Universidade de So Paulo - USP

Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz ESALQ

Departamento de Entomologia e Acarologia

Perodo: 21, 22 e 23 de novembro de 2011

Coordenador: Prof. talo Delalibera Jr.
Ministrantes: Italo Delalibera Jr., Celeste Paola DAlessandro, Giuliano Pauli, Janayne
Maria Rezende, Marcos Roberto Conceschi, Solange Aparecida Vieira Barros, Viviane
Santos.
Local: Laboratrio de Patologia e Controle Microbiano de Insetos ESALQ/USP

Sumrio
Prtica 1
Tcnicas de laboratrio: Esterilizao, assepsia, preparao de meios de
cultura e equipamentos. ..................................................................................... 4
Prtica 2
Parte 1: Isolamento e Identificao de Metarhizium anisopliae e Beauveria
bassiana. .......................................................................................................... 20
Parte 2: Identificao dos principais contaminantes presentes na produo de
fungos entomopatognicos. ............................................................................. 24
Prtica 3
Determinao da Viabilidade de condios de um produto base de
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana ................................................ 30
Prtica 4
Produo de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana ........................... 34
Prtica 5
Determinao da concentrao de condios de um produto base de fungos
entomopatognicos. ......................................................................................... 38
Prtica 6
Bioensaios ........................................................................................................ 44
Referncia Bibliogrfica ................................................................................... 49

Prtica 1

Tcnicas de laboratrio: Esterilizao, assepsia, preparao de meios de

cultura e equipamentos.

A. Objetivos

1. Determinar os principais equipamentos para um laboratrio de produo de fungos

entomopatognicos;
2. Conhecer os mtodos mais utilizados de esterilizao e assepsia;
3. Adquirir noes bsicas de preparo de meios de cultura, tcnicas em microbiologia e
de segurana no laboratrio.

B. Equipamentos do laboratrio

a) Microscpio de luz;
b) Lupa binocular;
c) Balana;
d) Estufa de secagem;
e) Estufa de esterilizao;
f) Autoclave;
g) Cmara de fluxo laminar (Capela);
h) Estufa incubadora (B.O.D.);
i) Destilador;
j) Purificador de gua (Osmose reversa);
k) Agitador vortex;

Microscpio ptico

Definio:
O microscpio ptico permite grandes aumentos (5 a 400x) e por isso adequado para
observar espcimes ou seces de organismos e tecidos, colocados sobre uma lmina
transparente que iluminada atravs de um espelho ou um iluminador de luz direta.

Requisitos prvios:
Nunca tocar com os dedos o material ptico das objetivas.
Ter cuidado especial quando utilizar as objetivas de maior aumento, uma vez que a
distncia de trabalho realmente pequena e pode-se, acidentalmente, tocar a amostra
com a objetiva durante o procedimento para focar a imagem.

Procedimento:
Colocar inicialmente reduzida quantidade da amostra sobre uma lmina de vidro. Em
seguida, depositar em cima da amostra a lamnula.
Ligar o microscpio e colocar a objetiva de aumento mnimo em posio de
observao. No aumento mnimo a objetiva trabalha a uma distncia maior da amostra.
Colocar a lmina com a amostra que ser observada sobre a platina do microscpio.
5

Verificar se a intensidade da luz est apropriada.

Caso o modelo de microscpio permita, ajustar a distncia interpupilar (ajustar de
forma a ver a mesma imagem com os dois olhos).
Focar a imagem, aproximando a objetiva da amostra com a ajuda do sistema
macromtrico e micromtrico, ajustando at a visualizao da imagem com a nitidez
desejada.
Girar o revlver, colocar a objetiva de aumento superior em posio de observao e
focar a imagem novamente. Repetir a operao at colocar a objetiva com o aumento de
observao desejado.
Realizar uma varredura na amostra mediante o deslocamento da lmina com o
comando de Charriot.
Terminada a observao, afastar a objetiva da amostra com o auxlio do sistema
micromtrico e macromtrico.
Girar o revlver at ajustar a objetiva de menor aumento em posio de observao e
ento retirar a amostra.
Diminuir a luz, desligar o aparelho.

Lupa Binocular (Microscpios estereoscpicos)

Definio e Funes:
Um microscpio estereoscpico um instrumento que possibilita a visualizao de estruturas
com diversas vezes de aumento. utilizado para observar objetos tais como gros, minrios,
insetos e etc. O seu poder de aumento mais baixo do que de um microscpio ptico (at 5x)
e o seu sistema de iluminao normalmente opera com uma luz direta.
6

Balanas
1 Prato de pesagem
2 Teclas
3 Parafusos niveladores

Balana analtica

Balana de preciso

3
2
Funes:
Balana de preciso: de uso mais comum no laboratrio, usualmente apresenta o prato
para colocao de amostras exposto. indicada para medidas da ordem de centenas a 0,01g.

Balana analtica: de uso mais restrito, pois seu mecanismo possui elevada sensibilidade
de leitura, usualmente apresenta o prato para colocao de amostras protegido por portinholas
de vidro corredias, pois leves ou at imperceptveis correntes de ar podem levar
instabilidade ao valor lido, ou at induzir a um grande erro de leitura. indicada para
medidas da ordem de gramas a 0,0001g (ou menos).

Requisitos prvios para operao de balanas:

Evitar alteraes bruscas de temperatura;
Evitar correntes de ar;
Situar a balana em uma base fixa e firme e sem trepidaes.
Verificar o nivelamento da balana, a bolha de ar do nvel dever estar no centro do
crculo. Caso a balana no esteja nivelada, o nivelamento dever ser realizado girando
o ajuste nos ps da balana at a centralizao da bolha de ar no nvel.
Evitar completamente golpes e sobrecargas acima do valor mximo (max.) dado,
diminuindo o valor de tara j existente. Isso poderia danificar a balana.
7

Estufas de secagem e esterilizao

Funo das estufas:

Secar e esterilizar por calor seco materiais
slidos, por exemplo, vidraria tais como,
pipetas, tubos de vidro, placas de Petri,
bqueres, frascos Erlenmayer etc,

Estufa incubadora (B.O.D.)

Funo:
Estufa com temperatura, umidade e fotoperodo
controlado utilizada para a multiplicao

de

microorganismos, desenvolvimento de bioensaios e

produo de fungos.

Autoclaves

Funo das autoclaves: Esterilizar por calor mido materiais slidos ou lquidos, por
exemplo, meio de cultura, arroz, saco de polipropileno, soluo de Tween, gua,
ponteiras de micropipetas, tubos tipo eppendorf, etc.

Procedimento (Autoclave Marca Phoenix, Modelo AV 75):

1. Verifique para que a autoclave esteja desligada;
2. Abra a tampa da autoclave e retire o cesto do receptculo;
3. Preencha com gua deionizada ou destilada o fundo do receptculo at o nvel indicado.
As resistncias devem estar completamente submersas em gua;
4. Verifique se o material a ser autoclavado certificado como autoclavvel, e que resista
a uma temperatura de 121C e uma presso de 1,2 kgf/cm;
5. Coloque o material a ser autoclavado na cesta. Instrumentos devem ser previamente
embrulhados para que a esterilidade seja mantida depois que a autoclave for aberta.
Vidraria vazia deve ter o seu bocal tampado ou com papel adequado, com sua tampa
prpria, no caso de ser rosquevel de tal forma que a tampa fique frouxa e que a vidraria
no fique hermeticamente fechada. Frascos contendo meios de cultura e reagentes lquidos
devem ser preenchidos apenas at a metade do seu volume e o fechamento pode ou no
ser hermtico;
6. Coloque a cesta contendo o material a ser autoclavado no receptculo da autoclave;
9

7. Feche a tampa da autoclave e trave-a com as roscas que a prendem;

8. Abra a vlvula que permite o escape de gases atravs da mangueira para alvio de
presso girando a torneira;
9. Ligue a autoclave no termostato, na temperatura mais alta (Max);
10. Aguarde que vapor dgua seja expelido atravs da mangueira;
11. Feche a torneira da vlvula de escape;
12. Aguarde a presso subir a 1,2 kgf/cm o que equivale a uma temperatura de 121C.
Ateno: no deixe a presso subir demais e atingir a regio indicada em vermelho
no manmetro;
13. Assim que a temperatura estiver um pouco acima de 121C coloque o termostato na
temperatura mdia (Med).
14. Marque o tempo necessrio para atingir esterilidade do material.
15. Durante esse tempo, monitore a presso/temperatura que no deve cair abaixo de 1,2
kgf/cm (121C). Caso isso ocorrer, volte o termostato temperatura mais alta para que a
presso fique acima de 1,2 kgf/cm (121C) e calibre o regulador girando o contrapeso de
sua alavanca para que este fique um pouco mais perto da ponta. Volte o termostato
posio mdia ou 1 aps a temperatura/presso ter subido um pouco e continue a marcar o
tempo;
16. Ao final do tempo de exposio a 121C, desligue a autoclave no termostato (Desl);
17. Aguarde a diminuio espontnea da temperatura com a vlvula fechada. No
alivie a presso com a abertura da torneira da vlvula de escape;
18. Aps a presso interna cair a zero, abra com cuidado a torneira da vlvula de escape;
19. Gire as roscas que a prendem a tampa, destravando-a e abra a tampa da autoclave.
Fique longe do vapor que sai para evitar queimaduras;
20. Retire a cesta do receptculo;
21. Coloque o material para secar em estufa de secagem a 60C at ficar seco. S ento
rosqueie a tampa de vidraria vazia. Meios de cultura ou reagentes podem ser guardados na
geladeira ou temperatura ambiente depois de arrefecerem-se espontaneamente;
22. Identifique o material como estril.

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Cmara de fluxo laminar (Capela)

Fluxo vertical

Fluxo horizontal

Definio das cmaras de fluxo laminar:

As cmaras de fluxo laminar so equipamentos desenvolvidos para criar ambientes limpos
em pequenas reas de trabalhos, independentemente das condies do ambiente que o rodeia.

Fluxo horizontal:
Seu uso recomendado para trabalhos com materiais no perigosos, quando for necessrio
que o ar esteja limpo e isento de partculas. No podem ser utilizadas em trabalhos que
estejam relacionados com a manipulao de agentes patognicos, ou que representem risco
ao operador e ao ambiente, pois o ar direcionado para fora da cmara atingindo o operador e
o ambiente de trabalho.

Fluxo vertical:
indicada para a proteo do produto e do operador nas manipulaes, por exemplo, de
materiais biolgicos, cultura de clulas, etc. A abertura na parte frontal facilita o acesso do
operador e sua manipulao, alm disso, o controle de fluxo do ar oferece proteo ao
usurio. A exausto passa por filtros, que protege o produto da contaminao, porm
descarregada no laboratrio.
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C. Material de laboratrio

a) Micropipetadores e ponteiras;
b) Pipetas graduadas;
c) Ala de Drigalsky;
d) Cabo de Kolle;
e) Ala de platina;
f) Lminas;
g) Lamnulas;
h) Cmara de Neubauer;
i) Ultra-som;
j) Bqueres;
k) Erlenmeyers;
l) Tubos de vidro;
m) Bico de bunsen;
n) Provetas;
o) Placas de Petri;
p) Papel alumnio;
q) Algodo Hidrfobo;
r) Ingredientes para Meio de cultura;
s) Fogo;
t) Microondas;
u) Contador Manual;
v) Funil;
w) Filtros;

Anotaes:
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Micropipetas e ponteiras

DESCRIO:

A) Boto com cdigo de cores

B) Corpo da pipeta ou handle
C) Porca de conexo
D) Ponteira
E) Ejetor de ponteiras
F) Boto de ejeo
H) Porta-cone
T) Tambor de ajuste do volume
V) Volmetro

13

Ajuste de volumeis das micropipetas:

Para evitar o efeito paralaxe procure ajustar o volmetro na posio horizontal (com a
pipeta deitada, com o volmetro na altura dos olhos). Tenha certeza de que o indicador de
volume e o marcador esto alinhados com sua viso.

14

Procedimento:
1. Encaixe a ponteira.
2. Molhe a ponteira: quando uma nova ponteira colocada (ou aumenta-se o volume a ser
aspirado), necessrio molhar a ponteira. Para isso, basta aspirar e dispensar o lquido
algumas vezes.
3. Aspire:
3.1 Pressione o boto at o primeiro estgio (que corresponde ao volume de lquido
selecionado). Segure a pipeta verticalmente e mergulhe a ponteira no lquido.
3.2 Solte o boto de modo lento e constante para aspirar o volume selecionado;
3.3 Espere alguns segundos e retire a ponteira do lquido;
4. Dispense:
4.1 Encoste a ponta da ponteira na parede interna do recipiente e incline a pipeta
aproximadamente de 10 a 40o;
4.2 Pressione o boto at o primeiro estgio de forma lenta e constante;
4.3 Ao final aguarde pelo menos um segundo; ento pressione o boto at o segundo
estgio (purga) para eliminar possveis gotculas que permaneceram na ponteira;
4.4 Mantenha o boto pressionado at o final e retire a ponteira de dentro do recipiente
mantendo-a em contato com a parede do mesmo (arranhar a ponta da ponteira na
parede do recipiente);
4.5 Solte o boto suavemente.
5. Descarte a ponteira pressionando o boto do ejetor de ponteiras.

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D. Tcnicas de Esterilizao, desinfeco e assepsia

a) Esterilizao: o processo pelo qual se eliminam todos os microrganismos vivos

existentes, incluindo esporos de resistncia;
b) Desinfeco: a eliminao dos microrganismos que se encontram dentro de
alguns corpos, normalmente por processos qumicos;
c) Desinfestao: a eliminao de microrganismos que se encontram na superfcie
de objetos, plantas e animais;
d) Assepsia: a utilizao de composto mineral ou orgnico para impedir a
multiplicao microbiana, sem necessariamente elimin-la.

Figura 1. Esquema geral para esterilizao do laboratrio para trabalhos de patologia de

insetos (MO = microrganismo; UV = ultravioleta) Adaptado de Alves, 1998

16

Mtodos Fsicos de esterilizao:

A) Calor seco:
a) Esterilizao pelo ar quente: o mais utilizado para certos tipos de vidrarias
laboratoriais, leos, ps e substncias no miscveis em gua. Para esse trabalho
pode ser utilizado o forno de Pasteur ou estufas eltricas, que so regulados para a
temperatura de 100 a 170 C. Deve-se deixar na temperatura de 170 C no mnimo
por duas horas;
b) Flambagem: o aquecimento direto em uma chama. Utilizado principalmente
para alas, tesouras, pinas e instrumentos de metal ou borracha no inflamvel.

B) Calor mido:
a) Vapor de gua sob presso: o mtodo mais frequente para fins de esterilizao.
Para esse procedimento utilizada a autoclave, equipamento considerado
essencial em um laboratrio de microbiologia. As vantagens desse mtodo so:
aquecimento rpido, penetrabilidade e grande umidade, o que facilita a coagulao
das protenas. utilizado para esterilizar meios de cultura, gua ou outros
materiais que no tm sua constituio alterada devido alta presso e
temperatura.

C) Radiaes:
a) Radiao ultravioleta: considerado um mtodo fsico, pois utiliza o efeito de
radiaes luminosas para diminuio da populao de microrganismos. No possui boa
penetrabilidade, por isso usada em cmara assptica, entradas de salas asspticas e para
desisfestao de material cirrgico. Para a utilizao dessa tcnica so necessrias
lmpadas especiais.

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E. Preparao de meios de cultura

Procedimento:
a) Pesar todos os ingredientes separadamente;
b) Adicionar o Agar a uma parte da gua exigida (a gua deve estar fria para se evitar a
formao de grumos);
c) Aquecer a mistura agitando levemente at o ponto de ebulio;
d) Acrescentar e homogeneizar os demais ingredientes do meio, exceto os termolbeis;
e) Distribuir em frascos apropriados para a esterilizao em autoclave, ocupando no
mximo a metade do volume do frasco;
f) Fechar os frascos com algodo hidrfobo e cobrir com papel alumnio;
g) Acondicionar os frascos em autoclave, evitando que fiquem inclinados. O tempo de
autoclavagem deve ser de 20 minutos a 120 C e 1 atm.;
h) Os componentes termolbeis (ex: antibitico) devem ser adicionados ao meio, quando
for utilizado, aps o aquecimento, at a solubilizao;
i) Aps o resfriamento os frascos devem ser guardados ao abrigo da luz e evitar
temperaturas e umidades elevadas.

Meios de cultura mais utilizados:

BDA (Batata Dextrose Agar)
- 20 g de gar
- 15 g de dextrose
- 200 g de batata
- 0,5 g de antibitico (streptomicina, tetraciclina, etc.)
- 1000 mL de H20 destilada
ME (Meio de Esporulao)
- 0,36 g de fosfato de potssio
- 1,05 g de fosfato de sdio
Mix de Sais

- 0,6 g sulfato de magnsio

- 1 g de cloreto de potssio

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- 10 g de glucose
- 1,58 g de nitrato de sdio
- 5 g de extrato de levedura
- 20 g de gar
- 1000 ml de H2O destilada

Verter os meios em placas de Petri:

a) Colocar os frascos com meio no Microondas;
b) Colocar os frascos na capela e esperar esfriar;
c) Verter o meio em placas de Petri;

Anotaes:
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Prtica 2

Parte 1: Isolamento e Identificao de Metarhizium anisopliae e Beauveria

bassiana.
Objetivos
1. Isolar os agentes entomopatognicos, Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana, de
insetos a fim de se obter culturas limpas.
2. Identificar os fungos M. anisopliae e B. bassiana com base nas caractersticas culturais
das colnias e montagem de lminas para visualizao das estruturas dos
entomopatgenos.

Material e Equipamentos
a) Lminas e lamnulas
b) Corante azul ltico (lactofenol blue)
c) Estilete, ala de platina
d) Pipetas
e) Placas de Petri com meio BDA
f) Lupas e microscpios de luz

Anotaes:
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Procedimentos

1. Isolamento de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana por diferentes tcnicas:

a) Transferncia de estruturas do patgeno: selecionar um inseto que apresente o corpo

coberto de miclio e condios de fungo, retirar pores das estruturas do fungo com
ala de platina, tocando a superfcie do meio em quatro pontos opostos.
b) Transferncia do inseto atacado: colocar um fragmento do inseto atacado diretamente
na superfcie do meio.
c) Semeadura indireta dos condios: tocar a superfcie do inseto coberta por condios com
uma ala polvilhando-os sobre o meio.
d) Semeadura direta de condios: colocar o inseto contaminado em um tudo de vidro
contendo 10 mL de gua destilada estril mais espalhante adesivo. Agitar o frasco e a
partir dessa suspenso realizar diluies sucessivas (10-1, 10-2, 10-3). Transferir 100 L
das diluies para placas de Petri contendo meio BDA e espalhar com ala de
Drigalsky.

Obs: as placas devero ser acondicionadas em cmara climatizada do tipo B.O.D

(Biological Oxigen Demand) a 26 1C por 5 dias. Aps o desenvolvimento do fungo
devem-se fazer repicagens das colnias a fim de se purificar o material.

Anotaes:
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2. Identificao de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana

a) Selecionar placas de Petri com colnias de M. anisopliae e B. bassiana

b) Colocar uma gota do corante em uma lmina seca.
c) Tocar as colnias com uma ala pegando uma pequena quantidade de miclio e/ou
condios (tocar a parte mais externa da colnia).
d) Espalhar o fungo (miclio e/ou condios no corante).
e) Cobrir com uma lamnula e observar.

Obs: as estruturas dos entomopatgenos aparecem em destaque, coradas de azul intenso, em

um fundo azul mais claro.

Metarhizium anisopliae (s.l.)

b

c
a

Figura 1. Metarhizium anisopliae (sensu

latu): 1. Representao esquemtica - a)

conidiforo, b) condios e c) filide; 2. Cigainha-da-raz atacada pelo fungo; 3 e 4. Estruturas

vistas em microscpio; 5. condios sobre o substrato; 6. Placa com estrias; 7. Colnia; 8.
Fungo cultivado em arroz.
22

Beauveria bassiana (Beauveria pseudobassiana s.l.)

1

Figura 2. 1. Representao esquemtica: conidiforo, filide e condios; 2. Placa com

colnias; 3 e 4. Estruturas vistas em microscpio; 5, 6 e 7. Insetos mortos pelo fungo.

23

Parte 2: Identificao dos principais contaminantes presentes na produo

de fungos entomopatognicos.
Objetivo
Reconhecer os principais contaminantes na produo de Metarhizium anisopliae e
Beauveria bassiana.

Material e Equipamentos

a) Lminas e lamnulas
b) Corante azul ltico (lactofenol blue)
c) Estilete, ala de platina
d) Lupas e microscpios de luz

Procedimentos

1. Identificao de contaminantes
a) Escolher o contaminante a ser identificado.
b) Colocar uma gota do corante em uma lmina seca.
c) Tocar as colnias com uma ala pegando uma pequena quantidade de miclio e/ou
condios (tocar a parte mais externa da colnia).
d) Espalhar o fungo (miclio e/ou condios no corante).
e) Cobrir com uma lamnula e observar.

Anotaes:
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Guia para identificao dos principais contaminantes na produo de fungos

entomopatognicos:

Aspergillus spp.

Condios
Filide
Vescula

Conidiforo

Fusarium spp.

Macrocondio

Microcondio

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Rhizopus spp.

Esporngio

Estolo

Penicillium spp.

Condio

Filide

Conidiforos

Anotaes:
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Trichoderma spp.

Condios

Bactrias

Bacilos
Cocos

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Esquema prtico da morfologia de colnias:

Anotaes:
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ATIVIDADE PROPOSTA

Identificar as amostras de fungos

a) observar as caractersticas morfolgicas das colnias

b) observar as caractersticas das hifas, conidiforos e condios (montagem de lminas e observao em microscpio)

Amostra

Descrio morfolgica da colnia

Desenho das estruturas

3
4
5

29

Identificao do
contaminante

Prtica 3

Determinao da Viabilidade de condios de um produto a base de

Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana

Objetivos

1.

Conhecer os mtodos de avaliao da viabilidade de um produto a base de

Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana;

2.

Adquirir noes de controle de qualidade baseando-se no parmetro viabilidade de

condios;

3.

Aprender a realizar avaliaes de viabilidade de condios de M. anisopliae e B.

bassiana.

Material e Equipamentos

a) Tubos de vidro (fundo chato)

b) Pipetas de volumes variados (1 mL, 10 mL, etc.)
c) Soluo de Tween 80 0,05% (gua + espalhante adesivo)
d) Agitador vortex
e) Ultra-som (se possvel)
f) Ala Drigalski
g) Placas de Petri com meio BDA
h) Placas Rodac com meio BDA
i) Microscpio de luz
j) Contador manual de clulas (de mo)

30

Procedimentos

1.1.

Mtodo de Unidades Formadoras de Colnia (UFC)

a) Pesar 1 g de Arroz + Fungo (ou 0,1 g de Esporos puros);

b) Preparar suspenso original adicionando-se em 10 mL de Soluo de Tween 80
(0,05%);
c) Numerar os tubos de 1 at n (dependendo do numero de diluies);
d) Nos demais tubos, colocar 9 mL de soluo;
e) Fazer diluies seriadas at o necessrio (6-10 tubos);
f) Inocular 0,1 mL (100L) em placas de Petri contendo meio BDA (pelo menos 3
placas por diluio avaliada);
g) Espalhar com o auxlio de uma ala Drigalski sobre toda a superfcie do meio;
h) Incubar em BOD a 26C pelo perodo necessrio;
i) Aps 3-4 dias contar o nmero de colnias nas placas provenientes das diferentes
diluies, e marcar no fundo com caneta, incubar novamente para confirmao;

Arroz+Fungo
1g

Quantas diluies forem preciso!

...

31

1.2.

Avaliao pelo Mtodo de Unidades Formadoras de Colnia

a) Selecionar para contagem as placas que apresentarem de 30 a 300 colnias;

b) Aps confirmar o nmero de colnias, fazer a mdia pelas repeties;

- Por exemplo, para 3 repeties

211+134+195 = 540 / 3

180

180 103

c) Multiplicar pela diluio selecionada;

- Por exemplo, a 3 diluio (10-3)

180 103 101

d) Multiplicar pela quantidade inoculada na placa;

- Sempre 0,1 mL = 10-1

e) O resultado se d como =

180 104/ mL

X / mL da original (em cada 1 mL da suspenso);

ou

1,8 106/ mL

f) Para saber a concentrao do produto, multiplicar baseando-se no peso da amostra

retirada;

Em 1 mL da original

1,8 106/ mL

Em 10 mL da original

1,8 107/ mL

Em 10 mL da original

1 g de Arroz + Fungo

Em 1 g de Arroz + Fungo

1,8 107 condios viveis

32

2. Mtodo de viabilidade por Contagem Direta

a) Preparar placas de Petri com uma fina camada de BDA + antibitico;

b) Inocular 0,1 mL de uma suspenso a 106 condios/ mL;
c) Espalhar bem com o auxlio de uma ala Drigalski;
d) Incubar em BOD a 26C por 16-18 horas;
e) Contar em microscpio de luz sob o aumento de 400 o nmero de condios viveis e
inviveis;
f) Dividir a placa em 4 campos, e contar 3 visadas por campo, sendo no mnimo 200
condios por placa;
g) Com base no total, tirar a porcentagem de condios viveis do produto (porcentagem
de germinao);
- Por exemplo 188 viveis

213

100%

25 inviveis

188

88,3% de viabilidade

3. Mtodo de viabilidade por Contagem Direta 2 (com placa pequena)

a) Preparar placas Rodac com BDA + antibitico + Fungicida;

b) Inocular 0,15 mL (150L) de uma suspenso a 106 condios/ mL no centro da placa,
em uma gota de uma s vez, abrangendo-se os quatro quadrados centrais.;
c) No espalhar a gota;
d) Aps a evaporao, incubar em BOD a 26C por 24-30 horas;
e) Focando-se diretamente um campo no centro de cada quadrado, sem escolher ou
alterar o local de visualizao;
f) Contar em microscpio de luz sob o aumento de 400 o nmero de condios viveis e
inviveis;
g) Fazer pelo menos 5 placas por amostra, contando no mnimo 200 condios por placa;
h) Com base no total, tirar a porcentagem de condios viveis do produto (porcentagem
de germinao) e calcular com visto acima.

33

Prtica 4

Produo de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana

Objetivos
Demonstrar o processo de produo de M. anisopliae e B. bassiana.

Material e Equipamentos

a)

Arroz parboilizado

b)

Frascos em vidro borossilicato tipo Schott

c)

Sacos de polipropileno

d)

Cmara de fluxo vertical

e)

Autoclave

f)

Frascos Erlenmayer (250 mL)

g)

Ala de Drigalsky

h)

Bandejas

i)

Soluo de Tween 80 0,05% (gua + espalhante adesivo)

j)

Placas de Petri com meio BDA

Procedimentos

1)

Escolher o fungo que ser produzido:

O fungo deve estar armazenado em freezer (-40C), de preferncia na forma de
condios puros.

2)

Repicagem do inculo incial (Placas de Petri):

Para obter a suspenso inicial de inculo os condios devem ser transferidos para
placas de Petri contendo meio de cultura Batata Dextrose gar BDA e espalhados
com auxlio de uma ala de Drigalsky. As placas deveram ser mantidas em cmara
climatizada do tipo B.O.D por sete dias, a 26 1C e doze horas de fotofase.

34

Aps o crescimento e conidiognese, os condios devero ser raspados do meio, com

auxlio de uma esptula, e colocados em frascos de Erlenmayer (250 mL), contendo
gua destilada estril.

3)

Obteno das matrizes:

a) Colocar o arroz parboilizado de molho em gua por 50 minutos distribuir
aproximadamente 50 g de arroz em frascos de vidro com capacidade de 250
mL (sugesto: utilizar frascos redondos para reagentes em vidro borossilicato,
com tampa rosquevel da marca Schott ou similar com capacidade de 250 mL).
b) Os frascos devem ser fechados e esterilizados em autoclave a 120oC por 30
minutos.
c) Aps o resfriamento os gros devero ser inoculados, em cmara de fluxo
vertical, com 5 mL de uma suspenso com concentrao de aproximadamente
1 x 108 condios.mL-1 do fungo desejado. Os frascos devem ser tampados e
para uma completa distribuio da suspenso devem ser agitados
vigorosamente.
d) Aps inocular o fungo, os frascos devem ser incubados por quatorze dias em
cmara ou sala climatizada com temperatura de aproximadamente 26 C e 12
horas de fotofase. Nesta sala os frascos devero ser colocados em posio
horizontal (deitados) em prateleiras, de forma que os gros de arroz fiquem
distribudos ao longo dos frascos, porm sem encostar-se tampa que deve
estar entreaberta.
e) Observar atentamente a pureza das matrizes. Caso algum frasco apresente
qualquer sinal de contaminao deve ser descartado imediatamente.
Recomenda-se fazer lminas para confirmar a identidade do fungo produzido.

4)

Cultivo em sacos de polipropileno:

a) O arroz parboilizado cru deve ser colocado em molho por 50 minutos, logo
aps deve ser escorrido e transferido (aproximadamente 300g) para sacos de
polipropileno. Os sacos devem ser fechados com auxlio de grampeador e
esterilizados em autoclave a 120oC por 20 minutos.
b) Aps o resfriamento o arroz deve ser inoculado com o fungo produzido nas
matrizes.
35

c) Para realizar o inculo pode-se utilizar:

Arroz com o fungo na quantidade de 1 colher cheia por saco ou
Uma suspenso lquida contendo condios de fungo. Para fazer a
suspeno deve-se adicionar gua destilada estril mais espalhante na
matriz.
d) Aps a distribuio manual do fungo, espalhando-o no arroz, o saco deve ser
novamente fechado e levado para a sala climatizada com temperatura de
aproximadamente 26 C e 12 horas de fotofase, por aproximadamente 14 dias.
Aps a observao do pico da conidiognese, quando se observa a cor verde
oliva (M. anisopliae) ou branca (B. bassiana) sobre o arroz, o fungo deve ser
levado para secar.

5)

Secagem do fungo:
O contedo dos sacos (arroz + fungo) deve ser distribudo em bandejas
(previamente esterilizadas com lcool 70%) que devem ser colocadas umas
sobre as outras de forma cruzada e acondicionadas em salas com baixa
umidade.

6)

Controle de qualidade: deve-se verificar

Viabilidade ver aula prtica 3
Concentrao ver aula prtica 5
Pureza ver aula prtica 2

7)

Embalagem e armazenamento: ver aula terica 5

Anotaes:
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
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37

Prtica 5:
Determinao da concentrao de condios de um produto base de fungos
entomopatognicos
Objetivo

Adquirir noes de pesagem, manipulao e preparo de diluies seriadas para

realizao de contagem em cmara de Neubauer (Hemacitmetro).

Material e Equipamentos

a)

Tubos de vidro (fundo chato)

b)

Pipetas de volumes variados (1 mL, 10 mL, etc.)

c)

Agitador vortex

d)

Soluo de Tween 80 0,05% (gua + espalhante adesivo)

e)

Ultra-som (se possvel)

f)

Balana semi-analtica (de preciso)

g)

Cmara de Neubauer

h)

Microscpio de luz

i)

Contador manual de clulas (de mo)

Anotaes:
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________

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Procedimentos

1. Preparo das diluies para contagem:

a) Pesar 1 g de Arroz + Fungo (ou 0,1 g de Esporos puros);

b) Preparar suspenso original adicionando-se em 10 mL de Soluo de Tween (0,05%);
c) Colocar nos demais tubos 9 mL de soluo;
d) Fazer diluies seriadas (pelo menos 4 diluies);
1 mL

Arroz+Fungo

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

1g

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10 mL

e) Pegar 1 mL da ltima diluio e preencher a Cmara de Neubauer, sem deixar bolhas

de ar;
f) Em um microscpio de luz no aumento de 400 , realizar a contagem de 3 cmaras
por amostra avaliada, sendo 6 campos no total (cada cmara possui 2 campos como o
demonstrado abaixo);

g) Contar a diluio que apresente de 50-150 condios por quadrado grande de fator
(circulado de vermelho), que contm 16 quadrados menores;
39

2. Procedimento de avaliao das contagens:

56+44+49+51=200
a) Somar os valores dos campos;

56 49
44 51

200 / 4 = 50

b) Tirar a mdia pelo nmero de contagens;

50 104

c) Multiplicar pelo fator de correo da cmara;

- Neubauer = 104, este valor fixo

50 104 103

d) Multiplicar pela diluio utilizada na contagem;

- Por exemplo, a 3 diluio = 103

e) O resultado se d como =

50 107/ mL

X / mL da original (em cada 1 mL da suspenso);

ou

5 108/ mL

f) Para saber a concentrao do produto, multiplicar baseando-se no peso da amostra

retirada;

Em 1 mL da original

5 108/ mL

Em 10 mL da original

5 109/ mL

Em 10 mL da original

1 g de Arroz + Fungo

Em 1 g de Arroz + Fungo

5 109

40

Ficha de quantificao Prtica 2

Produto:

Fator de correo da Cmara de Neubauer: 104

Peso da amostra:
Diluio:
Total:
Mdia:

Concentrao da original:

Concentrao do Produto:
41

Ficha de quantificao
Produto:

Fator de correo Cmara de Neubauer: 104

Peso da amostra:
Diluio:
Total:
Mdia:

Concentrao da original:

Concentrao do Produto:
42

Ficha de quantificao
Produto:

Fator de correo Cmara de Neubauer: 104

Peso da amostra:
Diluio:
Total:
Mdia:

Concentrao da original:

Concentrao do Produto:
43

Prtica 6

Bioensaios

Objetivo
Demonstrar a realizao de bioensaios utilizando bioinseticidas base de fungos
entomopatognicos empregando as tcnicas de imerso e pulverizao de insetos.

Material e Equipamentos

a) Tubos de vidro (fundo chato)

b) Placas de Petri plsticas (6 e 12 cm de dimetro)
c) Torre de Potter
d) Airbrush
e) Compressor de ar
f) Soluo de Tween 80 0,05% (gua + espalhante adesivo)
g) Dieta artificial
h) Papel filtro

Procedimentos

1) Obteno dos insetos:

Preferencialmente os insetos devem ser obtidos de criaes em laboratrio para que
seja possvel padronizar o tamanho e idade dos mesmos. No caso da broca da cana-deacar (Diatraea saccharalis) sugere-se utilizar lagartas em terceiro nstar, com
tamanho semelhante e no utilizar as lagartas que esto prximas ecdise.
As lagartas devem ser separadas da dieta e lavadas com gua para retirar os resduos
de anti-contaminantes presentes na dieta (Formol e Nipagin). Isso pode ser feito com
auxlio de uma peneira. Aps a lavagem, os insetos devem ser colocados sobre papel
toalha para que seja retirado o excesso de gua.

44

2) Obteno dos fungos:

Os condios devem ser produzidos em para placas de Petri contendo meio de cultura
Batata Dextrose gar BDA ou em arroz conforme descrito na aula prtica 4. Aps o
crescimento e conidiognese, os condios devero ser colocados em frascos de
Erlenmayer ou tubo de dieta, contendo gua destilada estril mais espalhante adesivo
(recomenda-se 0,05% de espalhante adesivo Tween 80).

3) Definio dos tratamentos:

Definir quais sero os tratamentos, por exemplo: tratamento com diferentes
concentraes de um mesmo isolado fngico ou vrios isolados fngicos na mesma
concentrao. Neste caso ser testado dois isolados fngicos, M. anisopliae isolado
ESALQ-1037 e B. bassiana isolado PL63.
Cada tratamento deve contar com no mnimo 5 grupos de 10 insetos, ou seja, 5
repeties por tratamento, totalizando 50 insetos por tratamento, alm da testemunha.
Assim teremos os seguintes tratamentos:
a) Testemunha: receber apenas gua destilada estril mais 0,05% de espalhante
adesivo Tween 80 (mesmo veculo utilizado para a suspeno de condios).
b) Fungo1: Suspenso de 5 x 108 condios.mL-1 de M. anisopliae isolado ESALQ1037.
c) Fungo2: Suspenso de 5 x 108 condios.mL-1 de B. bassiana isolado PL63.

4) Padronizao da suspenso:
A suspeno deve ser padronizada para a concentrao desejada conforme descrito na
aula prtica 5. Neste caso ser testada a concentrao de 5 x108 condios por mL.
importante avaliar a viabilidade dos condios conforme explicado na aula prtica 3.

5) Aplicao dos tratamentos:

a)

Mtodo de imerso:

Os insetos devem ser mergulhados em grupos de 10 em 15 mL de suspenso de

condios por 10 segundos (o tempo de imerso pode variar de acordo com o inseto). A

45

testemunha deve ser mergulhada apenas em gua destilada estril mais 0,05% de
espalhante adesivo Tween 80.
b)

Pulverizao:

As suspenses podem ser pulverizadas sobre os insetos empregando:

Torre Potter: distribuir grupos de 10 lagartas em placas de Petri grande (12 cm de
dimetro). Calibrar o equipamento para 15 libras.pol-2 e aplicar 2,5 mL de suspenso
sobre as lagartas.
Pulverizador tipo Airbrush acoplado a um compressor: distribuir grupos de 10
lagartas em placas de Petri grande (12 cm de dimetro). Aplicar 2,5 mL de suspenso
sobre as lagartas.
A testemunha deve ser pulverizada apenas com gua destilada estril mais 0,05% de
espalhante adesivo Tween 80.

6) Conduo do bioensaio:
Aps a pulverizao ou imerso, grupos de 10 lagartas devem ser acondicionados em
placas de Petri pequena (6 cm de dimetro) forrados com papel filtro. Aps 24 horas
os insetos devem ser alimentados diariamente com dieta artificial sem anticontaminantes (Formaldedo e Nipagin). Os insetos devem ser mantidos temperatura
de 26 1C e doze horas de fotofase.

7) Avaliao:
As avaliaes devem ser realizadas diariamente, por 10 dias, anotando o nmero de
insetos mortos. Nesta ocasio deve-se aproveitar para fazer a limpeza da placa de Petri
e trocar a dieta por uma nova, evitando a proliferao de bactrias.

8) Confirmao da causa da morte:

Os insetos mortos devem ser lavados em soluo de hipoclorito de sdio (1%) e
acondicionados em cmara mida (261C e fotoperodo de 12 horas), para a anlise
visual da exteriorizao dos miclios e conidiognese do fungo sobre o cadver do
inseto.

46

ESQUEMA DE UM BIOENSAIO

3. Distribuir os insetos

1. Preparar os insetos
Lavar com gua
Secar sobre
papel filtro

Separar as lagartas

Placa de Petri Pequena

Dieta

2. Aplicar os tratamentos

Pulverizao

Tampa com Dieta

Imerso

Ou

Ou

Airbrush
Fundo forrado com papel filtro
Torre de Potter
47

ATIVIDADE PROPOSTA
Avalie o bioensaio e preencha a tabela abaixo

Tratamentos

Nmero Inicial de
Insetos

Avaliao 7 dias aps a aplicao dos tratamentos

Nmero de Insetos
Mortos

Nmero de Insetos
Esporulados

Mortalidade Total
(%)

Mortalidade
Confirmada (%)

Testemunha
M. anisopliae
ESALQ-1037
B. bassiana
PL63

Mortalidade total = Nmero de insetos mortos x 100

Nmero inicial de insetos

Mortalidade Confirmada =

Nmero de insetos esporulados x 100

Nmero inicial de insetos

Qual fungo voc indicaria para realizar o controle da broca-da-cana-de-acar? Justifique a sua escolha.
____________________________________________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________________________________

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Referncia Bibliogrfica:
ALVES, S.B. (Ed.) Controle Microbiano de insetos. Piracicaba: Fealq, 1998. 1163p.
LEITE, L.G. (Ed.). Produo de Fungos Entomopatognicos. Ribeiro Preto: A.S. Pinto,
2003. 92p.
Esquemas:
Samson, R.A.; E.S. Hoekstra; C.A.N. van Oorschot. Introduction to food-borne fungi.
Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands. 1984.
COPERSUCAR. Guia prtico ilustrado para identificao e controle de contaminantes em
insetrios. 1987. (Boletim Tcnico Edio Especial)
Fotos:
Macrocondios de Fusarium spp.
www.med.univ-angers.fr/GEIHP/Images/Fusarium.jpg. Acesso em: 15/09/2009
Rhizopus spp.
John H. Wahlert, J.H.; Holland, M.J. General Biology II - Laboratory Notes for BIO 1003,
New York, 1999. Disponvel em:http://faculty.baruch.cuny.edu/jwahlert/bio1003/index.html.
Acesso em: 15/09/2009
Demais fotos
Banco de fotos do Laboratrio de Patologia e Controle Microbiano de Insetos, Universidade
de So Paulo, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - ESALQ.

Material Didtico de Autoria de:

Celeste Paola DAlessandro, Daian Guilherme Pinto de Oliveira, Giuliano Pauli, talo
Delalibera Jr, Janayne Maria Rezende, Solange Aparecida Vieira de Barros.
FICA EXPRESSAMENTE PROIBIDA A REPRODUO DESTE NO TODO OU EM
PARTE, SEM A DEVIDA AUTORIZAO DOS AUTORES.
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