidrofbico da subunidade p66 de RT e classificam-se em:

Mutaes de resistncia aos NNRTI: conferem diferentes


nveis de resistncia a nevirapina, delavirdina e efavirenz,
com exceo das mutaes P225H, com resistncia somente
a efavirenz e P236L, com resistncia somente a delavirdina
Mutaes adicionais: incluem vrias mutaes incomuns,
associadas terapia com NNRTI e suscetibilidade reduzida a esses compostos
Mutaes polimrficas: apresentam pouco efeito sobre a
resistncia aos antirretrovirais. A exceo a este grupo
a substituio polimrfica K103R, que ocorre em cerca de
1 a 2% de indivduos no tratados, reduzindo a suscetibilidade, em 15 vezes, a nevirapina, delavirdina e efavirenz,
quando associada mutao Vl 79D
Mutaes em posies adicionais: selecionadas por etravirina, causam reduo da suscetibilidade a este frmaco ou a
cada um dos NNRTI.

Mutaes de resistncia aos IP


Essas mutaes afetam, diretamente, o stio cataltico enzimtico (posies 25 a 27), causando resistncia pelo decrscimo da capacidade de ligao desses quimioterpicos e classificam-se em quatro categorias:
Mutaes de resistncia aos IP
Mutaes adicionais
Mutaes acessrias polimrficas e no polimrficas,
nas quais os polimorfismos so definidos como mutaes naturais que ocorrem, frequentemente, em vrus no
expostos presso seletiva dos frmacos e as mutaes
no polimrficas so aquelas que no ocorrem na ausncia de terapia
Mutaes de hipersuscetibilidade, que podem aumentar
a suscetibilidade a todos os IP, a um grupo de compostos
(p. ex., atazanavir, saquinavir e tipranavir) ou a compostos
individuais (p. ex., tipranavir, fosamprenavir).

Diagnstico Laboratorial

108

Mutaes de resistncia aos inibidores de fuso


Mutaes no gene env do HIV-1, que codifica para a
glicoprotena 41 (gp41), domnio HR-2, foram relatadas em
oito posies conferindo resistncia ao enfuvirtide. Mutaes
acessrias, associadas a outras mutaes especficas nas posies 36 a 45, contribuem para uma capacidade melhor de
replicao virai.

Mutaes de resistncia aos inibidores de integrase


Mutaes de resistncia aos inibidores de integrase (INI),
selecionadas em indivduos em tratamento com raltegravir ou
elvitegravir, tm sido caracterizadas para a suscetibilidade in

vitro.

. . . Diagnstico laboratorial
Infeco pelo HIV e marcadores virais
Na infeco inicial pelo HIV observa-se importante
aumento da carga virai e de antgeno p24, posteriormente inibido pela ativao da resposta imune (Figura 7.3). Perodos
de incubao, que variam de alguns dias a 3 meses, tm sido
descritos, e a soroconverso ocorre entre 1 e 1O semanas aps
o incio da doena (Cooper et al., 1987). Anticorpos contra o
HIV-1 podem ser detectados por teste de imunofluorescncia em perodos de 2 a 8 dias aps o incio da infeco (Clark
et al., 1991). Testes de radioimunoprecipitao e Western blot
podem ser reativos em perodos de 2 semanas de doena clnica, enquanto testes imunoenzimticos tornam-se reativos
posteriormente (Gaines et al., 1987), em perodos mdios de
31 a 58 dias. A seguir, estabelecida uma condio de equihbrio entre vrus e hospedeiro, varivel de pessoa a pessoa e
que pode ser preditiva de um curso clnico de longa durao.
Em adultos, perodos mdios anteriores ao desenvolvimento
da AIDS tm sido estimados em 10 anos, na ausncia de terapia (Rutherford et al., 1990). Nessa fase, indivduos infectados
geralmente apresentam baixos e persistentes nveis de viremia
e depleo gradual de linfcitos T CD4+ que, na ausncia de
tratamento, pode levar a uma grave imunodeficincia e ao
aparecimento de infeces oportunistas, neoplasias e morte.
No estgio final da doena, so observados novamente nveis
elevados da carga virai e antgeno p24.

Avaliao de resistncia aos antirretrovirais

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Semanas a meses
Meses a anos
Sintomas
Infeco aguda
Perodo assintomtico
- - RNA-HIV (cpias/m.e)
cDNA-HIV em PBMC

Clulas T CD4+
Agp24

Tempo

- -Ac

Figura 7.3 Marcadores biolgicos e imunolgicos do HIV-1 , associados


a infeco e doena.

Testes quantitativos de biologia molecular melhoraram sensivelmente o monitoramento da doena, avaliando no s o


prognstico como tambm a resposta terapia antirretroviral.
Tcnicas de amplificao genmica ou de sinais, empregando
as tecnologias reversed transcriptase-polymerase chain reaction
(rT-PCR), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)
e branched-DNA (b-DNA) permitem avaliaes quantitativas
do RNA virai no plasma, mesmo no incio da infeco (Piatec
et al., 1993).
A determinao qualitativa do cDNA virai recomendada, principalmente, para o diagnstico da infeco pelo
HIV em crianas nascidas de mes soropositivas, com idade
at 15 meses, nas quais a permanncia de anticorpos maternos
pode determinar resultados falso-positivos, e tambm em casos
de infeco recente, com perodos inferiores a 2 ou 3 meses, nos
quais no tenha havido, ainda, a soroconverso e em casos de
indivduos com resultados de testes sorolgicos duvidosos ou
indeterminados, observados em pacientes com hepatite alcolica, anormalidades imunolgicas ou neoplasmas, mulheres
multparas e indivduos politransfundidos, os quais tm desenvolvido anticorpos contra antgenos HLA classe li, presentes
em linhagens de clulas com replicao do HIV.
Muitas metodologias foram desenvolvidas e aplicadas
utilizao rotineira para o estudo de marcadores biolgicos e
imunolgicos, associados a infeco e doena causadas pelo
HIV (Figura 7.3). As tcnicas so: determinao sorolgica
de anticorpos circulantes; deteco e quantificao de antgenos virais (Agp24); deteco e quantificao do genoma virai,
cDNAouRNA.

Testes imunolgicos
Os testes aplicados ao diagnstico da infeco pelo HIV,
pela pesquisa de anticorpos circulantes, podem apresentar diferentes abordagens metodolgicas, como os mtodos
imunoenzimticos (Enzyme Linked Immunosorbent Assay
[ELISA] e Enzyme Linked Fluorescent Assay [ELFA]), o
mtodo quimioluminescente e outros tipos de testes, como
a aglutinao que emprega antgenos ligados a partculas de
ltex, gelatina ou hemcias, e de revelao direta.
Os imunoenzimticos, mais comumente utilizados, empregam antgenos adsorvidos em fases slidas, que podem ser
protenas recombinantes obtidas por engenharia gentica,
peptdios quimicamente sintetizados (geralmente gp41 e
p24 para o HIV-1 e gp36 para o HIV-2) ou o prprio vrus
inativado (lisado virai).
Esses mtodos so, preferencialmente, utilizados para rastreamento em bancos de sangue e amostras sorolgicas de
indivduos com sintomatologia sugestiva ou assintomticos
e com histria de situao de risco. Os testes licenciados e
comercializados atualmente apresentam elevada sensibilidade
e especificidade, com ndices de 98 a 99%, e a possibilidade de
automao permite a anlise de um grande nmero de amostras em pequeno intervalo de tempo.
Um teste sorolgico, reativo para anti-HIV em uma primeira amostra, dever ser repetido, com a mesma amostra,
por metodologia de diferente procedncia. Se for reativo novamente, deve-se considerar o resultado positivo. Recomenda-se
a repetio da mesma rotina, em uma segunda coleta, como
conduta para confirmar essa positividade em mtodo imunoenzimtico e em conjunto com outros testes de confirmao.
Os mtodos de Western blot e imunofluorescncia em clulas
fixadas so amplamente utilizados como testes confirmatrios,
em funo de sua especificidade.

Captulo 7

Infeco por HIV

O Western blot um mtodo com elevada sensibilidade e


especificidade que permite identificar anticorpos contra os
diferentes constituintes do HIV-1. A metodologia do teste utiliza antgenos do vrus, obtido em cultura de linhagem celular
ou sinteticamente obtidos, separados em distintas regies, por
eletroforese em gel de poliacrilamida, de acordo com seu peso
molecular. A transferncia para uma membrana de nitrocelulose permite a reao entre os antgenos fixados na membrana e os anticorpos, presentes no soro ou plasma de indivduos infectados. Padres de positividade podem ser definidos
como: (1) reatividade para p24 ou p31 e (2) gp41 ou gp120/
gp 160, com recomendaes de que pelo menos uma das duas,
p24 ou gp120/gp160, seja identificada (Centers for Disease
Control and Prevention, 1989).
A ausncia de reaes especficas para os diferentes antgenos do HIV confirma a reao negativa, e padres que no
atendam ao critrio de positividade estabelecido so considerados indeterminados. Resultados indeterminados podem ser
observados em indivduos com soroconverso precoce ou em
fase avanada da infeco pelo HIV-1, casos de infeco pelo
HIV-2 ou por reatividade cruzada com aloanticorpos (gravidez e indivduos politransfundidos) ou autoanticorpos (neoplasias e doenas autoimunes).
A deteco do antgeno p24 do HIV-1, no sangue perifrico,
clinicamente importante por seu valor para o diagnstico da
infeco, previamente ao perodo de soroconverso. Aps a
exposio ao HIV, o antgeno p24 est presente, no soro, por
perodos que se estendem de poucas semanas a vrios meses
at o desenvolvimento de anticorpos (Cooper et al., 1987). A
formao de complexos antgeno-anticorpo dificulta a deteco dos nveis de antgeno circulante, que pode tornar-se indetectvel por meses a anos. A antigenemia novamente detectada com a evoluo do quadro clnico, associada a prognstico
desfavorvel e falncia imunolgica. Mtodos para a deteco
do antgeno p24, incluindo os de dissociao cida, consistem
em ensaios imunoenzimticos que utilizam anticorpos monoclonais antip24 (Merigan et al., 1989). Testes de quarta gerao
que detectam simultaneamente AgHIV e anticorpos anti-HIV
permitem reduzir para 5 dias o perodo de janela imunolgica
(Long, 2011; Pavie et al., 2010).

Testes de biologia molecular


Mtodos de biologia molecular, que permitem a amplificao genmica ou aqueles que amplificam sinais, tm sido
amplamente utilizados para detectar e quantificar cDNA
e RNA do HIV-1, a partir de sangue total e soro ou plasma
(Piatec et al., 1993).

cDNA virai 1 Determinao qualitativa


A determinao qualitativa do cDNA viral ou DNA provira! feita pela reao em cadeia da polimerase (PCR). Ela se
aplica confirmao de resultados de testes imunoenzimticos
reativos e Western blot indeterminados, que requerem avaliaes clnicas e acompanhamento laboratorial, com a coleta de
novas amostras. O mtodo permite a amplificao exponencial
de sequncias do cido nucleico, com elevadas especificidade e
sensibilidade (Rozera et al., 2010).

RNA virai 1 Determinao quantitativa (carga virai)


A carga viral traduz o nmero de partculas virais no sangue perifrico e, por meio de metodologias de amplificao
do cido nucleico ou sondas marcadas, pode ser estimada
pela quantificao direta do RNA viral no plasma de pacien-

109
tes infectados. A avaliao da carga viral permite estabelecer
o estgio da infeco viral e o risco de evoluo AIDS, indicar o incio da terapia antirretroviral e monitorar a resposta
terapia, e pode, com ressalvas, ser utilizado como teste confir, .
mator10.
Diferentes mtodos moleculares esto disponveis comercialmente para a quantificao do cido nucleico viral, com
variados graus de sensibilidade. Cada um deles utiliza diferentes estratgias para as etapas requeridas para o preparo da
amostra, amplificao e deteco, alcanando limites bastante
baixos de quantificao, equivalentes a 50 a 80 cpias de RNA
por mililitro de plasma.
Os mtodos de escolha, tais como Amplicor HIV-1 Monitor,
NucliSens HIV-1 QT assay, Versant HIV- lRNA assay (bDNA)
e LCx HIV RNA Quantitative Assay, apresentam constantes
atualizaes que levam ao desenvolvimento de tecnologias
mais sensveis e especficas.

Amplificao e deteco em tempo real (real-time PCRJ


Um importante avano na determinao da carga viral para
HIV-1 foi a implementao da deteco, em tempo real, do
produto acumulado durante a fase exponencial da amplificao por PCR ou NASBA, em contraposio aos ensaios tradicionais com titulao final (Heid et al., 1996). O mtodo permite reduzir o nmero de etapas, manipular a amostra e prever
o risco de contaminao, mantendo a sensibilidade e especificidade dos ensaios de amplificao tradicionais, mas com uma
variao linear muito mais expandida, da ordem de 5 log10
Estudos comparativos do desempenho dos diferentes produtos so publicados com frequncia, o que permite uma anlise bastante apropriada (Bourlet et al., 2011; Ssebugenyi et al.,
2011).
Os mtodos comercialmente disponveis so:

AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test: tem como alvo a


sequncia conservada do gene gag do HIV-1, amplificada de
forma seletiva na presena de um RNA como padro interno,
dUTP e AmpErase. A reao real-time PCR (RT-PCR) se
processa pela adio de enzima recombinante com atividades de transcrio reversa e DNA polimerase, sondas marcadas com fluorforos e quencher e enzima com atividade
exonuclease (Meng et al., 2001). A faixa de deteco do teste
situa-se entre 40 e 1 x 107 cpias por mililitro de plasma
NucliSens EasyQ HIV-1 (bioMerieux): a deteco em tempo
real dos amplicons ocorre durante a fase exponencial da
reao NASBA, por meio de sondas moleculares marcadas
com fluorforos que diferenciam entre a sequncia-alvo
especfica e amplicons calibradores (Tyagi et al., 1998). De
acordo com estudos desenvolvidos por de Mendoza et al.
(2005), o ensaio apresenta especificidade de 99,3% com
variao linear entre 50 e 3 X 106 UI/m.t'
RealTime HIV-1 Assay (Abbott Laboratories): a sequnciaalvo o gene pol do HIV-1. utilizada, na reao, uma
nica sonda que apresenta cadeias parcialmente duplas,
marcadas com fluorforo (reprter) na terminao 5' e
quencher na terminao 3' da cadeia complementar, menor.
Na presena da sequncia-alvo, ocorre a ligao preferencial da sonda reprter, que fluoresce sob a liberao da
sonda quencher. As caractersticas do ensaio indicam
variao linear de 5 log10, especificidade de 100%, probabilidade de 95% de deteco de amostras com carga viral
equivalente a 25 cpias por mililitro e reconhecimento de
subtipos virais dos grupos M, N, e O (Bourlet et al., 2011;
Ssebugenyi et al., 2011).

110

Genotipagem do HIV-1
O mecanismo de resistncia do HIV-1 aos frmacos antirretrovirais o principal obstculo ao sucesso da terapia e
decorre, principalmente, do desenvolvimento de mutaes
no genoma viral, em regies que codificam para as enzimas
envolvidas no processo de replicao viral; em consequncia, a
funo enzimtica no afetada por inibidores virais e a replicao se processa normalmente.
Testes para a avaliao da resistncia viral podem ser teis,
esclarecendo aspectos da interao frmaco-hospedeiro e,
quando associados aos valores de carga viral e clulas T CD4+,
podem auxiliar na determinao de alteraes de esquemas
teraputicos ou na introduo do regime antivira!.
Vrios mtodos laboratoriais foram padronizados e aplicados
deteco de mutaes associadas resistncia antirretroviral,
incluindo-se tcnicas de clivagem por RNase (Lpez-Galndez
et al., 1991), sistemas de hibridizao RNA/RNA (Japour
et al., 1991 ), reao em cadeia da polimerase (Richmann et al.,
1991), ensaio de sondas lineares (Stuyver et al., 1997) e a genotipagem por sequenciamento do cDNA viral (Johnston-Dow
et al., 1998), que o mtodo de escolha para a determinao
de mutaes em genes especficos do genoma viral, indicando
nveis de resistncia aos antirretrovirais. Os resultados obtidos
por todas as metodologias devem ser cuidadosamente interpretados em associao a outros parmetros, tais como medicao prvia, informaes clnicas e dados laboratoriais.

Fenotipagem
A suscetibilidade viral aos frmacos pode, alternativamente, ser avaliada por testes de resistncia fenotpica, que
consistem na quantificao da sensibilidade aos antirretrovirais. Inculos virais, identificados como cepas selvagens e
mutantes, so mantidos em culturas celulares, sob a presso
seletiva de frmacos antivirais, em concentraes crescentes,
expressas em ICSO (ndice que indica a concentrao mnima
do frmaco requerida para inibir 50% da replicao viral). A
supresso da produo viral in vitro determinada para os
inculos virais em comparao aos valores cut-off estabelecidos, decisivos na interpretao dos resultados. Esse mtodo de
avaliao da resistncia viral apresenta algumas desvantagens:
um procedimento moroso e de custo elevado e, para alguns
frmacos, no esto estabelecidos os valores de cut-off clnico.

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Captulo 8
ln eco por HPV

Jos Eduardo Levi

Introduo, 114
Diagnstico laboratorial, 116
Referncias bibliogrficas, 119

Diagnstico Laboratorial

114

. .,. Introduo
Histrico
Nos ltimos 20 anos muitas mudanas conceituais ocorreram na rea de estudo dos papilomavrus humanos (HPV), bem
como na sua relao com cncer de colo de tero e leses precursoras do mesmo: da clonagem do primeiro HPV humano
em 1980 por Lutz Gissman e Harald zur Hausen, 1 passando
pelos estudos na dcada de 1990, utilizando mtodos de biologia molecular que revelaram de maneira incontestvel o papel
causal de alguns tipos de HPV no cncer cervical,2 sendo a partir de ento denominados "oncognicos': Esses primeiros anos
do novo milnio testemunharam a aplicao rotineira de testes moleculares para HPV no manejo de pacientes com leses
cervicais; o aparecimento de vacinas preventivas altamente
eficazes e o merecido Prmio Nobel de Medicina a Harald zur
Hausen em 2008. Reconhecidamente, para nosso orgulho, esse
um campo em que pesquisadores brasileiros deram enorme
contribuio, com pesquisas desenvolvidas no pas.

Classificao e nomenclatura dos papilomavrus


Os papilomavrus so pequenos vrus de DNA com um
genoma de cerca de 8.000 pares de bases. Todos os genes
esto contidos na mesma fita de DNA, sendo que os genes de

expresso precoce so denominados E (early) seguidos de um


nmero, reconhecendo-se El-E7, e os tardios codificam as
protenas do capsdio, sendo denominados Ll e 12 (late). Os
genes El e E2 so responsveis pelo controle da transcrio e
replicao viral, enquanto ES, E6 e E7 so os oncogenes virais
que interferem nas protenas do hospedeiro e acarretam replicao celular acelerada e imortalizao dos queratincitos.
Todas as famlias de mamferos estudadas apresentam infeco por um papilomavrus espcie-especfico, no havendo
transmisso interespcies. Assim, so reconhecidos e classificados os papilomavrus bovinos (BPV), os caninos (CPV)
e os murinos (MPV), entre outros. At mesmo rpteis como
tartarugas e jacars e tambm papagaios apresentam verrugas
causadas por seus respectivos papilomavrus.
Uma classificao taxonmica formal dos papilomavrus foi criada e atualmente eles esto agrupados na famlia
Papillomaviridae. Dentro dessa famlia so reconhecidos
gneros denominados por letras do alfabeto grego, como
alfapapilomavrus, betapapilomavrus etc., conforme a
Figura 8.1.
Nos humanos, nos quais foram e so mais intensamente
estudados, os HPV podem ser divididos, pelo aspecto clnico,
em trs grupos:
HPV associados a verrugas cutneas (gamapapilomavrus)
HPV associados mucosa anogenital (alfapapilomavrus)

Gnero Alfapapilomavrus

Espcies 8

43c91740

10

61
81
72
3 c62
83
c89
c87
c86
84

7729394 78 28 10

6 7411554413CCPV
PcPV

12

58526733313516

RhPV

BPV2
4[
BPV1

Deltapapilomavrus

[EEPV
RPV
2 - DPV
1

1111>

...-Betapapilomavrus

3[0vPV1
OvPV2

.
.
....-. BPV5
Epsi1onpap1 1omav1rus
95]

~5 1

Figura 8.1 Arvore filogentica dos papilomavrus3 com 118 tipos e sua classificao, com base na sequncia do gene L1.

Captulo 8

Infeco por HPV

115

HPV associados a leses cutneas de portadores de epidermodisplasia verruciforme, uma doena rara de base hereditria (betapapilomavrus).

25

Todos os tipos de HPV de importncia para a etiologia do


cncer cervical em humanos esto contidos no gnero dos
alfapapilomavrus, em que se destacam os HPV 16 e 18, responsveis por cerca de 70% de todos os tumores dessa localizao anatmica no mundo Entre os HPV que infectam a
mucosa anogenital a principal distino a ser feita se refere ao
risco que a infeco por determinado tipo confere para desenvolvimento de neoplasia no portador. Assim, existem os HPV
considerados de alto risco (HPV 16 e 18, j apontados, alm de
31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59 e 66), os de baixo risco (HPV
11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72 e 81) e os de risco intermedirio ou desconhecido (HPV 34, 57, 83 e outros). A classificao
desses tipos virais nos respectivos grupos de risco decorre de
informaes de cunho epidemiolgico4 (prevalncia do DNA
deste tipo de HPV em tumores x prevalncia na populaocontrole), dados in vitro, como a capacidade de imortalizao
de cultura primria de queratincitos, produo de tumores
em roedores e tambm por proximidade filogentica.

20

Epidemiologia do cncer cervical e


leses precursoras
A relao entre o cncer cervical e a atividade sexual foi percebida desde os primrdios da medicina. O fato de que esta doena
no acometia freiras e virgens, sendo frequente entre prostitutas,
sugeria a participao de algum agente sexualmente transmissvel em sua etiogenia. Por alguns anos a hiptese dos herpes-vrus foi investigada, porm nunca foi comprovada. Na dcada de
1970, Harald zur Hausen lanou a ideia dos HPV como agentes
causais dessa neoplasia. Na dcada de 1980, alguns estudos epidemiolgicos no conseguiram comprovar essa hiptese, persistindo um conflito entre os dados in vitro e aqueles obtidos com
amostras humanas. Apenas com o advento da reao em cadeia
da polimerase (PCR) que a correlao HPV-cncer cervical foi
demonstrada de maneira indubitvel, atribuindo-se os insucessos pregressos ao diagnstico de baixa sensibilidade e especificidade dos HPV pelos mtodos adotados at ento.5
Estudos com acompanhamento de inmeras coortes de
mulheres acompanhadas por muitos anos possibilitaram a elucidao da histria natural da infeco pelo HPV e das leses
por ele causadas. Hoje sabemos que a infeco pelo HPV ocorre
com o incio da atividade sexual e o pico da infeco ocorre
justamente na faixa etria com maior atividade sexual, em que
se encontra uma prevalncia de 10-30% nas mulheres entre 15
e 30 anos de idade. Essa prevalncia vai diminuindo at valores
inferiores a 5% nas mulheres acima de 55 anos. Curiosamente,
algumas localidades geogrficas, como a Colmbia e o Mxico,
apresentam um segundo pico nesta faixa etria acima dos
55 anos de idade (Figura 8.2). Se levada em considerao a
prevalncia acumulada, ou seja, o nmero de mulheres que
se infectou pelo HPV em algum momento da vida, verifica-se
que esta supera os 50%, sendo, portanto, a infeco por este
vrus algo extremamente comum na populao em geral.
Estes mesmos estudos demonstraram que, entre as infectadas pelo HPV, estavam sob risco de vir a desenvolver leses
pr-malignas e malignas aquelas que apresentavam persistncia do DNA viral por duas anlises separadas no tempo,
e obrigatoriamente do mesmo tipo de HPV. Verifica-se que a
infeco persistente leva ao aparecimento das leses denominadas intraepiteliais escamosas (LIE). As LIE-BG (baixo grau)

15

10

Faixa
etria

< 25

25-34

35-44

45-54

> 54

Pases desenvolvidos - - Pases em desenvolvimento

Figura 8.2 Prevalncia do HPV-DNA, ajustada pela distribuio etria


populacional, em mulheres com citologia normal (pases desenvolvidos
e em desenvolvimento).6

podem ocorrer j como a manifestao de uma primeira infeco por HPV, porm essas leses regridem e desaparecem na
grande maioria das portadoras. Como mencionado, a persistncia do DNA de HPV de alto risco que causa a evoluo
de uma LIE-BG para LIE-AG (alto grau), em que h um gradiente de malignidade iniciando-se com a neoplasia intraepitelial cervical (NIC 1eNIC2) at a NIC 3/carcinoma in situe
por ltimo o carcinoma invasivo (Figura 8.3).
Citologia LIE-BG
NIC 1
NIC2
Histologia
Normal Displasia Displasia
leve
moderada

LIE-AG
NIC 3

~~~~

invasivo

Infeco
pelo HPV
Produo
do vrus

Altas concentraes
de E6 e E?
Integrao do
DNA virai

Carcinoma
micro invasivo

Figura 8.3 Esquema de um epitlio de mucosa cervical com o gradiente biolgico das transformaes induzidas por HPV e as classificaes
citolgicas e histolgicas. LIE-BG = leso intraepitelial escamosa de
baixo grau; LIE-AG = leso intraepitelial escamosa de alto grau; NIC =
neoplasia intraepitelial cervical.8

Diagnstico Laboratorial

116
Uma vez que a mdia da idade de iniciao sexual ocorre
entre 15e18 anos e a maior incidncia do cncer cervical invasivo acontece, no Brasil, na faixa dos 55 a 60 anos, deduz-se que
esta doena de evoluo lenta, possibilitando sua preveno
por meio de exames peridicos, tais como o teste de citologia
esfoliativa. No Brasil, o Instituto Nacional do Cncer (INCA)
aponta que em 2012 o nmero de casos novos de cncer do
colo de tero esperado ser de 17.540, com um risco estimado
de 18 casos por 100.000 mulheres.7

"citologia lquid' possibilita a realizao de uma lmina com


melhor visualizao das clulas em monocamada, aumentando a sensibilidade para a deteco de alteraes displsicas
e diminuindo o nmero de lminas de significado indeterminado. Tambm nessa direo, empresas tm pesquisado o uso
de inteligncia artificial, ou seja, a leitura da lmina sendo feita
por um computador que seleciona aquelas com alterao para
serem ento revistas por um citopatologista.

Testes moleculares

. . . Diagnstico laboratorial
Teste citolgico
O teste citolgico para o cncer de colo de tero uma das
mais bem-sucedidas intervenes diagnsticas da histria
da medicina, levando queda vertiginosa nos ndices dessa
doena nos pases que implantaram programas de citologia
com boa adeso pela populao. Primeiramente descrito por
Georges Papanicolaou, cujo nome at hoje utilizado como
sinnimo do exame de citologia esfoliativa, o teste consiste
na coleta de clulas esfoliadas da mucosa uterina, particularmente da crvice, com um instrumento tipo esptula, escova
ou cotonete, e realizao de um esfregao sobre uma lmina,
que ser corada e analisada ao microscpio, buscando a deteco de clulas com caractersticas de malignidade. Este teste
foi sendo aprimorado ao longo dos anos, seus critrios mais
bem definidos e o modo de relatar os achados padronizado,
de maneira a possibilitar a realizao do exame em locais diferentes com os mesmos resultados. Ainda assim, um exame
subjetivo e dependente da acurcia do observador, razo pela
qual existem enormes variaes quanto ao percentual de falsopositivos e negativos deste teste em diferentes laboratrios.
Deve ser ressaltado que o exame citolgico visa deteco
de clulas tumorais, no do HPV. Ainda hoje comum relatar no laudo citolgico "HPV" ou "sugestivo de HPV': Para
isso, o observador vale-se de algumas caractersticas morfolgicas celulares tidas como patognomnicas da infeco pelo
HPV, primordialmente a "coilocitose': que o halo perinuclear
(Figura 8.4). No entanto, cabe salientar que o achado do coilcito tem uma fraca correlao com a identificao molecular da
presena do DNA de HPV, no devendo ser de fato valorizado;
portanto, o exame citolgico no se presta deteco de HPV.
A citologia esfoliativa vem sendo modificada de maneira
a tornar o exame mais preciso. O uso de meios chamados de

Figura 8.4 Clulas escamosas com binucleao e halo perinuclear (colilcito), coradas pelo mtodo de citologia lquida ThinPrep.

Em contraste com testes citolgicos, exames moleculares que


detectam o DNA dos HPV so obviamente especficos para este
agente, e so esses resultados que devem ser usados na avaliao
de prevalncias de infeco por HPV. Com a comprovao do
papel etiolgico de alguns tipos de HPV, notadamente os HPV
tipos 16 e 18, na gnese do carcinoma cervical, pesquisadores
passaram a avaliar se a deteco do vrus por esses mtodos
poderia ser utilizada na preveno, tal qual um exame citolgico,
ou mesmo no manejo da paciente, conforme discutido a seguir.
No entanto, o uso dos testes moleculares de HPV para a deteco de neoplasia fazem um raciocnio de inferncia; se a paciente
tem HPV de alto risco provvel que tenha leso ou poder vir
a ter; se ela no tem HPV muito provavelmente no tem leso de
alto grau/cncer, sendo o HPV uma condio necessria (infeco persistente por HPV oncognico), mas no suficiente por si
s, uma vez que de milhes de mulheres infectadas pelo HPV
apenas alguns milhares viro a desenvolver cncer.
Com esta enorme aplicao que se abriu, diversos testes moleculares para HPV foram desenvolvidos. Esses testes
podem ser separados de acordo com o princpio metodolgico
e a molcula-alvo, como mostrado a seguir.

Teste de amplificao de sinal


Trata-se de teste molecular, que emprega a tecnologia de
cidos nucleicos recombinantes, porm no h amplificao
do material gentico viral, mas sim do sinal provocado pela
presena do DNA de HPV nas clulas esfoliadas da crvice.
O primeiro teste de HPV a chegar ao mercado, e at hoje o de
maior utilizao em todo o mundo, o teste de captura lubrida
(Qiagen). Trata-se de um mtodo de hibridizao do DNA viral
provindo da amostra com sondas sintticas de RNA complementares ao DNA dos HPV de alto risco para cncer (13 tipos) e de
baixo risco (5 tipos). O lubrido RNA:DNA capturado por um
anticorpo antitripla hlice e posteriormente revelado por meio de
mtodos convencionais enzimtico-colorimtricos.9 O resultado
indica se a paciente est infectada por um ou ambos os grupos de
HPV e d um valor semiquantitativo que guarda uma boa relao
clnica, ou seja, quanto maior o valor de leitura, maior a chance de
uma leso HPV-induzida estar presente. Outros agentes infecciosos ginecolgicos foram acrescentados ao teste, que possibilita a
deteco tambm de gonococos e clamdia. As principais crticas
a este mtodo so a falta de um controle interno de adequao da
amostra, ou seja, na ausncia de clulas por problemas de coleta,
o resultado ser sempre negativo, possibilitando a ocorrncia de
falso-negativos. Sabe-se que mulheres aps a menopausa frequentemente apresentam coletas com baixo nmero de clulas,
e esta faixa etria(> 45 anos) a de maior incidncia da doena.
Outra deficincia que o mtodo no identifica individualmente
os tipos de HPV, no permitindo a avaliao da persistncia viral,
j que uma paciente pode estar infectada em um momento por
HPV 16 e em um momento posterior por HPV 18. Do ponto de
vista do risco para cncer, esta paciente no tem infeco persistente, portanto o risco baixo, mas a captura hbrida ir acusar
dois testes consecutivos reativos para HPV oncognico.

Captulo 8

117

Infeco por HPV

Testes com base em PCR


Mtodos fundamentados em amplificao de cidos nucleicos, principalmente a PCR, revolucionaram o entendimento da
epidemiologia do cncer cervical. Logicamente, esses mtodos
foram sendo aprimorados para uso no diagnstico e manejo
desta doena. A princpio, mtodos in-house foram empregados, desenvolvidos nos prprios laboratrios de anlise, frequentemente de boa sensibilidade, mas de difcil comparao
interlaboratorial. Devido alta sensibilidade apresentada, a
correlao clnica costuma ser baixa, pois muitas mulheres
esto infectadas por HPV sem qualquer implicao clnica, e a
maior parte das infeces tem carter transitrio e assintomtico. Os testes com base em PCR tm outras vantagens, como a
possibilidade de uso de diferentes tipos de amostras biolgicas
(clulas esfoliadas, biopsias, tumores, lavado cervicovaginal
e outras). Atualmente esto disponveis muitos testes semelhantes para a deteco de HPV por meio de amplificao por
PCR. Em geral esses testes baseiam-se na homologia existente
no gene Ll entre os diferentes tipos de HPV, em que so alocados os primers que delimitam a regio amplificada. O conjunto
de primers genricos denominados MY09/11 capaz de detectar um grande nmero de tipos, por meio da amplificao de
uma regio de 450 pares de bases deste gene.10 Esses primers
foram sendo aprimorados e constituem a base do teste usado
pela empresa Roche em seu kit Linear Array HPV Genotyping
Test. Outros primers bastante utilizados nesta regio so o par
GP5+/6+, desenvolvido e utilizado pelo grupo holands, e o
par SPFlO, tambm criado na Holanda11 (Figura 8.5).
E2

- - - E4

Essa regio Ll muito atraente como alvo diagnstico


porque, alm de ter um grau de conservao nucleotdica que
possibilita o uso de primers que cobrem uma ampla gama de
HPV, exibe variabilidade interna suficiente para tipar esses
mesmos HPV. No passado usava-se um sistema de digesto
com 7 enzimas de restrio que produziam um perfil tipoespecfico.12 Atualmente, essa tipagem costuma ser feita em
uma etapa de hibridizao com sondas especficas posterior
amplificao. Essas sondas podem estar aderidas em uma fita
de nitrocelulose, e o uso de primers biotinilados possibilita a
revelao colorimtrica da hibridizao sonda:amplicon para
a identificao especfica do(s) tipo(s) de HPV presente(s)
(Figura 8.6). So mtodos trabalhosos, porm mais robustos e
fundamentais na avaliao de infeces mltiplas, muito frequentes em imunossuprimidos. 13

Arrays
Por haver grande quantidade de tipos de HPV, e haver interesse especfico em se individualizar o( s) tipo( s) presente(s) na
amostra, a tipagem de HPV uma necessidade laboratorial
qual a tecnologia de arrays presta-se muito bem. Um mtodo
j disponvel comercialmente o PapilloCheck (Greiner
Bio-One), que emprega o formato de microarrays de sondas aderidas em uma lmina de plstico. O mtodo trabalha
com amplificao de uma regio bastante varivel dos HPV, o
gene El, porm a hibridizao para tipagem se faz sobre uma
lmina contendo centenas de sondas ( microarrays) possibilitando a tipagem de uma maneira extremamente controlada
e confivel, tambm incluindo diversos controles internos e
externos de amplificao e hibridizao. 14 A anlise neste caso
se faz por um leitor de fluorescncia e um software que interpreta as combinaes de cor provindas da lmina hibridizada,
transformando-as em um resultado vlido e compreensvel.

RNA mensageiro virai

L2

Devido ao grande nmero de mulheres que abrigam HPV


oncognicos sem significado clnico, os pesquisadores de
alguns laboratrios esto buscando outros marcadores que
possibilitem identificar, entre as pacientes HPV-positivas,
aquelas que se encontram sob risco de evoluo maligna ou
mesmo j apresentam leses. Desse modo, sugeriu-se que
a presena do RNA mensageiro que codifica para as duas
oncoprotenas virais E6 e E7 (E6/E7 mRNA) seria o marcador
ideal, uma vez que identifica a expresso do genoma virai, e

Aprox. 8.000 pb

E7

L1

160 161

URR

162 163 164

165 166

My09/11 /PGMY
-450 pb
Rache Amplicor

------

GP5+/6+

-170 pb .

HPV 16

..,

-150pb

65pb

Figura 8.5 Esquema do genoma do HPV com detalhamento da regio


L1e os principais conjuntos de primers em uso amplificando fragmentos
de diferentes tamanhos. pb = pares de bases.

Figura 8.6 Sete amostras de pacientes HIV+ submetidas ao teste de


Linear Array (Roche). Infeco por mltiplos tipos so observadas nas
amostras 160, 161, 162, 165 e 166. A amostra 163 apresenta infeco
apenas por HPV 16, enquanto a amostra 164 negativa para HPV-

DNA.13

Diagnstico Laboratorial

118

PreTect
APTIMA
PapilloCheck HPV-Proofer HPVAssay
(E1)
(E6/E7)
(E6/E7)

Captura
hbrida 2

PCR
(MY09/11)

Sonda

Pool de sondas
RNA

Prmers
degenerados

Primers
consenso

Primers
consenso

Primers
consenso

DNA

RNAm E6/E7

RNAm E6/E7

Alvo

Hbridos RNADNA

Fragmento
450pb

Fragmento
150 pb

Fragmento
450pb

Fragmento
65pb

Fragmento
350pb

Varivel

Varivel

25-75 fg

0,1-100fg

0,5-10 fg

900-3.000
cpias/clula

0,1-10fg

30-150 fg

13

39

20

37

26

24

Sim/Sim/Sim

No/No/No

No/No/No

Sim/Sim/Sim

No/Sim/No

No/Sim/Sim

No/Sim/Sim

No/Sim/No

Sim

Sim

No

Sim

Sim

Sim

Sim

Sim

Baixo

Alto

Alto

Alto

Alto

Alto

Alto

Alto

Semiquantitativo

Posslvel, mas
no otimizado

Passivei, mas
no otimizado

Qualitativo

Qualitativo

Qualitativo

Qualitativo

Qualitativo

No

Sim

Sim

Sim

Sim

Sim

Sim

Sim

Sensibilidade

Alta

Alta

Alta

Alta

Alta

Alta

Alta

Alta

Especificidade

Alta

Alta

Alta

Alta

Alta

Alta

Alta

Alta

Sensibilidade
analtica
Nmero de
genotipos de
HPV detectados
Aprovao
FDA/ CEI
Anvisa
Kit
comercialmente
disponvel
Nvel de reao
cruzada
Quantificao
DNAHPV
Infeco
mltipla

PCR
Linear Array INNO-LiPA
(FP5+/GP6+) (PGMY09/11) (SPF10)

0,01 cpias/clula 250 cpias/clula

14

Figura 8.7 Informaes comparativas de alguns mtodos moleculares de deteco de HPV.8

no apenas sua presena ou mesmo a replicao.1516 Dois testes que detectam este analito passaram por intensa avaliao
clnica, chegando ao mercado em 2010: o Proofer (Norchip) e
o Aptima (GenProbe). Mesmo com a introduo das vacinas,
persiste a necessidade da realizao dos testes para preveno
do cncer cervical, uma vez que as vacinas s se mostram protetoras em mulheres virgens de infeco, sendo incuas para
as mulheres que j tiveram infeco por estes HPV contidos
na vacina. Outro ponto que os HPV contidos na vacina no
cobrem todos os casos de cncer cervical, portanto, enquanto
houver a possibilidade de neoplasia causada por um HPV sem
cobertura na vacina, mesmo as mulheres vacinadas devero
continuar realizando o exame peridico. 17 A comparao
entre os diversos testes disponveis encontra-se na Figura 8.7.

nmero de mulheres com cncer, menor custo ao sistema


e possibilita maior espaamento no tempo da realizao
do exame peridico. Igualmente, um teste mais especfico
significa menor nmero de mulheres encaminhadas para
exames complementares, como a colposcopia seguida de
biopsia ou mesmo tratamentos desnecessrios. O ponto
crtico dos exames moleculares que so, sem dvida, mais
sensveis, mas ainda menos especficos que os exames citolgicos de qualidade. Por outro lado, so automatizveis e
mais baratos que os exames convencionais. Provavelmente
os exames citolgicos sero, no futuro prximo, deslocados da posio de triagem primria para exames confirmatrios, realizados aps um resultado molecular persistentemente positivo para HPV oncognico. 20

Hibridizao in situ
A tcnica de hibridizao in situ promove a hibridizao
de sondas HPV-especficas, marcadas com compostos radioativos ou colorimtricos, sobre um corte histolgico de material fixado e parafinado. Embora esta tcnica torne possvel a
associao dos dados moleculares com as caractersticas histolgicas, extremamente trabalhosa e de baixa sensibilidade,
tendo poucas aplicaes adequadas na prtica laboratorial.
Um exemplo de corte histolgico positivo para HPV ilustrado na Figura 8.8.

Uso dos testes de HPV no rastreio


de cncer cervical
Nesse momento, diversas naes tm discutido e avaliado se a substituio do exame citolgico por um teste
molecular pode apresentar melhores resultados mdicos
e econmicos. 19 Um teste mais sensvel significa menor

Figura 8.8 Corte de papilomatose de laringe corado com hematoxilina


e eosina, hibridizado com sondas radioativas de HPV 6 e 11. Os pontos
pretos indicam ncleos de clulas contendo grande quantidade de
DNA desses HPV.18

Captulo 8

Infeco por HPV

Uso dos testes de HPV na triagem de pacientes


com citologia alterada/indeterminada
Uma das aplicaes mais frequentes do teste para HPV
acontece quando uma paciente apresenta o resultado citolgico de ASCUS (Abnormal Squamous Cell of Undetermined
Significance). Essa categoria uma espcie de zona cinzenta
em que o citopatologista reconhece que as clulas no so
normais, porm no est caracterizada a presena de displasia. Nesse caso um ASCUS com o achado de HPV-DNA de
alto risco deve ser investigado, enquanto aquele no qual HPV
de alto risco esto ausentes pode ser interpretado como sem
maior significado clnico, e a paciente retorna rotina de rastreio. A mesma situao tambm se aplica quando o achado
citopatolgico de LIE-BG (leso intraepitelial escamosa de
baixo grau). Quando ocorre na ausncia de HPV de alto risco,
no se considera a necessidade de mais investigaes.21

Uso dos testes de HPV ps-tratamento


Vrios estudos demonstraram que a presena de DNA de HPV
de alto risco aps o tratamento para a neoplasia intraepitelial cervical um indicador de falha teraputica, ao mesmo tempo em
que sua ausncia um indicador seguro de eficcia, possibilitando
a reintegrao da paciente aos esquemas regulares de rastreio.

Carga virai e infeces mltiplas


A carga virai de HPV ainda um assunto bastante controverso. Embora vrios estudos tenham encontrado um
gradiente de carga virai maior em leses mais avanadas
(normal < displasia leve < moderada < grave) essa relao
se perde na ponta mais preocupante do espectro, que so o
carcinoma in situe invasivo.22 Isso se d porque nos carcinomas a replicao virai muito baixa ou inexistente, embora
a expresso de E6/E7 seja necessria para a manuteno da
transformao celular. Diferenas metodolgicas tambm
contribuem para a indefinio do tema, pois os estudos utilizam diferentes maneiras de normalizar a carga virai (por
clula, por ng de DNA, por cpias de um gene endgeno,
sem normalizao etc.), impedindo a comparao direta de
resultados entre laboratrios.22
O papel das infeces mltiplas, ou seja, infeces concomitantes por mais de um tipo de HPV, tambm tem dados
contraditrios. Alguns estudos apontam que essas infeces
mltiplas conferem paciente um risco aumentado para o
desenvolvimento de neoplasia em relao quelas infectadas por um nico tipo. 23 No entanto, outras pesquisas verificam que mais frequente a infeco mltipla em mulheres
assintomticas do que nas leses em que se detecta normalmente apenas um tipo de HPV. 13 Esses achados sugerem que
a infeco por mltiplos tipos seja, na verdade, um marcador de m resposta imune infeco por HPV, embora a
gnese de uma leso intraepitelial seja clonai, partindo de
uma nica clula imortalizada por um nico tipo virai.
Novamente, a questo tcnica influencia muito essa discusso, uma vez que mtodos mais eficientes de identificao
de infeces mltiplas tornaram-se disponveis apenas nos
ltimos anos.

119

..,. Referncias bibliogrficas


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Captuo 9
ln eco por HTLV-1 e
HTLV-11

Jos Marcos Pereira Costa,


Emanuela Avelar Silva Costa e
Alusio Augusto Cotrim Segurado
Agente etiolgico, 121
Resposta imunolgica infeco por HTLV, 122
Patognese e manifestaes clnicas, 122
Epidemiologia, 123
Diagnstico, 125
Referncias bibliogrficas, 131

Captulo 9

Infeco por HTLV-1 eHTLV-11

121

Agente etiolgico

O vrus linfotrpico de clulas T humanas do tipo I (HTLV-I,


do ingls human T cell lymphotropic vrus type I) foi o primeiro
retrovrus humano descrito, ao ser isolado do sangue perifrico de um paciente com linfoma de clulas T com manifestaes cutneas. 1 Dois anos depois, outro retrovrus geneticamente relacionado foi identificado em linfcitos esplnicos
de um paciente com tricoleucemia de clulas T, sendo denominado HTLV-II. 2 Ambos os vrus foram integrados famlia Retroviridae, subfamlia Orthoretrovirinae e ao gnero
Deltaretrovirus. Subsequentemente, um terceiro retrovrus
humano foi isolado e denominado vrus da imunodeficincia humana (HIV), sendo posteriormente identificado como
o agente causal da sndrome da imunodeficincia adquirida
(AIDS, do ingls acquired immune de.ficiency syndrome) e classificado na subfamlia Lentivirinae. 3 A Figura 9.1 ilustra as
relaes filogenticas entre os retrovrus. 4
O HTLV-I reconhecidamente o agente etiolgico de vrias
doenas humanas, que sero descritas mais detalhadamente
neste captulo, enquanto a infeco por HTLV-II foi raramente
associada a casos de afeces neurolgicas. Em 2005, foram
descritos dois novos gentipos de HTLV, denominados HTLVIII e HTLV-IV, em indivduos assintomticos que habitavam o
sul da Repblica de Camares, na frica Central; porm, at o
momento no se demonstrou associao dessas infeces com
doena humana.56

Gag (p19). O capsdio apresenta simetria icosadrica e composta por protenas codificadas pelo gene gag (p24), constituindo o cerne virai. A poro central do vrion contm duas
cpias de cido ribonucleico (RNA) de fita dimricas de polaridade positiva e pela enzima transcriptase reversa, responsvel pela transcrio do genoma virai de RNA para cDNA
(provrus) 11 (Figura 9.2).

Estrutura genmica do HTLV e


seus produtos proteicos
Alm dos genes estruturais comuns aos retrovrus (gag, env
e pol), o genoma do HTLV-I/II apresenta uma regio prxima
extremidade 3', denominada pX, que contm os genes reguladores tax e rex. Nas extremidades 5' e 3' do genoma virai
encontram-se as sequncias repetitivas longas (LTR), essenciais para a regulao transcricional do genoma (Figura 9.3). 7
O genoma provira! do HTLV-I e do HTLV-II contm 9.032
nucleotdios, sendo seus principais elementos e respectivos
produtos gnicos:

Gene env: codifica as glicoprotenas externas do envolt

Estrutura da partcula virai


Os vrus HTLV-I e HTLV-II so partculas de forma esfrica a pleomrfica (vrions), com 80 a 100 nanmetros de
dimetro, morfologicamente semelhantes s dos demais
retrovrus, constitudas por um core central eltron-denso
e um envoltrio externo glicoproteico. O envoltrio contm
uma glicoprotena de superfcie (gp46) e uma glicoprotena
transmembrana (gp21), alm da camada bilipdica, derivada
da membrana celular da clula eucaritica infectada. Junto
membrana do envelope est a matriz, composta pela protena

rio (precursora gp61/68 e sua derivada gp46) e a protena


transmembrana (gp21)
Gene pol: codifica as enzimas transcriptase reversa (p99),
integrase e protease
Gene gag: codifica as protenas do core virai (precursora p53
e suas derivadas p15, p 19 e p24)
Gene tax: codifica a protena p4otax, transativadora do segmento LTR virai e de genes da clula eucaritica infectada
Gene rex: codifica a protena p27rex, reguladora ps-transcricional da sntese de protenas estruturais do vrus
Protenas p12/p30: codificadas pelo gene ORF I, interage
com cadeias do receptor de IL-2
Segmentos LTR: encontradas nas extremidades do genoma
provira!, contm as regies reguladoras da transcrio
virai
0
Segmento 3' LTR: codifica uma protena denominada
fator HTLV-I bZIP (HBZ, do ingls HTLV-I basic zipper
factor), que estimula a replicao virai e proliferao
celular.

Lentivirus
SIV-agm
FIV

gp21 transmembrana

HIV-1
HIV-2

Spumavirus
Betaretrovirus
HFV BFV

Transcriptase
reversa

MMTV

Epsilonretrovirus

MPMV

WEHV-2 PHV PHV

p19matriz

RSV

Alpharetrovirus
SnRV

FelV

p24
capsdeo

HTLV-1
HTLV-11

Deltaretrovirus

Gammaretrovirus

Figura 9.1 Anlise filogentica de regies conservadas do gene da polimerase dos retrovrus. Adaptada de Quackenbush e Casey, 2005.4

Figura 9.2 Estrutura da partcula virai do HTLV-1/11. gp46, glicoprotena de 46 kDa; gp21, glicoprotena de 21 kDa; p19, protena de 19 kDa;
p24, protena de 24 KDa.

Diagnstico Laboratorial

122

LTR

Tax
Rex

7,0

8,0

9,0

luC7l fita negativa


~.,..

SP1 RNA
SP2 RNA

Figura 9.3 Representao esquemtica do genoma do HTLV-1.

Embora o HTLV-I e o HTLV-II se diferenciem, principalmente no gene pX, apresentam cerca de 65% de similaridade
gentica do genoma. Com propriedades biolgicas semelhantes, agem infectando linfcitos humanos, sendo que o tipo I
tem tropismo preferencial por linfcitos T de fentipo CD4+,
enquanto o tipo 2 por linfcitos T CD8+. 89 Ambos tm a capacidade de integrar-se ao genoma da clula hospedeira e, nessa
forma, recebem a denominao de provrus. 1 11
Apesar de apresentarem uma estrutura genmica comum,
os HTLV-I e HTLV-II diferem em suas propriedades patognicas, que so geralmente atribudas s protenas transativadoras
Tax, denominadas Tax 1 e Tax 2, respectivamente. 12 Ambas so
responsveis pela induo e expresso de genes celulares e pela
promoo indireta da transcrio do genoma provira!. 11 Esses
efeitos da Tax podem interferir nas funes da clula hospedeira em diferentes nveis, afetando a transcrio e a traduo
de vrios genes celulares, tais como genes de citocinas e protoncogenes, que podem influenciar no desenvolvimento da infeco e na patognese das doenas associadas ao HTLV-I. 1112

. . . Resposta imunolgica
infeco por HTLV
O HTLV-I, ao infectar clulas T CD4+ e levar sntese dos
produtos gnicos anteriormente enumerados, induz resposta
imune humoral, com produo de anticorpos dirigidos inicialmente a antgenos de superfcie viral (gp46, gp21) e, posteriormente, do core (p15, p19, p24). H tambm induo de
resposta do tipo celular (clulas T citotxicas), direcionada
principalmente protena Tax. Estudos detalhados dos diversos antgenos virais tornaram possvel identificar os principais
epitopos imunodominantes para clulas B, quais sejam:
As pores carboxilaterminal da p 19 gag e aminoterminal
da p15 gag de HTLV-I e HTLV-II, que apresentam sororreatividade cruzada com antgenos celulares
Epitopos conformacionais descontnuos da p24 gag
A poro central da glicoprotena viral externa (gp46) e a
regio central da glicoprotena transmembrana (gp21).

associada ao HTLV-I (PET/MAH), mielopatia crnica descrita em pacientes do Caribe14 e, posteriormente, identificada
no Japo. 15 Alm dessas doenas, sndromes inflamatrias, tais
como uvete, polimiosite, artropatias, sndrome de Sjgren e
dermatopatias, como a dermatite infecciosa e a ictiose adquirida, diversas manifestaes oculares e afeces pulmonares tambm vm sendo associadas infeco por HTLV-I.
Estudos epidemiolgicos estimam o risco de adoecimento de
indivduos infectados por HTLV-I em cerca de 1 a 4% ao longo
da vida. 16
Ao contrrio do HTLV-I, o HTLV-II no est associado a
uma doena especfica, embora existam relatos de casos de
mielopatias crnicas e de manifestaes neurolgicas clinicamente semelhantes s da PET/MAH em pacientes soropositivos para HTLV-II, 1 1718 o que aponta para um possvel potencial neuropatognico desse vrus.
Os mecanismos patogenticos dos HTLV que determinam
a evoluo da infeco do estado assintomtico para quadros
hematolgicos ou neurolgicos clinicamente relevantes ainda
no esto totalmente elucidados. Contudo, estudos recentes apontam mais para maior influncia de fatores genticos
do hospedeiro (processos imunolgicos e de transativao
gnica) do que para fatores virais, uma vez que a variabilidade
gentica dos HTLV-I baixa. 19
Alm dos linfcitos T, os HTLV tambm infectam clulas
endoteliais e fibroblastos. As protenas codificadas pelo gene
tax do HTLV-I (p4otax) e do HTLV-II (p37 tax) desempenham
papel importante nos processos de imortalizao celular,
oncognese e inflamao. Localizadas no ncleo dos linfcitos
infectados, elas estimulam a transcrio de genes virais e celulares, sendo essenciais na transformao de linfcitos. A propriedade de transativao do gene tax estimula a produo de
citocinas, quimiocinas e metaloproteinases, tais como interleucina 2 (IL-2) e seu receptor (IL-2R), fatores de crescimento
de colnias de granulcitos e moncitos (GM-CSF), fator
de necrose tumoral a, protena quimiottica de moncitos e
metalopreoteinase da matriz, alm de ativar protoncogenes. A
superproduo de interleucinas pode acarretar em inflamao
crnica, que caracteriza doenas como a PET/MAH.20
J na ATL, cerca de 60% dos pacientes no expressam
protena Tax, e neles, a protena HBZ foi recentemente
implicada na proliferao de linfcitos T e na induo da
leucemia.1921 A expresso de mRNA para HBZ cerca de 20 a
50 vezes menor do que o mRNA para Tax. Contudo, diferentemente do mRNA para Tax, o mRNA para HBZ consistentemente expresso em clulas da ATL. Assim, age aumentando
a proliferao de clulas T,7 mostrando-se fundamental para o
desenvolvimento da ATL.22
O nmero aumentado de clulas T CD4+ perifricas na
infeco por HTLV-I pode erroneamente dar a impresso de
melhora clnica em pacientes coinfectados pelo HIV-1, ou
ainda, interferir na indicao de incio do tratamento antirretroviral. 23 Portanto, em pacientes coinfectados pelo HIVJ
HTLV-I, esse parmetro laboratorial deve ser cuidadosamente
analisado.

. . . Patognese e manifestaes clnicas

Leucemia/linfoma de clulas Tdo adulto

Embora a maior parte dos indivduos infectados por


HTLV-I ou HTLV-II permanea assintomtica por toda a
vida, reconhece-se, atualmente, o papel etiolgico do HTLV-I
em alguns desfechos clnicos, tais como a leucemia/linfoma
de clulas T do adulto (ATL), doena de alta incidncia no
sul do Japo, 13 e a paraparesia espstica tropical/mielopatia

A leucemia/linfoma de clulas T do adulto (ATL) uma


doena maligna de linfcitos T maduros, associada infeco
por HTLV-I,24 sendo que, dos portadores do vrus, apenas 2 a
3% desenvolvem ATL. Incide preferencialmente em adultos e
apresenta-se, na sua forma aguda, clinicamente mais agressiva,
como adenomegalia generalizada, acompanhada de hepatosple-

Captulo 9

Infeco por HTLV-1 eHTLV-11

123

nomegalia, leses osteolticas, hipercalcemia e frequentes manifestaes cutneas, em especial a eritrodermia. O sangue perifrico de pacientes com ATL apresenta linfcitos com morfologia
atpica, exibindo um acentuado pleomorfismo celular em relao ao seu tamanho, irregularidades no ncleo (multilobulado)
e no grau de condensao da cromatina nuclear. Em razo dessas caractersticas peculiares, as clulas T tpicas da ATL foram
denominadas clulas em flor, do ingls flower cells (clulas ATL),
conforme descrio de pesquisadores japoneses25 (Figura 9.4).
A ATL pode apresentar-se sob diferentes formas clnicas:

Aguda: com os sinais e sintomas anteriormente descritos,


acompanhados de hipercalcemia e elevao dos nveis sricos de desidrogenase lctica. Nesses casos encontram-se
clulas ATL em nmero elevado no sangue perifrico
Crnica: predominam quadros de linfonodomegalia e de
hepatosplenomegalia, acompanhadas de leucocitose. A calcemia normal, podendo-se observar elevao dos nveis
sricos de desidrogenase lctica. Clulas mononucleares
perifricas atpicas correspondem a menos de 10% do total
de leuccitos
Indolente (smoldering): com manifestaes dermatolgicas
apenas. Nessa forma clnica a calcemia e os nveis sricos de
desidrogenase lctica so normais. Clulas ATL representam apenas 0,5 a 3% dos leuccitos perifricos
Forma linfomatosa: apresenta quadro de linfonodomegalia
e sem linfcitos atpicos circulantes.
A proliferao leucmica da ATL predominantemente
monoclonal, com clulas de fentipo CD3+, CD4+, CD25+,
HLA-DR+. Essa neoplasia hematolgica apresenta mau prognstico, especialmente quando se apresenta sob a forma aguda
ou linfomatosa.

Paraparesia espstica tropical/mielopatia


associada ao HTLV-1
A paraparesia espstica tropical/mielopatia associada ao
HTLV-I (PET/MAH) definida como uma doena neurolgica
degenerativa que provoca desmielinizao crnica progressiva
da medula espinal (Figura 9.5). Exterioriza-se clinicamente
como paresia espstica com liberao piramidal, preferencialmente em membros inferiores. Em geral, a doena tem incio
insidioso, acomentendo de 1a2% dos portadores de HTLV-I,
afetando mais mulheres do que homens, geralmente entre a
quarta e quinta dcadas de vida. 24 Pode manifestar-se, entretanto, na adolescncia, em casos de infeco por transmisso
vertical.

Figura 9.4 Clulas leucmicas caractersticas da ATL - clulas em flor,


do ingls flower cells (400x). Cortesia de Jain e Prabhash, 2010.26

Figura 9.5 Desmielinizao medular provocada pelo vrus HTLV-1.


A. Indivduo sadio. B. Paciente com PET/MAH. Cortesia de Montanheiro, 2007. 27

O quadro parapartico comumente acompanhado de distrbios esfincterianos (reteno urinria e/ou fecal), distrbios
sensoriais discretos, dificuldades para deambular e intensa
fraqueza muscular. 14 Na investigao diagnstica complementar dos pacientes acometidos pela PET/MAH, encontram-se,
ainda, reaes imunolgicas positivas para infeco por
HTLV-I tambm no liquor. A evoluo lenta e progressiva do
quadro neurolgico pode provocar incapacidade fsica, com
restrio cadeira de rodas em alguns casos.

..,. Epidemiologia
Infeces por HTLV no mundo
As infeces pelos vrus HTLV-I e HTLV-II tm sido descritas em diversas regies do mundo, com variaes significativas
de soroprevalncia de acordo com a rea geogrfica, o grupo
tnico e o comportamento de risco da populao. Em geral,
dados de prevalncia de infeco por HTLV-I/II no mundo
so obtidos em inquritos epidemiolgicos entre candidatos a
doador de sangue, gestantes, indivduos com sintomas relacionados com a infeco viral e seus parentes, populaes nativas
e usurios de drogas ilcitas injetveis (UDI). H poucos relatos de taxas de prevalncia na populao geral.
O HTLV-I tem distribuio geogrfica esparsa, com soroprevalncias mais elevadas em populaes de ilhas do sul do
Japo (18% da populao adulta apresenta anticorpos antiHTLV-I circulantes);28 em ilhas do Pacfico, como Melansia
e Austrlia (1,7 a 14%); 2930 nas regies central e ocidental
da frica (Camares, Costa do Marfim e Moambique) ( 1 a
10%);3132 nas Amricas Central e do Sul;33 e, ainda, em ilhas
do Caribe (3,9% em negros de Trinidad-Tobago,34 4,25% em
Barbados, 5 a 6% na Jamaica) 35 (Figura 9.6). As maiores taxas
de infeco ocorrem entre indivduos com menor condio
socioeconmica e escolaridade, e aumentam progressivamente
com a idade desses indivduos.
J o HTLV-II tem sido encontrado entre UDI (1 a 50%),
tanto de regies urbanas dos EUA37 como de pases europeus38
e da Amrica do Sul, 394 sendo tambm prevalente em nativos
da frica, pigmeus da Repblica de Camares e Zaire4142 e em
populaes indgenas das Amricas do Norte e do Sul,43 com
taxas que variam de 5 a 30%: ndios Seminoles na Flrida,46

124

Diagnstico Laboratorial

--

Europa

---

"'

Asia

frica

"' ~. '

"''..\

'
"

--

/f

Antrtida

Pases com altas taxas de prevalncia para HTLV-1


Pases com altas taxas de prevalncia intermediria para HTLV-1

Figura 9.6 Epidemiologia global do HTLV-1. Adaptada de Proietti, 2010.36


Navajos e Pueblos no Novo Mxico;47 ndios Guaymis no
Panam;48 ndios Caiaps e Krahos no Brasil; ndios Wayuus e
Tunebos na Colmbia;50 ndios Tobas e Matacos na Argentina51
e em ndios Pume na Venezuela. 52

Infeces por HTLV no Brasil


Estimativas com base em estudos de soroprevalncia em
doadores de sangue e em populao geral apontam o Brasil
como o pas com o maior nmero absoluto de indivduos soropositivos para HTLV-I/II no mundo, com cerca de 2,5 milhes
de pessoas infectadas. 36
O HTLV-I foi identificado pela primeira vez no Brasil em
1986, em imigrantes japoneses provenientes de Okinawa, que
residiam na cidade de Campo Grande, Mato Grosso do Sul. 53

Desde ento, diversos inquritos epidemiolgicos apontam


as Regies Norte e Nordeste como as que apresentam maior
nmero de infectados por HTLV-I/II no pas.
Estudo realizado com doadores de sangue de vrias cidades do Brasil mostrou que a maior prevalncia da infeco
por HTLV-I/II foi encontrada no Maranho (10/1.000)
e a menor, em Santa Catarina (0,4/1.000). 54 A cidade de
Salvador, na Bahia, apresenta a maior prevalncia de infeco por HTLV-I na populao geral (1,3 a 1,8%), 55 sendo esta
atribuda concentrao de populao negra, descendente
de escravos africanos, encontrada naquela localidade. J o
HTLV-II apresenta alta prevalncia na Amaznia brasileira,
principalmente em populao indgena, e em UDI de reas
urbanas de todo o pas, principalmente os infectados pelo
HIV-1(Quadro9.1).

Quadro 9.1 Prevalncia de infec~o por HTLV-1/11 descritas em alguns estudos conduzidos com diferentes populaes das vrias
regies do Brasil.
Regio

Cidade(UF)

Populao

Prevalncia

Diagnstico

Fonte

Sul

Florianpolis (SC)
Londrina (PR)

Doadores de sangue
HIV+/HIV+UDI

1.200
758/57

0,08% (HTLV-1)
0,8%/7% (HTLV-1)

WB
WB

Galvo-Castro et al.57
Morimoto et ai. 58

Centro-Oeste

Sudeste

Campo Grande (MS)

Imigrantes japoneses

147

4,9%/43,8% (HTLV-11)
6,8% (HTLV-1)

Estado do MS
Campo Grande (MS)

Gestantes
Gestantes

32.512
116.689

0,1%(HTLV-1/11)
0,13% (HTLV-1/11)

WB/PCR
WB/PCR

Figueir-Fil ho et ai. 59
Dai Fabbro et al.60

So Paulo(SP)

Doadores de sangue

17.063

WB/PCR

Ferreira et ai. 61

Riode Janeiro (RJ)


So Paulo(SP)

1.200
351.639
18.169

WB
WB

Galvo-Castro et al.57
Segurado et ai. 62

So Paulo(SP)

Doadores de sangue
Doadores de sangue
Doadores de sangue

0,15% (HTLV-1)
0,03% (HTLV-11)
0,33% (HTLV-1)
0,3% (HTLV-1/11)

WB

Sabino et al.63

So Paulo(SP)

HIV+/HIV+UDI

533/89

0,1%(HTLV-1)
0,07% (HTLV-11)
4%/11,2% (HTLV-1)

WB

Caterino-de-Araujo et ai. 64

WB
WB

Olbrich Neto eMeira 65


Etzel et ai. 66

Botucatu (SP)
Santos (SP)

Gestantes
HIV+/HIV+UDI

913
499/119

6,1%/16,8% (HTLV-11)
0,1%(HTLV-1)
6%/15,9% (HTLV-1)
7,4%/21% (HTLV-11)

Kitagawa et ai. 53

Continua

Captulo 9

Infeco por HTLV-1 eHTLV-11

125

Quadro 9.1 Prevalnda de infeco por HTLV-1/11 desaitas em alguns estudos conduzidos com diferentes populaes das vrias
regies do Brasil (continuao}.
Regio

Cidade (UF}

Populao

Prevalnda

Diagnstico

Fonte

Nordeste

Recife (PE)
Salvador (BA)

Doadores de sangue
UDI

1.200
216

WB
WB

Galvo-Castro et ai. 57

Salvador (BA)

Gestantes

WB/PCR

Bittencourt et ai.68

Salvador (BA)
Joo Pessoa (PB)
Belm (PA)

Populao geral
Lactantes
Populao geral

6.754
1.385
1.033

WB
PCR

Kubenkokre (AM/PA)
Belm (PA)

Tribo indgena

0,33% (HTLV-1)
25,12% (HTLV-1)
10,08% (HTLV-11)
0,84% (HTLV-1)
1,76% (HTLV-1)
0,68% (HTLV-1)
1,61% (HTLV-1/11)
37,4% (HTLV-11)
1,71% (HTLV-1)
3,42% (HTLV-11)

Dourado et ai. 55
Pimenta et ai. 69
Carneiro-Proietti et al.7
lsha k et ai. 71

Norte

HIV+

107
117

WB/PCR
PCR

Dourado et ai. 67

Laurentino et al.72

Adaptadode Costa, 2010.56

Mecanismos de transmisso
Os HTLV so transmitidos pelo contato com sangue contaminado, por meio da transfuso de hemocomponentes celulares, por relao sexual, mais eficazmente do homem infectado
para sua parceira, e, principalmente, pelo aleitamento materno
prolongado, com transmisso vertical (de me para filho) ou
transmisso horizontal (mes de leite).
Em populaes endmicas, os modos de transmisso vertical e sexual so as mais frequentes vias de aquisio desses
vrus, e em UDI, principalmente infectados pelo HIV, pelo uso
compartilhado de agulhas e seringas contaminadas.
O risco de transmisso transfusional de HTLV-1 ou HTLV-11
estimado em aproximadamente 60%, o que torna a triagem
sorolgica dessa infeco uma etapa crucial para garantir a
segurana dos procedimentos hemoterpicos. 73 Desse modo,
atento ao risco de transmisso sangunea, o Ministrio da Sade
(MS) do Brasil, em sua Portaria n 1.376, de 19 de novembro de
1993, tornou obrigatria a triagem sorolgica da infeco por
HTLV em candidatos a doador, por meio da pesquisa de anticorpos anti-HTLV-1/11 em bancos de sangue de todo o pas. 74 A
janela imunolgica na infeco por HTLV-1 adquirido por via
transfusional de 51 dias (36 a 72 dias; intervalo de confiana
de 95%), porm a do HTLV-11 desconhecida.
No estado do Mato Grosso do Sul, desde 2002, foi institudo
o Programa de Proteo Gestante, que inclui a solicitao de
teste sorolgico para HTLV-1/11 no pr-natal como estratgia
para controle de transmisso materno-infantil dessa infeco
viral. 59 Em Minas Gerais, a Lei n 17.344 dispe que os servios de sade pblica devem realizar testes sorolgicos para o
diagnstico de infeco por HTLV-1/11 em casos com sintomatologia clnica sugestiva e em todas as gestantes no pr-natal.
Inclui ainda, o aconselhamento clnico e familiar, bem como o
tratamento do infectado. 75

. .,. Diagnstico
O diagnstico laboratorial de infeco por HTLV-1 ou II
recomendado nas seguintes situaes clnicas:
Diante de um paciente que apresente sintomas e/ou sinais
sugestivos de ATL ou PET/MAH, para confirmao da
hiptese diagnstica clnica

Na triagem diagnstica de indivduos expostos aos HTLV,


como, por exemplo, em comunicantes familiares ou parceiros sexuais de portadores dessas infeces
Na triagem compulsria de doadores assintomticos de
, sangue ou orgaos
No rastreamento de gestantes durante o pr-natal com vistas preveno da transmisso vertical.
Considerando que a prevalncia da infeco pelos agentes
pesquisados varia sensivelmente nas diferentes situaes anteriormente enumeradas, cabe enfatizar que o valor preditivo
dos testes diagnsticos tambm ser distinto, exigindo sempre
a realizao de testes confirmatrios para correta elucidao
do estado sorolgico do indivduo pesquisado.
Basicamente, o diagnstico laboratorial de infeco por
HTLV-1/11 se d pela deteco de anticorpos especficos, voltados a constituintes antignicos das diferentes pores do vrus
(core e envoltrio) no soro/plasma e/ou pela pesquisa de segmentos de DNA proviral em clulas do sangue perifrico. Em
vista dos prognsticos muito diferentes associados s infeces por HTLV-1 e li, fundamental que os testes diagnsticos sejam capazes de distinguir a infeco pelos dois vrus,
no contexto de confirmao sorolgica, de aconselhamento ao
infectado e na prtica da rotina clnica. 76

Testes de triagem sorolgica


Como at a presente data no foram descritas evidncias
sorolgicas de clareamento viral, a presena de anticorpos
anti-HTLV significa persistncia de infeco por esses vrus,
apresentando, portanto, valor diagnstico.
Os testes de aglutinao de partculas (PA), que pesquisam
anticorpos encontrados no soro de indivduos infectados, tm
sido utilizados em inquritos epidemiolgicos e, em alguns
pases, como testes de triagem e confirmatrio, simultaneamente. No Japo, onde a infeco por HTLV-1 endmica,
a utilizao da reao de PA mostra-se suficiente, em razo
da sua alta sensibilidade, rapidez e facilidade de execuo77
(Figura 9.7).
Os ensaios imunoenzimticos (EIA ou ELISA) tambm so
teis para detectar anticorpos anti-HTLV. Em 1988, a Food
and Drug Administration (FDA) dos EUA licenciou o primeiro kit de EIA para a deteco de anticorpos dirigidos ao
HTLV-1. 78 Desde ento, os EIA passaram por vrias modifi-

Diagnstico Laboratorial

126
Amostras HTLV-negativas
(sem aglutinao)

Amostras HTLV-positivas
(com aglutinao)

10

e
Figura 9.7 Reao de aglutinao em placa de microtitulao.

caes em sua composio antignica e formato, com vistas


a aprimorar sua sensibilidade e especificidade para detectar
infeco por HTLV-II.79
Os testes EIA iniciais continham lisado viral de HTLV-I ( 1
gerao) e a semelhana entre os genomas do HTLV-I e II possibilitava sua utilizao na triagem sorolgica da infeco por
HTLV-II. 80 No entanto, a sensibilidade no se mostrava adequada, apesar de haver sororreatividade cruzada entre ambos
os tipos de HTLV. Assim, esses testes foram substitudos
por ensaios que, alm do lisado viral de HTLV-I, continham
protenas recombinantes e/ou peptdios sintticos de HTLV-I
e II (2 gerao) em seu substrato antignico. Mais recentemente foram desenvolvidos testes no formato sanduche, que
contm apenas protenas recombinantes e peptdios sintticos
de HTLV-I e HTLV-II (3 gerao) (Quadro 9.2).

Mesmo aps essas modificaes, vrios estudos conduzidos


na Amrica do Sul apontaram deficincias dos EIA comercialmente disponveis no comrcio para a deteco principalmente
de HTLV-II, na maioria, em pacientes com HIV/AIDS.40,82-84

Testes confirmatrios
Dado que os mtodos de triagem sorolgica para HTLV-I/
II citados anteriormente apresentam deficincias e frequentes
resultados falso-positivos, o diagnstico confirmatrio dessas
retroviroses faz-se necessrio.
Ainda, como o diagnstico discriminatrio entre o HTLV-I
e o HTLV-II de suma importncia para o aconselhamento
e direcionamento da conduta clnica frente ao paciente, em
pases em que ambos so endmicos e onde os isolados virais

Quadro 9.2 Desaio das modificaes ocorridas na composio antignica e formato de alguns kits de EIA utilizados na triagem sorolgica
da infeco por HTLV-1/11 ao longo do tempo.
Gerao

Kits

Antgeno

Conjugado/substrato

EIA 1 (1991)

RETROTEK HTLV-1

Usado virai de HTLV-1

HEMOBIOanti-HTLV-1

Usado virai de HTLV-1

PLATEUA HTLV-1

Usado virai de HTLV-1

UBI HTLV-1+ li

Peptdio sinttico Env HTLV-1e li

VIRONOSTIKA HTLV-1/11

Usado virai de HTLV-1eli + p21 Ede HTLV-1

EIA 2 (1995)

HEMAGEN HTLV-1+ li

Usado virai de HTLV-1+ gp46 ep21 E

EIA 2 (2006)

BioELISA HTLV-1+ li

Antgenos recombinantes de HTLV-1eli

Anti-lgG
Fosfatase/N PP
Anti-lgG
Peroxidase/TMB
Anti-lgG eanti-lgM
Peroxidase/OPD
Anti-lgG
Peroxidase/OPD
Anti-lgG
Peroxidase/TMB
Anti-lgG eanti-lgM
Peroxidase/TMB
Anti-lgG eanti-lgM
Peroxidase/OPD

EIA 3 (1999)

ORTHO HTLV-l/HTLV-11

Antgenos recombinantes (Env/core) de HTLV-1eli

EIA 3 (1999)

MUREX HTLV-1+ li

Peptdio sinttico gp46 de HTLV-1e li + gp21 HTLV-11

EIA 2 (1992)

Adaptado deCaterino-de-Araujo, 2008.81

Protenas recombinantesEnv/core
Peroxidase/OPD
gp46 HTLV-1eli + gp21 HTLV-1
Peroxidase/TMB

Captulo 9

Infeco por HTLV-1eHTLV-11

127

podem divergir dos isolados empregados na composio dos


kits utilizados, h necessidade de se verificar qual o melhor
teste confirmatrio para ser utilizado no diagnstico.

Testes confirmatrios sorolgicos


Amostras reagentes triagem de infeco por HTLV
podem ser confirmadas por diversos ensaios sorolgicos, tais
como Western blot (WB), imunofluorescncia indireta (IFI),
radioimunopreciptao (RIPA) ou imunoensaio de linha
(INNO-LIA), ou at mesmo, por imunoquimioluminescncia
(ARCHITECT rHTLV-1/11).
O teste de IFI para pesquisa de HTLV baseia-se na incubao dos soros a serem testados com antgenos dos vrus em
clulas infectadas fixadas em lminas de vidro e visualizadas
por leitura em microscpio de fluorescncia. Embora seja um
teste de baixo custo, cuja sensibilidade e especificidade so
altas, apresenta problemas operacionais, que dificultam sua
utilizao na rotina diagnstica, como:
Necessidade de manuteno de linhagens celulares infectadas por HTLV
Necessidade de equipamentos especiais como microscpio
de fluorescncia
Cabines e salas com nveis de biossegurana 2 e 3
Tcnicos altamente treinados para a leitura do ensaio.
Ainda, em uma reao positiva, o resultado indica apenas a
presena de anticorpos contra HTLV, sem distinguir se foram
induzidos por infeco causada por HTLV-1 ou HTLV-11. J o
ensaio de RIPA cada vez menos utilizado na rotina diagnstica, particularmente em razo do emprego de istopos radioativos, apesar de ser um mtodo bastante sensvel e especfico.
Outro mtodo promissor, recentemente desenvolvido para
o diagnstico confirmatrio de infeco pelos HTLV, baseia-se
no princpio de imunoquimioluminescncia. O ARCHITECT
rHTLV-1/11 um sistema automatizado para deteco de anticorpos anti-HTLV-1/11, que utiliza protenas recombinantes e
peptdios sintticos com mtodo imunoenzimtico tipo duplo

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Controle negativo
(HTLV-1 e HTLV-11)

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p36

p36

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p24

p24

p24

p24

p24

p19

p19

p19

rgp21

rgp21

rgp21

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GD21

HTLV-1

anti-lgG
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sanduche. Estudos preliminares mostram que o teste altamente sensvel e especfico.85


Embora todas as tcnicas empregadas apresentem limitaes e no haja um teste padro-ouro para o diagnstico confirmatrio de infeco por HTLV-1/11, o ensaio de WB destaca-se como o teste mais utilizado no Brasil e no mundo.
Assim como os EIA, os testes confirmatrios de WB tm
sido modificados com o passar dos anos. Ao WB foram incorporadas glicoprotenas recombinantes do envelope do HTLV-1
e HTLV-11 (MTA-1/rgp46-I e K-55/rgp46-ll, respectivamente), bem como a protena recombinante transmembrana
GD21 compartilhada entre HTLV-1 e HTLV-11, o que acarretou menor frequncia de reaes inespecficas, reduzindo
o nmero de resultados falso-positivos encontrados e conferindo maior especificidade ao teste (Figura 9.8). 8687
No entanto, mesmo aps tais modificaes, diversos estudos tm mostrado que a ltima verso do WB (HTLV Blot 2.4,
Genelabs Diagnostics, Singapore), ainda apresenta um grande
percentual de resultados soroindeterminados,408889 em frequncias variando de 0,5% entre doadores de sangue a 7,05%
em populao de risco. 9091 Esses achados chegam a ser mais
frequentes do que os resultados comprovadamente positivos,
tanto em pases localizados em regies no endmicas, como
nos EUA (0,027% positivos e 0,14% indeterminados),92 como
tambm em regies consideradas endmicas, tais como o Brasil
(0,03% positivos e 0,14% indeterminados)62 e outros pases do
Caribe, Guadalupe (0,2% positivos e 0,4% indeterminados)93 e
Martinica (0,4% positivos e 0,5% indeterminados).90 Na frica,
estudos conduzidos na Repblica de Camares j mostraram
taxas populacionais de sororreatividade indeterminada iguais
ou superiores a 11%.9495
O ensaio de WB para HTLV-1/11 anteriormente citado, alm
de teste diagnstico confirmatrio, serve tambm como teste discriminatrio, pois pesquisa anticorpos circulantes voltados para
epitopos no compartilhados entre os dois tipos de HTLV, possibilitando assim identificar o tipo viral responsvel pela infeco.
Os antgenos virais utilizados so obtidos a partir de culturas de

GD21

_
_

anti-lgG
rgp46-ll

anti-lgG
rgp46-ll

p53

HTLV-11

Figura 9.8 Esquema das modificaes ocorridas na composio antignica do ensaio de Western blot utilizado na confirmao sorolgica da
infeco por HTLV-1/11 ao longo do tempo. Adaptada de Caterino-de-Araujo, 2008.81

128

Diagnstico Laboratorial

clulas infectadas, que, por meio de uma eletroforese em gel de


poliacrilamida, tm suas respectivas protenas virais separadas
de acordo com seu peso molecular. Esse material , ento, transferido para uma membrana de nitrocelulose, que cortada em
tiras. A anlise por WB , na verdade, uma variao da reao
de ELISA: quando expostas ao soro do paciente infectado, as
protenas imobilizadas capturam os anticorpos especficos do
vrus, e essa ligao pode ser visualizada com um anticorpo antihumano conjugado a uma enzima. A tcnica revela as protenas reconhecidas pelo soro do paciente e a sororreatividade aos
antgenos tipo-especficos distingue os indivduos infectados
por HTLV-1 daqueles infectados por HTLV-11. Porm, nos casos
em que o WB no for capaz de confirmar a infeco pelos HTLV
e apresentar resultados indeterminados, ou, ainda, quando no
puder identificar o tipo viral responsvel pela infeco (padro
HTLV no tipado), h a necessidade de se recorrer s tcnicas
laboratoriais de biologia molecular para esse fim.76
A Figura 9.9 ilustra as bandas que podem ser visualizadas
no teste de WB para a pesquisa de infeco por HTLV-1/11 e os
critrios de interpretao da tcnica, segundo recomendaes
do fabricante do kit diagnstico.

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p28
p26
p24
gp21
p19

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GD21

Figura 9.9 Padro de reatividade do Western blot (HTLV Blot 2.4, Genelabs), segundo critrios do fabricante. Interpretao dos resultados: Negativo - nenhuma reatividade para as bandas especficas do HTLV-1/11;
HTLV-1 seropositivo - reatividade para bandas dos genes gag (p19 com
ou sem a p24) e env (GD21 e rgp46-I); HTLV-11 seropositivo - reatividade
para bandas dos genes gag (p24 com ou sem ap19) e env (GD21 e rgp46ll); HTLV-1 e HTLV-11 seropositivo - reatividade para bandas dos genes
gag (p24 e p19) e env (GD21, rgp46-I e rgp46-ll); HTLV-positivo, mas no
tipado - reatividade para bandas dos genes gag (p 19 e p24) e env (GD21 );
indeterminado - reatividade para bandas especficas do HTLV, mas no
preenchem os critrios de positividade para o HTLV-1 ou HTLV-11 ou HTLV;
amostras representativas de alguns padres indeterminados -indeterminado -todas as bandas, exceto rgp46-I, rgp46-ll eGD21; indeterminadob
-GD21, p24; indeterminadoc -GD21 (TL) e rgp46-ll;TL-traos leves; CS
- controle da qualidade do soro. Adaptada de Costa, 2010.56

A elevada frequncia de resultados indeterminados pelo


WB acarreta intensa insegurana para o paciente e seus familiares. Alm disso, compromete significativamente, sob o
ponto de vista epidemiolgico, a estimativa da prevalncia de
infeco por HTLV-1/11 na populao e, sob o ponto de vista
clnico, o aconselhamento e a assistncia ao paciente.
Embora estudos conduzidos em reas no endmicas
para a infeco por HTLV tenham demonstrado que padres
indeterminados ao WB, em geral, no correspondem a casos
verdadeiramente positivos infeco,96 o mesmo parece no
ocorrer em regies endmicas ou em populaes mais suscetveis infeco.409798
Amostras soroindeterminadas ao WB com resultados comprovadamente negativos infeco pelos HTLV, quando submetidas a outros testes confirmatrios (sorolgicos e/ou moleculares), podem ser decorrentes de reatividade cruzada por
coinfeco com outros vrus e/ou parasitas.99- 101 Resultados
indeterminados podem ainda ser decorrentes de infeces por
cepas variantes de HTLV que apresentam mutaes genmicas em segmento(s) do DNA provira! que codificam os peptdios imunodominantes contidos no susbstrato antignico do
teste.1213 Por outro lado, amostras indeterminadas ao WB
que resultam positivas nos testes moleculares podem representar casos de infeco recente, ainda em fase de soroconverso.90
Para minimizar as limitaes do WB, um teste semelhante
foi desenvolvido posteriormente, o Immunoblot, com a vantagem de conter apenas protenas especficas, e, por isso, apresenta melhor poder discriminatrio, com menor percentual
de resultados indeterminados.6314 No entanto, sua utilizao
tem sido raramente descrita, pois, assim como o WB, tem
custo bastante elevado.

Diagnstico molecular
A pesquisa de genomas (pro)virais por testes moleculares vem se tornando a principal ferramenta para a deteco
e a identificao de diversos vrus em laboratrios de todo o
mundo. Sendo assim, como nova alternativa para o diagnstico confirmatrio e discriminatrio da infeco pelos HTLV,
ensaios moleculares de amplificao genmica como a reao
em cadeia da polimerase (PCR) e a PCR em tempo real tm
sido utilizados.88105- 107 Alm disso, as reaes de PCR tambm tm sido teis no diagnstico precoce da transmisso
materno-infantil, pois, nesses casos, os resultados das provas
sorolgicas sofrem interferncia da transferncia passiva de
anticorpos maternos. A deteco da infeco na fase de soroconverso aps infeco recente tambm pode ser realizada
com base nos testes moleculares.108
As tcnicas de biologia molecular empregadas com finalidade diagnstica pesquisam DNA proviral em clulas
mononucleares do sangue perifrico (PBMC), uma vez que os
HTLV no apresentam significativa viremia plasmtica. 109
Os ensaios da PCR (convencional e em tempo real)
baseiam-se na amplificao exponencial de segmentos genmicos do DNA proviral. Na reao com finalidade diagnstica,
tm-se utilizado iniciadores (primers) consensuais relacionados
com regies mais conservadas do genoma proviral (pol e/ou
tax), capazes de amplificar sequncias tanto de HTLV-1 como
de HTLV-11. No caso da PCR em tempo real uti1izam-se na
reao sondas luminescentes (no sistema de deteco TaqMan)
ou corantes, que se ligam fita dupla de DNA (no sistema de
deteco SYBR Green), possibilitando que se detecte o produto
da amplificao no prprio equipamento em que o ensaio est
sendo realizado. Na PCR convencional, aps a amplificao,

Captulo 9

Infeco por HTLV-1eHTLV-11

h necessidade de submeter as amostras a eletroforese em


suporte slido (gel de agarose ou poliacrilamida) para posterior adio das sondas e revelao dos amplicons.
Por outro lado, se o interesse identificar subtipos virais,
os segmentos genmicos de HTLV com maior variabilidade
gentica (LTR e env) so escolhidos para a amplificao pela
PCR.110-113
Os testes moleculares so altamente sensveis e especficos,
com maior sensibilidade da PCR em tempo real. Todavia, o
desempenho dessa tcnica depende diretamente da carga provira! de HTLV encontrada nas amostras testadas.97114 Com
a finalidade de aumentar a sensibilidade da PCR convencional, em alguns casos pode-se optar pelo emprego da tcnica
de nested PCR, que consiste em uma segunda amplificao
genmica, a qual utiliza como molde o produto de amplificao inicial e um par de iniciadores, localizado internamente
sequncia do par de iniciadores consensuais empregado na
primeira amplificao. Contudo, esse ensaio adicional consome tempo e apresenta alto risco de contaminao. Por outro
lado, em ambas as reaes de PCR (convencional e em tempo
real), fundamental incluir controles internos de reao,
como, por exemplo, iniciadores para sequncias genmicas
de clulas eucariticas (3-globina, HLA), que tornam possvel
verificar as condies de amplificao, minimizando os riscos
de se obterem resultados falso-negativos.
Para distinguir as infeces por HTLV-I e/ou por HTLV-II,
utilizam-se tcnicas de hibridao com sondas especficas
marcadas, 115 ou, ainda, a anlise de polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrio enzimtica (RFLP), aps
digesto dos produtos da PCR por endonucleases, que produzem fragmentos tipo-especficos.4 73116 Contudo, para minimizar etapas, em vez de se utilizarem iniciadores consensuais,
a PCR pode tambm ser executada, empregando-se iniciadores
especficos, capazes de amplificar exclusivamente segmentos de
HTLV-I ou HTLV-II em cada reao. Nessa situao, o diagnstico diferencial depende apenas da visualizao dos produtos da PCR diretamente por eletroforese em suporte slido.
A Figura 9 .1O mostra um grfico de amplificao de uma
reao de PCR em tempo real para a deteco do segmento
genmico pol dos HTLV-I e HTLV-II e de albumina humana,
utilizada como controle endgeno de reao (A) e apresenta
os produtos de amplificao da nested PCR (B), seguida de
RFLP (C), ambas para a regio tax dos HTLV.
No Brasil, em vista do alto custo do teste de WB e do elevado nmero de soros com padro inconclusivo (indeterminado ou HTLV no tipado), diversos protocolos de PCR tm
sido propostos. No entanto, carecem de padronizao quanto
ao segmento proviral pesquisado e quanto aos iniciadores e
sondas empregados.40,72,88,97,118-121
A escassez de estudos multicntricos que utilizam esses testes no pas dificulta a comparao dos resultados obtidos.

Algoritmos de testes laboratoriais para odiagnstico


O Ministrio da Sade do Brasil (1998) recomenda dois
algoritmos para o diagnstico de infeco por HTLV-I/II, de
modo a contemplar as necessidades dos bancos de sangue e
dos laboratrios de diagnstico, que diferem entre si. Nas unidades de hemoterapia, as amostras de soro devem ser submetidas a um nico teste de EIA que contenha antgenos especficos
de HTLV-I e HTLV-II. Quando apresentam resultados reagentes ou indeterminados devem ser retestadas em duplicata,
utilizando-se o mesmo kit de EIA e, em caso de novamente
resultarem reagentes e/ou indeterminadas, devem determinar
a excluso do doador. Em laboratrios de diagnstico, aps a

129
A. PCR em tempo real

(po~

- 1.062
~

LO

co

LO

<.D

:::!:.

co
o
e:

Q)

~
~

g 1.001
o:

Threshold

25

20

35

30

40

45

Ciclos
HTLV-1 positivo
HTLV-11 positivo

Albumina endgena
HTLV-1/11 negativo

e. PCR-RFLP (taq /)

B. nested PCR (tax)


M

128 pb

...

1 1

2 2

CN CN

1NO 1D 2ND 20 CNND CNDM

128 pb ...

69153 pb ...

HTLV-1 HTLV-11 HTLV-11

Figura 9.1 OTestes moleculares empregados no diagnstico confirmatrio de infeco por HTLV-1/11. A. Curvas de amplificao da PCR em
tempo real (pon. Threshold: valor de fluorescncia ideal para discriminar
uma amostra positiva de uma negativa na PCR em tempo real; Ct:cycle
threshold. Adaptada de Costa, 2010.56 B. Produtos de amplificao da
nested PCR (tax). C. Padro eletrofortico de produtos de amplificao da
nested PCR (tax) antes e aps a digesto pela enzima Taq 1na reao de
PCR-RFLP. M: DNA Ladder de 100 pb; CN: duplicata do controle negativo
para HTLV-1/11; 1: duplicata do controle positivo para HTLV-1; 2: duplicata
do controle positivo para HTLV-11; ND: produto no digerido; D: produto
digerido. As setas esquerda indicam os tamanhos dos produtos amplificados em pares de bases. Adaptada de Caterino-de-Araujo, 2008.117

triagem sorolgica baseada em EIA e retestagem em duplicata


das amostras reagentes e indeterminadas, sugere-se proceder
ao teste confirmatrio por IFI ou WB, embora o primeiro no
esteja disponvel comercialmente.
Diversos grupos de pesquisa em HTLV do Brasil e do
mundo tm descrito dificuldades em definir o melhor algoritmo laboratorial para diagnstico de infeco por HTLV,
principalmente por HTLV-II, uma vez que dados mostram
que nenhum teste de EIA atualmente disponvel no comrcio (1, 2 ou 3 gerao) capaz de detectar todos os casos
verdadeiramente soropositivos (confirmados por WB e/ou
PCR).40,79,83,91.118122- 128 Corroborando esses achados, estudos
com os testes preconizados para o diagnstico confirmatrio
e discriminatrio da infeco mostram que nenhum apresenta
100% de eficincia, quando empregado isoladamente, sendo
os vrios testes, em verdade, complementares entre si.4798897
Em funo de tais limitaes, estudos para adequar os algoritmos de testes vm sendo desenvolvidos e novas condutas
vm sendo adotadas. Para atender a populao de bancos de

Diagnstico Laboratorial

130
sangue, considerada de baixo risco para a aquisio dos HTLV,
em geral a amostra de soro testada em duplicata por um
nico teste de EIA que apresente alta sensibilidade (3 gerao). As amostras reagentes e/ou indeterminadas so automaticamente descartadas. Apesar do grande percentual de
resultados falso-positivos apresentados pelos EIA de 3 gerao, candidatos doao de sangue devem ser rigorosamente
triados; portanto, o seu uso em duplicata parece ser suficiente.
Contudo, a realizao dos testes confirmatrios para HTLV
facultativa em bancos de sangue, e aqueles que a fazem, geralmente, utilizam o ensaio de WB ou a PCR. Em sua maioria,
os indivduos sororreagentes so encaminhados a ambulatrios especializados para confirmao diagnstica e aconselhamento clnico.63127129
Em contrapartida, populaes de risco para aquisio da
infeco so assistidas por laboratrios de referncia, que
tm solicitado uma nica amostra de sangue colhida em tubo
contendo anticoagulante, para possibilitar que a triagem e a
confirmao dignstica sejam realizadas por ensaios sorolgicos e moleculares a partir da mesma amostra. Para a triagem,
recomenda-se o emprego de dois testes EIA de composio
antignica e formatos diferentes (2 e 3 gerao). Embora essa
medida no minimize o nmero de resultados falso-positivos
dos EIA de 3 gerao, reduz significativamente o nmero de
resultados falso-negativos. As amostras reagentes em pelo
menos um EIA so retestadas em duplicata pelos mesmos
testes e as que novamente resultarem reagentes e/ou indeterminadas devem ser submetidas aos testes confirmatrios.
Recentemente, foi proposto novo algoritmo de testes confirmatrios para atender essa populao, que recomenda o uso
da PCR em tempo real como teste confirmatrio, reservando a
avaliao por WB somente para as amostras negativas PCR.
Essa medida, alm de reduzir custos, minimiza consistentemente o percentual de resultados indeterminados observado
com o WB. Contudo, somente factvel em laboratrios equipados para realizar a PCR em tempo real.

Sendo assim, poderia representar um marcador de evoluo


clnica para PET/MAH.
Embora os resultados variem muito de um indivduo para
outro, e, at, no mesmo indivduo em diferentes perodos da
infeco (flutuao da carga proviral), 137 a mdia da carga provira! de HTLV-I em um portador assintomtico significativamente mais baixa do que em pacientes com ATL e PET/MAH,
principalmente nos progressores rpidos (que apresentam
cargas 10 a 100 vezes mais elevadas). 136138- 140 Presume-se que
o aumento da carga proviral esteja relacionado com a maior
resposta inflamatria e, em consequncia, com a leso no sistema nervoso. Entretanto, no h at o momento evidncias
de que se possa definir um limiar de carga provira! associado
a risco de progresso para doena neurolgica em coortes
de portadores assintomticos da infeco por HTLV-I. Alm
disso, relatos mostram que, em geral, aps o estabelecimento
da doena, a carga provira! pode tornar-se indetectvel em
pacientes com PET/MAH. 132
Alm de ser determinante na patognese da PET/MAH,
a carga provira! elevada de HTLV-I parece estar associada a
outras doenas de carter inflamatrio, como uvetes141 e artrites.142No contexto da ATL, carga provira! aumentada indica um
estgio intermedirio da doena, frequentemente complicada
por infeco oportunista, coma parasitoses (estrongiloidase)
e micoses. 22
Os indivduos infectados por HTLV-II, ao contrrio, exibem habitualmente cargas provirais muito baixas, fato esse
atribudo por alguns autores grande estabilidade genmica
desse vrus ou a sua lenta replicao. 131134 Em contrapartida,
em pacientes coinfectados com HIV-I, h relatos que mostram
carga provira! de HTLV-II aumentada, 143144 muito embora
haja outro estudo que no corroborou tais achados. 145
A intensidade da carga proviral do HTLV tambm tem sido
relacionada com a via de aquisio do vrus (sexual ou vertical), sendo mais baixa nos indivduos que adquiriram a infeco por via sexual. 146

Monitoramento da carga provira/

Isolamento virai

Nas ltimas dcadas, a PCR em tempo real quantitativa


(qPCR) vem sendo empregada na prtica clnica para monitorar a carga virai plasmtica em casos de infeco pelo H IV e
pelos vrus das hepatites B e C. Na infeco pelo HIV, esse marcador, que indica a intensidade da replicao viral, torna possvel que seja avaliado o risco de o paciente evoluir para AIDS,
bem como sua resposta ao tratamento antirretroviral. 130
O advento da qPCR possibilitou a introduo da automao na quantificao da carga provira!, o que conferiu reprodutibilidade e preciso de resultados, ampliando o espectro de
aplicaes dos mtodos moleculares e direcionando-os para
uma aplicao clnica.105,107,131,132
No caso da infeco por HTLV a determinao da carga
provira! vem sendo estudada quanto ao seu valor prognstico
no monitoramento de portadores assintomticos e de pacientes com PET/MAH.16133- 136 No entanto, assim como a PCR
convencional para o diagnstico, a qPCR tambm carece de
padronizao e de estudos multicntricos.
A carga provira! de HTLV-I/II geralmente medida em
PBMC, sendo expressa em nmero de cpias por 106 PBMC.
Esse marcador determina o nvel de integrao virai nas clulas hospedeiras, ou seja, a proporo de clulas infectadas que
carregam provrus, possibilitando o acompanhamento peridico da evoluo clinica dos pacientes infectados, uma vez
que, como um marcador de replicao viral, pode indicar possveis danos ao hospedeiro em diferentes perodos da infeco.

As tcnicas de isolamento virai podem tambm detectar e


identificar o tipo de HTLV responsvel pela infeco, embora
com menor sensibilidade, quando comparadas aos mtodos
sorolgicos e de amplificao do genoma. O isolamento revelado pela pesquisa da produo de antgenos virais, utilizandose EIA para quantificar tais protenas no sobrenadante da cultura (p24 do HTLV-I/II, por exemplo). 147 Alm disso, pode-se
buscar a deteco direta de partculas retrovirais nos cultivos,
por ultramicroscopia, ou, ainda, pesquisar antgenos virais em
clulas cultivadas in vitro, por imunofluorescncia direta.
As tcnicas que apresentam melhores resultados envolvem o
cocultivo de PBMC do paciente a ser testado com linfcitos de
indivduo no infectado, estimulados por mitgenos (fito-hemaglutinina) e fatores de crescimento linfocitrio, como a IL-2. 148
Apesar de ser a mais clssica tcnica de diagnstico virolgico e de tornar possvel a obteno e a manuteno do vrus
para estudos posteriores, o isolamento viral apresenta limitaes operacionais no que se refere a: longo tempo necessrio
para a obteno dos resultados; custo elevado, pois requer
infraestrutura laboratorial sofisticada com nvel de biossegurana adequado para ser executada; problemas de frequente
contaminao dos cocultivos por bactrias e/ou fungos; e
sensibilidade comprometida em casos de pacientes com baixa
carga viral. Considerando tais limitaes, sua utilizao tem
sido restrita a laboratrios de pesquisa, no se aplicando
rotina diagnstica.

Captulo 9

Infeco por HTLV-1eHTLV-11

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Captulo 9

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Captulo 1O

Mononucleose
ln ecciosa

Thelma Suely Okay

Introduo, 136
Epidemiologia e transmisso, 136
Caractersticas do vrus, 137
Diagnstico laboratorial, 138
Referncias bibliogrficas, 140

136

Diagnstico Laboratorial

. .,. Introduo

. . . Epidemiologia etransmisso

O vrus Epstein-Barr (EBV, do ingls Epstein-Barr vrus)


o agente causal da sndrome de mononucleose infecciosa (MI)
caracterizada por febre, faringite e linfadenopatia. Alm dessa
apresentao clssica, a infeco primria pelo EBV pode
manifestar-se de modo atpico em lactentes, idosos e pacientes
imunodeficientes, e, assim, ser confundida com outras infeces. O EBV, tambm chamado de herpes-vrus humano 4
(HHV-4), muito antigo e, provavelmente, evoluiu com seus
diferentes hospedeiros ao longo dos ltimos 9/10 milhes de
anos. 1 Com habilidade de estabelecer latncia e reativao
intermitente ao longo da vida do hospedeiro aps infeco primria, causando poucos sintomas na maioria dos indivduos
infectados, o EBV tornou-se ubiquitrio. H fortes indcios de
que o vrus exera papel fundamental na patognese de vrias
doenas autoimunes, tais como dermatomiosite, lpus eritematoso sistmico, artrite reumatoide, sndrome de Sjgren,
esclerose mltipla e diabetes melito do tipo 1.2 Outra caracterstica do EBV estar associado a vrias doenas linfoproliferativas e neoplasias, particularmente o linfoma de Hodgkin,
o linfoma de Burkitt, o carcinoma nasofarngeo e linfomas do
sistema nervoso em pacientes HIV-positivos.34 Por esses motivos, a confirmao laboratorial da infeco causada pelo EBV
fundamental, e, apesar dos avanos na rea da imunologia
e do advento de tcnicas moleculares, o desenvolvimento de
testes rpidos e especficos para o diagnstico dessa infeco
ainda um desafio para a medicina laboratorial.
O termo mononucleose infecciosa (MI) foi criado em
1920 para descrever uma sndrome caracterizada por febre,
linfadenopatia, fadiga e linfocitose com predomnio de clulas mononucleares observada em seis pacientes. 5 No incio da
dcada de 1930, os trabalhos de Paul e Bunnell levaram descoberta do teste para deteco de anticorpos heterfilos,6 ainda
utilizado atualmente no diagnstico da MI. Paul e Bunnell
observaram que soros obtidos de pacientes com MI aglutinavam eritrcitos de carneiro. Outros pesquisadores observaram
que os soros desses pacientes tambm aglutinavam eritrcitos
de outros animais (boi e cavalo) e que as protenas responsveis por essa aglutinao eram glicoprotenas encontradas na
membrana de eritrcitos de vrios mamferos. Estudos subsequentes mostraram que protenas extradas de eritrcitos
bovinos apresentavam avidez ainda maior pelos anticorpos
heterfilos do EBV.
O nome Epstein-Barr oriundo dos nomes dos descobridores do vrus, Anthony M. Epstein e Yvonne Barr. Em
1961, Anthony Epstein, patologista especializado em microscopia, assistiu palestra "Cncer infantil na frica tropical
- sndrome at agora no reconhecid', proferida por Denis
Burkitt Parsons, um cirurgio que trabalhava em Uganda e que
descreveu o linfoma de Burkitt pela primeira vez. Em 1963,
uma amostra de tumor infantil foi enviada de Uganda para o
Hospital Middlesex, a fim de se cultivarem as clulas tumorais. Partculas do vrus foram, ento, identificadas em culturas de clulas.7 As linhagens celulares foram enviadas para
Werner e Henle Gertrude, do Hospital Infantil da Filadlfia, e
esses pesquisadores desenvolveram testes sorolgicos.89 Alm
disso, demonstraram que o vrus Epstein-Barr era o agente
etiolgico nos casos de MI associados a anticorpos heterfilos. Vrias tcnicas sorolgicas que envolvem o uso de antgenos especficos do EBV tm surgido desde ento. Em 1984, o
genoma da cepa B95-8 do vrus foi totalmente sequenciado, o
que facilitou, sobremaneira, o diagnstico molecular de infeces causadas pelo EBV. 1

Os sintomas da mononucleose infecciosa (febre glandular),


que surgem aps um perodo de incubao de 4 a 7 semanas,
geralmente incluem linfadenopatia, febre e faringite.11 O EBV
encontrado na orofaringe em aproximadamente 15% de
adultos soropositivos e a excreo na saliva mais frequente
em pacientes com MI e em pacientes imunodeficientes (transplantados, portadores do HIV). 1213 A transmisso ocorre por
meio de contato ntimo, geralmente com secrees orais, de
um indivduo que est excretando o vrus. O EBV pode ser
cultivado da orofaringe de pacientes com MI at 18 meses
aps a infeco.
A prevalncia de anticorpos anti-EBV est diretamente
relacionada com o nvel socioeconmico da populao estudada. Cerca de 50% da populao apresenta anticorpos antiEBV quando atinge 5 anos de idade, com uma taxa de soroconverso elevada durante a adolescncia. 14 Em So Paulo,
cerca de 80% da populao j tm anticorpos anti-EBV aos
12 anos de idade.1516
A infeco primria pelo EBV tem sido considerada assintomtica ou incaracterstica quando ocorre em lactentes e crianas pequenas. Sendo assim, a maior parte do conhecimento
sobre a infeco primria derivada de estudos em adolescentes portadores de mononucleose infecciosa. No entanto,
a premissa de que a infeco primria pelo EBV na infncia
seja sempre subclnica no verdadeira. 17 Embora os sintomas
possam ser mais amenos, a infeco primria em lactentes no
fundamentalmente diferente da MI da adolescncia. 18
A excreo do EBV na saliva de adultos pode variar de 22 a
90% durante um perodo de 12 meses.1924 Nesses e em outros
estudos, no foi possvel detectar qualquer associao entre a
frequncia de excreo viral ou o nvel da carga viral na saliva
e a presena do EBV em polimorfonucleares,224 sugerindo
que os fatores responsveis pela reativao do EBV na orofaringe so diferentes daqueles que regem a variao da carga
viral no sangue.
O EBV foi detectado em secrees do colo uterino com frequncias que variaram de 8 a 28% em adolescentes e mulheres
adultas, e tambm foi observado em amostras de smen; 25- 28
entretanto, evidncias sobre a transmisso do EBV por contato
genital so limitadas. Estudo realizado em populao masculina evidenciou que o EBV tipo 2 significativamente mais prevalente em homens homossexuais do que entre heterossexuais
masculinos, estando associado ao nmero de parceiros.29 O
modo exato de transmisso, no entanto, desconhecido, uma
vez que difcil distinguir entre transmisso genital, contato
orogenital ou pela saliva. A transmisso transplacentria e a
transmisso por intermdio do leite materno tm sido relatadas em raras circunstncias; por isso, so considerados modos
de transmisso de pouca relevncia mdica. 3o-32 O EBV pode
ser transmitido por transfuso de sangue e por transplante de
rgos. 33- 34 A transmisso do EBV particularmente preocupante em pacientes que receberam transplantes de rgos nos
quais a infeco primria pelo EBV constitui um importante
fator de risco para o desenvolvimento de doena linfoproliferativa (PTLD) ps-transplante. 34 - 36
Como o contato ntimo parece ser responsvel pela maioria
dos casos de mononucleose infecciosa,37 a incidncia idadeespecfica da MI pode diferir em razo de diferenas de comportamento. Em crianas, o hapltipo ATA na regio promotora da interleucina 10 est associado a nveis elevados de
IL-1 O e a idade mais tardia de aquisio da infeco primria

137

Captulo 1O 1 Mononucleose Infecciosa


pelo EBV. Assim, o hapltipo ATA parece influenciar a idade
na qual a infeco primria ocorre e, talvez, o risco de o indivduo apresentar doena sintomtica. 38 Estudos sobre os alelos
do HLA deram origem a resultados conflitantes. Foi relatada
maior frequncia de HLA-B-3501 em casos de mononucleose
infecciosa em relao aos indivduos-controle; no entanto,
estes dados no puderam ser reproduzidos.I I

. .,. Caractersticas do vrus


O EBV pertence familia Herpesviridae. microscopia
eletrnica, partculas virais apresentam nucleocapsdio hexagonal envolvido por envelope de estrutura complexa, sendo
indistinguveis de outros herpes-vrus.
O isolamento do EBV somente possvel em linfcitos B e
em clulas epiteliais da orofaringe de primatas, no havendo
produo de efeito citoptico. Linfcitos B infectados in vitro
com EBV so capazes de proliferar continuamente, sendo
denominados linfcitos imortalizados ou transformados;
porm, apenas 10% dos linfcitos B expostos ao EBV em
cultura se tornam imortalizados.4 Aps a transformao, as
clulas prognicas passam a conter vrus sob forma latente,
capazes de produzir vrios antgenos passveis de deteco por
imunofluorescncia indireta ou hibridizao in situ. Os linfcitos B transformados in vitro tm ainda capacidade de produzir imunoglobulinas das classes IgG, IgA e IgM. 39
Aps replicao inicial em clulas da nasofaringe, nas quais
sofrem replicao ativa,40 a penetrao do vrus em linfcitos
B se faz por meio de uma ligao com o receptor C3d (CD21)
do complemento, seguida de endocitose.4I A partir dos linfcitos, os vrus infectam outros rgos e sistemas, produzindo
dois tipos de infeco:
Ltica, na qual o DNA do EBV induz a produo de protenas
virais, ocorrendo lise de linfcitos e liberao de vrions
No ltica (latente), que subdividida em quatro fases (1, li,
III e IV ou latncia zero), de acordo com o nvel de expresso gnica do EBV e as protenas expressas.
O ciclo ltico resulta da infeco aguda, e vrias protenas virais so expressas com o objetivo de produzir vrions
infectantes. Formalmente, essa fase de infeco no leva inevitavelmente lise da clula hospedeira contendo vrions do
EBV. II O ciclo latente executa programas que no resultam na
produo de vrions. Um conjunto muito limitado e distinto
de protenas virais produzido durante o ciclo latente. Estas
protenas incluem os antgenos nucleares EBNA-1, EBNA-2,
EBNA-3A, EBNA-3B e EBNA-3C, alm da EBNA-protena
lder (EBNA-LP), de protenas latentes da membrana LMP-1,
LMP-2A e LMP-2B, e finalmente de RNA (EBER). Sequncias
que codificam ao menos 20 micro-RNA tambm so expressas
em clulas com infeco latente. II
Na infeco latente, o genoma do EBV incorporado ao
genoma dos linfcitos do paciente permanentemente. Aps
24 h da entrada do EBV no linfcito, podem-se detectar antgenos nucleares (EBNA), os quais so os responsveis pela
imortalizao do linfcito. Linfcitos B imortalizados tm a
capacidade de produzir vrias imunoglobulinas policlonais.
Anticorpos que reagem com eritrcitos de carneiro (heterfilos) e outros constituem o resultado da produo de imunoglobulinas policlonais pelos linfcitos B imortalizados. Poucos
linfcitos B infectados pelo EBV so lisados, provocando a
liberao de antgenos especficos do vrus, os quais funcio-

nam como marcadores da replicao viral ativa. Esses antgenos podem ser divididos em antgenos de expresso precoce
(EA) e antgenos da cpside viral (VCA). Os antgenos precoces subdividem-se em antgenos difusos (EA-D), detectveis
no citoplasma e no ncleo das clulas infectadas, e antgenos
restritos (EA-R), encontrados somente no citoplasma.42
As protenas virais EBNA-2, EBNA-3C e LMP-1 so essenciais para a transformao celular e esto associadas ao desenvolvimento de tumores, enquanto a EBNA-LP e os EBER no
esto. A protena EBNA-1 essencial para a manuteno do
genoma do vrus. II Postula-se que, aps a infeco natural
com EBV, o vrus execute alguns ou todos os programas de seu
repertrio de expresso gnica para estabelecer uma infeco
persistente. O Quadro 10.1 apresenta um resumo das protenas, dos genes e dos antgenos expressos pelo EBV durante as
fases latente e ltica da infeco.
Em razo da ausncia inicial de imunidade no hospedeiro,
o ciclo ltico produz grandes quantidades de vrions para
infectar outros linfcitos B no interior do mesmo hospedeiro.
Os programas de latncia, por outro lado, so capazes de
reprogramar linfcitos B infectados. Eventualmente, quando
o hospedeiro desenvolve imunidade, o vrus consegue sobre-

Quadro 10.1 Protenas, genes eantgenos do vrus


Epstein-Barr (EBV).
Protena/
gene/antgeno

Estgio

Descrio

EBNA-1

Latente+
ltico

EBNA-1 uma protena que se liga ao local de


origem da replicao do vrus (oriP) no genoma
virai emedeia a replicao durante adiviso
celular da clula do hospedeiro. ~a nica protena
virai expressa durante afase 1de latncia

EBNA-2

Latente+
ltico

EBNA-2 oprincipal transativador virai

EBNA-3

Latente+
ltico

LMP-1

Latente

Esses genes se ligam protena RBP-Jk do


hospedeiro
LMP-1uma protena transmembrana essencial
para ocrescimento eatransformao de clulas,
infectadas pelo EBV

LMP-2

Latente

LMP-2A/1MP-2B so protenas transmembrana


que atuam bloqueando asinalizao via
tirosinoquinases

EBER

Latente

EBER-1/EBER-2 so pequenos RNA nucleares que


se ligam adeterminadas protenas nucleares,
possibilitando aligao ao PKR (RNA de dupla
fita dependentes de serinas etreoninoquinases),
inibindo sua funo. EBER tambm induzem a
produo de IL-10, que, por sua vez, aumenta
ocrescimento celular einibe atoxicidade de
clulas T

miRNA

Latente

Os micro-RNA do EBV so codificados por dois


transcritos, um deles localizado no gene BART
eooutro prximo ao cluster do gene BHRF1. Os
trs micro-RNA do BHRF1 so expressos durante
afase Ili de latncia enquanto ogrande cluster
dos micro-RNA do gene BART expresso durante
afase li de latncia. Afuno desses micro-RNA
ainda desconhecida

EBV-EA

Ltica

Antgeno precoce ou early antigen

EBV-MA

Ltica

EBV-VCA

Ltica
Ltica

Antgeno de membrana
Antgeno da cpside virai

EBV-na

Nuclease alcalina

138
viver, "desligandd' a maioria (ou quase todos) os seus genes,
porm, reativando a produo de novos vrions de tempos em
tempos. O equilbrio entre a reativao viral ocasional e a vigilncia imune do hospedeiro alcanado com a remoo das
clulas que ativam a expresso viral da circulao. A regio de
persistncia do EBV parece ser a medula ssea, uma vez que
pacientes EBV-positivos que tiveram sua medula ssea substituda pela medula ssea de doadores EBV-negativos se tornaram EBV-negativos aps o transplante.35
Dois tipos de EBV, chamados de 1e2 (ou A e B), so reconhecidos com base em diferenas nos antgenos nucleares e
na habilidade de infectar linfcitos B in vitro. O EBV tipo 1
transforma rapidamente linfcitos B in vitro, enquanto o tipo
2 infecta os linfcitos com menor eficincia. Sabe-se que os
subtipos do EBV ( 1 e 2) parecem ter distribuio geogrfica
distinta, e que a maioria dos indivduos no imunodeficientes est infectada com subtipos especficos. O tipo 1 o mais
prevalente e o mais frequentemente isolado da orofaringe de
indivduos assintomticos. O tipo 2 o mais prevalente em
indivduos previamente infectados com o tipo 1 e portadores
de HIV. Pacientes imunodeficientes apresentam uma populao heterognea e mutvel de subtipos 1 e 2 do EBV. 43

. .,. Diagnstico laboratorial


Diagnstico hematolgico
As alteraes hematolgicas mais frequentes so:

Linfocitose absoluta (> 4.500) e relativa (> 50% do nmero


de leuccitos): ocorre em cerca de 70% dos casos. A linfocitose atinge os nveis mais elevados durante a segunda ou a
terceira semana de doena, e, ocasionalmente, pode sugerir
um quadro de reao leucemoide. Linfcitos atpicos so
muito variveis e, embora sugestivos, no so patognomnicos de infeco pelo EBV. Outras afeces associadas
linfocitose atpica incluem: citomegalovirose, infeco pelo
herpes-vrus-6, HIV, hepatites virais, rubola, caxumba,
toxoplasmose, linfomas, leucemias linfoides e reaes
adversas a frmacos44
Neutropenia: ocorre em 60 a 90% dos pacientes e costuma
ser autolimitada45
Trombocitopenia: 50% dos pacientes apresentam plaquetas
< 140.000/mm3 46
Outras alteraes comuns so: elevao dos nveis de imunoglobulinas das classes IgM, IgG e IgA e aumento das concentraes de enzimas hepticas.47

Diagnstico sorolgico
Anticorpos heterfilos
O teste de Paul-Bunnell-Davidsohn ainda bastante empregado em nosso meio, sobretudo para testar pacientes imunocompetentes. Este teste est fundamentado nos mesmos princpios anteriormente descritos que dependem da presena de
anticorpos heterfilos, exceto por ser realizado em tubos de
ensaio. Os testes de aglutinao rpida disponveis comercialmente apresentam sensibilidade semelhante ou ligeiramente
superior ao teste de Paul-Bunnell tradicional, com a vantagem
de serem executados mais rapidamente.
Em pacientes com suspeita de infeco primria pelo
EBV, o Monospot ou similares, tais como Monoslide e

Diagnstico Laboratorial
Monolatex, so indicados como teste inicial. Se o teste for
positivo, a realizao de outros testes para a identificao de
anticorpos especficos no necessria em indivduos imunocompetentes. Entretanto, se o Monospot for negativo, os
casos suspeitos devero ser avaliados por meio da determinao de anticorpos especficos para o EBV. importante lembrar que o Monospot pouco til no diagnstico de MI em
pacientes imunodeficientes, uma vez que a maior parte deles
no produz anticorpos heterfilos.

Anticorpos especficos
Estes testes so teis no diagnstico de MI com anticorpos heterfilo-negativos (10% dos casos) e em casos atpicos.
Linfcitos B infectados com o EBV produzem vrios anticorpos especficos, os quais podem ser detectados por imunofluorescncia ou testes imunoenzimticos. importante enfatizar
que anticorpos especficos no devem ser valorizados no diagnstico de MI crnica se forem encontrados em ttulos baixos
ou moderados (VCA < 1:320 e EA < 1:40), uma vez que esses
ttulos podem ser encontrados aps vrios anos em indivduos
que tiveram infeco no complicada.48

Cultura do vrus
Muito embora o EBV possa ser cultivado a partir de
secrees orofarngeas ou de linfcitos em cerca de 90% dos
pacientes com MI aguda, as dificuldades tcnicas associadas
ao cultivo viral e o fato de o EBV poder ser cultivado a partir
da orofaringe de indivduos saudveis faz com que esse teste
apresente pouco valor clnico.49

Tcnicas moleculares
Atualmente, inmeros kits comerciais de hibridizao ou
de hibridizao in situ esto disponveis. As tcnicas de hibridizao tornam possvel distinguir entre infeco ativa ou
latente, e ainda se o EBV de origem monoclonal ou policlonal, porm apresentam menor sensibilidade quando comparadas s tcnicas de amplificao qualitativas ou quantitativas,
as quais tambm se encontram disponveis comercialmente e
apresentam a vantagem de poderem ser aplicadas ao monitoramento de pacientes em tratamento, o que extremamente
til em indivduos transplantados com doena linfoproliferativa. Na verso RT-qPCR, isto , analisando a expresso de
genes que so amplificados aps reao de transcrio reversa
com metodologia quantitativa, possvel distinguir as diferentes fases de latncia e os perodos de reativao da infeco
crnica.5051
Durante estudo realizado por Okay et al., 52 24 amostras de
sangue total e de soro foram obtidas de uma criana de 8 anos
de idade, que recebeu um transplante cardaco e foi acompanhada por 36 meses. Aos 5 anos de idade, a criana apresentou sinais e sintomas compatveis com MI, e a sorologia
para o EBV foi positiva para o VCA-IgM e IgG e negativa para
EBNA-IgG. Aps 14 meses, os parmetros sorolgicos mostravam VCA-IgG positivo, EBNA-IgG e VCA-IgM negativos;
esse padro sorolgico persistiu mesmo durante episdios
sugestivos de reativao. A PCR amplificou um fragmento
oriundo da glicoprotena gp220 do EBV e o limiar de deteco foi de 100 cpias virais. Todas as 24 amostras de sangue
total apresentaram resultados positivos por reao em cadeia
da polimerase (PCR, do ingls polymerase chain reaction ),
enquanto 12 das 24 amostras de soro foram positivas. Com
o intuito de analisar se a deteco de EBV-DNA em amostras
de soro poderia ser utilizada como marcador dos episdios de
reativao da infeco, consideramos os perodos nos quais a

Captulo 1O 1 Mononucleose Infecciosa


criana necessitou de internao e administrao de antivira!
como indicativos dos perodos de reativao. A anlise estatstica mostrou que houve associao entre os dois parmetros (PCR positiva em soro versus internao e tratamento).
Essa correlao foi analisada pelo teste de concordncia kappa
(valor der= 0,75 com p < 0,001). Concluiu-se que a deteco
de EBV-DNA em amostras de soro de pacientes imunossuprimidos poderia ser utilizada como marcador laboratorial de
reativao da infeco na falta de tcnicas quantitativas, tais
como a real-time PCR (PCR em tempo real).
O achado de DNA viral em soro de indivduos saudveis
excepcional, mas na fase aguda da MI altas cargas virais do
EBV so encontradas no soro da maior parte dos pacientes. O
pico de carga viral srica observado nos primeiros 7 dias de
doena, posteriormente a carga viral reduzida com a resoluo de sintomas, mas parece haver considerveis diferenas
entre indivduos.53 Paralelamente ao aumento da carga viral no
soro, a carga viral do EBV em clulas mononucleares do sangue perifrico (PBMC) aumenta durante as primeiras semanas
de doena, e, posteriormente, declina.54 Elevadas cargas virais,
entretanto, so encontradas na saliva por um perodo mnimo
de 6 meses aps o incio dos sinais clnicos, estando associadas
persistncia da infectividade.55
Os testes moleculares tambm tm sido empregados no
diagnstico laboratorial da infeco crnica ativa pelo EBV
(CAEBV), descrita pela primeira vez no final dos anos 1970
e caracterizada pela presena de infeco crnica e recorrente causada pelo EBV com sintomas semelhantes aos da
sndrome da mononucleose infecciosa, porm com um
padro incomum de anticorpos anti-EBV. O quadro clnico
caracterizado por linfadenopatia, esplenomegalia, pancitopenia, hepatite, m absoro intestinal, pneumonite e
uvete. 42 O padro sorolgico caracterstico inclui altos ttulos de VCA-IgG > 1:5.120, altos ttulos do antgeno precoce
(EA > 1:640) e baixos ttulos de EBNA (< 1:2). Os critrios para
o diagnstico da CAEBV foram sugeridos, e recentemente um
novo conjunto de diretrizes foi proposto.5657 Alm do padro
de anticorpos que se assemelha ao da infeco aguda e caracterizado por altos ttulos de anticorpos IgG anti-VCA e EA
(early antigens), com ausncia de anticorpos anti-EBNA (antgenos nucleares), pacientes com CAEBV tambm apresentam
menor nmero de linfcitos CDS+ EBV-especficos em relao a pacientes com MI ou a indivduos assintomticos que
se recuperaram de MI.58 No entanto, pacientes com CAEBV
apresentam cargas virais elevadas em linfcitos de sangue
perifrico e em soro.59
No h at o momento nenhum indcio de que o estabelecimento da CAEBV esteja associado a mutaes gnicas,
incluindo o gene responsvel pela sndrome linfoproliferativa
ligada ao X.60 A CAEBV parece constituir um espectro de doenas que cursam com a ativao incomum do EBV, causando
infeces crnicas sintomticas com presena de anticorpos
anti-EBV moderadamente elevados. Entretanto, podem ocorrer situaes mais graves de infeco crnica ativa com anticorpos anti-EBV extremamente elevados, expanso clonal de
clulas T e clulas NK infectadas pelo EBV, com agravamento
do quadro clnico, levando pancitopenia e insuficincia
heptica, culminando com elevada mortalidade.5961
Apesar de o EBV ter sido detectado em todas as populaes e reas do mundo, 18 foram observadas variaes geogrficas notveis na distribuio dos dois principais gentipos,
que diferem em relao aos genes que codificam algumas das
protenas nucleares em clulas cronicamente infectadas.62
Ambos os tipos so detectados em todo o mundo, sendo o

139
tipo 1 o mais prevalente. Em algumas regies (frica Central,
Papua-Nova Guin e Alasca), entretanto, o tipo 2 mais
prevalente.6364 Supe-se que a distribuio geogrfica dos dois
tipos de EBV reflita a prevalncia geral nas reas envolvidas.63
Assim, parece haver uma clara associao entre os dois gentipos virais e doenas especficas.
Na maioria das reas, o encontro do tipo 2 incomum,
exceto em pacientes imunodeficientes, HIV-positivos e transplantados. O aumento da deteco em indivduos imunodeficentes tem sido explicado por um aumento da exposio
ao vrus exgeno combinado com imunidade celular EBVespecfica deficiente. 63 A frequncia do gentipo 2 do EBV em
hemoflicos HIV-positivos comparvel frequncia em indivduos saudveis, o que indica que a imunodeficincia, por si,
no responsvel pelo aumento da deteco do tipo 2.65
Recentemente, em estudo realizado por Mendes et al.,66
44 crianas e adolescentes (21 pacientes transplantados de
fgado, 7 submetidos a transplante cardaco, 5 com AIDS, 3 com
hepatite autoimune, 2 com sndrome nefrtica, 2 com aplasia
medular, 2 com imunodeficincias primrias, 1 com prpura
trombocitopnica e 1 com lpus eritematoso sistmico ), todos
eles apresentando infeco crnica ativa pelo EBV (CAEBV)
com VCA-IgM persistentemente positivo, VCA-IgG > 1:5.120
e EBNA-IgG positivo, tiveram amostras de sangue perifrico
obtidas durante os episdios de reativao caracterizados
clinicamente. Amostras de DNA foram amplificadas com o
objetivo de realizar a deteco e a tipagem de EBV (tipo 1 ou
2) utilizando como alvo a sequncia que codifica o EBNA-2,
sabendo que este antgeno nuclear do EBV essencial para a
imortalizao de linfcitos B. Embora tenha-se encontrado
um predomnio do EBV tipo 1 do EBNA-2 (33/44, 75%),
10 pacientes (22,73%) tinham o tipo 2, e um paciente transplantado de fgado (2,27%) apresentava os dois tipos de EBV.
Na populao estudada formada por crianas e adolescentes com imunodeficincias primrias e secundrias, alm de
doenas autoimunes, foi encontrada maior proporo do tipo
2 do EBV do que seria esperado para uma populao peditrica. No entanto, em populaes de maior risco para o desenvolvimento de doena linfoproliferativa (PTLD) associada ao
EBV, notadamente linfomas, tambm existe aumento da deteco do tipo 2 em relao ao tipo 1, e da coinfeco pelos dois
tipos. Esses estudos amplificaram amostras de tumores para a
deteco do EBV e a tipagem, enquanto no estudo de Mendes
et al.66 foi testado sangue perifrico de crianas que ainda no
haviam desenvolvido tumores, porm faziam parte do grupo
de risco. Concluiu-se que a tipagem do EBNA-2 pode ser realizada em amostras de sangue perifrico, e a alta prevalncia
do tipo 2 na casustica indica que essa populao apresenta de
fato maior risco de desenvolver PTLD, e que, por isso, deveria
ser monitorada.
A distribuio de polimorfismos em sequncias especficas
do DNA do EBV tambm mostra variao geogrfica, sendo
a epidemiologia do oncogene codificado pelo gene LMP-1 do
EBV a mais estudada. Inmeras variaes na sequncia do
LMP-1 foram detectadas e algumas delas tm sido associadas
a um risco aumentado de carcinoma da nasofaringe.67 Estudos
indicam que sequncias variantes do LMP- 1 esto associadas
ao carcinoma de nasofaringe em reas de alta prevalncia da
doena, tais como o Sudeste Asitico,68 sugerindo que a presso seletiva positiva sobre o LMP-1 possa aumentar o potencial oncognico do vrus.
Diferenas na prevalncia e nos padres de infeco nunca
foram claramente associadas origem tnica, mas foram apenas observadas como diferenas no comportamento socio-

140
econmico, higinico e cultural. No entanto, a distribuio
diferenciada do carcinoma de nasofaringe com alta incidncia observada em esquims do rtico e no Sudeste Asitico
sugere a existncia de um controle imunolgico especfico do
EBV nessas etnias, embora o mecanismo exato permanea
desconhecido.6970
Durante a ltima dcada, os mtodos para deteco e
quantificao do EBV intra e extracelular a partir de sangue
perifrico tm melhorado significativamente. A carga viral de
EBV em clulas mononucleares do sangue perifrico (PBMC)
o resultado combinado do nmero de clulas B infectadas
e o nmero de genomas de EBV por clula B. Um nmero
relativamente constante de clulas B infectadas ( 1 a 50 por
1.000.000) est presente no sangue perifrico de um hospedeiro saudvel cronicamente infectado, mas este valor parece
variar consideravelmente em indivduos de uma mesma
populao. 71 Diferenas nos mtodos de deteco, preparao
de amostras e unidades de medida tornam as comparaes
de cargas virais de EBV em diferentes estudos impraticveis.
Entretanto, a carga viral do EBV parece estar transitoriamente
elevada na infeco primria.72 Em geral, a carga viral, observada em PBMC de indivduos saudveis, baixa (< 100 cpias
de DNA viral/ g de DNA genmico humano) em comparao a cargas elevadas observadas em pacientes transplantados
com doena linfoproliferativa.7374 A baixa carga viral do EBV
na maioria dos indivduos assintomticos, porm cronicamente infectados pelo EBV, reflete a baixa frequncia de clulas B EBV-positivas em circulao, enquanto as cargas virais
elevadas na PTLD em pacientes imunossuprimidos so o
resultado do aumento do nmero de clulas B contendo EBV
em circulao,7576 juntamente com o aumento do nmero de
genomas do EBV em cada clula B infectada.77
A associao entre a carga viral do EBV em PBMC e a resposta sorolgica no de fcil compreenso.78 Altos ttulos
de anti-p18-VCA so sugestivos de replicao viral ltica e
normalmente esto associados a elevadas cargas virais, assim
como baixos ttulos de anti-EBNA-1 IgG tambm tm sido
associados a altas cargas virais em portadores do HIV.7374
O EBV em soro ou plasma frequentemente detectado em
pacientes com carcinoma de nasofaringe ou PTLD, porm
apenas muito raramente em indivduos saudveis.79

Resumo da confirmao do
diagnstico laboratorial
A confirmao do diagnstico laboratorial em pacientes imunocompetentes tem sido tradicionalmente baseada
na deteco de atipias linfocitrias e presena de anticorpos
heterfilos, encontrados em mais de 80% de adolescentes e
adultos com MI,80 mas em frequncia muito mais baixa em
crianas pequenas com infeco aguda.17 Entretanto, devemos
lembrar que a deteco de anticorpos heterfilos pode ocorrer
em outras condies, incluindo a infeco pelo HIV, o lpus
eritematoso sistmico e outras infeces virais.8 1- 83 A deteco
de anticorpos IgM dirigidos contra o antgeno da cpside viral
(VCA) mais sensvel e especfica, e encontrada no incio
dos sintomas. No entanto, assim como os anticorpos heterfilos, o anti-VCA IgM transitrio e desaparece em alguns
meses. A deteco de DNA do EBV em soro ou plasma por
meio de tcnica qualitativa ou quantitativa pode ser til para
o diagnstico laboratorial, como exame complementar sorologia, e tambm para o acompanhamento de pacientes em tratamento. O monitoramento da carga viral do EBV em PBMC

Diagnstico Laboratorial
ou em plasma/soro por meio de tcnicas moleculares eficaz
na deteco de episdios de reativao por ser mais sensvel
que os mtodos sorolgicos tradicionais. Esta a justificativa
para que a deteco quantitativa do EBV em sangue, soro ou
plasma esteja se tornando o teste de referncia e j constitua
o exame laboratorial mais solicitado em pacientes imunodeficientes com doena crnica ativa causada pelo EBV.84

..,. Referncias bibliogrficas


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Captu o 11

Rubola

Kioko Takei e Yoshimi /moto Yamamoto

Introduo, 143
Epidemiologia, 143
Aspectos clnicos, 145
Vrus da rubola e seus antgenos, 146
Resposta imune infeco e
interpretao clnica dos resultados, 147
Diagnstico laboratorial, 150
Referncias bibliogrficas, 152

Captulo 11

Rubola

Introduo

A primeira descrio da rubola foi feita no incio do sculo


18 por George Maton, na Inglaterra, como sendo uma doena
discreta caracterizada por exantema maculopapular, adenopatia, pouca ou nenhuma febre. O nome rubola foi proposto
em 1866 por Henry Veale, para designar a doena at ento
conhecida por Rotelm ou German measles, que significava
"similar ao sarampo'.1
A doena no despertou grande interesse, sendo considerada uma infeco da infncia, sem consequncias mais
graves. A primeira descrio do efeito teratognico do vrus
da rubola (VR) foi feita em 1941, por Norman McAlister
Gregg, em sua publicao Congenital cataratfollowing German
measles in the mother. Nesse trabalho, o autor relata o sbito
aumento da catarata congnita em crianas nascidas de mes
que haviam sido acometidas pela rubola no incio da gravidez, durante uma grande epidemia ocorrida na Austrlia.1
Outras anormalidades oculares, assim como alta frequncia
de crianas com doena cardaca congnita e surdez sensorineural, foram tambm descritas.1'2 Atualmente, a sndrome
da rubola congnita (SRC) compreende um amplo espectro
de manifestaes clnicas, cujo conhecimento se amplia a cada
nova epidemia.
O isolamento do vrus em 1961 por dois grupos de investigadores americanos possibilitou o rpido conhecimento de
histria natural, viremia, excreo viral, aspectos clnicos e
resposta imunolgica desta infeco. A maioria dos conhecimentos sobre a sndrome da rubola congnita foi adquirida
aps grandes epidemias, como a que ocorreu em 1964 no oeste
europeu e nos EUA, onde a rubola congnita pde, pela primeira vez, ser estudada com suporte no diagnstico viral especfico.1
O marco mais importante na histria da rubola foi a
produo e o licenciamento de vacinas antirrubola, o que
mudou radicalmente o padro epidemiolgico desta infeco,
dividindo a histria da rubola em eras pr e ps-vacina. O
Quadro 11.1 mostra o cronograma de eventos importantes no
controle da rubola.

Quadro 11.1 Cronograma de eventos importantes no controle da


rubola eda sndrome de rubola congnita (SRC).
1866

Henry Veale props onome rubola

1941

Norman McAlister Gregg descreveu os efeitos teratognicos da rubola


na gravidez ecaractersticas clnicas da rubola congnita

1961
1962-64

Identificao ecultura do vrus


Pandemia de rubola nos EUA ena Europa

1969
1970

Foram licenciadas as primeiras vacinas


Introduo de vacinao rotineira nos EUA, para todas as crianas,
entre 12e 15 meses de idade ecampanha de vacinao para crianas
de 5a 12anos entre 1970. Em 1970, aGr-Bretanha iniciou a
vacinao em mulheres na idade pr-puberal

1979
1987-89

ARA 27/3 foi escolhida como vacina adotada nos EUA


Declnioda SRC para menos de 0,1por 100.000 nascimentos vivos nos
EUA (queda de 99% desde aintroduo da vacina)

1992

No estado de So Paulo, houve aintroduo do programa de controle


da rubola e da SRC, que inclua a vacina trplice virai (sarampo,
caxumba erubola) no calendrio vacinai de rotina aos 15 meses e
tomava compulsriaanotificao da rubola e da SRC
Campanha nacional de vacinao para eliminao da rubola no Brasil

2008

Fonte: Cooper LZ, 1985;1 Centro deVigilncia Epidemiolgica daSecretariada SadedoEstadode So Paulo, 1992.3

143

Epidemiologia

Estudos epidemiolgicos da rubola so dificultados pela


ocorrncia de infeces no aparentes em mais da metade dos
casos. As manifestaes clnicas, quando ocorrem, so em
geral discretas, inespecficas e no notificadas por dispensarem cuidados mdicos especiais. Alm disso, casos espordicos de rubola podem no ser devidamente diagnosticados.
Nos perodos anteriores vacina, as epidemias eram cclicas,
com intervalos regulares de 5 a 9 anos, provavelmente quando
o acmulo de indivduos suscetveis alcanava valores acima de
15%. No entanto, epidemias de propores inesperadas foram
registradas na Inglaterra em 1940 e, nos EUA, em 1964.4
A populao mais acometida, nos pases sem um programa
de preveno, a de crianas entre 5 e 9 anos, sendo rara a
ocorrncia no primeiro ano de vida. No Brasil, um estudo realizado entre 1970 e 1983, no Rio de Janeiro, por Schatzmayr,
verificou que 70% da populao de crianas com 9 anos de
idade j apresentavam anticorpos com ttulos significativos no
teste de inibio da hemaglutinao (IHA). Nas mulheres em
idade frtil, a soropositividade foi de 80 a 90%.5

Transmisso
Transmisso ps-natal
A transmisso da rubola pode ocorrer durante todo o ano,
principalmente no inverno e na primavera. 3 O ser humano
provavelmente o nico hospedeiro do vrus da rubola.6 A
porta de entrada do vrus a via respiratria superior, disseminando-se em seguida aos ndulos linfticos regionais, por meio
da viremia transitria ou pelo sistema linftico. Aps 7 a 9 dias,
o vrus liberado na circulao, alcanando mltiplos tecidos,
inclusive a placenta. A excreo viral inicia-se no 9 ao 11 dia
da infeco, principalmente pelo trato respiratrio e pelos rins,
mas tambm pela crvice uterina, pelo trato gastrintestinal e por
outros stios. Laboratorialmente, o vrus pode ser detectado nestes materiais, principalmente na nasofaringe, sendo isolado com
maior frequncia entre 7 dias antes e 14 dias depois do incio da
doena. O pico da viremia ocorre do 10 ao 17 dia da infeco,
imediatamente antes do exantema. O vrus desaparece do sangue poucos dias depois, quando os anticorpos se tornam detectveis; porm, podem persistir dentro de linfcitos e moncitos
por 1a4 semanas.7 A infeco contagiosa durante o perodo
prodrmico at cerca de 7 dias aps o exantema. Atualmente,
por meio de tcnicas moleculares de elevada sensibilidade, a
excreo viral tem sido demonstrada por perodos maiores,
principalmente no fluido oral e no material de nasofaringe.

Transmisso pr-natal
A transmisso materno-fetal pode ocorrer durante todo o
perodo de gestao, sendo mais grave no incio da gravidez.
Estudos realizados por Miller et al. 8 em 258 crianas nascidas
de mes com rubola sintomtica e assintomtica adquirida
durante a gravidez mostraram as seguintes taxas de recmnascidos infectados, de acordo com o perodo gestacional: 67
a 90% no primeiro trimestre; 25 a 67% no segundo trimestre
e 35 a 100% no terceiro trimestre. Apesar desse alto ndice de
infeces congnitas, as anomalias nos recm-nascidos foram
observadas somente naqueles acometidos no primeiro trimestre de gravidez, como se observa no Quadro 11.2. 8 A causa
da variao na taxa de transmisso de acordo com o tempo
de gestao desconhecida; porm, modificao na estrutura
placentria possivelmente est envolvida.

144

Diagnstico Laboratorial

Quadro 11.2 Taxas de infeces congnitas, resultantes de infeces maternas sintomticas e assintomticas, de acordo com os estgios da
gravidez e as taxas de anomalias congnitas observadas em aianas infedadas acompanhadas durante 26 meses.
Estgio da gravidez
{semanas}

Nmero de aianas
estudadas

Soropositivos {%}

Antes de 11
11a12
13a14
15a16

10
6
18
36
33
59
32
31
25
8
258

90
67
06
47
39
34
25
35
60
100
45

17a18
19a 20
23a 26
27 a 30
31a36
Aps36
Total

Nmero de aianas
acompanhadas

Risco estimado defeitos


congnitos {%}

9
4
12
14
10
53

90
33
11
24

102

Adaptado deMiller et al.8

Crianas congenitamente infectadas por VR podem excre,


. , .
.
tar o VIrus nas secreoes resprrator1as e na urina por meses ou
anos, sendo, portanto, contagiosas durante todo esse perodo.9

Preveno 1Vacinao antirrubola


A imunizao ativa o nico meio eficaz de preveno da
rubola e da SRC. A vacinao antirrubola, visando preveno da rubola congnita, foi introduzida em alguns pases
entre 1969 e 1970, imediatamente aps o licenciamento das
primeiras vacinas. A estratgia de vacinao nos EUA e no
Canad visava eliminao do vrus da rubola na populao
e, consequentemente, a proteo dos indivduos suscetveis.
Este mtodo, chamado indireto, tinha como populao-alvo
crianas de ambos os sexos de 12 a 15 meses de idade. I0 O
mtodo direto, adotado a partir de 1970 na Gr-Bretanha e nos
pases da Europa, visava imunizao seletiva da populao
feminina na idade escolar e principalmente na idade frtil. II
Em 1976, a vacinao foi estendida a todas as idades, e a prevalncia de indivduos suscetveis registrou importante queda.
A vacina contra rubola consiste em vrus vivo atenuado por meio de passagens sucessivas em cultivos celulares.
As primeiras vacinas licenciadas foram RA 27/3, Cendehill,
Takahashi, Matsuura e HP-77, em 1969.I2 Em 1971, a vacina
antirrubola foi combinada com a de sarampo e caxumba,
constituindo a vacina trplice viral, tambm conhecida como
MMR, iniciais em ingls de measles, mumps and rubella.
Licenciada no mesmo ano nos EUA, esta vacina contm a cepa
RA 27/3 do vrus da rubola que tem a vantagem de apresentar
menor frequncia de artropatias ps-vacinao.3,I 3 Em 1982,
a vacina trplice viral foi introduzida para ambos os sexos, e a
imunizao passou a ser feita em duas etapas: a primeira em
torno de 1 ano e a segunda na idade escolar. I4 No perodo de
1966 a 1988, a incidncia da rubola registrou queda de 99%. II
Contudo, entre 1989 e 1991, rubola e SRC ressurgiram nos
EUA, em comunidades segregadas no vacinadas, como as de
alguns grupos religiosos, Is declinando novamente a taxas baixas no perodo de 1992 a 1996.I6
No Brasil, a vacinao contra rubola foi implantada gradativamente na forma de campanhas estaduais, iniciando-se
em 1992 e completada em 2000.I7 No estado de So Paulo, o
Centro de Vigilncia Epidemiolgica da Secretaria do Estado

da Sade de So Paulo (CVE/SES) introduziu, em 1992, o


Programa de Controle da Rubola e da SRC, que consistia em
uma campanha inicial de vacinao de todas as crianas entre
1 e 10 anos de idade, independentemente da histria anterior
de doena ou de vacina, a substituio, no calendrio vacinal,
de vacina monovalente contra sarampo pela trplice viral, aplicada aos 15 meses de idade, e a notificao compulsria da
rubola e da SRC. 3
A vacina trplice viral utilizada no Programa Nacional de
Imunizao contm a cepa Wistar RA 27/3 do vrus da rubola,
a qual obtida a partir de um feto infectado com rubola,
sendo a mais utilizada no mundo. As passagens sucessivas em
cultura de clulas atenuam o vrus, que perde a sua patogenicidade, porm preservam a capacidade de replicao e a imunogenidade.I7
A via de administrao mais eficaz a subcutnea, embora
a via intranasal seja tambm utilizada. IS Nveis mximos de
anticorpos so observados entre o 14 e o 21 dia aps a vacinao. A eficcia da vacina muito alta e a soroconverso em
nveis protetores ocorre entre 95 e 99% dos vacinados. A vacinao confere imunidade duradoura, provavelmente por toda
a vida. I7,IS
A vacina da rubola bastante segura, e as contraindicaes
so restritas a poucas condies, como: antecendente de reao anafiltica grave, imunossupresso, doenas agudas graves
e gestantes. Cerca de 5 a 15% das pessoas vacinadas suscetveis
podem apresentar alguns efeitos adversos. Is
Entre os efeitos colaterais da vacina contra rubola, o principal o acometimento articular com artralgia e artrite, que
pode ocorrer em cerca de 25 a 40% dos adultos, principalmente
mulheres. So geralmente agudas e transitrias, com raras
recorrncias. Outros efeitos tambm podem ocorrer, tais como
febre baixa, linfadenopatia e exantema (Quadro ll.3).7,I9
As vacinas sintticas ou recombinantes, empregando apenas as regies antignicas envolvidas na imunidade, tanto
humoral como celular, tm sido estudadas para diminuir os
efeitos colaterais. 20
Recentemente, uma vacina tetravalente, denominada
MMRV (sigla em ingls de measles, mumps, rubella, varicella),
que adiciona aos trs vrus da trplice viral o vrus atenuado da
varicela-zster, tem sido introduzida como alternativa administrao de MMR e vacina da varicela, concomitantemente.

Captulo 11

Rubola

145

Quadro 11.3 Prindpais eventos adversos aps a vadna trplice virai contendo a cepa RA 27/3 do vrus da rubola.
Evento adverso

Tempo ps-aplicao

Frequncia

Artralgia e/ou artrite


Febre > 39,5(
Exantema
Cefaleia, irritabilidade, febre baixa, conjuntivite e/ou manifestaes catarrais
Linfadenopatia
Prpura trombocitopnica
Reaes de hipersensibilidade*
Reao anafiltica**

1a3 semanas
5a12 dias
7a12 dias
5a 12 dias
7a 21 dias
2a 3semanas
24a 72 h
Primeira hora

25% das mulheres


5a 15% dos primovacinados
5% dos primovacinados
0,5 a 4% dos primovacinados
< 1% dos primovacinados
1/30.000a1/40.000
Raras
Extremamente raras

Fonte: Brasil. Ministrioda Sade, 200719 *Urticriasno local ou, maisraramente, em outras reasdocorpo. **Urticrias, sibilos, laringospasmo, edemade lbios, hipotenso echoque.

Essa vacina tem mostrado alto ndice de taxa de soroconverso


a todos os quatro componentes antignicos, sendo respectivamente de 94,5%, 96,1 %, 99,7% e 95,5% quando administrada
em uma nica dose e de 98,3%, 99,4%, 99,7 e 99,7%, quando
administrada em duas doses, uma no primeiro ano de vida
e a outra no segundo ano.2122 A maioria dos autores considera que a imunogenicidade da vacina, administrada em uma
nica dose aos 9 a 24 meses de idade, pode ser considerada
equivalente administrao em duas doses. A vacina tetravalente bem tolerada, pois no tm sido verificados efeitos
colaterais adicionais aos observados nas vacinas MMR e na de
varicela.21 - 23

para avaliao de SRC ou malformao congnita. A sorologia


deve ser realizada aps 6 meses para a concluso do diagnstico. A mesma conduta realizada para crianas IgG-positivas
ao nascer e que persistem positivas aos 6 meses de idade. Aps
avaliao e classificao final do caso, conforme estabelece o
protocolo, define-se como SRC "toda criana menor de 1 ano
que apresentar catarata congnita unilateral ou bilateral e/ou
glaucoma congnito e/ou dficit auditivo e/ou malformao
cardaca (persistncia do canal arterial, estenose artica, estenose da artria pulmonar e cardiopatia no especificada) associadas ao vrus da rubol'.17

Vacinao antirrubola em grvidas

Aps a erradicao da varola, da poliomielite e da circulao do vrus do sarampo, a 44 reunio do Conselho Diretor da
Organizao Pan-Americana de Sade, realizada em 2007, estabeleceu como meta a "Erradicao da Rubola e da Sndrome
da Rubola Congnita (SRC)" nas Amricas no ano 2010.17
No Brasil, para alcanar essa meta, uma campanha nacional de vacinao para homens e mulheres dos grupos de idade
identificados com suscetibilidade para a rubola foi realizada
em 2008, visando tambm total erradicao do sarampo. O
objetivo esgotar a totalidade da populao ainda suscetvel
e, com isso, interromper a transmisso endmica do vrus da
rubola no pas. 17

O vrus atenuado da rubola utilizado na vacina no teratognico, apesar de apresentar capacidade de atravessar a placenta e infectar o feto. 23 Estudos realizados na Gr-Bretanha e
nos EUA demonstraram que a vacina contra rubola incua
para o feto, mesmo quando os testes sorolgicos indicavam que
o feto havia sido infectado por esse vrus. 24 Durante a campanha de vacinao nos pases das Amricas, realizada em 2006,
mais de 29 mil gestantes vacinadas inadvertidamente (GVI)
foram identificadas, mas nenhum caso de SRC foi detectado
entre os recm-nascidos dessas mes. 17
Apesar disso, sendo o risco diferente de zero, a vacinao
contra rubola contraindicada durante a gravidez. A recomendao para evitar a gravidez, at ento de 3 meses, passou, a partir de 2001, para 1 ms aps a vacinao contra
rubola. A vacinao inadvertida de gestantes no motivo
para interrupo da gravidez, por no haver risco comprovado
de embriopatia fetal, mas imprescindvel fazer o registro e
o acompanhamento destas mulheres, por meio de protocolo
definido pelo Ministrio da Sade. 17 Resumidamente, este
protocolo visa acompanhar as GVI at 3 meses de gestao,
mulheres que receberam a vacina e engravidaram at 30 dias
aps a data do recebimento da vacina e recm-nascidos de GVI
suscetvel para rubola. A gestante considerada suscetvel se
apresentar IgM positiva (independentemente do resultado de
IgG) na amostra coletada imediatamente aps a suspeita de
vacinao inadvertida e IgM e IgG positivas na segunda coleta
20 a 30 dias aps a primeira amostra. Essa gestante deve ser
acompanhada, e a coleta de sangue do recm-nascido obrigatria, preferencialmente ainda na maternidade.
Se o recm-nascido apresentar IgM positiva, este considerado infectado congenitamente e a coleta da secreo de
nasofaringe necessria para identificar o vrus e diferenciar
o vrus selvagem do vacinal. A criana ser acompanhada em
servios de referncia para diversas especialidades mdicas

Erradicao da rubola nas Amricas

. . . Aspectos clnicos
Rubola ps-natal
A rubola ps-natal tpica , em geral, uma doena benigna,
autolimitada, altamente contagiosa, com manifestaes febris
e exantema maculopapular de 2 a 3 dias de durao, que se
inicia pela face e pelo pescoo, alastrando-se rapidamente
para o tronco e as extremidades, sempre no sentido craniocaudal. A rubola pode ser subclnica em 1/3 a 2/3 dos casos.
Em crianas, geralmente o exantema o primeiro sinal observado. Em adolescentes e adultos, a erupo precedida por
um perodo prodrmico de 1 a 5 dias caracterizado por febre
baixa, cefaleia, mal-estar, anorexia, conjuntivite leve, coriza e
dor de garganta. A linfadenopatia suboccipital, retroauricular e cervical resultante da intensa multiplicao viral nesses
stios auxilia no diagnstico, porm, no patognomnica.
Esses sintomas desaparecem logo aps o exantema quando os
anticorpos tornam-se detectveis.7 A recuperao do paciente
quase sempre total. Artralgias e artrites so as complicaces mais frequentes da infeco naturalmente adquirida ou

146
aps a vacinao, particularmente em adolescentes e mulheres jovens, ocorrendo em cerca de 10 a 40% dos casos.9 So
transitrias, de 5 a 1O dias de durao e sem sequelas, porm,
em alguns pacientes, podem ser recorrentes ou persistir por
anos. A patognese dessa artrite parece estar relacionada com
a persistncia do vrus da rubola por perodos prolongados,
de meses a anos, aps infeco. De fato, o vrus da rubola tem
sido isolado de linfcitos circulantes e do fluido sinovial de
alguns desses pacientes. 7
Outras complicaes, como a trombocitopenia, so relativamente comuns, porm raras vezes tm importncia clnica.
A meningoencefalite de curta durao pode ocorrer 1 a 6 dias
aps o exantema em 1:6.000 casos, sendo fatal em 20% destes. Infeces por adenovrus, enterovrus e vrus Epstein-Barr
podem mimetizar a rubola em razo de exantema, febre e
linfadenopatia. Fora do perodo epidmico, o diagnstico da
rubola deve ser feito avaliando-se, em conjunto, os dados clnicos e sorolgicos.9

Rubola congnita
A rubola congnita , atualmente, uma doena rara nos
pases onde o programa de vacinao eficiente. As manifestaes clnicas da rubola congnita so bastante variadas,
abrangendo desde recm-nascidos aparentemente saudveis
a gravemente acometidos com mltiplas anomalias. Infeces
congnitas subclnicas ou assintomticas com manifestaes
que se tornam aparentes nos primeiros anos de vida ou que
se desenvolvem posteriomente podem ocorrer em 2/3 dos
casos. Por isso, a incidncia precisa da rubola congnita
difcil de ser estimada, sendo necessrio o acompanhamento
dos recm-nascidos suspeitos por perodos de 2 a 5 anos. 725
O efeito teratognico do vrus da rubola sobre o feto tanto
maior quanto mais precoce for a infeco durante a gravidez.
Assim, quando o vrus acomete o feto no primeiro trimestre
de gravidez, pode produzir uma infeco macia e devastadora com acometimento de mltiplos rgos e resultar em
aborto, nascimento prematuro, recm-nascido com uma ou
mltiplas anomalias como a catarata, surdez e cardiopatias
congnitas, produzindo a chamada sndrome da rubola
congnita (SRC). 16 Presume-se que as leses fetoplacentrias se devam ao efeito citoptico do vrus em replicao.26
A inibio da mitose causada pelo vrus da rubola pode,
em parte, explicar o retardo e a desorganizao da organognese que se expressa como recm-nascido de baixo peso
com anomalias estruturais no olho, corao, crebro e em
outros rgos. 1 Aps o perodo da organognese, o vrus da
rubola pode ainda continuar infectando todos os rgos
e tecidos do feto e do recm-nascido, podendo resultar em
hepatite, pneumonia, pancreatite, miocardite, meningite e
outros. Ao contrrio da rubola ps-natal, a rubola congnita caracteriza-se pela infeco crnica, que persiste por
todo o perodo intrauterino at meses a anos depois do nascimento. Essa persistncia do vrus por anos pode ainda produzir leses progressivas e patologias que envolvem mecanismos autoimunes com formao de imunocomplexos com
a participao de IgG antirrubola.27 Para facilitar o estudo,
as manifestaes da sndrome da rubola congnita podem
ser agrupadas em trs categorias:
Manifestaes transitrias do recm-nascido, como, por
exemplo: prpura trombocitopnica neonatal, anemia
hemoltica, hepatites e outros, que regridem espontaneamente em 2/3 dos casos

Diagnstico Laboratorial
Manifestaes permanentes, como surdez, doena cardaca
congnita, catarata, glaucoma, retinopatia pigmentar, retardamento mental etc.
Manifestaes tardias, como diabetes melito, hipo e hipertireoidismo, retinopatias e uma doena neurodegenerativa
rara, a pan-encefalite. A manifestao tardia mais predominante o diabetes melito insulinodependente, que ocorre
em aproximadamente 20% dos pacientes com rubola
congnita, na idade adulta. 28 Essa prevalncia 100 a 200
vezes maior do que a observada na populao geral. As
causas dessas manifestaes so pouco conhecidas; porm,
postula-se que estejam associadas a algumas anormalidades da clula T ou a condies que aumentem a suscetibilidade preexistente. A disfuno tireoidiana afeta cerca
de 5% dos pacientes, podendo manifestar-se como hiper
ou hipotireoidismo; parece estar associada ao mecanismo
autoimune.28
O vrus pode ser isolado de garganta, urina, conjuntiva,
medula ssea, liquor e outros stios de recm-nascidos vivos,
bem como da maioria dos rgos em fetos obtidos de necropsias. A excreo viral persistente pode ser observada nos
recm-nascidos infectados: em aproximadamente 80% destes
no primeiro ms de vida; 62% entre 1 e 4 meses; 33% entre 5
e 8 meses; 11 % entre 9 e 12 meses e 3% at o segundo ano de
vida. A permanncia do vrus ou de seu antgeno por muitos anos tem sido relatada, na literatura, em tecidos como o
das lentes, da tireoide e do crebro. 1' 2729 Essa excreo prolongada, consequente infeco crnica, observada unicamente na forma congnita e atribuda, em parte, tolerncia
imunolgica seletiva ao antgeno El do vrus da rubola, que
associado proteo, consequente exposio do sistema
imune imaturo do feto muito precocemente na vida intrauterina. A deficincia na resposta imune celular e a incapacidade
em sintetizar IgG de alta afinidade podem tambm ser a causa
da falha na eliminao do vrus. A coexistncia do vrus da
rubola e de altos ttulos de anticorpos maternos neutralizan tes constitui um paradoxo.27
A sndrome da rubola congnita associada reinfeco materna rara, sendo praticamente nula em mes que
tiveram, no passado, a rubola naturalmente adquirida. 1' 8
Contudo, a reinfeco de mes previamente vacinadas pode
raramente dar origem a crianas com a sndrome da rubola
congnita.

. .,. Vrus da rubola eseus antgenos


O vrus da rubola (VR) classificado como o nico membro do gnero Rubivirus, pertencente famlia Togaviridae.
Apenas um sorotipo de VR foi descrito at o momento, apesar
de existirem algumas diferenas biolgicas entre as cepas. 30
A partcula viral , em geral, esfrica e apresenta de 50 a 70
nm de dimetro. Consiste estruturalmente em nucleocpside
icosadrico (core) contendo RNA genmico de 40S, associado
protena do capsdio (a protena C, de 33 kDa) e envolto por
envelope lipdico constitudo de duas glicoprotenas virais E 1
(58 kDa) e E2 (42 a 47 kDa). 31 - 33 No envelope viral, apresenta
projees ou espculas de 5 a 6 nm, que constituem as hemaglutininas.28
As clulas infectadas com VR contm mRNA subgenmico
de 24S, cuja transcrio produz uma poliprotena precursora
de 11O kDa, que resulta, aps clivagem proteoltica, sequencialmente, nas protenas E2, E 1 e C.3134

Captulo 11

Rubola

O vrus da rubola apresenta o seu RNA altamente conservado. Entretanto, as cepas circulantes no mundo podem
apresentar diferenas de at 10% na sequncia de nucleotdios
que codificam E 1, o que torna possvel a classificao em dois
gentipos principais e vrios subgentipos.35 Nos pases das
Amricas, o tipo C o gentipo mais frequente, seguido pelo
tipo lE. 17
A glicoprotena E1 o antgeno mais importante do VR e
constitui o alvo principal na resposta imune, tanto humoral
quanto celular. Assim, o anti-E1 o anticorpo predominante
na infeco adquirida naturalmente ou aps a imunizao.3136
E 1 apresenta pelo menos 3 a 6 epitopos independentes com
atividades neutralizante (NT) e hemaglutinante (HT).331
Antigenicamente, a glicoprotena E 1 altamente conservada,
diferindo no mais que 3% entre as diferentes cepas.28
A glicoprotena E2 no hemaglutinnante, mas apresenta
pelo menos um epitopo neutralizante. altamente glicosilada e muito heterognea, produzindo na eletroforese de
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) uma migrao difusa,
abrangendo bandas de peso molecular de 42 kDa (E2a) e 47
kDa (E2b ), 37 mas o seu papel biolgico ainda no est bem
definido. 30,32,37
A protena C no glicosilada, e sua funo, do ponto de
vista imunolgico, pouco conhecida. Parece, entretanto, estar
envolvida na transferncia do RNA viral para o citoplasma da
clula hospedeira.27 Os anticorpos antiprotena C so encontrados na maioria dos indivduos expostos ao VR.32

Antgenos
Os antgenos empregados nos testes imunolgicos so
tradicionalmente obtidos de culturas de clula como Vero,
BHK-21, RK-13, Sirc sob a forma de extratos ou lisado de
clulas infectadas por VR. O antgeno purificado de rubola
contm componentes do envelope (com epitopos neutralizantes e hemaglutinantes) e da protena e. o antgeno hemaglutinante capaz de aglutinar diversas hemcias como as de
pintos recm-nascidos, gansos adultos, pombos e humanos. A
presena de ons de clcio necessria para que as hemaglutininas se liguem aos receptores encontrados nas hemcias. A
capacidade dos anticorpos especficos de inibir essa aglutinao constitui a base do teste de inibio de hemaglutinao
(IHA). Entretanto, a produo em larga escala, bem como a
purificao do antgeno para torn-lo livre de restos celulares,
tecnicamente complexa, e a utilizao de subunidades virais
limitada, em razo da reduo da atividade biolgica e da sua
antigenicidade durante o processo de isolamento. 3338
O emprego de antgenos de especificidade definida como os
peptdios sintticos nos testes sorolgicos tem a vantagem de
ser altamente sensvel e especfico. Vrios autores tm obtido,
com sucesso, a produo de peptdios sintticos (PS) com atividades neutralizante e hemaglutinante. A seleo de PS como
antgeno nos testes laboratoriais feita por meio de anticorpos
monoclonais que, tendo especificidade definida, ao se ligarem
aos PS definem tambm a especificidade deste antgeno. Os
peptdios sintticos j vm sendo utilizados em kits imunoenzimticos para deteco de anticorpos antirrubola, como,
por exemplo, o SPl, tambm conhecido como BCH-178C,
correspondente sequncia 213-239 da glicoprotena E 1 do
envelope viral.39 Esta regio altamente conservada em quase
todas as cepas do vrus, incluindo a RA 27/3 da vacina. 384 41
Antgenos sintticos como o correspondente sequncia C
263-275 da protena C viral tm sido propostos como candidatos vacina por serem reconhecidos por linfcitos T CD4+ e

147
CD8+. 18 Alguns peptdios sintticos relevantes com atividade
neutralizante e hemaglutinante com perspectivas de uso no
diagnstico so mencionados na literatura como: El 208 _239,42
4
43
31
36
E1245-285> E1193-269> El 213-239, El 324-343 etc.
Antgenos recombinantes da regio E 1 tm sido utilizados
em alguns kits ELISA comerciais, com elevada sensibilidade.
A deteco do IgM foi possvel imediatamente aps incio da
doena, e a positividade persistiu por mais de 7 semanas.44
Antgenos recombinantes expressos em levedura tm demonstrado alta reatividade no ELISA, podendo substituir, com van tagem, o uso do antgeno viral. 45

..., Resposta imune infeco e


interpretao clnica dos resultados
Rubola ps-natal
A ocorrncia de infeces no aparentes, a grande variao
na expresso clnica da doena e o mimetismo com exantemas de outras origens tornam a sorologia indispensvel no
diagnstico da rubola e da sndrome da rubola congnita
(SRC).
O isolamento do vrus complexo, demorado e de alto
custo, limitando-se apenas aos casos de extrema necessidade.
O diagnstico laboratorial fundamentalmente apoiado na
deteco de anticorpos antirrubola.
Na infeco primria, os anticorpos da classe M so, em
geral, detectados muito precocemente, aps o incio da doena,
sendo encontrados em um a dois teros dos pacientes nos primeiros 3 dias e em quase todos os pacientes no decorrer do
primeiro ms. Alcanam nveis mximos entre 7 e 1Odias pelo
teste de inibio da hemaglutinao ou entre 4 e 35 dias por
ELISA.4647 A negativao do teste para IgM tambm depende
da sensibilidade da tcnica empregada. Pela tcnica de inibio
da hemaglutinao, anticorpos IgM antirrubola permanecem
positivos por curto perodo, em geral entre 4 e 6 semanas e,
raras vezes, por 3 meses.47 J no ELISA, resultados positivos
podem ser observados por 2 a 6 meses, ocorrendo raros casos
at 1 ano. 47 H, no entanto, relatos isolados na literatura de
IgM persistente por perodos prolongados de anos.48
O emprego de testes cada vez mais sensveis para a deteco
de IgM especfica, como, por exemplo, o ELISA por captura de
IgM, tornou a interpretao clnica dos resultados mais complexa em razo da persistncia deste anticorpo, por muito tempo
aps a infeco primria e a sua deteco nas reinfeces.
Os anticorpos antirrubola da classe IgG so altamente
eficazes na proteo do indivduo. So detectveis no soro a
partir de 3 a 4 dias, aps o incio da doena, alcanando nveis
mximos em 2 semanas. Em seguida, declinam lentamente,
porm, persistem por toda a vida, na maioria dos indivduos.
Em casos raros, o nvel de IgG chega ao limiar de deteco ou
at a negativao.48
Anticorpos IgG apresentam baixa avidez no incio da infeco, at 3 a 5 meses, seguidos de gradual aumento medida
que o tempo decorre. Para fins de diagnstico da infeco
recente, a deteco de IgG de baixa avidez deve ser feita em
amostras obtidas at 2 a 4 meses aps o incio da doena.
especialmente til na distino entre a infeco recente da
antiga, quando os ttulos de anticorpos j se encontram em
nveis mximos nos mtodos sorolgicos convencionais.4849
Alm disso, quando se utilizam mtodos de sensibilidade muito
alta, os anticorpos IgM-especficos podem ser detectados

Diagnstico Laboratorial

148
tanto na infeco primria quanto na reinfeco, e, neste caso,
a avidez da IgG pode definir o diagnstico. A avidez baixa na
infeco primria e alta na reinfeco.
Na rubola, a subclasse de IgG predominante IgG 1, sendo
encontrada sempre que a amostra for positiva para IgG. IgG2
praticamente indetectvel e IgG4 somente observada em
alguns indivduos, em nveis muito baixos.50 IgG3 tem sido
associada por alguns autores fase recente da infeco, sendo
encontrada entre 2 e 6 semanas aps o incio da doena, dados
esses no confirmados por outros autores. 50
Os anticorpos antirrubola da classe IgA so detectados
no incio da doena, logo depois de IgM. Alcanam nveis
mximos em torno de 1 semana e tornam-se indetectveis em
perodos muito variveis, dependendo do paciente. A sua presena pode ser transitria ou persistir por meses a anos. 51
O diagnstico da rubola ps-natal, a coleta do sangue no
perodo adequado durante a infeco fator determinante
para a interpretao correta dos resultados da sorologia. A
primeira amostra deve ser colhida imediatamente aps os sintomas, antes que os anticorpos se tornem detectveis ou assim
que houver suspeita de contato com caso confirmado ou suspeito de rubola. Resultado positivo para anticorpos totais ou
IgG antirrubola com ttulo significativo, na ausncia de anticorpos IgM, pode ser interpretado como imunidade. Mas, se o
resultado for negativo ou no limiar de deteco, uma segunda
amostra deve ser coletada 2 semanas aps a data da primeira
e as duas ensaiadas na mesma rotina. A segunda amostra
tambm necessria quando a primeira tiver sido obtida poucos dias aps o incio dos sintomas, j no perodo de soroconverso. A observao da soroconverso ou a elevao de 4
vezes no ttulo da 2 amostra em relao primeira, associada
presena de IgM, torna possvel o diagnstico sorolgico da
rubola ps-natal. Resultados idnticos entre as duas amostras,
associados ao resultado negativo para IgM, so interpretados
como ausncia de infeco recente pelo VR. O resultado ser
considerado inconclusivo se a segunda amostra apresentar
ttulo apenas duas vezes maior que a primeira. Neste caso, uma
terceira amostra deve ser coletada aps 1O a 14 dias da data da
segunda e as trs ensaiadas juntas, na mesma rotina. Segundo
CVE da Secretaria de Estado da Sade, os Laboratrios de
Referncia de Sade Pblica utilizam, rotineiramente, o teste
ELISA para deteco de anticorpos IgM para rubola, em
todos os suspeitos em amostra nica de sangue, coletada no 5
ao 28 dia do incio do exantema.52
Em gestantes expostas a caso confirmado ou suspeito de
rubola, a segunda amostra deve ser coletada independentemente do resultado da primeira, para investigar a possibilidade
da reinfeco. Se as duas amostras forem positivas, com ttulo
significativamente superior na segunda, independentemente
da presena ou no de IgM, pode-se interpretar como provvel reinfeco. Neste caso, muito importante assegurar-se de
que a primeira amostra realmente tenha sido coletada imediatamente aps o contato. No caso de o teste ser realizado com
objetivo nico da determinao da imunidade, como nos exames pr-natais, suficiente a soropositividade em uma nica
amostra pela tcnica de inibio da hemaglutinao (IHA) ou
ELISA. Ttulos iguais ou superiores a 8 UI/m.t' por IHA ou 10
UI/m.t' por ELISA so considerados como de imunidade.

Vacinados
A resposta imunolgica vacina antirrubola bastante
semelhante da infeco natural; porm, os ttulos de IgG e
IgM so geralmente mais baixos. Anticorpos da classe M so

detectados na maioria dos vacinados aps 2 a 3 semanas; em


seguida, h gradual declnio, persistindo por 2 a 3 meses em
cerca de 1/3 dos indivduos.53
Anticorpos da classe G so detectados entre 3 e 4 semanas
aps vacinao em 98 a 99% dos vacinados,54 podendo neles
permanecer durante longos anos ou, na maioria dos indivduos, por toda a vida. 55, 56 Com o decorrer dos anos, declnio
lento e gradual destes anticorpos leva alguns indivduos a
apresentarem ttulos inferiores a 8 ou 10 UI/m.t', tornando-os
potencialmente suscetveis reinfeco.55 Nos pases em que
no h um programa adequado de controle, a circulao do
vrus da rubola na populao auxilia na manuteno dos
nveis de anticorpos especficos.
IgA especfica pode ser observada no lavado de nasofaringe
3 semanas aps vacinao, podendo persistir por 3 a 6 anos e,
raramente, at 10 a 12 anos.57

Reinfeco
A reinfeco por VR pode ocorrer tanto em indivduos que
j tiveram rubola naturalmente como em vacinados, e , na
maioria das vezes, assintomtica. Na reinfeco de gestantes
com histria anterior de rubola, o risco de transmisso para
o feto praticamente nulo.58 Sorologicamente, diagnosticada
pela presena de anticorpos antirrubola antes da exposio
fonte infectante e pela elevao dos ttulos em no mnimo
4 vezes. Anticorpos especficos das classes M e A geralmente
no so detectados, porm IgM podem estar presentes em
geral em nveis reduzidos.58, 59
A reinfeco de indivduos vacinados muito mais frequente, sendo tambm, na maioria dos casos, assintomtica.
Foi observado que cerca de 10% dos indivduos vacinados
podem ser reinfectados quando expostos a surtos de rubola.6061 Achados de IgM so muito mais comuns na reinfeco
de indivduos vacinados do que na reinfeco de indivduos
infectados naturalmente, em razo de a imunidade decorrente da vacinao ser menos efetiva do que a induzida pela
infeco natural. 58,6 1 Apesar disso, o risco para o feto, quando
a reinfeco acomete gestantes, baixo. H, no entanto, raros
relatos na literatura de crianas com SRC nascidas de mulheres soropositivas, vacinadas no passado e reinfectadas durante
a gestao.
A reinfeco e a infeco primria subclnica por VR so
difceis de serem diferenciadas quando no se dispe de amostra de soro ou resultado sorolgico anterior exposio. Em
ambos os casos, verifica-se a elevao nos ttulos de anticorpos
antirrubola, podendo estar acompanhado de IgM. Neste caso,
o teste de avidez de IgG pode ser de grande valia, pois a avidez
de IgG baixa na infeco primria e alta nas reinfeces.6263
O perfil sorolgico de uma infeco primria por vrus da
rubola pode ser observado na Figura 11.1.
Vale ressaltar que a interpretao dos resultados sorolgicos deve ser feita sempre em associao a outros dados, tais
como clnicos e epidemiolgicos, ou outros exames laboratoriais.

Rubola congnita
Na rubola congnita, o padro de resposta imunolgica
peculiar e nico. Esta infeco caracteriza-se por prolongada produo de anticorpos IgM; lenta maturao da avidez
de IgG e respostas imune humoral e celular reduzidas. Esses
efeitos, que constituem a expresso imunolgica da ao

Captulo 11

149

Rubola

Concentrao
relativa de
anticorpos

Rash
lgG

,,,,,,....----- -- -.

Vrus em
nasofaringe

I
I
I
I
/
/

-21

-14

-7

14

21

28

35 Dias

Figura 11.1 Perfil sorolgico relativo da rubola ps-natal. Adaptada


de Castillo-Solrzano C, 2006. <www.paho.org/immunization>.

do vrus da rubola sobre o organismo ainda em formao,


so mais graves quanto mais precoce a infeco durante a
gravidez.4064
Aps a infeco da gestante, o VR dissemina-se pelo sangue e infecta mltiplos tecidos maternos, inclusive a placenta.
Com o desenvolvimento da resposta imune materna o vrus
desaparece do sangue, mas pode persistir na placenta por
meses e infectar o feto em consequncia da leso placentria.2 No primeiro trimestre, o feto extremamente suscetvel
por ser incapaz de montar uma resposta imune adequada.
No segundo trimestre, h diminu io no risco em razo da
modificao da placenta e da resposta imune do feto que se
inicia aps 7 a 8 semanas de gestao, quando linfcitos pr-B
podem ser observados no fgado fetal. Clulas produtoras de
IgM, IgG e IgA podem ser detectadas a 15, 20 e 30 semanas,
respectivamente. Entretanto, a produo de imunoglobulinas
s pronunciada ao redor de 22 a 24 semanas de gestao, e
expressiva apenas para os anticorpos IgM.
A passagem transplacentria de IgG materna, em condies normais, ocorre a partir de 38 dias de gestao, porm
em quantidades mnimas at 17 semanas, quando se inicia o
aumento na transferncia. Contudo, a transferncia macia
de IgG s observada nas ltimas semanas de gravidez. Ao
termo, o sangue do cordo umbilical apresenta nveis de anticorpos praticamente iguais aos da me.65 Aps nascimento,
IgG materna transferida passivamente catabolizada, alcanando nveis mnimos ao redor de 3 a 5 meses, quando anticorpos IgG da criana ainda esto em nveis muito baixos. Em
seguida, o gradual aumento na sntese de IgG faz a curva de
anticorpos que estava em declnio se elevar novamente. Essa
caracterstica, da persistncia de IgG pelo perodo de 6 meses
a 1 ano, em vez da negativao que ocorre em recm-nascidos normais, constitui um dos recursos para o diagnstico da
infeco congnita. 6465
A produo de IgM na rubola congnita inicia-se ao redor
de 1O semanas de gestao, porm somente alcana nveis
detectveis a partir de 22 semanas. IgM especfica continua
sendo sintetizada aps o nascimento por 2 a 6 meses ou, em
raras vezes, at 18 a 24 meses.5866 A deteco de anticorpos
da classe IgM a mais importante no diagnstico intrauterino de infeces congnitas em geral, pois, no sendo capaz
de atravessar a barreira placentria, sua presena revela produo fetal. Nveis elevados de IgM total sugerem fortemente
infeco congnita.65 Estudos realizados no sangue de cordo
umbilical de fetos de 22 a 26 semanas revelaram a presena
de IgM em nveis superiores a 10 mg/de naqueles infectados e

nveis inferiores a 6 mglmf em amostras de fetos no infectados. Altos ttulos de anticorpos maternos e de IgM produzida
pelo feto ocorrem paralelamente com a persistncia virai no
feto e no recm-nascido. Este paradoxo , em parte, explicado
pela resposta imune celular alterada.
Os anticorpos IgA tambm podem estar aumentados em
fetos infectados, porm em nveis mais baixos que os anticorpos IgM.67 As demais classes de imunoglobulinas so produzidas em quantidades mnimas.
A lenta maturao da resposta imune na rubola congnita pode tambm ser observada por meio da persistncia de
IgG 1 de baixa avidez por 7 a 15 meses.68
A imunidade celular gravemente acometida quando a
infeco por vrus da rubola ocorre no incio da gravidez,
at 4 meses.3269 A resposta linfoproliferativa diminuda
observada em mais da metade das crianas com menos de
3 anos de idade congenitamente infectadas, podendo ser til
nos casos em que as anormalidades, tais como a surdez sensorineural, so detectadas tardiamente, quando somente a
sorologia no possibilita o diagnstico preciso. Uma resposta
linfoproliferativa negativa com a sorologia positiva sugere
infeco congnita.29
O diagnstico laboratorial da rubola intrauterina pode
ser feito precocemente durante a gestao em materiais obtidos por tcnicas como: biopsia do vilo corinico e amniocentese para a demonstrao do vrus e cordocentese, tanto
para testes virolgicos como tambm para sorolgicos.7 71
A identificao do vrus ou de seus antgenos nesses materiais pode ser feita pelas tcnicas como a imuno-histoqumica, que fornece resultados muito mais sensveis e rpidos
do que a tradicional cultura. Entretanto, a demonstrao do
material genmico do vrus pelas tcnicas de amplificao
do cido nucleico, principalmente pela reao em cadeia
da polimerase (PCR, polymerase chain reaction) constitui,
atualmente, mtodo de escolha pela praticidade e elevada
sensibilidade.31 71
A biopsia de vilo corinico pode ser feita a partir do final
do primeiro trimestre e a amniocentese entre 15 e 20 semanas
de gravidez. Contudo, o emprego dessas tcnicas limitado
em razo do risco de perda fetal, de 1 a 5%. A cordocentese
, atualmente, muito utilizada no diagnstico intrauterino da
rubola congnita. O sangue fetal, neste caso, deve ser coletado aps 22 a 24 semanas de gravidez, e pode ser empregado
tanto para o diagnstico virolgico como tambm para a sorologia.26
Portanto, a sorologia , na prtica, o recurso laboratorial
mais importante no diagnstico da rubola congnita e se
baseia, entre outros, no diagnstico da infeco materna, na
deteco de IgM total e especfica no feto ou no recm-nascido,
na dosagem de IgG at 6 meses a 1 ano aps o nascimento e na
determinao da avidez de IgG.
Atualmente, o Ministrio da Sade, por meio da Secretaria
de Vigilncia em Sade, classifica como caso confirmado de
SRC associada ao vrus selvagem da rubola "recm-nascido
ou criana menor de 1 ano que apresente manifestaes clnicas de SRC e resultados laboratoriais com anticorpos IgM
reagente para rubola ou IgG reagente e persiste para rubola
depois de 6 meses de vida e com a identificao do vrus
selvagem': 17
Assim, testes moleculares ganham espao a cada dia no
diagnstico de rubola adquirida, mas principalmente na
identificao e na confirmao de rubola congnita. Para
facilitar a interpretao, o perfil sorolgico da rubola congnita pode ser observado na Figura 11.2.

Diagnstico Laboratorial

150
Concentrao
relativa de
anticorpos

A remoo de inibidores inespecficos tem sido feita por


meio de:

Nascimento
Excreo virai

Caolim
Mistura heparina-cloreto de mangans
Sulfato de dextrana-cloreto de clcio, a partir do soro no
inativado, e as hemcias indicadoras mais empregadas no
teste tm sido as de pinto, pombo, ganso e hemcias humanas do grupo "O" tripsinizadas. 75

Viremia

.....

/'

I:
1 :1

Infeco

2
Trimestre

........
'

'
'

II
I
I
I
3

,1gG materna

'
lgM

''

''

lgG do RN

''
3

Meses

Figura 11.2 Perfil sorolgico relativo na rubola congnita consequente


infeco materna no incio da gravidez.

. . . Diagnstico laboratorial
O diagnstico laboratorial essencialmente sorolgico e
visa principalmente deteco de: rubola congnita e psnatal, controle de vacinao, determinao da imunidade e
estudos soroepidemiolgicos.
Os testes sorolgicos baseiam-se:
No efeito dos anticorpos sobre a funo biolgica especfica
do vrus, como as tcnicas de neutralizao (NT) e de inibio de hemaglutinao (IHA)
Na reao entre o anticorpo e qualquer componente antignico relevante do vrus da rubola como as tcnicas imunoenzimticas, imunofluorscencia, aglutinao de partculas
de ltex e outros.

Tcnica de neutralizao e teste de inibio


de hemaglutinao
A tcnica de neutralizao (NT) determina a capacidade
do anticorpo presente no soro do paciente de neutralizar a
infecciosidade viral e a de inibir a atividade hemaglutinante
do vrus da rubola.
A NT poderia ser considerada como o gold standard da
sorologia para a rubola, pois a que melhor se correlaciona
com a proteo. Entretanto, em razo da necessidade de culturas celulares para a sua realizao, o seu uso na rotina diagnstica limitado.
O teste de inibio de hemaglutinao (IHA) foi o primeiro ensaio para deteco de anticorpos antirrubola disponvel para a maioria dos laboratrios de rotina diagnstica, sendo considerado na prtica como teste de referncia
para avaliao de novos testes. 7273 O antgeno hemaglutinante constitudo de vrus da rubola, obtido por mei