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Universidade de São Paulo - USP Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – ESALQ Departamento de Entomologia e Acarologia

– ESALQ Departamento de Entomologia e Acarologia Período: 21, 22 e 23 de novembro de 2011
– ESALQ Departamento de Entomologia e Acarologia Período: 21, 22 e 23 de novembro de 2011

Período: 21, 22 e 23 de novembro de 2011 Coordenador: Prof. Ítalo Delalibera Jr. Ministrantes: Italo Delalibera Jr., Celeste Paola D’Alessandro, Giuliano Pauli, Janayne Maria Rezende, Marcos Roberto Conceschi, Solange Aparecida Vieira Barros, Viviane Santos. Local: Laboratório de Patologia e Controle Microbiano de Insetos ESALQ/USP

Sumário

Prática 1 Técnicas de laboratório: Esterilização, assepsia, preparação de meios de cultura e

4

Prática 2 Parte 1: Isolamento e Identificação de Metarhizium anisopliae e Beauveria

 

20

Parte 2: Identificação dos principais contaminantes presentes na produção de

fungos

24

Prática 3 Determinação da Viabilidade de conídios de um produto à base de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana

30

Prática 4 Produção de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana

34

Prática 5 Determinação da concentração de conídios de um produto à base de fungos

 

38

Prática 6

Bioensaios

44

Referência Bibliográfica

49

2
2

Prática 1

Técnicas de laboratório: Esterilização, assepsia, preparação de meios de cultura e equipamentos.

A. Objetivos

1. Determinar os principais equipamentos para um laboratório de produção de fungos entomopatogênicos;

2. Conhecer os métodos mais utilizados de esterilização e assepsia;

3. Adquirir noções básicas de preparo de meios de cultura, técnicas em microbiologia e de segurança no laboratório.

B. Equipamentos do laboratório

a) Microscópio de luz;

b) Lupa binocular;

c) Balança;

d) Estufa de secagem;

e) Estufa de esterilização;

f) Autoclave;

g) Câmara de fluxo laminar (Capela);

h) Estufa incubadora (B.O.D.);

i) Destilador;

j) Purificador de água (Osmose reversa);

k) Agitador vortex;

4

Microscópio óptico

Microscópio óptico Definição: O microscópio óptico permite grandes aumentos (5 a 400x) e por isso é

Definição:

O microscópio óptico permite grandes aumentos (5 a 400x) e por isso é adequado para observar espécimes ou secções de organismos e tecidos, colocados sobre uma lâmina transparente que é iluminada através de um espelho ou um iluminador de luz direta.

Requisitos prévios:

espelho ou um iluminador de luz direta. Requisitos prévios: Nunca tocar com os dedos o material

Nunca tocar com os dedos o material óptico das objetivas.

Ter cuidado especial quando utilizar as objetivas de maior aumento, uma vez que a distância de trabalho é realmente pequena e pode-se, acidentalmente, tocar a amostra com a objetiva durante o procedimento para focar a imagem.Nunca tocar com os dedos o material óptico das objetivas. Procedimento: Colocar inicialmente reduzida quantidade da

Procedimento:

durante o procedimento para focar a imagem. Procedimento: Colocar inicialmente reduzida quantidade da amostra sobre

Colocar inicialmente reduzida quantidade da amostra sobre uma lâmina de vidro. Em seguida, depositar em cima da amostra a lamínula. Ligar o microscópio e colocar a objetiva de aumento mínimo em posição de observação. No aumento mínimo a objetiva trabalha a uma distância maior da amostra. Colocar a lâmina com a amostra que será observada sobre a platina do microscópio.

a uma distância maior da amostra. Colocar a lâmina com a amostra que será observada sobre
a uma distância maior da amostra. Colocar a lâmina com a amostra que será observada sobre

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Verificar se a intensidade da luz está apropriada. Caso o modelo de microscópio permita, ajustar
Verificar se a intensidade da luz está apropriada. Caso o modelo de microscópio permita, ajustar
Verificar se a intensidade da luz está apropriada. Caso o modelo de microscópio permita, ajustar

Verificar se a intensidade da luz está apropriada. Caso o modelo de microscópio permita, ajustar a distância interpupilar (ajustar de forma a ver a mesma imagem com os dois olhos). Focar a imagem, aproximando a objetiva da amostra com a ajuda do sistema macrométrico e micrométrico, ajustando até a visualização da imagem com a nitidez desejada. Girar o revólver, colocar a objetiva de aumento superior em posição de observação e focar a imagem novamente. Repetir a operação até colocar a objetiva com o aumento de observação desejado.

Realizar uma varredura na amostra mediante o deslocamento da lâmina com o comando de Charriot. Terminada a observação, afastar a objetiva da amostra com o auxílio do sistema micrométrico e macrométrico. Girar o revólver até ajustar a objetiva de menor aumento em posição de observação e então retirar a amostra. Diminuir a luz, desligar o aparelho.

retirar a amostra. Diminuir a luz, desligar o aparelho. Lupa Binocular ( Microscópios estereoscópicos) Definição
retirar a amostra. Diminuir a luz, desligar o aparelho. Lupa Binocular ( Microscópios estereoscópicos) Definição
retirar a amostra. Diminuir a luz, desligar o aparelho. Lupa Binocular ( Microscópios estereoscópicos) Definição
retirar a amostra. Diminuir a luz, desligar o aparelho. Lupa Binocular ( Microscópios estereoscópicos) Definição
retirar a amostra. Diminuir a luz, desligar o aparelho. Lupa Binocular ( Microscópios estereoscópicos) Definição

Lupa Binocular (Microscópios estereoscópicos)

o aparelho. Lupa Binocular ( Microscópios estereoscópicos) Definição e Funções: Um microscópio estereoscópico é

Definição e Funções:

Um microscópio estereoscópico é um instrumento que possibilita a visualização de estruturas com diversas vezes de aumento. É utilizado para observar objetos tais como grãos, minérios, insetos e etc. O seu poder de aumento é mais baixo do que de um microscópio óptico (até 5x) e o seu sistema de iluminação normalmente opera com uma luz direta.

6

Balanças

1 Prato de pesagem

2 Teclas

3 Parafusos niveladores

Balança de precisão

1 3
1
3
Balança analítica 2
Balança analítica
2

Funções:

Balança de precisão: É de uso mais comum no laboratório, usualmente apresenta o prato

para colocação de amostras exposto. É indicada para medidas da ordem de centenas a 0,01g.

Balança analítica: É de uso mais restrito, pois seu mecanismo possui elevada sensibilidade

de leitura, usualmente apresenta o prato para colocação de amostras protegido por portinholas

de vidro corrediças, pois leves ou até imperceptíveis correntes de ar podem levar

instabilidade ao valor lido, ou até induzir a um grande erro de leitura. É indicada para

medidas da ordem de gramas a 0,0001g (ou menos).

Requisitos prévios para operação de balanças:

Evitar alterações bruscas de temperatura;menos). Requisitos prévios para operação de balanças: Evitar correntes de ar; Situar a balança em uma

Evitar correntes de ar;de balanças: Evitar alterações bruscas de temperatura; Situar a balança em uma base fixa e firme

Situar a balança em uma base fixa e firme e sem trepidações.alterações bruscas de temperatura; Evitar correntes de ar; Verificar o nivelamento da balança, a bolha de

Verificar o nivelamento da balança, a bolha de ar do nível deverá estar no centro doa balança em uma base fixa e firme e sem trepidações. círculo. Caso a balança não

círculo. Caso a balança não esteja nivelada, o nivelamento deverá ser realizado girando

o ajuste nos pés da balança até a centralização da bolha de ar no nível.

Evitar completamente golpes e sobrecargas acima do valor máximo (max.) dado,da balança até a centralização da bolha de ar no nível. diminuindo o valor de tara

diminuindo o valor de tara já existente. Isso poderia danificar a balança.

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Estufas de secagem e esterilização

Estufas de secagem e esterilização Função das estufas: Secar e esterilizar por calor seco materiais sólidos,

Função das estufas:

Secar e esterilizar por calor seco materiais sólidos, por exemplo, vidraria tais como, pipetas, tubos de vidro, placas de Petri, béqueres, frascos Erlenmayer etc,

Estufa incubadora (B.O.D.)

frascos Erlenmayer etc, Estufa incubadora (B.O.D.) Função: Estufa com temperatura, umidade e fotoperíodo

Função:

Estufa com temperatura, umidade e fotoperíodo controlado utilizada para a multiplicação de microorganismos, desenvolvimento de bioensaios e produção de fungos.

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Autoclaves

Autoclaves Função das autoclaves: Esterilizar por calor úmido materiais sólidos ou líquidos, por exemplo, meio de

Função das autoclaves: Esterilizar por calor úmido materiais sólidos ou líquidos, por

exemplo, meio de cultura, arroz, saco de polipropileno, solução de Tween, água,

ponteiras de micropipetas, tubos tipo eppendorf, etc.

Procedimento (Autoclave Marca Phoenix, Modelo AV 75):

1. Verifique para que a autoclave esteja desligada;

2. Abra a tampa da autoclave e retire o cesto do receptáculo;

3. Preencha com água deionizada ou destilada o fundo do receptáculo até o nível indicado.

As resistências devem estar completamente submersas em água;

4. Verifique se o material a ser autoclavado é certificado como autoclavável, e que resista

a uma temperatura de 121°C e uma pressão de 1,2 kgf/cm²;

5. Coloque o material a ser autoclavado na cesta. Instrumentos devem ser previamente

embrulhados para que a esterilidade seja mantida depois que a autoclave for aberta.

Vidraria vazia deve ter o seu bocal tampado ou com papel adequado, com sua tampa

própria, no caso de ser rosqueável de tal forma que a tampa fique frouxa e que a vidraria

não fique hermeticamente fechada. Frascos contendo meios de cultura e reagentes líquidos

devem ser preenchidos apenas até a metade do seu volume e o fechamento pode ou não

ser hermético;

6. Coloque a cesta contendo o material a ser autoclavado no receptáculo da autoclave;

9

7. Feche a tampa da autoclave e trave-a com as roscas que a prendem; 8. Abra a válvula que permite o escape de gases através da mangueira para alívio de pressão girando a torneira; 9. Ligue a autoclave no termostato, na temperatura mais alta (“Max”);

10.

Aguarde que vapor d‟água seja expelido através da mangueira;

11.

Feche a torneira da válvula de escape;

12.

Aguarde a pressão subir a 1,2 kgf/cm² o que equivale a uma temperatura de 121°C.

Atenção: não deixe a pressão subir demais e atingir a região indicada em vermelho no manômetro;

13. Assim que a temperatura estiver um pouco acima de 121°C coloque o termostato na

temperatura média (“Med”).

14. Marque o tempo necessário para atingir esterilidade do material.

15. Durante esse tempo, monitore a pressão/temperatura que não deve cair abaixo de 1,2

kgf/cm² (121°C). Caso isso ocorrer, volte o termostato à temperatura mais alta para que a

pressão fique acima de 1,2 kgf/cm² (121°C) e calibre o regulador girando o contrapeso de sua alavanca para que este fique um pouco mais perto da ponta. Volte o termostato à posição média ou 1 após a temperatura/pressão ter subido um pouco e continue a marcar o tempo;

16. Ao final do tempo de exposição a 121°C, desligue a autoclave no termostato (“Desl”);

17. Aguarde a diminuição espontânea da temperatura com a válvula fechada. Não alivie a pressão com a abertura da torneira da válvula de escape;

18. Após a pressão interna cair a zero, abra com cuidado a torneira da válvula de escape;

19. Gire as roscas que a prendem a tampa, destravando-a e abra a tampa da autoclave.

Fique longe do vapor que sai para evitar queimaduras;

20. Retire a cesta do receptáculo;

21. Coloque o material para secar em estufa de secagem a 60°C até ficar seco. Só então

rosqueie a tampa de vidraria vazia. Meios de cultura ou reagentes podem ser guardados na

geladeira ou à temperatura ambiente depois de arrefecerem-se espontaneamente;

22. Identifique o material como estéril.

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Câmara de fluxo laminar (Capela)

Câmara de fluxo laminar (Capela) Fluxo vertical Fluxo horizontal Definição das câmaras de fluxo laminar: As

Fluxo vertical

Fluxo horizontal

Definição das câmaras de fluxo laminar:

As câmaras de fluxo laminar são equipamentos desenvolvidos para criar ambientes limpos em pequenas áreas de trabalhos, independentemente das condições do ambiente que o rodeia.

Fluxo horizontal:

Seu uso é recomendado para trabalhos com materiais não perigosos, quando for necessário que o ar esteja limpo e isento de partículas. Não podem ser utilizadas em trabalhos que estejam relacionados com a manipulação de agentes patogênicos, ou que representem risco ao operador e ao ambiente, pois o ar é direcionado para fora da câmara atingindo o operador e o ambiente de trabalho.

Fluxo vertical:

É indicada para a proteção do produto e do operador nas manipulações, por exemplo, de materiais biológicos, cultura de células, etc. A abertura na parte frontal facilita o acesso do operador e sua manipulação, além disso, o controle de fluxo do ar oferece proteção ao usuário. A exaustão passa por filtros, que protege o produto da contaminação, porém é descarregada no laboratório.

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C.

Material de laboratório

a) Micropipetadores e ponteiras;

b) Pipetas graduadas;

c) Alça de Drigalsky;

d) Cabo de Kolle;

e) Alça de platina;

f) Lâminas;

g) Lamínulas;

h) Câmara de Neubauer;

i) Ultra-som;

j) Béqueres;

k) Erlenmeyers;

l) Tubos de vidro;

m) Bico de bunsen;

n) Provetas;

o) Placas de Petri;

p) Papel alumínio;

q) Algodão Hidrófobo;

r) Ingredientes para Meio de cultura;

s) Fogão;

t) Microondas;

u) Contador Manual;

v) Funil;

w) Filtros;

Anotações:

Micropipetas e ponteiras

Micropipetas e ponteiras DESCRIÇÃO: A) Botão com código de cores B) Corpo da pipeta ou handle

DESCRIÇÃO:

A)

Botão com código de cores

B)

Corpo da pipeta ou handle

C)

Porca de conexão

D)

Ponteira

E)

Ejetor de ponteiras

F)

Botão de ejeção

H)

Porta-cone

T)

Tambor de ajuste do volume

V)

Volúmetro

ponteiras F) Botão de ejeção H) Porta-cone T) Tambor de ajuste do volume V) Volúmetro 13

13

Ajuste de volumeis das micropipetas:

Para evitar o efeito “paralaxe” procure ajustar o volúmetro na posição horizontal (com a pipeta “deitada”, com o volúmetro na altura dos olhos). Tenha certeza de que o indicador de volume e o marcador estão alinhados com sua visão.

na altura dos olhos). Tenha certeza de que o indicador de volume e o marcador estão
na altura dos olhos). Tenha certeza de que o indicador de volume e o marcador estão

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Procedimento:

1. Encaixe a ponteira.

2. Molhe a ponteira: quando uma nova ponteira é colocada (ou aumenta-se o volume a ser

aspirado), é necessário molhar a ponteira. Para isso, basta aspirar e dispensar o líquido algumas vezes.

3. Aspire:

3.1 Pressione o botão até o primeiro estágio (que corresponde ao volume de líquido

selecionado). Segure a pipeta verticalmente e mergulhe a ponteira no líquido.

3.2 Solte o botão de modo lento e constante para aspirar o volume selecionado;

3.3 Espere alguns segundos e retire a ponteira do líquido;

4. Dispense:

4.1 Encoste a ponta da ponteira na parede interna do recipiente e incline a pipeta

aproximadamente de 10 a 40 o ;

4.2 Pressione o botão até o primeiro estágio de forma lenta e constante;

4.3 Ao final aguarde pelo menos um segundo; então pressione o botão até o segundo

estágio (purga) para eliminar possíveis gotículas que permaneceram na ponteira;

4.4 Mantenha o botão pressionado até o final e retire a ponteira de dentro do recipiente

mantendo-a em contato com a parede do mesmo (“arranhar” a ponta da ponteira na

parede do recipiente);

4.5 Solte o botão suavemente.

5. Descarte a ponteira pressionando o botão do ejetor de ponteiras.

do recipiente); 4.5 Solte o botão suavemente. 5. Descarte a ponteira pressionando o botão do ejetor

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D.

Técnicas de Esterilização, desinfecção e assepsia

a) Esterilização: é o processo pelo qual se eliminam todos os microrganismos vivos existentes, incluindo esporos de resistência;

b) Desinfecção: é a eliminação dos microrganismos que se encontram dentro de alguns corpos, normalmente por processos químicos;

c) Desinfestação: é a eliminação de microrganismos que se encontram na superfície de objetos, plantas e animais;

d) Assepsia: é a utilização de composto mineral ou orgânico para impedir a multiplicação microbiana, sem necessariamente eliminá-la.

multiplicação microbiana, sem necessariamente eliminá-la. Figura 1. Esquema geral para esterilização do laboratório

Figura 1. Esquema geral para esterilização do laboratório para trabalhos de patologia de insetos (MO = microrganismo; UV = ultravioleta) Adaptado de Alves, 1998

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Métodos Físicos de esterilização:

A) Calor seco:

a) Esterilização pelo ar quente: é o mais utilizado para certos tipos de vidrarias

laboratoriais, óleos, pós e substâncias não miscíveis em água. Para esse trabalho pode ser utilizado o forno de Pasteur ou estufas elétricas, que são regulados para a temperatura de 100 a 170º C. Deve-se deixar na temperatura de 170º C no mínimo por duas horas;

b) Flambagem: é o aquecimento direto em uma chama. Utilizado principalmente

para alças, tesouras, pinças e instrumentos de metal ou borracha não inflamável.

B) Calor úmido:

a) Vapor de água sob pressão: é o método mais frequente para fins de esterilização. Para esse procedimento é utilizada a autoclave, equipamento considerado essencial em um laboratório de microbiologia. As vantagens desse método são:

aquecimento rápido, penetrabilidade e grande umidade, o que facilita a coagulação das proteínas. É utilizado para esterilizar meios de cultura, água ou outros materiais que não têm sua constituição alterada devido à alta pressão e temperatura.

C) Radiações:

a) Radiação ultravioleta: é considerado um método físico, pois utiliza o efeito de radiações luminosas para diminuição da população de microrganismos. Não possui boa penetrabilidade, por isso é usada em câmara asséptica, entradas de salas assépticas e para desisfestação de material cirúrgico. Para a utilização dessa técnica são necessárias lâmpadas especiais.

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E. Preparação de meios de cultura

Procedimento:

a) Pesar todos os ingredientes separadamente;

b) Adicionar o Agar a uma parte da água exigida (a água deve estar fria para se evitar a

formação de grumos);

c) Aquecer a mistura agitando levemente até o ponto de ebulição;

d) Acrescentar e homogeneizar os demais ingredientes do meio, exceto os termolábeis;

e) Distribuir em frascos apropriados para a esterilização em autoclave, ocupando no

máximo a metade do volume do frasco;

f) Fechar os frascos com algodão hidrófobo e cobrir com papel alumínio;

g) Acondicionar os frascos em autoclave, evitando que fiquem inclinados. O tempo de

autoclavagem deve ser de 20 minutos a 120º C e 1 atm.;

h) Os componentes termolábeis (ex: antibiótico) devem ser adicionados ao meio, quando

for utilizado, após o aquecimento, até a solubilização;

i) Após o resfriamento os frascos devem ser guardados ao abrigo da luz e evitar

temperaturas e umidades elevadas.

Meios de cultura mais utilizados:

BDA (Batata Dextrose Agar)

- 20 g de ágar

- 15 g de dextrose

- 200 g de batata

- 0,5 g de antibiótico (streptomicina, tetraciclina, etc.)

- 1000 mL de H 2 0 destilada

ME (Meio de Esporulação)

- 0,36 g de fosfato de potássio

- 1,05 g de fosfato de sódio

- 0,6 g sulfato de magnésio

- 1 g de cloreto de potássio

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Mix de Sais

- 10 g de glucose

- 1,58 g de nitrato de sódio

- 5 g de extrato de levedura

- 20 g de ágar

- 1000 ml de H 2 O destilada

Verter os meios em placas de Petri:

a) Colocar os frascos com meio no Microondas;

b) Colocar os frascos na capela e esperar esfriar;

c) Verter o meio em placas de Petri;

Anotações:

19

Prática 2

Parte 1: Isolamento e Identificação de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana.

Objetivos

1. Isolar os agentes entomopatogênicos, Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana, de insetos a fim de se obter culturas limpas.

2. Identificar os fungos M. anisopliae e B. bassiana com base nas características culturais das colônias e montagem de lâminas para visualização das estruturas dos entomopatógenos.

Material e Equipamentos

a) Lâminas e lamínulas

b) Corante azul lático (lactofenol blue)

c) Estilete, alça de platina

d) Pipetas

e) Placas de Petri com meio BDA

f) Lupas e microscópios de luz

Anotações:

20

Procedimentos

1. Isolamento de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana por diferentes técnicas:

a) Transferência de estruturas do patógeno: selecionar um inseto que apresente o corpo coberto de micélio e conídios de fungo, retirar porções das estruturas do fungo com alça de platina, tocando a superfície do meio em quatro pontos opostos.

b) Transferência do inseto atacado: colocar um fragmento do inseto atacado diretamente na superfície do meio.

c) Semeadura indireta dos conídios: tocar a superfície do inseto coberta por conídios com uma alça polvilhando-os sobre o meio.

d) Semeadura direta de conídios: colocar o inseto contaminado em um tudo de vidro contendo 10 mL de água destilada estéril mais espalhante adesivo. Agitar o frasco e a partir dessa suspensão realizar diluições sucessivas (10 -1 , 10 -2 , 10 -3 ). Transferir 100 µL das diluições para placas de Petri contendo meio BDA e espalhar com alça de Drigalsky.

Obs: as placas deverão ser acondicionadas em câmara climatizada do tipo B.O.D (Biological Oxigen Demand) a 26 ± 1°C por 5 dias. Após o desenvolvimento do fungo devem-se fazer repicagens das colônias a fim de se purificar o material.

Anotações:

21

2. Identificação de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana

a) Selecionar placas de Petri com colônias de M. anisopliae e B. bassiana

b) Colocar uma gota do corante em uma lâmina seca.

c) Tocar as colônias com uma alça pegando uma pequena quantidade de micélio e/ou conídios (tocar a parte mais externa da colônia).

d) Espalhar o fungo (micélio e/ou conídios no corante).

e) Cobrir com uma lamínula e observar.

Obs: as estruturas dos entomopatógenos aparecem em destaque, coradas de azul intenso, em um fundo azul mais claro.

Metarhizium anisopliae (s.l.)

a

Metarhizium anisopliae (s.l.) a b c 1 2 3 4 5 6 7 8
Metarhizium anisopliae (s.l.) a b c 1 2 3 4 5 6 7 8
Metarhizium anisopliae (s.l.) a b c 1 2 3 4 5 6 7 8

b

c

1

2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8

Figura 1. Metarhizium anisopliae (sensu latu): 1. Representação esquemática - a) conidióforo, b) conídios e c) fiálide; 2. Cigainha-da-raíz atacada pelo fungo; 3 e 4. Estruturas vistas em microscópio; 5. conídios sobre o substrato; 6. Placa com estrias; 7. Colônia; 8. Fungo cultivado em arroz.

22

Beauveria bassiana (Beauveria pseudobassiana s.l.)

1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7

Figura 2. 1. Representação esquemática: conidióforo, fiálide e conídios; 2. Placa com colônias; 3 e 4. Estruturas vistas em microscópio; 5, 6 e 7. Insetos mortos pelo fungo.

23

Parte 2: Identificação dos principais contaminantes presentes na produção de fungos entomopatogênicos.

Objetivo Reconhecer os principais contaminantes na produção de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana.

Material e Equipamentos

a) Lâminas e lamínulas

b) Corante azul lático (lactofenol blue)

c) Estilete, alça de platina

d) Lupas e microscópios de luz

Procedimentos

1. Identificação de contaminantes

a) Escolher o contaminante a ser identificado.

b) Colocar uma gota do corante em uma lâmina seca.

c) Tocar as colônias com uma alça pegando uma pequena quantidade de micélio e/ou

conídios (tocar a parte mais externa da colônia).

d) Espalhar o fungo (micélio e/ou conídios no corante).

e) Cobrir com uma lamínula e observar.

Anotações:

24

Guia para identificação dos principais contaminantes na produção de fungos entomopatogênicos:

Aspergillus spp.

Conídios Fiálide Vesícula Conidióforo
Conídios
Fiálide
Vesícula
Conidióforo
Aspergillus spp. Conídios Fiálide Vesícula Conidióforo
Aspergillus spp. Conídios Fiálide Vesícula Conidióforo
Aspergillus spp. Conídios Fiálide Vesícula Conidióforo
Aspergillus spp. Conídios Fiálide Vesícula Conidióforo

Fusarium spp.

Fusarium spp. Macroconídio Microconídio

Macroconídio

Microconídio

Fusarium spp. Macroconídio Microconídio
Fusarium spp. Macroconídio Microconídio
Fusarium spp. Macroconídio Microconídio
Fusarium spp. Macroconídio Microconídio

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Rhizopus spp.

Rhizopus spp. Esporângio Estolão

Esporângio

Estolão

Rhizopus spp. Esporângio Estolão
Rhizopus spp. Esporângio Estolão
Rhizopus spp. Esporângio Estolão
Rhizopus spp. Esporângio Estolão

Penicillium spp.

Conídio

Conidióforos

Fiálide

Penicillium spp. Conídio Conidióforos Fiálide
Penicillium spp. Conídio Conidióforos Fiálide
Rhizopus spp. Esporângio Estolão Penicillium spp. Conídio Conidióforos Fiálide Anotações: 26

Anotações:

26

Trichoderma spp.

Conídios
Conídios
Trichoderma spp. Conídios
Trichoderma spp. Conídios
Trichoderma spp. Conídios
Bactérias Bacilos Cocos

Bactérias

Bacilos Cocos
Bacilos
Cocos
Bactérias Bacilos Cocos

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Esquema prático da morfologia de colônias:

Esquema prático da morfologia de colônias: Anotações: 28

Anotações:

28

ATIVIDADE PROPOSTA

Identificar as amostras de fungos

a) observar as características morfológicas das colônias

b) observar as características das hifas, conidióforos e conídios (montagem de lâminas e observação em microscópio)

Amostra

Descrição morfológica da colônia

Desenho das estruturas

Identificação do contaminante

1

     

2

     

3

     

4

     

5

     
29
29

Prática 3

Determinação da Viabilidade de conídios de um produto a base de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana

Objetivos

1. Conhecer os métodos de avaliação da viabilidade de um produto a base de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana;

2. Adquirir noções de controle de qualidade baseando-se no parâmetro viabilidade de conídios;

3. Aprender a realizar avaliações de viabilidade de conídios de M. anisopliae e B. bassiana.

Material e Equipamentos

a) Tubos de vidro (fundo chato)

b) Pipetas de volumes variados (1 mL, 10 mL, etc.)

c) Solução de Tween ® 80 0,05% (Água + espalhante adesivo)

d) Agitador vortex

e) Ultra-som (se possível)

f) Alça Drigalski

g) Placas de Petri com meio BDA

h) Placas Rodac com meio BDA

i) Microscópio de luz

j) Contador manual de células (de mão)

30

Procedimentos

1.1. Método de Unidades Formadoras de Colônia (UFC)

a) Pesar 1 g de Arroz + Fungo (ou 0,1 g de Esporos puros);

b) Preparar suspensão original adicionando-se em 10 mL de Solução de Tween ® 80

(0,05%);

c) Numerar os tubos de 1 até n (dependendo do numero de diluições);

d) Nos demais tubos, colocar 9 mL de solução;

e) Fazer diluições seriadas até o necessário (6-10 tubos);

f) Inocular 0,1 mL (100µL) em placas de Petri contendo meio BDA (pelo menos 3 placas por diluição avaliada);

g) Espalhar com o auxílio de uma alça Drigalski sobre toda a superfície do meio;

h) Incubar em BOD a 26°C pelo período necessário;

i) Após 3-4 dias contar o número de colônias nas placas provenientes das diferentes diluições, e marcar no fundo com caneta, incubar novamente para confirmação;

Arroz+Fungo 1 g Quantas diluições forem preciso!
Arroz+Fungo
1 g
Quantas diluições forem preciso!

31

1.2.

Avaliação pelo Método de Unidades Formadoras de Colônia

a) Selecionar para contagem as placas que apresentarem de 30 a 300 colônias;

contagem as placas que apresentarem de 30 a 300 colônias ; b) Após confirmar o número

b) Após confirmar o número de colônias, fazer a média pelas repetições;

- Por exemplo, para 3 repetições

211+134+195 = 540 / 3

211+134+195 = 540 / 3 180

180

c) Multiplicar pela diluição selecionada;

- Por exemplo, a 3ª diluição (10 -3 )

d) Multiplicar pela quantidade inoculada na placa;

- Sempre 0,1 mL = 10 -1

180 × 10 3

180 × 10 3 × 10 1

e) O resultado se dá como =

180 × 10 4 / mL

X / mL da original (em cada 1 mL da suspensão);

ou

1,8 × 10 6 / mL

f) Para saber a concentração do produto, multiplicar baseando-se no peso da amostra retirada;

Em 1 mL da original

Em 10 mL da original

Em 10 mL da original

Em 1 g de Arroz + Fungo

32

1,8 × 10 6 / mL

1,8 × 10 7 / mL

1 g de Arroz + Fungo

g de Arroz + Fungo 32 1,8 × 10 6 / mL 1,8 × 10 7

1,8 × 10 7 conídios viáveis

2.

Método de viabilidade por Contagem Direta

a) Preparar placas de Petri com uma fina camada de BDA + antibiótico;

b) Inocular 0,1 mL de uma suspensão a 10 6 conídios/ mL;

c) Espalhar bem com o auxílio de uma alça Drigalski;

d) Incubar em BOD a 26°C por 16-18 horas;

e) Contar em microscópio de luz sob o aumento de 400 × o número de conídios viáveis e inviáveis;

f) Dividir a placa em 4 campos, e contar 3 visadas por campo, sendo no mínimo 200 conídios por placa;

g) Com base no total, tirar a porcentagem de conídios viáveis do produto (porcentagem de germinação);

- Por exemplo 188 viáveis 25 inviáveis

213

100%

 
   
 
  88,3% de viabilidade

88,3% de viabilidade

188

x

3. Método de viabilidade por Contagem Direta 2 (com placa pequena)

a) Preparar placas Rodac com BDA + antibiótico + Fungicida;

a) Preparar placas Rodac com BDA + antibiótico + Fungicida; b) Inocular 0,15 mL (150µL) de

b) Inocular 0,15 mL (150µL) de uma suspensão a 10 6 conídios/ mL no centro da placa, em uma gota de uma só vez, abrangendo-se os quatro quadrados centrais.;

c) Não espalhar a gota;

d) Após a evaporação, incubar em BOD a 26°C por 24-30 horas;

e) Focando-se diretamente um campo no centro de cada quadrado, sem escolher ou alterar o local de visualização;

f) Contar em microscópio de luz sob o aumento de 400 × o número de conídios viáveis e inviáveis;

g) Fazer pelo menos 5 placas por amostra, contando no mínimo 200 conídios por placa;

h) Com base no total, tirar a porcentagem de conídios viáveis do produto (porcentagem de germinação) e calcular com visto acima.

33

Prática 4

Produção de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana

Objetivos Demonstrar o processo de produção de M. anisopliae e B. bassiana.

Material e Equipamentos

a) Arroz parboilizado

b) Frascos em vidro borossilicato tipo “Schott

c) Sacos de polipropileno

d) Câmara de fluxo vertical

e) Autoclave

f) Frascos Erlenmayer (250 mL)

g) Alça de Drigalsky

h) Bandejas

i) Solução de Tween 80 0,05% (Água + espalhante adesivo)

j) Placas de Petri com meio BDA

Procedimentos

1)

Escolher o fungo que será produzido:

O fungo deve estar armazenado em freezer (-40°C), de preferência na forma de conídios puros.

2)

Repicagem do inóculo incial (Placas de Petri):

Para obter a suspensão inicial de inóculo os conídios devem ser transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura Batata Dextrose Ágar BDA e espalhados com auxílio de uma alça de Drigalsky. As placas deveram ser mantidas em câmara climatizada do tipo B.O.D por sete dias, a 26 ± 1°C e doze horas de fotofase.

34

Após o crescimento e conidiogênese, os conídios deverão ser raspados do meio, com auxílio de uma espátula, e colocados em frascos de Erlenmayer (250 mL), contendo água destilada estéril.

3)

Obtenção das matrizes:

a) Colocar o arroz parboilizado de molho em água por 50 minutos distribuir aproximadamente 50 g de arroz em frascos de vidro com capacidade de 250 mL (sugestão: utilizar frascos redondos para reagentes em vidro borossilicato, com tampa rosqueável da marca Schott ou similar com capacidade de 250 mL).

b) Os frascos devem ser fechados e esterilizados em autoclave a 120 o C por 30 minutos.

c) Após o resfriamento os grãos deverão ser inoculados, em câmara de fluxo vertical, com 5 mL de uma suspensão com concentração de aproximadamente 1 x 10 8 conídios.mL -1 do fungo desejado. Os frascos devem ser tampados e para uma completa distribuição da suspensão devem ser agitados vigorosamente.

d) Após inocular o fungo, os frascos devem ser incubados por quatorze dias em câmara ou sala climatizada com temperatura de aproximadamente 26 °C e 12 horas de fotofase. Nesta sala os frascos deverão ser colocados em posição horizontal (deitados) em prateleiras, de forma que os grãos de arroz fiquem distribuídos ao longo dos frascos, porém sem encostar-se à tampa que deve estar entreaberta.

e) Observar atentamente a pureza das matrizes. Caso algum frasco apresente qualquer sinal de contaminação deve ser descartado imediatamente. Recomenda-se fazer lâminas para confirmar a identidade do fungo produzido.

4)

Cultivo em sacos de polipropileno:

a) O arroz parboilizado cru deve ser colocado em molho por 50 minutos, logo após deve ser escorrido e transferido (aproximadamente 300g) para sacos de polipropileno. Os sacos devem ser fechados com auxílio de grampeador e esterilizados em autoclave a 120 o C por 20 minutos. b) Após o resfriamento o arroz deve ser inoculado com o fungo produzido nas matrizes.

35

c) Para realizar o inóculo pode-se utilizar:

→ Arroz com o fungo na quantidade de 1 colher cheia por saco ou → Uma suspensão líquida contendo conídios de fungo. Para fazer a suspenção deve-se adicionar água destilada estéril mais espalhante na matriz.

d) Após a distribuição manual do fungo, espalhando-o no arroz, o saco deve ser novamente fechado e levado para a sala climatizada com temperatura de aproximadamente 26 °C e 12 horas de fotofase, por aproximadamente 14 dias. Após a observação do pico da conidiogênese, quando se observa a cor verde oliva (M. anisopliae) ou branca (B. bassiana) sobre o arroz, o fungo deve ser levado para secar.

5)

Secagem do fungo:

O conteúdo dos sacos (arroz + fungo) deve ser distribuído em bandejas (previamente esterilizadas com álcool 70%) que devem ser colocadas umas sobre as outras de forma cruzada e acondicionadas em salas com baixa umidade.

6)

Controle de qualidade: deve-se verificar

Viabilidade ver aula prática 3

→ Concentração – ver aula prática 5

→ Pureza– ver aula prática 2

7)

Embalagem e armazenamento: ver aula teórica 5

Anotações:

36

Prática 5:

Determinação da concentração de conídios de um produto à base de fungos entomopatogênicos

Objetivo

Adquirir

noções

de

pesagem,

manipulação

e

preparo

de

diluições

seriadas

para

realização de contagem em câmara de Neubauer (Hemacitômetro).

Material e Equipamentos

a) Tubos de vidro (fundo chato)

b) Pipetas de volumes variados (1 mL, 10 mL, etc.)

c) Agitador vortex

d) Solução de Tween ® 80 0,05% (Água + espalhante adesivo)

e) Ultra-som (se possível)

f) Balança semi-analítica (de precisão)

g) Câmara de Neubauer

h) Microscópio de luz

i) Contador manual de células (de mão)

Anotações:

38

Procedimentos

1. Preparo das diluições para contagem:

a) Pesar 1 g de Arroz + Fungo (ou 0,1 g de Esporos puros);

b) Preparar suspensão original adicionando-se em 10 mL de Solução de Tween (0,05%);

c) Colocar nos demais tubos 9 mL de solução;

d) Fazer diluições seriadas (pelo menos 4 diluições);

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

Arroz+Fungo

10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
10 -1
10 -2
10 -3
10 -4
10 -5

10 mL

mL 1 mL Arroz+Fungo 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 mL

1 g

e) Pegar 1 mL da última diluição e preencher a Câmara de Neubauer, sem deixar bolhas de ar;

f) Em um microscópio de luz no aumento de 400 ×, realizar a contagem de 3 câmaras por amostra avaliada, sendo 6 campos no total (cada câmara possui 2 campos como o demonstrado abaixo);

(cada câmara possui 2 campos como o demonstrado abaixo); g) Contar a diluição que apresente de

g) Contar a diluição que apresente de 50-150 conídios por quadrado grande de fator (circulado de vermelho), que contém 16 quadrados menores;

39

2. Procedimento de avaliação das contagens:

a) Somar os valores dos campos;

56 49 44 51
56
49
44
51

56+44+49+51=200

b) Tirar a média pelo número de contagens;

200 / 4 = 50

c) Multiplicar pelo fator de correção da câmara;

- Neubauer = 10 4 , este valor é fixo

50

× 10 4

d) Multiplicar pela diluição utilizada na contagem;

- Por exemplo, a 3ª diluição = 10 3

50

× 10 4 × 10 3

e) O resultado se dá como =

50 × 10 7 / mL

X / mL da original (em cada 1 mL da suspensão);

ou

5 × 10 8 / mL

f) Para saber a concentração do produto, multiplicar baseando-se no peso da amostra retirada;

Em 1 mL da original

Em 10 mL da original

Em 10 mL da original

Em 1 g de Arroz + Fungo

40

5 × 10 8 / mL

5 × 10 9 / mL

1 g de Arroz + Fungo

10 mL da original Em 1 g de Arroz + Fungo 40 5 × 10 8

5 × 10 9

Produto:

Produto: Ficha de quantificação Prática 2 Fator de correção da Câmara de Neubauer : 10 4
Produto: Ficha de quantificação Prática 2 Fator de correção da Câmara de Neubauer : 10 4

Ficha de quantificação Prática 2

Produto: Ficha de quantificação Prática 2 Fator de correção da Câmara de Neubauer : 10 4
Produto: Ficha de quantificação Prática 2 Fator de correção da Câmara de Neubauer : 10 4
Produto: Ficha de quantificação Prática 2 Fator de correção da Câmara de Neubauer : 10 4
Produto: Ficha de quantificação Prática 2 Fator de correção da Câmara de Neubauer : 10 4

Fator de correção da Câmara de Neubauer: 10 4 Peso da amostra:

Diluição:

Total:

Média:

Concentração da original:

Concentração do Produto:

41

Produto:

Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:
Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:

Ficha de quantificação

Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:
Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:
Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:
Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:

Fator de correção Câmara de Neubauer: 10 4 Peso da amostra:

Diluição:

Total:

Média:

Concentração da original:

Concentração do Produto:

42

Produto:

Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:
Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:

Ficha de quantificação

Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:
Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:
Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:
Produto: Ficha de quantificação Fator de correção Câmara de Neubauer : 10 4 Peso da amostra:

Fator de correção Câmara de Neubauer: 10 4 Peso da amostra:

Diluição:

Total:

Média:

Concentração da original:

Concentração do Produto:

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Prática 6

Bioensaios

Objetivo Demonstrar a realização de bioensaios utilizando bioinseticidas à base de fungos entomopatogênicos empregando as técnicas de imersão e pulverização de insetos.

Material e Equipamentos

a) Tubos de vidro (fundo chato)

b) Placas de Petri plásticas (6 e 12 cm de diâmetro)

c) Torre de Potter

d) Airbrush

e) Compressor de ar

f) Solução de Tween 80 0,05% (Água + espalhante adesivo)

g) Dieta artificial

h) Papel filtro

Procedimentos

1) Obtenção dos insetos:

Preferencialmente os insetos devem ser obtidos de criações em laboratório para que seja possível padronizar o tamanho e idade dos mesmos. No caso da broca da cana-de- açúcar (Diatraea saccharalis) sugere-se utilizar lagartas em terceiro ínstar, com tamanho semelhante e não utilizar as lagartas que estão próximas à ecdise. As lagartas devem ser separadas da dieta e lavadas com água para retirar os resíduos de anti-contaminantes presentes na dieta (Formol e Nipagin). Isso pode ser feito com auxílio de uma peneira. Após a lavagem, os insetos devem ser colocados sobre papel toalha para que seja retirado o excesso de água.

44

2) Obtenção dos fungos:

Os conídios devem ser produzidos em para placas de Petri contendo meio de cultura Batata Dextrose Ágar BDA ou em arroz conforme descrito na aula prática 4. Após o crescimento e conidiogênese, os conídios deverão ser colocados em frascos de Erlenmayer ou tubo de dieta, contendo água destilada estéril mais espalhante adesivo (recomenda-se 0,05% de espalhante adesivo Tween 80 ® ).

3) Definição dos tratamentos:

Definir quais serão os tratamentos, por exemplo: tratamento com diferentes concentrações de um mesmo isolado fúngico ou vários isolados fúngicos na mesma concentração. Neste caso será testado dois isolados fúngicos, M. anisopliae isolado ESALQ-1037 e B. bassiana isolado PL63. Cada tratamento deve contar com no mínimo 5 grupos de 10 insetos, ou seja, 5 repetições por tratamento, totalizando 50 insetos por tratamento, além da testemunha.

→Assim teremos os seguintes tratamentos:

a) Testemunha: receberá apenas água destilada estéril mais 0,05% de espalhante

adesivo Tween 80 ® (mesmo veículo utilizado para a suspenção de conídios).

b) Fungo1: Suspensão de 5 x 10 8 conídios.mL -1 de M. anisopliae isolado ESALQ-

1037.

c) Fungo2: Suspensão de 5 x 10 8 conídios.mL -1 de B. bassiana isolado PL63.

4) Padronização da suspensão:

A suspenção deve ser padronizada para a concentração desejada conforme descrito na aula prática 5. Neste caso será testada a concentração de 5 x10 8 conídios por mL. É importante avaliar a viabilidade dos conídios conforme explicado na aula prática 3.

5) Aplicação dos tratamentos:

a) Método de imersão:

Os insetos devem ser mergulhados em grupos de 10 em 15 mL de suspensão de conídios por 10 segundos (o tempo de imersão pode variar de acordo com o inseto). A

45

testemunha deve ser mergulhada apenas em água destilada estéril mais 0,05% de espalhante adesivo Tween 80 ® .

b)

As suspensões podem ser pulverizadas sobre os insetos empregando:

Torre Potter: distribuir grupos de 10 lagartas em placas de Petri grande (12 cm de diâmetro). Calibrar o equipamento para 15 libras.pol -2 e aplicar 2,5 mL de suspensão sobre as lagartas. →Pulverizador tipo Airbrush acoplado a um compressor: distribuir grupos de 10 lagartas em placas de Petri grande (12 cm de diâmetro). Aplicar 2,5 mL de suspensão sobre as lagartas. A testemunha deve ser pulverizada apenas com água destilada estéril mais 0,05% de espalhante adesivo Tween 80 ® .

Pulverização:

6) Condução do bioensaio:

Após a pulverização ou imersão, grupos de 10 lagartas devem ser acondicionados em placas de Petri pequena (6 cm de diâmetro) forrados com papel filtro. Após 24 horas os insetos devem ser alimentados diariamente com dieta artificial sem anti- contaminantes (Formaldeído e Nipagin). Os insetos devem ser mantidos à temperatura de 26 ± 1°C e doze horas de fotofase.

7) Avaliação:

As avaliações devem ser realizadas diariamente, por 10 dias, anotando o número de insetos mortos. Nesta ocasião deve-se aproveitar para fazer a limpeza da placa de Petri e trocar a dieta por uma nova, evitando a proliferação de bactérias.

8) Confirmação da causa da morte:

Os insetos mortos devem ser lavados em solução de hipoclorito de sódio (1%) e acondicionados em câmara úmida (26±1ºC e fotoperíodo de 12 horas), para a análise visual da exteriorização dos micélios e conidiogênese do fungo sobre o cadáver do inseto.

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ESQUEMA DE UM BIOENSAIO

1. Preparar os insetos

Separar as lagartas

1. Preparar os insetos Separar as lagartas Lavar com água Secar sobre papel filtro
Lavar com água
Lavar com água

Secar sobre

papel filtro

1. Preparar os insetos Separar as lagartas Lavar com água Secar sobre papel filtro

2. Aplicar os tratamentos

Imersão

2. Aplicar os tratamentos Imersão Ou Pulverização Ou Airbrush Torre de Potter

Ou

Pulverização

2. Aplicar os tratamentos Imersão Ou Pulverização Ou Airbrush Torre de Potter
2. Aplicar os tratamentos Imersão Ou Pulverização Ou Airbrush Torre de Potter

Ou

Airbrush
Airbrush

Torre de Potter

47
47

3. Distribuir os insetos

Placa de Petri Pequena

Dieta Tampa com Dieta
Dieta
Tampa com Dieta

Fundo forrado com papel filtro

ATIVIDADE PROPOSTA

Avalie o bioensaio e preencha a tabela abaixo

Avaliação 7 dias após a aplicação dos tratamentos

Número Inicial de Insetos

Tratamentos

Número de Insetos Mortos

Número de Insetos Esporulados

Mortalidade Total (%)

Mortalidade Confirmada (%)

Testemunha

M. anisopliae

ESALQ-1037

B. bassiana

PL63

Mortalidade total =

Número de insetos mortos x 100

Número inicial de insetos

Mortalidade Confirmada =

Número de insetos esporulados x 100

Número inicial de insetos

Qual fungo você indicaria para realizar o controle da broca-da-cana-de-açúcar? Justifique a sua escolha.

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Referência Bibliográfica:

ALVES, S.B. (Ed.) Controle Microbiano de insetos. Piracicaba: Fealq, 1998. 1163p.

LEITE, L.G. (Ed.). Produção de Fungos Entomopatogênicos. Ribeirão Preto: A.S. Pinto, 2003. 92p.

Esquemas:

Samson, R.A.; E.S. Hoekstra; C.A.N. van Oorschot. Introduction to food-borne fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands. 1984.

COPERSUCAR. Guia prático ilustrado para identificação e controle de contaminantes em insetários. 1987. (Boletim Técnico Edição Especial)

Fotos:

Macroconídios de Fusarium spp. www.med.univ-angers.fr/GEIHP/Images/Fusarium.jpg. Acesso em: 15/09/2009

Rhizopus spp. John H. Wahlert, J.H.; Holland, M.J. General Biology II - Laboratory Notes for BIO 1003, New York, 1999. Disponível em:http://faculty.baruch.cuny.edu/jwahlert/bio1003/index.html. Acesso em: 15/09/2009

Demais fotos Banco de fotos do Laboratório de Patologia e Controle Microbiano de Insetos, Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura „Luiz de Queiroz‟ - ESALQ.

Material Didático de Autoria de:

Celeste Paola D’Alessandro, Daian Guilherme Pinto de Oliveira, Giuliano Pauli, Ítalo Delalibera Jr, Janayne Maria Rezende, Solange Aparecida Vieira de Barros.

FICA EXPRESSAMENTE PROIBIDA A REPRODUÇÃO DESTE NO TODO OU EM PARTE, SEM A DEVIDA AUTORIZAÇÃO DOS AUTORES.

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