INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

TESIS

Presentada para obtener el grado de

DOCTORA EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS

por

M. en C. Regina Hernndez Gama

ANALISIS DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA DE UN POZO DE

CHICONTEPEC Y LAS CONDICIONES EN LAS QUE E STA
FAVORECE LA EMULSIFICACION DE CRUDO

Dirigida por

Dr. Luis Gilberto Torres Bustillos

Dra. Norma Gabriela Rojas Avelizapa

Mxico, D.F., enero de 2014

 Resumen

Resumen
La extraccin mejorada del petrleo empleando microorganismos (MEOR) involucra el uso de
clulas completas o sus productos metablicos para favorecer la recuperacin de petrleo,
diferentes grupos microbianos pueden generar subproductos que favorecen la extraccin como,
cidos, solventes o surfactantes. La biomasa o clulas completas tambin pueden favorecer la
extraccin, en este trabajo se propone el uso de clulas microbianas provenientes del yacimiento
Chicontepec, para estabilizar emulsiones de petrleo y agua, dichas emulsiones pueden favorecer
el desplazamiento del crudo y por lo tanto la recuperacin del petrleo.

Inicialmente se analiz la diversidad microbiana a partir de una muestra de crudo y una de agua
congnita de la zona Coyotes en el yacimiento Chicontepec, para lo cual se construyeron
genotecas ribosomales. Adems, se realiz el enriquecimiento en diferentes medios de cultivo
para cuatro muestras de agua y crudo de pozos petroleros de Chicontepec y Samaria. Una vez
establecidos los cultivos, se evalu la hidrofobicidad de los mismos usando la tcnica MATH
modificada. Posteriormente se realizaron pruebas de emulsificacin de crudo y agua en sistemas
de 3 ml, evaluando la estabilidad de las emulsiones con respecto a la concentracin de clulas, la
relacin crudo/agua y la salinidad. Finalmente se evalu la estabilidad de emulsiones usando
reologa oscilatoria y se determin el efecto de las clulas y la salinidad en sistemas de emulsin
de 500 ml.

Como resultados se encontraron en las muestras de crudo y agua congnita las siguientes
especies: Mesotoga prima, Geotoga petraea y Sphaerochaeta globosa. Tambin se encontraron
integrantes de los gneros: Marinobacterium, Rhodovulum, Mesorhizobium; y se encontraron
secuencias relacionadas con los gneros: Marinobacter, Thermovirga, Geoalkalibacter,
Calditerrivibrio, Moorella, Prolixibacter, Owenweeksia y Sphaerochaeta. Las secuencias de ambas
genotecas se relacionaron con secuencias reportadas de microorganismos provenientes de
yacimientos petroleros o de ambientes relacionados como sedimentos marinos, fosas
hidrotermales o ambientes contaminados con petrleo. Se identificaron microorganismos con
metabolismos propios de yacimientos petroleros como fermentativos, reductores de nitrato,
reductores de hierro, as como degradadores de hidrocarburos.

Adems, se obtuvieron cuatro cultivos fermentativos nombrados como A, B, C y D. Los cultivos A,

B y D tuvieron una hidrofobicidad alta, mientras que el cultivo C present una hidrofobicidad de
intermedia a alta. A pesar de ello los cultivos A, C y D tuvieron efecto en la estabilidad de
emulsiones en sistemas de 3 ml. Las condiciones en las que se favoreci la emulsificacin fueron

i
 Resumen

una relacin crudo/agua de 0.5, una concentracin celular de 0.1 DO a 600nm, mientras que la
salinidad entre 0.1% y 3% no tuvo efecto significativo en la estabilidad de emulsiones.

El cultivo A se seleccion para realizar las pruebas de emulsificacin en sistemas de 500 ml por su
rpido crecimiento y se identific con base a su secuencia 16S rRNA como Thermoanaerobacter
mathranii. Las emulsiones en sistemas de 500 ml se formaron con el aceite ligero AF392 y tuvieron
una alta viscosidad, se produjo un aumento en la tensin superficial con respecto al crudo, sin
embargo, la adicin de clulas disminuy la tensin superficial en las emulsiones. La reologa de
las emulsiones mostr que se trata de sistemas reofluidizantes que disminuyen su viscosidad al
aplicar esfuerzo y su estabilidad depende de la frecuencia aplicada. Son emulsiones muy estables
a bajas frecuencias y conforme aumenta la frecuencia se vuelven inestables. No hubo efecto de
las clulas sobre las caractersticas reolgicas, pero la salinidad de 3% s favoreci la estabilidad
con respecto a las emulsiones preparadas con regulador al 1% de NaCl.

ii
 Abstract

Abstract
Microbial enhanced oil recovery (MEOR) involves the use of cells or their metabolic products to
favor oil recovery, different microbial groups can generate byproducts that enhance oil recovery as
acids, solvents or surfactants. Biomass or cells also can enhance the extraction, in this work, we
propose the use of microbial cells from Chicontepec oilfield, to stabilize emulsions of oil and water,
such emulsions can favor displacing of crude oil and thereby enhance the oil recovery.

Initially we explored microbial diversity in oil and associated water samples from Coyotes zone in
Chicontepec oil reservoir, for which we constructed ribosomal libraries. Besides enrichment culture
was performed with different culture media for four samples of water and crude oil from different
wells of Chicontepec and Samaria oil fields. Once the cultures were established, their
hydrophobicity was evaluated using the modified MATH test. Later, emulsification of crude and
water was tested in 3 ml systems, respect to the cell concentration, the oil/water ratio and salinity.
Finally the stability of emulsions in 500 ml systems was assessed using oscillatory rheology and the
effect of salinity and cell concentration was determined.

As results were found in samples of oil and formation water the following species: Mesotoga prima,
Geotoga petraea and Sphaerochaeta globosa. Also were found members of the genera:
Marinobacterium, Rhodovulum, Mesorhizobium, and sequences related to genera Marinobacter,
Thermovirga, Geoalkalibacter, Calditerrivibrio, Moorella, Prolixibacter, Owenweeksia and
Sphaerochaeta. The sequences of both libraries were related to reported sequences of
microorganisms from oil fields or related environments as marine sediments, hydrothermal vents or
oil-contamined environments. Metabolisms of identified microorganisms were related to oilfields as
fermentative, nitrate-reducing, iron-reducing and hydrocarbon degraders.

Furthermore, four fermentative cultures were obtained and designated as A, B, C and D. Cultures
A, B and D were highly hydrophobic, and culture C showed an intermediate to high hydrophobicity.
However cultures A, C and D had an effect on the stability of emulsions in 3 ml systems. Conditions
under which the emulsification was favored were 0.5 oil/water ratio, a cell concentration of 0.1 OD
at 600 nm, while salinity from 0.1% to 3% apparently had no effect on the stability of emulsions.

Culture A was selected for testing 500 ml emulsification systems for its rapid growth and was
identified based on their 16S rRNA sequence as Thermoanaerobacter mathranii. The emulsions in
500 ml systems were formed with light oil AF392 and had a high viscosity, there was an increase in
the surface tension of emulsions relative to the oil, however the addition of cells decreased the
surface tension in the emulsions. The rheology of the emulsions showed that were rheofluidizing
iii
 Abstract

systems which reduce its viscosity by applying strain. Emulsions are very stable at low frequencies
and with increasing frequency become unstable. There was no effect of the cells on the rheological
characteristics, but the salinity of 3% favored stability regarding emulsions prepared with buffer at
1% NaCl.

iv
 Productos derivados de esta tesis

Productos derivados de esta tesis

Artculo:

Hernndez-Gama, R.; Muoz-Colunga, A.; Hernndez-Mendoza, E.; Torres, L.; y Rojas-Avelizapa,

N. 2013. Identification of Carbon Dioxide-Producing Microorganisms Originating from Mexican Oil
Wells with Potential Application in Oil Recovery. Journal of Petroleum Science Research (JPSR).
2013. Volumen 2, Issue 1, 1-13.

Captulo de libro:

Rojas-Avelizapa, N.; Hernndez-Gama, R; Torres, L.G. New approaches to microbial enhanced oil
recovery MEOR. En: Torres, L.G. y Garca-Pea, I. BIOTECHNOLOGY: Health, food, energy and
environment applications. 2013. Nova Publishers, ISBN: 978-1-62081-071-2.

Exposicin oral en congreso con resumen publicado in extenso:

HernndezGama, R.; Muoz Colunga, A.M.; RojasAvelizapa, N.G. y Torres, L.G. 2013.
Estabilidad de emulsiones de petrleo en agua favorecida por un cultivo microbiano fermentativo.
VII Congreso de la Red Latinoamericana de Ciencias Ambientales. San Carlos, Costa Rica. 11-15
de Noviembre. (En prensa).

Carteles en congresos:

Hernndez-Gama, R.; Hernndez-Mendoza, E.; Martinez-de la Paz, R.; Muoz-Colunga, A.; Rojas-
Avelizapa, N. 2011. Identification of oil reservoir occurring bacteria and its ability to produce carbon
dioxide. American Genetic Asociation 2011 Symposium; Genomics and Biodiversity. Guanajuato,
Mxico. 23-26 de Julio.

Hernndez-Gama, R.; Hernndez-Mendoza, E.; Martinez-de la Paz, R.; Muoz-Colunga, A.; Rojas-
Avelizapa, N. 2011. Identification of carbon dioxide producing microorganisms with potential
application in oil recovery. XIV congreso nacional de biotecnologa y bioingeniera. Quertaro,
Mxico. 19-24 junio.

Hernndez Gama, R.; Rojas Avelizapa, N.; Torres Bustillos, L. 2010. Anlisis de la diversidad
microbiana de un pozo de alta temperatura en Chicontepec. Microbial Biodiversity Symposium
2010. Morelos, Mxico. 14-15 octubre.

v
 Agradecimientos

Agradecimientos

Agradezco profundamente al Dr. Luis Torres por su paciente gua y todas las
consideraciones que ha tenido conmigo durante el desarrollo de este trabajo.

A la Dra. Norma Rojas por su gran enseanza de vida a lo largo de mi estancia en el

CICATA-Quertaro.

A los integrantes de mi comit tutorial por sus valiosas aportaciones y en especial a la Dra.
Ins Garca y el Dr. Agustn Badillo quienes adems me brindaron su profesional y
generosa ayuda en el desarrollo experimental de este trabajo.

A la M. Ana Muoz, por el apoyo econmico y por su apoyo para conseguir las muestras.

A mis alumnas Priscila y Ronna por su colaboracin en la parte experimental.

A las personas que me aman y me brindan luz en la cotidianidad de mi vida.

vi
 Contenido

Contenido
Resumen i
Abstract iii
Productos derivados de esta tesis v
Agradecimientos vi
Contenido vii
ndice de figuras ix
ndice de cuadros x
I. INTRODUCCIN 1
1.1 Antecedentes 1
1.2 Justificacin 16
1.3 Objetivos 17
II. MATERIALES Y MTODOS 18
2.1 Muestreo 18
2.2 Extraccin de ADN a partir de muestras de aceite 19
2.3 PCR-DGGE del gen 16S ribosomal 20
2.4 Construccin de genotecas ribosomales y seleccin de clonas 21
2.5 Secuenciacin y anlisis filogentico 22
2.6 Cultivo microbiano 23
2.7 Evaluacin de la cintica de crecimiento 24
2.8 Determinacin de la adherencia microbiana a hidrocarburos 24
2.9 Estabilidad de emulsiones 25
2.10 Caracterizacin reolgica de emulsiones 27
2.11 Identificacin del cultivo seleccionado 28
III. RESULTADOS 29
3.1 Extraccin de ADN a partir de muestras de aceite 29
3.2 PCR-DGGE de las muestras AC272 y CC332 29
3.3 Genotecas ribosomales 31
3.4 Cultivo de microorganismos 42
3.5 Cintica de crecimiento 44
3.6 Hidrofobicidad de los cultivos fermentativos 46

vii
 Contenido

3.7 Estabilizacin de emulsiones por suspensiones bacterianas 49

3.8 Propiedades reolgicas de las emulsiones de aceite y agua 56
3.9 Identificacin del cultivo seleccionado 66
IV. DISCUSIN 68
4.1 Diversidad microbiana en agua congnita y crudo de Coyotes, Chicontepec 68
4.2 Cultivos fermentativos provenientes de yacimientos mexicanos 72
4.3 Efecto de las clulas en la estabilidad de emulsiones de crudo y agua 74
4.4 Propiedades reolgicas de las emulsiones 76
V. CONCLUSIONES 79
VI. BIBLIOGRAFA 80
VII. APNDICE 89
7.1 Medios de cultivo 89

viii
 ndice de figuras

ndice de figuras
Figura 1. Esquema representativo de la extraccin secundaria de crudo. .........................................................3
Figura 2. Distribucin de las pruebas MEOR a nivel mundial..............................................................................5
Figura 3. Mapa de los yacimientos y zonas de muestreo. ............................................................................... 18
Figura 4. DGGE de las muestras de agua congnita y crudo de la zona Coyotes. ............................................ 30
Figura 5. Curvas de saturacin de perfiles de restriccin. ............................................................................... 32
Figura 6. rbol filogentico de las clonas de la muestra de crudo 332.. ......................................................... 34
Figura 7. rbol filogentico de las clonas de la muestra de agua congnita AC272. ....................................... 37
Figura 8. rbol filogentico de las clonas 55 y 77 de la muestra de agua AC272. . ......................................... 38
Figura 9. rbol filogentico de la clona 20 de la muestra AC272. ................................................................... 39
Figura 10. Distribucin de clonas en la genoteca de la muestra de crudo. ..................................................... 40
Figura 11. Distribucin de las clonas para la genoteca construida a partir de la muestra de agua congnita. 41
Figura 12. Tincin de Gram de los cultivos fermentativos. .............................................................................. 43
Figura 13. Cultivos fermentativos en sistemas anaerobios.............................................................................. 44
Figura 14. Cintica de crecimiento de los cultivos fermentativos. .................................................................. 45
Figura 15. Porcentaje de hidrofobicidad cultivo A. .......................................................................................... 47
Figura 16. Porcentaje de hidrofobicidad cultivo B. .......................................................................................... 48
Figura 17. Porcentaje de hidrofobicidad cultivo C. .......................................................................................... 48
Figura 18. Porcentaje de hidrofobicidad cultivo D. .......................................................................................... 49
Figura 19. Estabilidad de emulsiones con el cultivo A, B, C y D con crudo AF392. .......................................... 51
Figura 20. Estabilidad de emulsiones empleando los cultivos A y C y crudo CC154. ....................................... 52
Figura 21. Estabilidad de emulsiones con los cultivos A y C y crudo PA. ......................................................... 53
Figura 22. Estabilidad de emulsiones con el cultivo A y B con el aceite de la zona Samaria. .......................... 54
Figura 23. Tensin superficial de emulsiones, crudos y reguladores. .............................................................. 57
Figura 31. Barrido de frecuencia para las emulsiones 3 y 4. ............................................................................ 64
Figura 33. rbol filogentico del cultivo A ....................................................................................................... 67

ix
 ndice de cuadros

ndice de cuadros

Cuadro 1.Tecnologas de extraccin terciaria de petrleo. ................................................................................4

Cuadro 2. Condiciones de yacimiento limitantes para la aplicacin de tecnologas MEOR ...............................6
Cuadro 3. Origen de muestras de aceite empleadas para el cultivo de microorganismos .............................. 18
Cuadro 4. Soluciones desnaturalizantes para la preparacin del DGGE. ......................................................... 21
Cuadro 5. Parmetros y niveles de prueba de estabilidad de emulsiones. ..................................................... 25
Cuadro 6. Nivel de estabilidad de emulsiones. ................................................................................................ 26
Cuadro 7. Caractersticas generales de los aceites empleados en las emulsiones. ......................................... 26
Cuadro 8. Posicionamiento taxonmico de las clonas de las libreras ribosomales. ....................................... 33
Cuadro 9. Obtencin de organismos cultivables. ............................................................................................. 43
Cuadro 10. Anlisis de varianza para la estabilidad de emulsiones. ................................................................ 55
Cuadro 11. Valores que se dedujeron a partir de la de la ley de la potencia.................................................. 60

x
 Introduccin

I. INTRODUCCIN

1.1 Antecedentes

1.1.1 Extraccin mejorada del petrleo empleando microorganismos

El petrleo o aceite de roca, por el origen del vocablo en latn, es una mezcla compleja de
hidrocarburos, compuestos orgnicos y un importante nmero de componentes metlicos.
Se encuentra en el subsuelo y en muchas ocasiones se ha acumulado en formaciones
geolgicas permitiendo su extraccin (Covantes, 1988). El petrleo vara ampliamente en
su composicin y propiedades fsicas dependiendo del yacimiento del que se extrae, sin
embargo, algunos compuestos se encuentran en altas concentraciones y ampliamente
distribuidos en los yacimientos como hidrocarburos y cidos grasos (acetato, formiato,
propionato, butirato y benzoato) (Van Hamme et al. 2003; Ollivier y Alazard, 2010).

Actualmente se considera que el petrleo tuvo su origen en la descomposicin de grandes

cantidades de materia orgnica, aunque se tienen dos teoras sobre la formacin del
petrleo, la primera sugiere un origen abiognico en el cual reacciones geoqumicas entre
la materia orgnica, agua, CO2, carbonatos, y metales dio origen al petrleo. La segunda
teora del origen biognico es generalmente ms aceptada y en ella se propone que la
modificacin biolgica y geoqumica de enormes cantidades de materia orgnica, durante
millones de aos, acompaada de altas temperaturas y altas presiones dieron origen al
petrleo tal como lo conocemos ahora (Tsatskin y Balaban, 2008).

Aunque la mayora de los yacimientos se formaron en un periodo mayor a 2.5 millones de

aos, se han extrado hidrocarburos de sedimentos marinos con una antigedad de
apenas 10 mil aos. Similar al proceso biognico, se ha observado que a partir de la
descomposicin anaerobia de organismos planctnicos en sedimentos marinos se genera
un lodo oscuro llamado sapropel, considerado el precursor del petrleo, se propone que
reacciones complejas posteriores generan cidos grasos, seguido de escisin,
condensacin, ciclacin y deshidratacin para dar lugar a la formacin de hidrocarburos.
Se considera que las arcillas juegan un papel fundamental en este tipo de reacciones al
adsorber molculas que pueden funcionar como catalizadores (Covantes, 1988). El origen
y naturaleza del crudo se han estudiado con diferentes enfoques, pero principalmente con
un enfoque hacia la exploracin y explotacin de yacimientos (Esquivel, 2009).

1
 Introduccin

Durante el siglo XX se produjo una revolucin en el uso de combustibles, pasando de los

generados por reciente fijacin de carbono (aceites animales y carbn vegetal) al uso
extensivo de combustibles fsiles (carbn mineral, petrleo y gas). Actualmente, el
petrleo es la materia prima de una gran diversidad de productos que definen a la
industria en su contexto general, por lo que el desarrollo industrial global est
estrechamente relacionado con el consumo de petrleo. Slo por nombrar algunos de los
derivados de petrleo encontramos medicamentos, plsticos, tintas, fertilizantes,
plaguicidas, textiles, entre otros (Tsatskin y Balaban, 2008). De este modo, a medida que
se tiene un crecimiento industrial y econmico tambin hay un incremento en los
requerimientos energticos, especialmente de petrleo. Las economas emergentes como
China e India presentan un crecimiento exponencial en la demanda de petrleo, y, aunque
otras economas no presentan esta tendencia, la demanda global del producto va en
aumento, mientras que la produccin de algunos de los yacimientos ms importantes es
constante o incluso disminuye (Relman, 2010).

A partir de la crisis petrolera de la dcada de 1970, se impuls la bsqueda y explotacin

de nuevas reservas petroleras, dando excelentes resultados como el hallazgo de la
reserva Cantarell en Mxico, reserva que se ha explotado desde 1979 y hasta el momento
contina siendo la reserva ms importante del pas y una de las ms importantes a nivel
mundial. No obstante, a partir de 2005 se reconoci el decaimiento en la produccin de
Cantarell y rpidamente descendi de ser el segundo yacimiento productor a nivel
mundial al quinto productor; con ello se reactiv la necesidad de encontrar nuevas
reservas o bien, implementar mejores tecnologas de extraccin de aceite (Relman, 2010;
CNH, 2010).

De forma tradicional en la explotacin de yacimientos petroleros se realiza una extraccin

primaria, en la cual las condiciones naturales del yacimiento (presin y temperatura)
permiten la recuperacin del aceite sin aplicacin de energa. Posteriormente, cuando las
condiciones del pozo llevan al decaimiento en la produccin se inicia la extraccin
secundaria con procesos como el bombeo hidroneumtico con el cual se consigue
extraer una mayor cantidad de aceite. Hasta este punto las tecnologas de extraccin son
econmicas y las ms de las veces rentables, sin embargo, cuando el uso de tecnologas
secundarias ya no es econmicamente rentable, se pueden emplear tecnologas de
extraccin terciaria tambin conocidas como extraccin mejorada del petrleo o EOR por
sus siglas en Ingls (Enhanced Oil Recovery) (Babadagli, 2006).

2
 Introduccin

Figura 1. Esquema representativo de la extraccin secundaria de crudo.

Se considera que las tecnologas convencionales de extraccin de aceite, permiten

recuperar entre un tercio y la mitad del aceite presente en un yacimiento. Por lo anterior
se estima que la cantidad de aceite remanente en los yacimientos es mucho mayor a las
reservas que pudieran ser encontradas y en ello radica la importancia de emplear nuevas
tecnologas para el aprovechamiento del recurso (Volk y Liu, 2010).

Las tecnologas de extraccin terciaria son variadas, en la Cuadro 1 se indican algunas de

ellas, en particular a las que emplean microorganismos se le conoce como MEOR
(Microbial Enhanced Oil Recovery). La historia de las tecnologas MEOR comenz en
1926 cuando se propuso que las bacterias y sus metabolitos podran ayudar a la
liberacin y transporte de petrleo en las formaciones geolgicas (Beckmann, 1926). Sin
embargo, fue hasta 1947 cuando se propusieron los mecanismos microbianos que
contibuan a la extraccin de aceite como; la disolucin de carbonatos inorgnicos, la
disminucin de la viscosidad del aceite por gases miscibles, la produccin de surfactantes
o agentes modificadores de la mojabilidad y la adhesin de las clulas a la roca (Zo Bell,
1947). Fue hasta 1954 cuando se realiz la primera prueba de campo de tecnologas
MEOR en el campo Lisbon en Arkansas, Estados Unidos (Lazar et al. 2007).

Ms tarde, en los aos 60s y 70s se realizaron diversas pruebas en campo en

Checoslovaquia, Hungra y Polonia, dichas pruebas consistieron en la inyeccin de
bacterias anaerobias facultativas como Clostridium, Bacillus, Pseudomonas,

3
 Introduccin

Arthrobacterium, Micrococcus, Peptococcus, Mycobacterium, entre otras. Las bacterias

fueron seleccionadas por su capacidad para generar importantes cantidades de gases,
cidos, solventes, polmeros, surfactantes y biomasa (Lazar et al. 2007). En aos
posteriores se hicieron importantes esfuerzos en la produccin de biopolmeros como
xantana o escleroglucanos como agentes viscosificantes para procesos EOR (Hitzman,
1988).

En trabajos ms recientes se han considerado a los organismos autctonos como los

principales efectores de actividades que conduzcan al mejoramiento en la extraccin de
petrleo (Volk y Liu, 2010). El uso de la tecnologa MEOR se ha considerado con un
creciente inters en la industria del petrleo, debido a las ventajas que presenta con
respecto a otros procesos de extraccin terciara, por ejemplo: los componentes activos
pueden generarse in situ; los nutrientes usados para promover el crecimiento microbiano
(melazas, peptonas) son econmicos y los nutrientes e inculos se pueden inyectar
empleando las instalaciones construidas para la extraccin secundaria (Jang et al. 1983).

Cuadro 1.Tecnologas de extraccin terciaria de petrleo. Modificado de Sen, 2008.

Extraccin mejorada del petrleo Trmica Inundacin con vapor

Combustin in situ
Agua caliente
Qumica Polmeros
Surfactantes
lcalis o cidos
Solventes
Inyeccin de gas Gases miscibles CO2 y CH4
Gases inmiscibles N2
Gases de combustin
Biotecnolgica Biomasa
Biosurfactantes
Biopolmeros
Solventes
cidos
Gases (CO2 y CH4)

Hasta el momento la mayora de las pruebas realizadas en yacimiento con las tecnologas
MEOR han resultado en un incremento en la extraccin de crudo. En diferentes pases se

4
 Introduccin

han realizado pruebas de alternativas MEOR, en la Figura 2 se observa un mapa mundial

donde se sealan los lugares donde se han realizado dichas pruebas, por medio de
crculos con tamao proporcional al nmero de pruebas realizadas en campo. Es notable
que stas se han realizado ms intensamente en China y Estados Unidos, aunque en
otros pases tambin se han probado con buenos resultados bajo diferentes condiciones
de yacimiento y tipo de crudo (Volk y Liu, 2010).

Existen mltiples subproductos microbianos tiles en la extraccin mejorada del crudo,

dependiendo de la naturaleza del yacimiento pueden proponerse diferentes estrategias: a)
adicin de biomasa, la cual puede modificar la mojabilidad de la roca, alterar la viscosidad
o degradar selectivamente los componentes del petrleo; b) los biosurfactantes pueden
favorecer la emulsificacin y disminuir la tensin superficial; c) los polmeros modifican la
viscosidad permitiendo un desplazamiento selectivo; d) los solventes y cidos pueden
modificar la permeabilidad por disolucin de la roca o bien pueden reducir la viscosidad
del crudo; e) finalmente los gases pueden incrementar la presin o permear en el crudo y
reducir su viscosidad (Sen, 2008).

Figura 2. Distribucin de las pruebas MEOR a nivel mundial. Tomado de Volk y Liu, 2010.

La tecnologa MEOR tiene mltiples ventajas econmicas y tecnolgicas, sin embargo, no

puede emplearse en cualquier yacimiento. Algunas de las limitaciones de MEOR son en

5
 Introduccin

primer lugar las condiciones que impiden el crecimiento microbiana; como la temperatura
del yacimiento, el pH y la salinidad. Algunas condiciones que limitan el crecimiento
microbiano pueden modificarse mediante la inyeccin de agua, cambiando el pH, la
salinidad e incluso la temperatura y con ello incrementando las posibilidades de xito de la
aplicacin (Premuzic y Lin, 1991). El cuadro 2 lista una serie de parmetros y los lmites
propuestos para el xito de las aplicaciones MEOR.

Cuadro 2. Condiciones de yacimiento limitantes para la aplicacin de tecnologas MEOR

Parmetro Lmite para MEOR (NIPER)

Salinidad < 10% NaCl
Temperatura < 75C
pH 4 -9
Profundidad < 2500 m
Elementos traza < 15-15 mg/L (As, Hg, Ni, etc.)
Permeabilidad >50 mD
Porosidad > 3%
3
Densidad < 0.9659 g/cm
Tipo de aceite >15 API
2
rea de pozo < 0.16 Km

Adems otras caractersticas pueden limitar la aplicacin de MEOR, como la porosidad, la

permeabilidad, la profundidad, y la extensin del yacimiento que condicionan la eficiente
movilidad del aceite y de los microorganismos o sus bioproductos (Volk y Liu, 2010). Por
ello, es determinante tener un amplio conocimiento del yacimiento donde se pretenden
aplicar las tecnologas MEOR, para incrementar las posibilidades de xito.

1.1.2 Yacimiento Chicontepec

El paleocanal de Chicontepec se localiza en el este de Mxico, en la cuenca geolgica
Tampico-Misantla, al poniente de la plataforma de Tuxpan (Faja de Oro) y cubre un rea
de cerca de 3 800 kilmetros cuadrados. El yacimiento se origin de sedimentos del
jursico inferior, medio e incluso cretcico hace 100 a 200 millones de aos. Fue

6
 Introduccin

identificado en 1926 y hasta 1952 se inici la explotacin de hidrocarburos en el rea

Presidente Alemn. Econmicamente se ubica en la regin productora norte como un
activo integral denominado aceite terciario del golfo en donde se extrae aceite y gas
(CNH, 2010).

La reserva es de gran relevancia, ya que probablemente representa el 39% de la reserva

total de hidrocarburos del pas, es decir, cerca de 17.7 miles de millones de barriles de
aceite (CNH, 2010). Convertir al yacimiento en una cuenca que pueda producir entre 550
mil a 700 mil barriles diarios hacia el 2017 es un objetivo ambicioso de PEMEX que
requerir del desarrollo y administracin de tecnologas especializadas que incrementen
significativamente la productividad por pozo y permitan reducir los costos al mnimo
(Esquivel, 2009).

Algunas caractersticas del yacimiento Chicontepec incluyen una porosidad mxima de

14%, con permeabilidades entre 0.1 y 100 mD, con profundidades de entre 800 y 2400 m
y aceite entre 18 y 45 API. Es un sistema heterogneo con zonas geolgicas de
mojabilidad mixta. Principalmente la permeabilidad y heterogeneidad de la roca conduce a
una productividad reducida, cuyo costo de produccin es mucho mayor que los grandes
yacimientos del sureste del pas (CNH, 2010).

Segn el reporte de PEMEX PEP en 2010, el proyecto aceite terciario del golfo tuvo un
cumplimiento de 38% con respecto al pronstico costo-beneficio para el ao 2009, por lo
que se tomaron decisiones de modificar el proyecto aceite terciario tal y como se haba
propuesto en 2006 (CNH, 2010).

Algunas de las principales limitaciones geolgicas del yacimiento Chicontepec para la

extraccin de aceite son la baja permeabilidad y la mojabilidad mixta de las rocas, ya que
se dificulta el paso de agua a travs de la roca y el desplazamiento del aceite. Una de las
tecnologas de extraccin terciaria que se ha aplicado con xito en Chicontepec es
fractura hidralica, las compaas Shulenberger, Halliburton y Weatherford realizaron
estos proyectos que consisten en la aplicacin de explosivos y una inyeccin posterior de
soluciones altamente viscosas de polmeros como poliacrilamida, para realizar el
desplazamiento del aceite (Ballinas, 2012; Garca, et al., 2004; Garca, 2012) Tambin se
aplic una tecnologa MEOR (confidencial) por la compaa Tecpetrol, los resultados
obtenidos de la aplicacin MEOR fueron exitosos y facilitarn la aplicacin posterior de
estas tecnologas en Chicontepec (PEMEX, 2013).

7
 Introduccin

1.1.3 Diversidad microbiana de los yacimientos de petrleo

En los yacimientos de petrleo y especficamente en la roca del subsuelo se crea un
ambiente nico, donde las condiciones de vida son restrictivas por lo que este entorno
ofrece nichos ecolgicos que pueden ser ocupados exclusivamente por organismos
procariotes. Condiciones extremas de temperatura, pH, salinidad y presin sumadas a la
abundancia de fuentes de carbono de difcil asimilacin, sugieren que la mayora de los
microorganismos estn inactivos, presentan una actividad metablica baja, o bien, tienen
un metabolismo dependiente de la estructura de la comunidad microbiana (Head et al.
2003).

Desde 1926 se han descrito organismos cultivables de yacimientos, sin embargo, en aos
recientes se ha hecho una descripcin detallada de la biodiversidad, particularmente con
el uso de tcnicas moleculares, con las cuales se ha detectado un mayor nmero de
especies al interior de los yacimientos petroleros. Previamente, se han aislado diferentes
microorganismos de los pozos de petrleo, y se han descrito por su metabolismo como:
fermentadores, metangenos, reductores de sulfato, reductores de nitrato, reductores de
hierro, e incluso se han encontrado algunos organismos aerobios (Magot et al. 2000).

Los microorganismos fermentativos son los ms ampliamente distribuidos en ambientes

de yacimiento, se pueden encontrar en un intervalo de temperaturas y salinidad extensa.
Generan un importante nmero de subproductos del metabolismo que pueden contribuir a
la extraccin del petrleo, por ejemplo en la fermentacin de glucosa por
Thermoanaerobacter brockii un organismo autctono de yacimientos se generan como
productos lactato, acetato, etanol, dixido de carbono e hidrgeno (Lamed y Zeikus, 1980)
como se muestra en la reaccin:

C6H12O6 CH3CH(OH)COOH + CH3COOH + CH3CH2OH + CO2 + H2

Al parecer, los organismos organtrofos anaerobios se distribuyen ampliamente en

yacimientos petroleros y son considerados organismos autctonos (Bonch-Osmolovskaya
et al. 2003). Los gneros Thermoanaerobacter, Thermotoga, Petrotoga y Thermococcus
han sido aislados con frecuencia y pueden ser indicadores de la supervivencia de
organismos autctonos (Dahle et al. 2008; Magot et al. 2000). Especficamente en
Chicontepec se han encontrado bacterias fermentativas de los gneros: Thermotoga,

8
 Introduccin

Thermoanaerobacter y Caldanaerobacter (Castorena et al., 2012; Hernndez-Gama et al.

2013).

El metabolismo fermentativo en los yacimientos genera compuestos orgnicos que

pueden ser empleados por otros grupos metablicos como los metangenos y
sulfatorreductores. Las potenciales aplicaciones de microorganismos fermentativos en
MEOR son amplias e incluyen el uso de biomasa, dada su adaptacin a estos ambientes,
as como bioproductos incluidos los gases, solventes, cidos orgnicos y biosurfactantes
(Belyaev et al.2004)

Los microorganismos metangenos constituyen uno de los grupos microbianos ms

importantes en yacimientos, se estima que la mayor parte del metano que se encuentra
en yacimientos es de origen biolgico y puede producirse a profundidades de hasta 3350
m (Jeanthon et al., 2005). Los metangenos pertenecen al dominio Archaea, son
anaerobios estrictos y utilizan el CO2 como nica fuente de carbono a travs de una ruta
que involucra a la acetil-coA sintetasa en cuya ruta anablica se forman triosas que
posteriormente se unen formando hexosas. El CO2 o acetato funcionan como aceptores
finales de electrones y son reducidos usando al H2 producido por organismos
fermentadores:

CO2 + H2 CH4 + H2O

Los metangenos tienen una distribucin amplia en el planeta en ambientes libres de

oxgeno, algunos ejemplos incluyen Methanomicrobium, Methanosaeta, Methanococcus y
Methanolobus. Los metangenos son tiles en la recuperacin mejorada de hidrocarburos
pues el metano es un gas miscible en aceite y se emplea en la represurizacin de los
yacimientos (Sen, 2008).

Pocas veces se consigue cultivar arqueas provenientes de yacimiento, ya sea por sus
requerimientos de nutrientes o debido a la manipulacin de las muestras de aceite y agua
congnita, pero el uso de metodologas basadas en el ADN han permitido su deteccin en
diferentes yacimientos. Watanabe y colaboradores en 2002 encontraron mediante la
construccin de genotecas ribosomales a: Methanosaeta hollandica, adems de
miembros de la familia Methanomicrobiaceae y Methanomethylovorans; el estudio
tambin mostr que las clulas de arqueas representaban ms del 10% del recuento
microbiano total (Watanabe et al. 2002). Las potenciales aplicaciones de arqueas en

9
 Introduccin

procesos MEOR son prometedoras, porque contienen lpidos de membrana nicos, que
son una excelente fuente para la formacin de liposomas con notable estabilidad trmica
y que podran tener un efecto favorable en la movilizacin de aceite (Schiraldi et al. 2002).

Un grupo microbiano frecuentemente encontrado en yacimientos, son las bacterias

reductoras del sulfato, que utilizan este compuesto como aceptor final de electrones y
generan como producto H2S. Dicha reduccin est acoplada con la oxidacin de cidos
grasos de cadena corta como: acetato, lactato y piruvato. Existe un importante nmero de
bacterias termfilas, algunos gneros frecuentes en yacimientos son:
Thermodesulfobacterium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfococcus,
Desulfosarcina y Desulfobacterium. El metabolismo reductor de sulfato es indeseable en
yacimiento pues genera H2S que conduce al amargamiento del aceite y gas (se considera
amargamiento a concentraciones mayores a 50 ppm), con consecuencias de toxicidad y
corrosin, que ocasionan grandes prdidas a la industria del petrleo (Pavissich et al.
2010). La reaccin general de la reduccin del sulfato se muestra a continuacin:

CH3COOH + SO4 + H+ CO2 + H2S + H2O

Por los efectos negativos que tiene este grupo microbiano se han desarrollado mtodos
de deteccin rpida de bacterias reductoras de sulfato mediante microarreglos, con los
que pueden ubicarse de forma sensible y especfica algunas especies frecuentes en
yacimientos y de este modo proponer opciones de manejo para la industria del petrleo
(Bonch-Osmolovskaya, et al. 2003).

Los microorganismos reductores de nitrato utilizan al nitrato como aceptor final de

electrones y lo reducen hasta nitrgeno molecular, se emplean en la competencia
selectiva contra las bacterias reductoras de sulfato, al inyectar nitratos el metabolismo
reductor de nitrato se favorece sobre el de sulfato, en ausencia de oxgeno, fierro y
manganeso el nitrato es el aceptor de electrones ms oxidante. Adicionalmente las
bacterias reductoras de nitrato pueden favorecer la recuperacin de hidrocarburos
mediante la produccin de gases (CO2 y N2) (Sen, 2008).

El ltimo grupo comnmente reportado en yacimientos son las bacterias reductoras del
hierro, las cuales se encuentran con frecuencia en este ambiente y juegan un papel
fundamental en la solubilizacin del hierro en la naturaleza (Straub et al. 1999), la
reaccin de reduccin implica la adicin de un electrn al Fe3+ para producir Fe2+.

10
 Introduccin

A pesar de que los organismos mesfilos se reportan frecuentemente en los pozos con
altas temperaturas, se estima que muchos de ellos pudieron llegar al yacimiento por
operaciones de perforacin, por bombeo o por la inyeccin de agua de mar; y que no se
trata de organismos autctonos (Dahle et al. 2008; Li et al. 2006; Yamane et al. 2008;
Yoshida et al. 2005).

La diversidad microbiana es altamente dependiente de las condiciones dentro del

yacimiento, Grabowski y colaboradores (2005), describieron la diversidad microbiana en
agua congnita de un depsito de baja temperatura donde se encontr una gran variedad
de microorganismos anaerobios y aerobios debido a que se trata de pozos de perforacin
horizontal y se supone un aporte microbiano por los lodos de perforacin (Grabowski et al.
2005).

Existen descripciones de comunidades complejas al interior de yacimiento, Dahle y

colaboradores (2008) analizaron la diversidad microbiana en el agua de un pozo de alta
temperatura. Los grupos microbianos ms abundantes fueron: Firmicutes > Bacteroidetes
>Proteobacterias > Espiroquetas > Thermotogales. Mientras que las arqueas
encontradas fueron poco abundantes y pertenecientes a los gneros: Methanococcus,
Thermococcus y Methanolobus (Dahle et al. 2008)

Los estudios sobre la diversidad microbiana comnmente se limitan a la descripcin

taxonmica y slo en algunos trabajos se evalan los grupos microbianos desde sus
capacidades metablicas (Bonch-Osmolovskaya et al. 2003; Yamane et al. 2008). Es de
gran importancia conocer la comunidad microbiana y las interacciones ecolgicas al
interior del yacimiento, ya que a menudo se aplican tecnologas MEOR como la inyeccin
de medio de cultivo sin tener una imagen clara de las interacciones microbianas al interior
del pozo que no necesariamente conducirn al xito o al mejor rendimiento de los
tratamientos aplicados.

Adems de los productos metablicos generados por la comunidad microbiana que

integra el yacimiento, las clulas pueden por s mismas favorecer la extraccin de aceite,
ya que la biomasa puede adherirse a la superficie de la roca modificando su mojabilidad,
puede incrementar la viscosidad de los productos de inyeccin y tambin favorecer la
emulsificacin de aceite y agua permitiendo un mejor desplazamiento y extraccin del
crudo (Sen, 2008).

11
 Introduccin

1.1.4 Emulsificacin de aceite en yacimiento

A nivel de yacimiento el aceite se encuentra en interaccin con el agua subterrnea,
cuando se extrae el aceite crudo, ste se encuentra emulsionado con agua del subsuelo
tambin llamada agua congnita. Dicha emulsificacin se cree que facilita el
desprendimiento del aceite de la roca, e incrementa su recuperacin, sin embargo, la
posterior separacin de emulsiones es necesaria y representa altos costos a la industria
del petrleo (Titan Oil Recovery, 2010-2012).

Los agentes emulsionantes son numerosos y pueden ser surfactantes naturales como
asfaltenos, resinas, cidos naftnicos, cidos carboxlicos, entre otros componentes
naturales del petrleo. Algunos qumicos aadidos como surfactantes o humectantes
tambin pueden favorecer la emulsificacin. Tambin las partculas slidas finamente
divididas como arcillas o partculas de lodos de perforacin pueden formar emulsiones
muy estables (Nazar et al. 2011).

La estabilidad de las emulsiones depende de mltiples propiedades, existen algunos

factores que favorecen la estabilidad como una alta viscosidad en la fase dispersante que
disminuye la frecuencia de colisin de las gotas estabilizando la emulsin; otra propiedad
es el tamao de la gota, gotas menores a 10 m producen emulsiones ms estables; la
relacin de volumen de fases es determinante, pues al disminuir el volumen de la fase
dispersa disminuye el nmero de gotas, el rea interfacial y la probabilidad de colisin de
las gotas, dando como resultado una mayor estabilidad de las emulsiones (Marfisi y
Salager, 2004).

Existen otras propiedades que reducen la estabilidad de la emulsin, como son el pH y la

salinidad del agua congnita que alteran radicalmente la formacin de pelculas de
surfactantes naturales como los asfaltenos. Adems, el tipo de aceite determina la
formacin de emulsiones, los crudos con base parafnica usualmente no forman
emulsiones estables, mientras que los crudos naftnicos y aquellos que contienen ceras,
resinas, asfaltenos y otros slidos favorecen la estabilidad de la emulsin. En otras
palabras, el tipo de crudo determina la cantidad y tipo de emulsionantes naturales
(Langevin et al. 2004).

La temperatura es un factor complejo que aade energa a las emulsiones

proporcionando estabilidad, pero tambin disminuye la adsorcin de surfactantes

12
 Introduccin

naturales en las gotas dispersas y disminuye la viscosidad de la fase dispersante,

reduciendo la estabilidad de la emulsin (Marfisi y Salager, 2004).

Actualmente se emplean para la extraccin terciaria de petrleo las microemulsiones

generadas con surfactantes o solventes, este tipo de emulsiones disminuye la tensin
interfacial entre el aceite y la superficie agua-roca, mejorando el desplazamiento a nivel
de poro de la roca, adems tienen una alta viscosidad que mejora la eficiencia de barrido
en las zonas permeables. El costo de las emulsiones elaboradas con solventes,
surfactantes qumicos y biosurfactantes es alto por el precio alto de los surfactantes o de
los solventes, adems tanto el precio de los solventes como el de los surfactantes
qumicos dependen del precio del petrleo (Nazar et al. 2011).

1.1.5 Estabilidad de emulsiones de aceite y agua

Las emulsiones en general son sistemas termodinmicamente inestables por el aumento
en el rea de contacto interfacial. Un tipo especial de emulsiones que interesan a este
trabajo son las emulsiones Pickering, que son estabilizadas por partculas slidas las
cuales se adsorben en la interfase de la emulsin. Si se aaden partculas a un sistema
de dos fases, las partculas pueden establecerse en la interfase previniendo la
coalescencia de las gotas y ocasionando que la emulsin sea estable (Fennema, 1996).

Algunas propiedades de las partculas como la hidrofobicidad, la forma y tamao tienen

efecto en la estabilidad de la emulsin. El ngulo de contacto de la partcula a la superficie
de la gota es otra caracterstica importante y definida por la hidrofobicidad de la partcula.
Si el ngulo de contacto de la partcula con la interfase es bajo, la partcula ser ms
mojable por la gota y por lo tanto no prevendr la coalescencia de las gotas, cuando el
ngulo de contacto es cercano a 90, es decir las partculas son parcialmente
hidrofbicas, estabilizan eficientemente las emulsiones pues las partculas son mojables
en ambos lquidos y por lo tanto se establecen en la superficie de la gota. Sin embargo,
tambin se propone que las diferencias en el ngulo de contacto podran favorecer la
formacin de emulsiones de aceite en agua con ngulos menores a 90 y de agua en
aceite cuando el ngulo de contacto es mayor a 90 (Langevin et al. 2004).

13
 Introduccin

En este trabajo se propone la participacin de las bacterias como partculas que

favorecen la estabilizacin de emulsiones de crudo y agua. Adicionalmente el uso de
bacterias puede propiciar la formacin de emulsiones mediante la produccin de algunos
subproductos microbianos como biosurfactantes o emulsificantes (Dorobantu et al. 2004).

Las clulas bacterianas renen un conjunto de caractersticas que nos permite

considerarlas como partculas estabilizadoras de emulsiones, por ejemplo, se ha
observado que las partculas ms pequeas son aquellas que favorecen la estabilizacin
de emulsiones ms eficientemente (Torres et al. 2007), en este caso las clulas
bacterianas tienen un tamao pequeo con el cual se espera este efecto. Al respecto de
la hidrofobicidad, las clulas contienen en sus superficies cidos grasos y protenas de
pared que les proporcionan cierta hidrofobicidad con la cual pueden interactuar con la
fase de aceite y la fase de agua, una caracterstica relevante en la estabilizacin de
emulsiones (Van der Mei et al. 1995) Adems, en aplicaciones a nivel de yacimiento,
dependiendo de la permeabilidad de la roca, las clulas pueden dispersarse en el
yacimiento y a diferencia de otras partculas, pueden reproducirse en este ambiente
mucho despus de la inyeccin e incluso las clulas no viables conservan las propiedades
de superficie y con ello el efecto en la estabilizacin de emulsiones (Dorobantu et al.
2004).

Al interior del grupo de investigacin, previamente se han caracterizado emulsiones de

hexano en agua, comparando el efecto de diferentes partculas como arena, caolinita y
bentonita, se confirm el efecto del tamao de partcula sobre la estabilizacin de
emulsiones, se consiguieron emulsiones altamente estables con bentonita (2%), adems
se aadi CTAB (0.01%) y NaCl (0.28%) (Torres et al. 2007).

Posteriormente se analiz el desplazamiento de creosota desde un sistema poroso

saturado, donde se logr el desplazamiento de creosota haciendo pasar a travs del
sistema una emulsin Pickering empleando bentonita como partcula estabilizadora
(Torres et al. 2008). Lo anterior es un importante antecedente para las aplicaciones que
interesan al proyecto y que permiten suponer un desplazamiento de aceite desde la roca
al interior del pozo petrolero empleando emulsiones Pickering estabilizadas con
microorganismos.

14
 Introduccin

1.1.6 Evaluacin de la estabilidad de emulsiones con parmetros

reolgicos
Para mltiples aplicaciones industriales el uso de emulsiones estables es til, ya sea
porque aumentan la vida de anaquel de los productos, porque conservan consistencias
deseables o incluso la seguridad de los ingredientes. En el caso particular de las
emulsiones de aceite y agua la estabilidad de emulsiones permite tener una nocin del
comportamiento que tendrn a lo largo del tiempo (Mndez-Montealvo et al. 2001).

Una vez formadas las emulsiones hay diferentes procesos que pueden conducir a la
ruptura de las mismas, estos incluyen:

a) La cremacin o sedimentacin, en la cual la fase ms pesada se separa por

gravedad hacia el fondo del contenedor.
b) La floculacin que es causada por las fuerzas de atraccin de Van der Waals
cuando no hay suficiente repulsin entre las gotas de la fase dispersa.
c) Maduracin de Ostwald causada por la diferencia en solubilidad entre las gotas
grandes y pequeas de la fase dispersa, en este proceso las gotas pequeas se
disuelven y posteriormente se depositan en las gotas ms grandes incrementando su
tamao.
d) La coalescencia se produce por el adelgazamiento y ruptura de la pelcula de fase
dispersante que rodea las gotas de la fase dispersa.
e) La inversin de fase, en esta la fase dispersa y el medio se intercambian,
cambiando las caractersticas de la emulsin.

Para evaluar la estabilidad de las emulsiones existen mltiples mtodos, pero

recientemente las determinaciones reolgicas se han empleado debido a su rapidez y
especificidad con tres diferentes mediciones: la velocidad de esfuerzo con respecto a la
velocidad de deformacin, la aplicacin de esfuerzo constante (creep) y los mtodos
oscilatorios (Tadros, 2004).

La relacin de la velocidad de esfuerzo contra la velocidad de deformacin permite

obtener el ndice de comportamiento de flujo n con el cual se puede tener una nocin del
nivel de floculacin de las emulsiones. Mientras que con las mediciones de reologa
oscilatoria se pueden evaluar los componentes viscoso G y elstico G del sistema, de la
relacin entre estos parmetros se puede deducir la estabilidad de las emulsiones
(Mndez Montealvo et al. 2001).

15
 Introduccin

1.2 Justificacin

Actualmente nuestro conocimiento de la Biologa al interior de los yacimientos petroleros

es insuficiente, lo que requiere la realizacin de estudios moleculares, bioqumicos y
geoqumicos ms profundos para entender la distribucin, funcin e interacciones de los
microorganismos. El contar con este tipo de conocimiento permitir una mejor aplicacin
de tecnologas de extraccin de petrleo.

En Mxico, existe poca informacin sobre la microbiologa de yacimientos petroleros. El

presente trabajo contribuir al conocimiento de la diversidad microbiana de la zona
Coyotes en el yacimiento Chicontepec y sobre las caractersticas de los microorganismos
que permitan su uso, en aplicaciones de MEOR.

Tambin se propone el uso de las clulas de cultivos provenientes de yacimientos

mexicanos como partculas estabilizadoras de emulsiones de agua y aceite, una
propuesta que permitira reducir costos y el impacto ambiental de los surfactantes
sintticos y polmeros empleados actualmente. Adems se propone la formacin de
emulsiones directamente con el aceite, evitando as emplear solventes con altos costos
de produccin y que dependen del precio del petrleo.

16
 Introduccin

1.3 Objetivos

1.3.1 Generales

Analizar la diversidad microbiana de un pozo de Chicontepec y las condiciones en las que

se favorece la emulsificacin por efecto de los microorganismos.

1.3.2 Especficos

o Analizar la diversidad microbiana en una muestra de aceite y una de agua

congnita del yacimiento Chicontepec, empleando mtodos moleculares y mtodos
basados en el cultivo.

o Evaluar la hidrofobicidad de los cultivos microbianos.

o Determinar las condiciones que favorecen la formacin de emulsiones empleando

los cultivos microbianos.

o Producir emulsiones y evaluar la estabilidad de las mismas, mediante la

determinacin de sus propiedades reolgicas.

17
 Materiales y mtodos

II. MATERIALES Y MTODOS

2.1 Muestreo
Se realiz el muestreo por parte del personal del Instituto Mexicano del Petrleo,
participaron los tcnicos Jos Luis Huerta y scar Orozco. Se tomaron muestras de tres
pozos del yacimiento de Chicontepec en las zonas Coyotes y Agua fra; adems se
obtuvo una muestra de un pozo del yacimiento Samaria. Los bidones se llenaron con
crudo para limitar la presencia de oxgeno, las muestras se almacenaron a temperatura
ambiente y se protegieron de la luz hasta su uso.

Cuadro 3. Origen de muestras de aceite empleadas para el cultivo de microorganismos

Clave AC272 CC332 AF392 CS823

Tipo de muestra Agua congnita Crudo Crudo Crudo
Fecha de recoleccin Noviembre 2010 Octubre 2010 Noviembre 2010 Febrero 2011
Regin Coyotes Coyotes Agua fra Samaria
Pozo 271 332 392 823
Temperatura de pozo 70C 70C 70C 60C

Chicontepec

Samaria-Luna

Figura 3. Mapa de los yacimientos y zonas de muestreo. Al este del pas se ubica el
yacimiento Chicontepec y en la figura ampliada se indican las zonas Coyotes y Agua fra;
al sureste del pas se ubica el campo Samaria-Luna.

18
 Materiales y mtodos

2.2 Extraccin de ADN a partir de muestras de aceite

La naturaleza compleja de las muestras de aceite dificulta la extraccin de ADN por lo que
se evaluaron diferentes tcnicas de extraccin, a continuacin se describen las tcnicas
que permitieron la extraccin de ADN con calidad suficiente para la amplificacin por
PCR.

El mtodo modificado de Yamane y colaboradores 2008, en l se precipitaron las clulas

por extraccin con isooctano, para ello 7 ml de aceite se mezclaron en vrtex con un
volumen igual de isooctano (2,2,4-trimetilpentano), la mezcla se incub a 4C durante
toda la noche. Al terminar el tiempo de incubacin se mezcl vigorosamente y se
centrifug a 4400 rpm 60 min a 4 C. El precipitado se resuspendi en 14 ml de isooctano
y se precipit nuevamente por centrifugacin a 4400 rpm durante 10 min a 4 C. Se lav
dos veces con isooctano y se sec en campana de flujo laminar (Yamane et al. 2008). Al
precipitado se le aadi un volumen de perlas de vidrio, 2 ml de solucin de lisis (Tris HCl
10 mM pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 10 mM, SDS 1%). Se agit en vrtex 8 tiempos de 30 seg
con periodos de incubacin en hielo de 30 seg. Se aadieron 3 ml de fenol: cloroformo:
alcohol isoamlico (25:24:1), se mezcl en vrtex y se centrifug a 14000 rpm durante 10
min. Posteriormente se recuper la fase acuosa a la cual se aadi 2 volmenes de
etanol absoluto y se incub a -4C durante 2 h. Al terminar la incubacin se centrifug a
14000 rpm durante 10 min. Se retir el etanol y el botn se lav con 1 ml de etanol
absoluto, se centrifug a 14000 rpm durante 5 min, se retir el etanol absoluto y se sec
el botn en campana de flujo laminar. El botn se resuspendi en 60 l de agua estril y
la solucin de ADN se conserv a -20C.

Tambin se emple el kit de extraccin illustra tissue & cells genomic prep midiflow. Se
realiz el tratamiento con isooctano descrito en la tcnica anterior, una vez que se
realizaron los lavados con isooctano al precipitado se le aadieron 4.5 ml de solucin de
lisis y se agit en vrtex durante 15-30 seg (el paquete se resuspendi por completo antes
de contar el tiempo). Posteriormente se aadieron 50 l de proteinasa K y se agit en
vrtex durante 2 seg. Se incub a 60C durante 2 h y posteriormente se enfri el tubo
durante 2 min a -20C. Se filtr la muestra usando un filtro de acetato de celulosa de 0.22
m, se aadieron 4 ml de regulador de carga y esta mezcla se hizo pasar a travs de una
columna Genomic 250 para la purificacin del ADN (columna previamente tratada). La
columna se lav con 5 ml regulador de carga y una vez que fluy toda la solucin, se
eluy con 2.5 ml de regulador de elucin 1 y se colect la solucin. sta ltima solucin

19
 Materiales y mtodos

se hizo pasar a travs de una columna NAP-25 de desalado (previamente equilibrada), se

permiti que la solucin fluyera a travs de la columna y posteriormente se eluy el ADN
con 3.5 ml regulador de elucin 2. La solucin conteniendo el ADN se conserv a -20C.

Finalmente para las muestras de agua congnita se realiz una concentracin de clulas
por filtracin de 100 ml de agua congnita a travs de una membrana de 0.2 m y se
realiz la extraccin de lisis qumica y mecnica seguida de separacin con
fenol:cloroformo:alcohol isoamlico, que se describi en prrafos anteriores de esta misma
seccin.

2.3 PCR-DGGE del gen 16S ribosomal

Se realiz un anlisis de genes 16S rRNA en gel con gradiente desnaturalizante o DGGE
para estimar la complejidad de las comunidades microbianas de ADN obtenido de las
muestras de petrleo y agua congnita. Se efectu una PCR convencional con la mezcla
comercial IQ supermix (Bio Rad) usando oligonucletidos universales para la regin V3, el
oligo derecho: CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTA
CGGGAGGCAGCAGcctacgggaggcagcag y reverso: attaccgcggctgctgg modificados de los
oligos 2 derecho y 3 reverso previamente recomendados (Muyzer et al. 1993).

La mezcla de reaccin consisti en 12 l de agua, 2.5 l de regulador 10 X, 2.0 l de

dNTPs (2.5 mM de cada uno), 4 l de MgCl2 (25 mM), 1 l de oligo derecho y reverso (10
M), 0.5 l de Taq polimerasa (5 U/l) y 2 l de ADN molde (50 ng/ml). Las condiciones
del termociclador fueron las siguientes: desnaturalizacin de 95C durante 3 min. Seguido
de 21 ciclos de 95C durante 30 seg, 54C durante 30 seg, 72C durante 1 min. Extensin
final a 72C durante 10 min.

Se prepararon soluciones para generar un gradiente desnaturalizante 60% a 0% en un gel

de acrilamida al 8% como se muestra en la Cuadro 4. El gradiente desnaturalizante se
eligi con base a un corrimiento previo de las muestras en un gel horizontal con gradiente
desnaturalizante 100% a 0%.

Se colocaron las soluciones desnaturalizantes rpidamente en el distribuidor de gradiente,

se distribuyeron en el sistema horizontal (soluciones 0% y 60%) previamente armado y se

20
 Materiales y mtodos

dej polimerizar durante una hora. Se lavaron los pozos del gel polimerizado, se cargaron
10 l de muestra por pozo, previamente estandarizada la concentracin de ADN.

Cuadro 4. Soluciones desnaturalizantes para la preparacin del DGGE.

Solucin desnaturalizante 0% 60%

Acrilamida / bisacrilamida 40% 10 ml 10 ml
Buffer TAE 50X 1 ml 1 ml
Formamida (desnaturalizada) 12 ml
Urea 12.6 g
Agua desionizada a volumen final 50 ml 50 ml

Se separ en ADN a 120 V por 8 h. Al finalizar la corrida se tieron los geles con plata
empleando el kit silver staning (BioRad) segn el protocolo de tincin de ADN.

2.4 Construccin de genotecas ribosomales y seleccin de clonas

Para la construccin de la librera de genes ribosomales, se amplific el gen 16S
ribosomal usando los iniciadores 8 (derecho: GCG GAT CCG CGG CCG CTG CAG AGT
TTG ATC CTG GCT CAG) y 1492 (reverso GGC TCG AGC GGC CGC CCG GGT TAC
CTT GTT ACG ACT T) previamente recomendados (Relman, 1993). Tambin se probaron
los oligos universales para arqueas A4F TCCGGTTGATCCTGCCRG y A976R
YCCGGCGTTGAMTCCAATT (Dahle et al. 2008).

La mezcla de reaccin y las condiciones del termociclador fueron las mismas que las
descritas en la seccin anterior, excepto por la amplificacin con 30 ciclos. Posteriormente
se purific el producto de PCR con el kit comercial QIAquick Gel extraction kit (Qiagene).
El producto purificado se insert en el vector pJET 1.2/blunt con el kit CloneJET PCR
cloning kit (Fermentas). El producto de ligacin se transform en clulas
quimiocompetentes de Escherichia coli TOP 10.

Se seleccionaron clonas resistentes a ampicilina por extensin en placa en agar LB +

ampicilina 50 g/ml. Se picaron las colonias y se crecieron en medio lquido LB con
ampicilina 50 g/ml, se cosech 1ml para conservar en glicerol 25% y 1.5 ml para extraer
plsmido por la tcnica de minipreparacin por lisis alcalina.

21
 Materiales y mtodos

Se identificaron las clonas que contenan el fragmento de aproximadamente 1500 pb del

gen 16S rRNA por liberacin del mismo con la endonucleasa de restriccin Bgl II
(Fermentas) cuyas secuencias de corte flanquean el sitio de insercin en el plsmido. La
digestin se llev a cabo a 37C, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los
productos de la digestin se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1%.

Los plsmidos con inserto se restringieron por separado con las endonucleasas de
restriccin Hpa II y Hha I (InVitrogen) (Moyer et al. 1996). La mezcla se realiz siguiendo
las recomendaciones del fabricante y se incub durante 16 h a 37C. Los productos de la
digestin se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 3%. Para calcular el
tamao de los fragmentos se utiliz el marcador de peso molecular 100 pb (Fermentas).
Se seleccionaron las clonas con perfiles de restriccin diferentes con ambas enzimas para
la secuenciacin.

2.5 Secuenciacin y anlisis filogentico

Las clonas seleccionadas se cultivaron en medio LB con ampicilina 100 g/ml a partir de
los tubos conservados a -20C en glicerol al 25%. Se cosecharon 1.5 ml y se extrajo ADN
empleando el kit pure yield miniplasmid system (Promega), las muestras se secuenciaron
por sistema capilar (MAGROGEN).

Las secuencias de ambos lados del gen se integraron usando el programa DNA Baser
versin 2.11 (Heracle Software, Germany). Posteriormente las secuencias se sometieron
al anlisis BLAST en la modalidad Vec Screen para detectar fragmentos remanentes del
vector. La secuencia editada se someti a la bsqueda BLASTn en la base de datos del
portal NCBI (Altschul et al. 1997). Las secuencias relacionadas se capturaron
considerando los integrantes del mismo gnero.

Se colectaron las secuencias similares y se alinearon con el programa Clustal X 2.0 de

alineacin mltiple (Thompson et al. 1997), posteriormente los alineamientos se editaron
manualmente con el programa SEAVIEW (Galtier et al.1996). Las relaciones filogenticas
entre las secuencias se establecieron por mtodos de distancia con la aplicacin de los
mtodos de sustitucin apropiados y empleando el programa MEGA 5.2 (Tamura et al.
2007). Los porcentajes de similitud entre secuencias se calcularon utilizando BioEdit

22
 Materiales y mtodos

7.0.5.2 software (Hall, 1998). Los lmites para determinar gnero y especie fueron 95% y
97% respectivamente, de acuerdo con el criterio previo (Tindall et al. 2010).

2.6 Cultivo microbiano

Con la finalidad de complementar el estudio de la diversidad microbiana, se probaron
diferentes medios de cultivo: R1 para microorganismos fermentativos (Dahle et al. 2008);
Medio R1 modificado para el cultivo de microorganismos metangenos; medio
Chicontepec, con aceite y extracto de polvo de ncleo para organismos degradadores de
hidrocarburos; y medio Allen para organismos microaeroflicos o aerobios (Allen, 1959).
La composicin de los medios de cultivo se detalla en el apndice A de este documento.

Los medios de cultivo R1, R1 modificado y medio Chicontepec se prepararon en

condiciones que impidieran su oxigenacin, se distribuyeron alcuotas de 30 ml en frascos
de 125 ml, posteriormente se intercambi la atmsfera con gas Nitrgeno y finalmente se
sellaron los frascos para impedir la entrada de aire.

Se inocularon por duplicado frascos con los diferentes medios de cultivo con 3 ml de
aceite (10% v/v) o agua congnita de cada muestra. Se incubaron a 60C o 70C de
acuerdo a las condiciones de pozo del que se extrajeron las muestras. Se conservaron
en incubacin durante 2 semanas y hasta 2 meses en el caso de los medios R1
modificado y el medio Chicontepec.

Una vez que se present el crecimiento microbiano, los cultivos se resembraron cada 7
das o 21 das, dependiendo de su velocidad de crecimiento, adicionalmente se
conservaron en congelacin a -20C en glicerol al 40%, enfriando lentamente desde los
60 o 70C hasta -20C.

Se determin el crecimiento microbiano por incremento en la turbidez del medio de cultivo

comparado contra un testigo del mismo medio y se confirm mediante tincin de Gram y
observacin al microscopio.

23
 Materiales y mtodos

2.7 Evaluacin de la cintica de crecimiento

Cuando los cultivos presentaron un crecimiento estable se analiz su cintica de
crecimiento, para lo cual se inocularon frascos con medio de cultivo R1 con 10% (v/v) de
8
inculo proveniente del mismo medio de cultivo a una concentracin celular de 1-5 x 10
clulas / ml, se incubaron a 60C y 70C (dependiendo del origen de la muestra) durante
488 h, se tomaron muestras cada 8 h durante 32 h y posteriormente se extendi el tiempo
de muestreo a ms de 16 h. Para cada tiempo se determin la concentracin de protenas
por el mtodo de Bradford (microensayo) como indicador del aumento en la biomasa.

2.8 Determinacin de la adherencia microbiana a hidrocarburos

Para evaluar la hidrofobicidad de las clulas en los diferentes cultivos microbianos, se
realiz la prueba de adherencia microbiana a hidrocarburos o MATH por sus siglas en
ingls. El mtodo consiste en someter una suspensin microbiana a una mezcla con un
solvente de prueba y posteriormente cuantificar la cantidad de clulas que permanecieron
en la fase acuosa, para determinar indirectamente el porcentaje de clulas que migraron
hacia la fase orgnica como indicador de la hidrofobicidad de la superficie celular. La
prueba se realiz considerando los siguientes hidrocarburos: octano, hexadecano, xilenos
y tolueno. Adems se evalu diesel y los aceites CC332, AF392 y S823.

Se cosecharon las clulas de un cultivo en fase exponencial es decir a 32 h del cultivo A

y a 300 h de cultivo de las muestras B, C y D. Se hicieron 3 lavados con regulador PUM
(19.7 g K2HPO4, 7.26 g KH2PO4, 1.8 g urea-CH4N2O y 0.2 g MgSO4.7H2O en un litro de
agua destilada, alcanzando pH 7.1). Se resuspendi el paquete celular en el mismo
regulador y se ajust a una densidad ptica de 0.5 a 620 nm y se realiz cuenta
microbiana en cmara de Neubauer. Posteriormente a 1.2 ml de suspensin celular se le
aadieron 2 ml del solvente de prueba, se agit en vrtex durante 10 seg y se dej en
reposo durante 10 min. Trascurrido el tiempo se realiz el conteo de clulas bacterianas
en cmara de Neubauer, la hidrofobicidad se calcul en porcentaje empleando la
siguiente frmula %Hidrofobicidad = [(Nmero de clulas tiempo inicial- Nmero de clulas
tiempo final/ Nmero de clulas tiempo inicial) x 100]. Los valores menores a 30% se consideran
como baja hidrofobicidad, entre 30 y 50% intermedia y mayores a 50% alta (Rosenberg et
al. 1980).

24
 Materiales y mtodos

2.9 Estabilidad de emulsiones

La hidrofobicidad es un parmetro importante si se considera que las clulas se
establezcan en la interfase de las emulsiones y las estabilicen, adems otros parmetros
fsicos y qumicos determinan la estabilidad de emulsiones, uno de ellos es la salinidad
que en bajas concentraciones puede favorecer la estabilidad de emulsin al reducir la
repulsin electrosttica entre las clulas cargadas negativamente. No obstante la
salinidad es un parmetro especialmente sensible en el caso de yacimientos de petrleo,
pues la concentracin de sal como NaCl puede alcanzar incluso 30% en el agua
congnita.

De este modo la concentracin de agua en la emulsin es tambin importante, tanto por la

composicin del agua congnita, como por la relacin de crudo y agua, que influye en la
estabilidad de emulsin y tambin en la naturaleza de la emulsin, es decir si se forman
emulsiones aceite en agua o agua en aceite.

Para conocer las condiciones que favorecen la estabilidad de emulsiones se formaron

emulsiones en sistemas de 3 ml en tubos de cristal de 15 ml, se evalu el efecto de la
salinidad, concentracin celular y relacin de crudo/agua como se muestra en el Cuadro
5. Se realizaron 24 mezclas diferentes por duplicado para cada combinacin de aceite y
cultivo microbiano.

Cuadro 5. Parmetros y niveles de prueba de estabilidad de emulsiones.

Salinidad Concentracin celular DO 600nm Relacin crudo/agua

0.1% 0 0.1
1% 0.1 0.5
2% 0.5
3%

Para formar las emulsiones se cosecharon las clulas de un cultivo en fase exponencial
32 h del cultivo A y a 300 h de los cultivos B, C y D. Se hicieron 3 lavados con regulador
PUM y se resuspendi el paquete celular en el mismo regulador, la suspensin celular se
ajust a una densidad ptica de 0.1 y 0.5 a 620 nm en regulador PUM con salinidad de
0.1%, 1%, 2% y 3%. Despus se colocaron 2.7 ml (relacin crudo/agua 0.1) o 1.5 ml

25
 Materiales y mtodos

(relacin crudo/agua 0.5) de suspensin celular a la cual se le aadieron 0.3 ml o 1.5 ml

de crudo teniendo precaucin de que el crudo no se quedara en la paredes del tubo. Se
agit en vrtex a mxima potencia durante 2 min cuidando que se generara el vrtice y
posteriormente se dej en reposo durante 15 min. Trascurrido el tiempo se realiz la
observacin de las emulsiones y se consider esto como el tiempo 0, despus se revis
cada da durante 3 das y cada semana hasta los 21 das. La prueba se evalu
considerando el tipo de emulsin generado y asignndole un valor numrico como se
muestra en el Cuadro 6.

Cuadro 6. Nivel de estabilidad de emulsiones.

Nivel de estabilidad Imagen Descripcin

0 La emulsin se separ inmediatamente

1 El aceite incorpor agua y se expandi sin emulsionar

2 Emulsin de coloracin ligeramente rojiza en la interfase y

conservacin de ambas fases a los extremos

3 Emulsin completa con coloracin ligeramente rojiza

Cuadro 7. Caractersticas generales de los aceites empleados en las emulsiones.

o
Crudo Agua (% Sedimento Sales Asfaltenos Saturados Polares Aromticos Valor Valor API
v/v) (% v/v) totales (% v/v) (% v/v) (% v/v) (% v/v) cido bsico
(%v/v)

PA 0.2 Trazas 24.60 19.85 23.44 22.59 34.12 0.08 3.22 18.7

CC154 52.4 ND 14.76 0.88 23.35 22.47 53.30 0.11 1.00 21.9

AF392 3.8 ND 16.40 0.92 22.12 25.71 50.35 0.09 1.90 29.2

CS823 92.8 ND ND 10.82 13.82 ND 27.19 ND ND 11.4

Tomado de: Torres y colaboradores, en prensa.

26
 Materiales y mtodos

Una vez evaluados los niveles de estabilidad de emulsiones usando el crudo AF392 se
seleccionaron a los cultivos A y C, por su capacidad para estabilizar emulsiones y la
velocidad de crecimiento de los mismos. Se hicieron entonces nuevas pruebas de
estabilidad de emulsiones pero ahora con diferentes crudos, de los cuales se describen
sus caractersticas principales en el Cuadro 7, los crudos son nombrados dependiendo
de la zona y el pozo en que fueron extrados Coyotes CC, Agua fra AF Presidente
Alemn PA y Samaria CS

2.10 Caracterizacin reolgica de emulsiones

Con los resultados de las pruebas anteriores se establecieron las condiciones que
favorecieron la emulsificacin de aceite en agua y se probaron las siguientes condiciones:
radio aceite agua 0.5, suspensin celular 0 y 0.1 DO a 620 nm; salinidad como NaCl de
1% y 3%; se probaron con los crudos AF392 y CS823 debido a la disponibilidad de
muestras. Se seleccion al cultivo A debido a su rpido crecimiento.

Se probaron sistemas de 120 ml y 500ml, con el dispersador Ultraturrax T25, con el

accesorio S25N-25F que permite una finura de emulsin mnima de 1 a 5 m. De acuerdo
a lo reportado previamente para emulsiones de petrleo, se probaron los siguientes
tiempos y velocidades de agitacin de: 11 000 rpm durante 2 min (Valladares, 2005), 17
500 rpm durante 10 min (Fortuny et al. 2008) y 21 000 rpm durante 10 min (Sjblon,
1992). Se seleccion la ltima combinacin de 21000 rpm durante 10 min, pues gener
emulsiones estables en sistemas de 120 ml.

Dado que la agitacin gener calor, al terminar la agitacin, las emulsiones se dejaron en
reposo hasta que la temperatura descendi a temperatura ambiente y posteriormente a
las emulsiones se les evaluaron la tensin superficial y algunos parmetros reolgicos.

A las emulsiones se les midi la tensin superficial con un Tensimetro Sigma 703D con
Anillo de Du Noy, para determinar si hubo efecto sobre la tensin superficial con
respecto a la tensin superficial del crudo.

Posteriormente de evalu la relacin del esfuerzo (shear stress) con respecto a la

deformacin (shear rate), con estos datos se calcul el ndice de comportamiento de flujo
n, que describe el comportamiento reolgico de las emulsiones.

27
 Materiales y mtodos

Adems se realiz la caracterizacin reolgica de las emulsiones empleando un remetro

MCR 101 de la marca Anton Paar, con la geometra de platos paralelos empleando un
accesorio de 2.5 cm de dimetro con acabado de arena. Se determin en primera
instancia la zona viscoelstica lineal mediante un barrido de deformacin (strain) con
respecto a los mdulos G y G, con una frecuencia constante de 1 Hz. Se seleccion un
valor en que los mdulos se comportaran de forma lineal para posteriormente hacer un
barrido de frecuencia entre 0.01 y 1000 Hz en el cual se evaluaran los valores de los
mdulos G y G, se realiz la determinacin por duplicado para cada emulsin.

2.11 Identificacin del cultivo seleccionado

Se seleccion al cultivo A por su rpido crecimiento como un cultivo prometedor para
aplicaciones en MEOR y se identific mediante anlisis de su gen 16S ribosomal. Para
ello se extrajo ADN a partir de 30 ml de cultivo en fase exponencial en medio de cultivo
R1, se concentr por centrifugacin y se extrajo ADN por el mtodo de lisis qumica y
mecnica y separacin con fenol:cloroformo: alcohol isoamlico descrito en la seccin 2.2,
posteriormente se amplific el gen 16S rRNA con los oligos 8F y 1492R, bajo las
condiciones descritas previamente en la seccin 2.4, se purific el producto de PCR, se
secuenci y se realiz el anlisis de la misma forma que las secuencias de clonas
(seccin 2.5), exceptuando el anlisis Vec Screen.

28
 Resultados

III. RESULTADOS

3.1 Extraccin de ADN a partir de muestras de aceite

Se logr extraer ADN de las muestras de agua congnita AC272 y de crudo CC332 con la
calidad suficiente para realizar PCR, mientras que para las muestras de aceite de las
muestras AF392 y CS823 a pesar de realizar mltiples adaptaciones a las tcnicas de
extraccin no se consigui ADN ni en la cantidad, ni con la calidad suficiente para
amplificarlo mediante PCR. Cabe sealar que la cantidad de ADN obtenida no fue
suficiente para visualizarse en un gel de agarosa, por lo que la amplificacin mediante
PCR fue el indicador del xito de la extraccin. La imposibilidad de obtener ADN de las
muestras AF392 y CS823 se debi a las diferencias en la composicin qumica y biolgica
del petrleo, es decir, cada muestra de crudo posee un diferente contenido de asfaltenos
y de clulas que co-precipitaron con ellos al emplear la extraccin con isooctano.

3.2 PCR-DGGE de las muestras AC272 y CC332

Se emple el anlisis PCR-DGGE para hacer una estimacin de la diversidad microbiana
de las muestras de agua AC272 y crudo CC332. Al interpretar los resultados se consider
a cada banda como una unidad operativa taxonmica (OTU en Ingls) ya que no
necesariamente corresponde cada banda a una especie diferente. En la figura 4 se
observa la presencia de 25 bandas en el carril con la muestra de agua congnita AC272
y 16 bandas en la muestra de aceite CC332.

Adems, se presenta un esquema al lado del gel teido con plata para indicar de forma
sencilla la presencia de bandas y se sealan en rojo las 9 bandas que se comparten entre
las dos muestras, lo anterior indica que hay ciertas especies en comn a pesar de tratarse
de muestras provenientes de diferentes pozos.

29
 Resultados

Figura 4. DGGE de las muestras de agua congnita y crudo de la zona Coyotes. Se

separaron productos de PCR en un gradiente desnaturalizante de 0 a 60%.

A pesar de que existen condiciones extremas en el ambiente, como pH, temperatura y

salinidad, en ambas muestras se present un despliegue de bandas considerable.
Suponiendo que cada OTU corresponde a una especie diferente, hasta 25 especies
diferentes en el agua congnita y 16 diferentes en la muestra de aceite, los nmeros de
OTUs corresponden con los resultados que se presentan en la siguiente seccin.

30
 Resultados

3.3 Genotecas ribosomales

Con el fin de estimar de forma especfica la diversidad microbiana se evaluaron 2
diferentes pares de oligos universales para amplificar la subunidad pequea del gen
ribosomal tanto de bacterias como de arqueas, no se obtuvo amplificado con los oligos
diseados para arqueas y por lo tanto es probable que la muestra carezca de
representantes de este grupo microbiano.

Mientras que a partir de la amplificacin con oligos universales para bacterias, se

consigui la amplificacin a partir de ADN de una muestra de agua congnita AC272 y de
crudo CC332 y posteriormente se construyeron genotecas ribosomales; se obtuvieron 137
clonas de la muestra de crudo y 120 de la muestra de agua congnita. Con la enzima Bgl
II se confirm la presencia del inserto con el tamao correspondiente al gen de inters
(1500 pb), para cada una de las clonas.

Posteriormente las clonas con inserto del tamao esperado se seleccionaron mediante
perfiles de restriccin con las enzimas Hpa II y Hha I, las cuales fueron probadas por
separado. En la figura 4 se muestran las curvas de saturacin de perfiles diferenciales
para la enzima Hpa II se alcanz la saturacin de las curvas con 22 perfiles diferentes
para la muestra de agua congnita y 13 perfiles para la muestra de crudo. Con la enzima
Hha I, se alcanz la saturacin con 23 perfiles para la muestra de agua congnita y 15
perfiles para la muestra de crudo.

Se seleccionaron las clonas con patrones diferentes con ambas enzimas para cada
muestra, los insertos se secuenciaron directamente del plsmido y despus se editaron
con el programa VECscreen, despus del anlisis se obtuvieron 22 secuencias de la
muestra de agua congnita y 13 secuencias de la muestra de aceite, stas se analizaron
y se obtuvieron los posicionamientos taxonmicos que se presentan en la Cuadro 8. Para
establecer los niveles taxonmicos se consider el criterio propuesto previamente por
Tindall y colaboradores, 2010 en el cual se considera una asociacin a nivel de especie
con un porcentaje de similitud mayor o igual a 97% y a nivel de gnero con una similitud
mayor o igual a 95% (Tindall et al. 2010). Es importante resaltar que varias secuencias
aqu encontradas tuvieron porcentajes menores a 95% de similitud con secuencias
previamente reportadas en la base de datos, es por ello que se comparan contra las
secuencias ms parecidas, aunque es necesario realizar ms estudios para llegar a una
identificacin de las clonas o bien llegar a proponer nuevas especies.

31
 Resultados

25 15

Perfil de restriccin (acumulado)

Perfil de restriccin (acumulado)

20

10
15

10
5

0 0
0 20 40 60 80 100 1 21 41 61 81 101
a) No. de clonas b) No. de clonas

25
15

Perfil de restriccin (acumulado)

Perfil de restriccin (acumulado)

20

10
15

10
5

0 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100
c) No. de clonas d) No. de clonas

Figura 5. Curvas de saturacin de perfiles de restriccin. Grficas superiores con la

enzima Hpa II para las clonas de las genotecas a) de agua congnita y b) crudo. Las
grficas inferiores con la enzima Hha I para las clonas de las genotecas c) agua congnita
y d) crudo.

Como se observa en las figuras 6 y 10 las clonas obtenidas a partir de la muestra de

aceite correspondieron a dos grupos microbianos, la secuencia de la clona 17 se identific
como Marinobacterium sp., perteneciente a la clase Gammaproteobacteria; mientras que
el resto de las clonas se asociaron con un grupo de secuencias an no identificadas. En
todos los casos se trat de secuencias correspondientes a microorganismos provenientes
de ambientes de yacimiento, de ambientes contaminados con hidrocarburos o de
integrantes de consorcios tiles en tecnologas MEOR (Hendrickson et al. 2013).

32
 Resultados

Cuadro 8. Posicionamiento taxonmico de las clonas de las libreras ribosomales.

Clase Clonas Relacin Filogentica

Especie ms cercana Posicionamiento
Nmero de acceso / similitud (%) taxonmico
No clasificado* 1 CC, 4 CC, 27 Bacteria no cultivable EF157080 y GU120567 / Sin determinar1,2
CC, 29 CC, 66 95-97%
CC, 74 CC, 82 Hydrogenophilus thermoluteolus NR_024663 /
CC, 83 CC, 86 82.0-83.0
CC, 94 CC, 95
CC, 97 CC
Gammaproteobacteria 17 CC Marinobacterium sp. AB196257 / 95.0 Marinobacterium sp.
9 AC, 28 AC, 42 Marinobacterium sp. AB196257 / 97.8-97.4 Marinobacterium sp.
AC, 67 AC
17 AC Marinobacterium sp. AB196257 / 88.0 Sin determinar2

15 AC Marinobacter nanhaiticus Sin determinar2

FJ799008 / 91.5
Alphaproteobacteria 46 AC Alphaproteobacteria no cultivable JQ579966 / 95.0 Rhodovulum sp.
Rhodovulum marinum AM696301 / 95.0
20 AC Clona bacteriana no cultivable FJ203402 y Mesorhizobium sp.
FJ203409 / 97.0
Mesorhizobium chacoense AJ278249 / 95
Synergistia 31 AC, 49 AC Bacteria no cultivable AB701664 / 100.0-97.0 Sin determinar1,2
Thermovirga lienii NR_074606 / 93.3-93.3
Deltaproteobacteria 7 AC, 50 AC Geoalkalibacter subterraneus Sin determinar2
NR_044429 / 89.8-90.0
Deferribacteres 8 AC y 58 AC Calditerrivibrio nitroreducens NR_074851 / 88.0 Sin determinar2
Clostridia 23 AC Bacteria no cultivable DQ256327 / 99.7 Sin determinar1,2
Moorella thermoautotrophica NR_029144 / 83.9

Bacteroidetes 38 AC Prolixibacter bellariivorans NR_043273 / 89.7 Sin determinar2

45 AC Owenweeksia hongkongensis NR_074100 / 85.2 Sin determinar2
Thermotogae 12 AC Mesotoga prima NR_102952 / 98.7 Mesotoga prima
5 AC y 13 AC Geotoga petraea HM037999 / 99.0-99.5 Geotoga petraea
Spirochaetina 55 AC Spirochaeta no cultivable HM041923 / 100.00 Sphaerochaeta globosa
Sphaerochaeta globosa NR_074808 / 97.0
77 AC Clona bacteriana no cultivable FJ024712 / 97.0 Sin determinar1,2
Sphaerochaeta pleomorpha NR_102964 / 89.0
1
Las secuencias de referencia no han sido clasificadas

2
No se puede determinar posicionamiento taxonmico dada la baja similitud con las secuencias de referencia.

33
 Resultados

72 Clona 83 CC
Clona 29 CC
Clona 82 CC
Clona 86 CC
Clona 66 CC
Clona 74 CC
64
Clona 97 CC
58
Clona 27 CC

94 Clona 1 CC
Clona 4 CC
59 Clona 95 CC
Clona 94 CC
58
AB530200 Uncultured bacterium
EF157080 Uncultured bacterium
100
87 GU120567 Uncultured bacterium
EF095417 Uncultured bacterium
77 HM124399 Uncultured bacterium
NR_025556 Tepidiphilus margaritifer
AY820184 Hydrogenophilus denitrificans
89
NR_024663 Hydrogenophilus thermoluteolus
100
FR749905 Hydrogenophilus hirschii
EF368015 Hydrogenophilus halorhabdus
NR_044016 Marinobacterium litorale
NR_044528 Marinobacterium nitratireducens
100
EF468717 Marinobacterium marisflavum
AB680864 Marinobacterium jannaschii
NR_044529 Marinobacterium sediminicola
NR_024699 Marinobacterium stanieri
53 AB196257 Marinobacterium sp.
52 Clona 17 CC

0.02

Figura 6. rbol filogentico de las clonas de la muestra de crudo 332. Se construy con
mtodos de distancia, a partir de 820 posiciones, usando el mtodo de agrupamiento
Neighbor-Joining y Jukes-Cantor para calcular la distancia, se realiz un remuestreo tipo
bootstrap de 1000 rplicas.

34
 Resultados

La secuencia de la clona 17 CC se asoci a nivel de especie con una secuencia de

Marinobacterium sp. con nmero de acceso AB196257 y que corresponde a una bacteria
degradadora de carbazol obtenida en Tokio (Inoue, et al. 2005). Mientras que las 12
clonas restantes tuvieron una similitud de 95 a 97% entre ellas y valores similares con
respecto a algunas secuencias previamente reportadas y que no han sido clasificadas
taxonmicamente, con nmeros de acceso EF157080 y GU120567 que fueron
encontradas en pozos de alquitrn de Los ngeles, Estados Unidos (Kim y Crowley,
2007) y en un lago natural de asfalto en Canad (datos no publicados).

El posicionamiento taxonmico de las clonas de la muestra de agua congnita se observa

en las figuras 7, 8 y 9. Las secuencias se ubicaron en 9 diferentes clases de bacterias,
mostrando una amplia diversidad microbiana (Cuadro 8) y la distribucin de clonas en las
diferentes clases bacterianas se muestra en la figura 11.
Nuevamente la mayora de las secuencias no se pudieron identificar a nivel de gnero o
especie debido a su baja similitud con respecto a la secuencia ms parecida, o bien, a
que tuvieron una alta similitud pero con secuencias que no han sido clasificadas todava.
Las clonas 9 AC, 28 AC, 42 AC y 67 AC, se ubicaron como Marinobacterium sp. con
nmero de acceso AB196257 la misma secuencia con la que se asociaron las clonas de
la muestra de crudo (Inoue, et al. 2005). Mientras que la secuencia 17 AC aunque se
asoci en el rbol filogentico a la misma secuencia, tuvo una similitud de 88%.
La clona 15 AC tuvo una similitud de 91.5% con Marinobacter nanhaiticus, una bacteria
aislada de sedimentos de mar en China, anaerobia facultativa, ligeramente haloflica (1-
5% NaCl) (Gao et al. 2013).
La clona 46 AC se ubic dentro del gnero Rhodovulum ya que tuvo una similitud de 95%
con la secuencia de Rhodovulum marinum, que es una bacteria prpura no del azufre
identificada a partir de una muestra proveniente de la India (datos no publicados), aunque
se relacion ms estrechamente en el rbol filogentico con una secuencia de una
bacteria no cultivable con nmero de acceso JQ579966 que se obtuvo de muestras de
sedimento marino impactado por del derrame del buque Prestige en las costas de Espaa
(Acosta-Gonzlez et al. 2013).

35
 Resultados

Las clonas 49 AC y 31 AC se relacionaron con la secuencia AB701664 bacteria no

cultivable que participa en la degradacin anaerobia de cido polilctico para la
produccin de metano (datos no publicados), a su vez ambas secuencias se asociaron en
el rbol filogentico con una secuencia de Thermovirga lienii, bacteria termoflica,
fermentativa aislada de un pozo petrolero en el mar del norte en Noruega (Dahle y
Birkeland, 2006).
Las clonas 7 AC y 50 AC tuvieron un porcentaje de similitud de 89.8 a 90% con
Geoalkalibacter subterraneus, bacteria aislada del campo petrolero Redwash en Estados
Unidos, se trata de una especie termoflica, reductora de fierro, manganeso, nitrato y
azufre (Greene et al. 2009).
Las secuencias de las clonas 8 AC y 58 AC se asociaron con Calditerrivibrio
nitroreducens y presentaron una similitud de 88%, C. nitroreducens es una bacteria
termoflica y nitratorreductora, que fue aislada de una fuente hidrotermal en Yumata,
Nagano, Japn (Iino et al. 2008).
La clona 23 AC se asoci con un porcentaje de similitud de 99.7% con una bacteria no
cultivable con nmero de acceso DQ256327 proveniente del subsuelo en Sudfrica (datos
no publicados); y con una similitud de 83.9% tambin se relacion con Moorella
thermoautotrophica, bacteria fermentativa, termoflica (Slobodkin et al. 1997).
Dentro de la clase Bacteroidetes la clona 38 AC se asoci con Prolixibacter bellarivorans,
aunque con una baja similitud (87.9%), se trata de una bacteria fermentativa, termodrica
capaz de crecer en un intervalo de temperatura de 4 a 42C, aislada de sedimentos
marinos (Holmes et al. 2007). Por otra parte la clona 45 AC tambin tuvo una baja
similitud (85.2%) con una secuencia de Owenweeksia hongkongensis bacteria marina
psicrotolerante, productora de pigmentos betacarotenoides (Riedel et al. 2012).
A nivel de especie se ubic a la clona 12 AC con Mesotoga prima (Zhaxybayeva et al.
2012) aislada de sedimentos contaminados con BPC (Bifenilos policlorados), es una
bacteria anaerobia estricta, termfila capaz de crecer en un intervalo de 20 a 50C
(Nesb, et al. 2012). Las clonas 5AC y 13 AC tambin se identificaron a nivel de especie
con Geotoga petraea ATCC 51226 una bacteria aislada de campo petrolero, anaerobia
estricta, termfila y fermentativa (Davey et al. 1993).

36
 Resultados

Clona 28 AC
EU573094 Bacterium enrichment
Clona 67 AC
97
Clona 42 AC
100
Clona 9 AC
FJ901118 Uncultured bacterium clone
100
98 AB196257 Marinobacterium sp.
98 NR_044529 Marinobacterium sediminicola
100 NR_024699 Marinobacterium stanieri
100 Clona 17 AC
Clona 15 AC

100 EU652042 Marinobacter alkaliphilus

100
NR_074619 Marinobacter hydrocarbonoclasticus
98
100 NR_044392 Marinobacter lacisalsi
100 FJ799008 Marinobacter nanhaiticus
EU287912 Rhodovulum thermophilus
61
Clona 46 AC
100
JQ579966 Uncultured alphaproteobacterium
AM696301 Rhodovulum marinum

77 NR_026441 Rhodovulum iodosum

100
94 NR_042478 Rhodovulum imhoffii

86 Clona 49 AC
100 AB701664 Uncultured bacterium
100
Clona 31 AC
NR_074606 Thermovirga lienii
Clona 50 AC

100 Clona 7 AC
100 NR_044429 Geoalkalibacter subterraneus
10
100 Clona 8 AC
100 Clona 58 AC
NR_074851 Calditerrivibrio nitroreducens

100 Clona 23 AC
DQ256327 Uncultured bacterium
100 NR_029198 Moorella glycerini

100 NR_029144 Moorella thermoautotrophica

100 AY884087 Moorella thermoacetica

100 Clona 38 AC
NR_043273 Prolixibacter bellariivorans
100 NR_074100 Owenweeksia hongkongens
87 Clona 45 AC

100 Clona 12 AC

NR_102952 Mesotoga prima

100 NR_029145 Geotoga subterranea
HM037999 Geotoga petraea
100
Clona 5 AC
100
Clona 13 AC
96
HQ395219 Bacterium enrichment

0.2 0.0

Figura 7. rbol filogentico de las clonas de la muestra de agua congnita AC272. Se

realiz a partir de un alineamiento de 820 posiciones. Se construy con mtodos de
distancia, usando el mtodo de agrupamiento UPGMA y Jukes-Cantor para calcular la
distancia, se realiz un remuestreo bootstrap de 1000 rplicas, se emple el programa
Mega 5.2.

37
 Resultados

La clona 55 AC se ubic a nivel de especie con Sphaerochaeta globosa aunque la

secuencia fue idntica a un organismo no cultivable con nmero de acceso HM041923
que fue identificada a partir de una muestra del yacimiento petrolero en Niibori, Japn
(Kobayashi et al. 2012). La clona 77 AC tuvo una similitud a nivel de especie con una
clona bacteriana no cultivable FJ024712 identificada a partir de una comunidad bacteriana
proveniente de sedimentos contaminados con cobre (Pavissich et al., 2010), esta misma
clona se asoci con una menor similitud (89%) con Sphaerochaeta pleomorpha.. Ambas
especies Sphaerochaeta globosa y S. pleomorpha, son bacterias mesfilas,
fermentativas, anaerobias aerotolerantes y fierrorreductoras (Ritalahti et al. 2012).

100 Clona 55 AC
56 HM041923 Uncultured Spirochaeta
NR_074808 Sphaerochaeta globosa
90
NR_102964 Sphaerochaeta pleomorpha
99 NR_074647 Sphaerochaeta coccoides
Clone 77 AC
100 FJ024712 Uncultured bacterium clone
NR_074795 Spirochaeta thermophila
HM037999 Geotoga petraea

0.02

Figura 8. rbol filogentico de las clonas 55 y 77 de la muestra de agua AC272. Se utiliz

un alineamiento con 432 posiciones y se construy el rbol con el mtodo de
agrupamiento Neighbor-Joining usando Jukes-Cantor para calcular la distancia, se realiz
un anlisis bootstrap de 1000 rplicas, empleando el programa Mega 5.2.

Dentro de la clase Alphaproteobacteria se identific a la clona 20 AC como integrante del

gnero Mesorhizobium, la secuencia ms parecida e identificada previamente fue
Mesorhizobium chacoense, un microorganismo nodulador del algarrobo blanco
(Velzquez et al. 2001); adems esta misma secuencia tuvo una alta similitud con las
secuencias FJ203402 y FJ203409 reportadas para bacterias no clasificadas y que se
identificaron en corales caribeos (Sunagawa et al. 2009).

38
 Resultados

99 FJ203402 Uncultured bacterium clone

99 FJ203409 Uncultured bacterium clone
79
Clona 20AC

66 HQ697706 Uncultured bacterium clone

AJ278249 Mesorhizobium chacoense

67 JF273849 Mesorhizobium alhagi

99 EU169581 Mesorhizobium camelthorni

NR_025252 Mesorhizobium septentrionale

56
NR_042685 Mesorhizobium metallidurans
NR_025953 Mesorhizobium ciceri
NR_044118 Mesorhizobium caraganae
AY741362 Burkholderia cepacia

0.01

Figura 9. rbol filogentico de la clona 20 de la muestra AC272. Se construy el rbol con

547 posiciones con el mtodo de agrupamiento Neighbor-Joining y Jukes-Cantor para
calcular la distancia, se realiz un remuestreo tipo bootstrap de 1000 rplicas, se utiliz el
programa Mega 5.2.

La mayora de las clonas de la muestra de crudo correspondieron a organismos no

identificados, analizando la abundancia de clonas con los perfiles de restriccin, la
secuencia que se asoci al gnero Marinobacterium de la clase Gammaproteobacteria
corresponde tan solo al 1% de la comunidad y las clonas no identificadas al 99% restante.

39
 Resultados

Gammaproteobacteria
1%

No clasificado
99%

Figura 10. Distribucin de clonas en la genoteca de la muestra de crudo. Los porcentajes

se calcularon de acuerdo a la abundancia de clonas con los perfiles secuenciados.

Mientras tanto las clonas de la genoteca de agua congnita se ubicaron en 9 diferentes

clases Alfaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Synergistia,
Deferribacteres, Clostridia, Bacteroidetes, Thermotogae y Spirochaetina. En la figura 11
se muestra la distribucin porcentual de acuerdo a la abundancia de clonas de la muestra
de agua congnita.

40
 Resultados

Spirochaetina
7%

Thermotogae
11%

Gammaproteobacteria
29%
Bacteroidetes
7%

Clostridia
3%

Deferribacteres
18%

Synergistia
11% Alphaproteobacteria
7%

Deltaproteobacteria
7%

Figura 11. Distribucin de las clonas para la genoteca construida a partir de la muestra de
agua congnita. Los porcentajes se calcularon de acuerdo a la abundancia de clonas con
los perfiles secuenciados.

En la mayora de los casos las clonas correspondieron a microorganismos provenientes

de yacimientos petroleros o ambientes relacionados, como son el subsuelo, fosas
hidrotermales o sedimentos marinos. Solamente se identific a Mesorhizobium como un
microorganismo ajeno al ambiente de yacimiento, no obstante, se trata de un gnero
propio del suelo que pudo llegar al yacimiento por maniobras de perforacin y extraccin.
Considerando los principales grupos metablicos reportados en yacimientos, en este
trabajo fueron abundantes los organismos fermentativos, encontrando a Marinobacter,
Marinobacterium, Thermovirga, Moorella, Mesotoga, Geotoga y Sphaerochaeta. Otro
grupo metablico abundante fueron las bacterias reductoras de nitrato como
Geoalkalibacter, Calditerrivibrio y algunas fermentativas tambin reductoras de nitrato

41
 Resultados

fueron Marinobacter y Marinobacterium. Otro metabolismo propio de estos ambientes es

el reductor de hierro que puede ser realizado por los gneros Geoalkalibarter y
Sphaerochaeta. Mientras que los grupos microbianos como metangenos y reductores de
sulfato no se encontraron mediante tcnicas moleculares.
En cuanto a la supervivencia de los microorganismos encontrados al interior del pozo es
importante mencionar que se encontraron mltiples organismos termfilos como
Marinobacterium, Thermovirga, Geoalkalibacter, Calditerrivibrio, Moorella, Mesotoga y
Geotoga, adems de un organismo termodrico que fue Prolixibacter. El resto de los
organismos son mesfilos como Marinobacter, Rhodovulum, Owenweeksia y
Spaherochaeta que si bien, no resisten la temperatura de yacimiento, se encuentran
relacionados con estos ambientes. Otros factores como la falta de oxgeno, alta salinidad
y alcalinidad del yacimiento tambin son factores limitantes del crecimiento microbiano al
interior del yacimiento y se discutir posteriormente la capacidad de algunos organismos
identificados para resistir tales condiciones.

3.4 Cultivo de microorganismos

Adems de las genotecas ribosomales, se explor la diversidad microbiana mediante
mtodos de cultivo, para lo cual se emplearon cuatro medios de cultivo para permitir el
crecimiento de microorganismos fermentativos, metangenos, degradadores de
hidrocarburos y aerobios o microaeroflicos. Los medios de cultivo se incubaron a 70 y
60C, una condicin limitante para la mayora de los organismos, pero que permite usar
posteriormente a los cultivos microbianos en yacimiento.

De los cuatro medios de cultivo probados slo se obtuvo crecimiento microbiano estable
en el medio R1 para microorganismos fermentativos Cuadro 9 y Figura 12. A los cultivos
se les codific como cultivo A, al proveniente de la muestra AC272, Cultivo B al
proveniente de la muestra CC332, cultivo C al desarrollado a partir de la muestra AF392 y
finalmente cultivo D al proveniente de la muestra CS823. Tanto de la muestra AC272
como de la CC332 se describieron previamente los organismos encontrados en las
genotecas ribosomales.

42
 Resultados

Cuadro 9. Obtencin de organismos cultivables.

Muestra Medio de cultivo

R1 (Fermentativos) Chicontepec R1 (Metangenos) Allen (termfilos
(Degradadores de aerobios)
hidrocarburos)
AC272 Bacilos cortos y largos Gram NC NC NC
negativos
CC332 Bacilos cortos Gram NC NC NC
negativos
AF392 Bacilos cortos Gram NC NC NC
negativos
CS823 Bacilos cortos Gram NC NC NC
negativos
NC = No se detect crecimiento despus de 60 das de incubacin.

Figura 12. Tincin de Gram de los cultivos fermentativos. Micrografas obtenidas con el
objetivo 100x, de izquierda a derecha los cultivos A (muestra AC272), B (muestra CC332),
C (muestra AF392) y D (muestra CS823).

El medio de cultivo R1 permiti la obtencin de un crecimiento abundante para todas las

muestras, en el cultivo A se observ el crecimiento de bacillos Gram negativos cortos y
largos, en tanto en los cultivos B, C y D se present crecimiento de bacilos cortos Gram
negativos (Figura 12).

En el caso del medio Chicontepec slo se present crecimiento en las botellas inoculadas
con las muestras CC332 y CS823, aunque este crecimiento decay rpidamente,
posiblemente porque el medio no aport las condiciones necesarias de concentracin de
fuentes de carbono o nutrientes en general para el desarrollo de los microorganismos. En
el medio metangenas ocurri algo similar, se obtuvo crecimiento de la muestra CS823,
pero el crecimiento decay y no fue posible sostenerlo a lo largo de dos resiembras.

43
 Resultados

Figura 13. Cultivos fermentativos en sistemas anaerobios. La coloracin y turbiedad del

medio fueron un indicador del crecimiento de microorganismos, as como la produccin de
gas y la modificacin del pH.

Finalmente, a pesar de los mltiples reportes donde se mencionan organismos aerobios,

microaeroflicos o facultativos, no se observ en ningn caso crecimiento microbiano en el
medio Allen.

Los cultivos fermentativos obtenidos en este trabajo son tiles en aplicaciones MEOR, ya
que el metabolismo fermentativo genera productos como alcoholes, cidos orgnicos,
gases miscibles y subproductos que pueden ser usados por otros grupos microbianos al
interior del yacimiento, son adems cultivos que crecen a temperaturas de 70C y 60C,
con una salinidad de 2% de NaCl y pH de 8, por lo que es altamente posible su
supervivencia en las condiciones de yacimiento de Chicontepec y Samaria. Pudiendo ser
estimulados mediante la adicin de nutrientes al pozo o incluso ser cultivados e
inyectados.

3.5 Cintica de crecimiento

Una vez que se estabiliz el crecimiento microbiano se evalu la cintica de crecimiento
para los cuatro cultivos en medio R1. Como se muestra en la figura 9 el cultivo A mostr
un crecimiento rpido, teniendo un crecimiento exponencial entre las 16 y las 32 h de
incubacin con tiempo de generacin de 8.6 h y una velocidad de crecimiento de 0.08 h-1
(Figura 9), mientras que el resto de cultivos mostraron entre s una tendencia similar
iniciando el crecimiento de fase exponencial hasta las 152 h y llegando a la fase
estacionaria hasta las 320 h, presentando durante la fase exponencial un tiempo de
generacin de 50.3 para el cultivo B, 53 h para el cultivo C y 46.8 h para el cultivo D,

44
 Resultados

presentando velocidades de crecimiento de 0.014, 0.014 y 0.013 h-1 para los cultivos B, C
y D respectivamente.

500

450

400

350

300
Protena (mg/L)

250

200

150

100

50

0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo (h)

Figura 14. Cintica de crecimiento de los cultivos fermentativos. Los cuadros

corresponden al cultivo A, los tringulos al cultivo B, la cruz al cultivo C, el asterisco al
cultivo D y el rombo al testigo de esterilidad.

Podemos observar que los cultivos B, C y D tuvieron una fase de adaptacin o lag muy
larga, a pesar de tratarse de cultivos con mltiples resiembras en el medio de cultivo, es
comn que los organismos provenientes de yacimientos tengan lentos crecimientos y esto
se ha explicado con base a que no se aportan los nutrientes existentes en yacimiento o
bien a que los microorganismos se encuentran adaptados a un metabolismo lento, dadas
las condiciones del ambiente del que provienen (Head et al. 2003).

45
 Resultados

A tiempo final de la cintica de crecimiento los microorganismos acidificaron ligeramente

el medio de cultivo desde un pH inicial de 8.3, el cultivo A disminuy el pH hasta 6.7,
mientras que los cultivos B, C y D tuvieron un pH final de 8.0 a 8.1. La acidificacin del
medio puede tener importantes beneficios a nivel de yacimiento, en primer lugar porque al
neutralizar el medio, otros grupos microbianos pueden crecer, incluso si la acumulacin
de cido persiste puede favorecer la disolucin de la roca, favoreciendo el
desprendimiento de aceite (Wolicka et al. 2010).

Para las aplicaciones posteriores se consider como una ventaja el crecimiento rpido del
cultivo A, ya que permite obtener una mayor biomasa en menor tiempo, con un menor
gasto de energa, especialmente por su incubacin a temperaturas altas (70C), es decir,
obtener la biomasa de un cultivo en 48 h y no en 300 h es una diferencia conveniente
para aplicaciones posteriores y especialmente en el caso de que se requiriera un
escalamiento en la produccin de biomasa. Adicionalmente el crecimiento rpido reduce
el tiempo invertido en cualquier prueba de laboratorio o en campo.

3.6 Hidrofobicidad de los cultivos fermentativos

Como se explic previamente en la seccin 1.1.5 diferentes propiedades de las partculas,
como son la forma, tamao, hidrofobicidad determinan su capacidad para estabilizar
emulsines. La hidrofobicidad es una caracterstica que determina la capacidad de las
clulas para establecerse en interfase de las gotas dispersas y la fase dispersante, siendo
deseable aplicar partculas con hidrofobicidad intermedia para que estabilicen
eficientemente las emulsiones.

Para conocer la hidrofobicidad de los cultivos fermentativos se us la prueba de

adherencia microbiana a hidrocarburos modificada, con diferentes solventes y se
incluyeron las muestras de petrleo de inters. La hidrofobicidad se determin en forma
de porcentaje con la siguiente frmula: Hidrofobicidad= (No. de clulas inicial No. de
clulas final ) / No. de clulas inicial x 100. Los resultados del porcentaje de hidrofobicidad
se presentan en las figuras 15 a 18. Se consider que un organismo tiene una
hidrofobicidad baja cuando el porcentaje es entre 0 y 30%, una hidrofobicidad intermedia
entre 30% y 50% y una hidrofobicidad alta a partir del 50% (Rosenberg et al. 1980). El

46
 Resultados

porcentaje de hidrofobicidad indica la cantidad de clulas que se adhirieron a los

solventes de prueba, al diesel o a los crudos.

El cultivo A mostr una alta hidrofobicidad entre 96 y 99% (Figura 15), se trata de clulas
altamente hidrofbicas, a pesar de que este cultivo se obtuvo a partir de agua congnita.
De igual forma el cultivo D present una hidrofobicidad alta con respecto a todos los
solventes entre 51% y 87% (Figura 18).

100

90

80

70
Hidrofobicidad %

60

50

40

30

20

10

0
Hexadecano Xileno Tolueno Octano Diesel Aceite Aceite Agua Aceite
Coyotes Fra Samaria
Solventes

Figura 15. Porcentaje de hidrofobicidad cultivo A.

En el caso del cultivo B (Figura 16), en la mayora de los casos se observ una
hidrofobicidad alta (68%-85%), excepto para la interaccin con el aceite de la zona
Coyotes, ante ste, las clulas tuvieron una hidrofobicidad intermedia de 44%,
probablemente debido a que es el mismo aceite del cual se aisl el cultivo y posiblemente
se encuentre bien adaptado a ambas fases, agua y aceite.

47
 Resultados

100

90

80
Hidrofobicidad %

70

60

50

40

30

20

10

0
Hexadecano Xileno Tolueno Octano Diesel Aceite Aceite Agua Aceite
Coyotes Fra Samaria
Solventes

Figura 16. Porcentaje de hidrofobicidad cultivo B.

Para el cultivo C (Figura 17) se observ una hidrofobicidad intermedia para hexadecano,
xileno, octano y diesel, mientras que para el tolueno y las muestras de aceite se observ
una hidrofobicidad alta, sin que rebasara el 67%.

100

90

80
Hidrofobicidad %

70

60

50

40

30

20

10

0
Hexadecano Xileno Tolueno Octano Diesel Aceite Aceite Agua Aceite
Coyotes Fra Samaria
Solventes

Figura 17. Porcentaje de hidrofobicidad cultivo C.

48
 Resultados

100

90

80
Hidrofobicidad %

70

60

50

40

30

20

10

0
Hexadecano Xileno Tolueno Octano Diesel Aceite Aceite Agua Aceite
Coyotes Fra Samaria
Solventes

Figura 18. Porcentaje de hidrofobicidad cultivo D.

El cultivo C present una hidrofobicidad intermedia en la mayora de los casos, es por ello
que se propone como el cultivo que puede estabilizar de forma ms eficiente las
emulsiones por su capacidad para establecerse en la interfase del agua y crudo. De los
resultados anteriores se espera que los cultivos B, C y D que presentaron una mayor
hidrofobicidad no favorezcan la estabilizacin de emulsiones. Sin embargo, existen otros
parmetros que influyen en la estabilizacin de emulsiones como la salinidad,
composicin del aceite, entre otras (Bidyut y Moulik, 2001). Por lo anterior se realizaron
pruebas de estabilizacin de emulsiones con cada uno de los cultivos fermentativos como
se ver en la siguiente seccin.

3.7 Estabilizacin de emulsiones por suspensiones bacterianas

Actualmente se usan emulsiones para la extraccin de petrleo, dichas emulsiones son
producidas con solventes, surfactantes, partculas e incluso nanopartculas, sin embargo
el costo de dichas emulsiones es alto y por ello en este trabajo se propone el uso de
clulas para la estabilizacin de emulsiones de aceite y agua.

49
 Resultados

Para conocer el efecto de las clulas sobre la estabilizacin de emulsiones se probaron

suspensiones celulares de los diferentes cultivos con crudo de la muestra AF392 (figura
19). Las variables consideradas para evaluar la estabilidad de emulsiones fueron: la
relacin de crudo/agua, la concentracin de clulas y la salinidad; se evalu el nivel de
estabilidad de la emulsin con una escala de 0 a 3.

Con la finalidad de representar en un solo esquema las tres variables probadas: salinidad,
clulas y relacin de crudo/agua; se construyeron diagramas triangulares, con los datos
normalizados en escalas de 0 a 100, se representaron con colores las zonas con diferente
estabilidad, el color verde oscuro corresponde a las zonas con mxima estabilidad 3, en
verde claro el nivel de estabilidad 2, en azul claro el nivel de estabilidad 1 y en azul oscuro
el valor 0 que corresponde a las emulsiones donde las fases se separaron
inmediatamente.

En cada grfico la escala inferior corresponde a la cantidad de clulas, por lo que el

extremo derecho corresponde a la zona en que no se emplearon clulas, la zona del
extremo izquierdo corresponde a aquella en que se usan 0.5 DO y el valor 20 marcado
con una lnea negra corresponde al 0.1 DO de clulas. Con respecto a la salinidad se
marcan los 4 niveles de concentracin de NaCl, 3.3 corresponde a salinidad 0.1%, el valor
33 corresponde a salinidad 1%, el valor 66 corresponde a salinidad 2% y el valor 100 a
salinidad 3%. Finalmente la escala del lado derecho muestra los dos valores de radio
aceite y agua, con marca en el valor 20 que corresponde a 0.1 radio aceite agua y el
valor 100 correspondiente al radio aceite agua de 0.5.

Los cultivos A, C y D mostraron zonas de mayor estabilidad (3) en las zonas de salinidad
de 1 y 3%; cuando se us una concentracin de clulas de 0.1 y un radio de aceite agua
de 0.5. Con el cultivo B, no se generaron emulsiones con estabilidad 3, slo emulsiones
de estabilidad 2 y no hubo diferencia cuando se aadieron clulas, por lo que
aparentemente este cultivo no favoreci la estabilizacin de emulsiones.

50
 Resultados

A B

C D

Figura 19. Estabilidad de emulsiones con el cultivo A, B, C y D con crudo AF392. Se

muestran los niveles de estabilidad con smbolos y nmeros: rombos para estabilidad 3,
tringulos orientados hacia arriba para estabilidad 2, tringulo orientado hacia abajo para
estabilidad 1 y estrella para nivel de estabilidad 0.

De los resultados de hidrofobicidad obtenidos en la seccin anterior se esperaba que el

cultivo C estabilizara de forma ms eficiente las emulsiones y efectivamente se gener
una mayor rea de emulsiones con estabilidad mxima, sin embargo, tanto las clulas del
cultivo A como las del cultivo D tambin tuvieron efecto positivo en la estabilizacin de
emulsiones, independientemente de su alta hidrofobicidad.

51
 Resultados

Considerando los resultados se seleccionaron a los cultivos C y A para probar la

formacin de emulsiones con otros crudos, El cultivo C se seleccion porque gener un
mayor nmero de emulsiones con alta estabilidad y el cultivo A porque tambin gener un
buen nmero de emulsiones con mxima estabilidad, pero tuvo adems un crecimiento
celular rpido.

Usando el crudo CC154, se formaron emulsiones con la estabilidad mxima bajo

condiciones de salinidad de 1% y 3% y relacin de crudo/agua de 0.5, sin embargo, las
emulsiones fueron estables con clulas 0.1 y sin clulas (figura 20), es decir, no hubo
efecto de las clulas sobre la formacin de emulsiones. De tal forma que la composicin
del petrleo, ya sea por surfactantes naturales o por el contenido de partculas es
igualmente eficiente para generar las emulsiones que la adicin de clulas.

A C

Figura 20. Estabilidad de emulsiones empleando los cultivos A y C y crudo CC154. Se

muestran los niveles de estabilidad con smbolos y nmeros: rombos para estabilidad 3,
tringulos hacia arriba para estabilidad 2, tringulo hacia abajo para estabilidad 1 y
estrella para nivel de estabilidad 0.

52
 Resultados

Cuando se us el crudo proveniente de la zona Presidente Alemn (PA), se observ una

diferencia importante debida al cultivo microbiano empleado, cuando se emple el cultivo
A se obtuvo una mayor zona de estabilidad de emulsin, en ambos casos la estabilidad se
vio favorecida por efecto de las clulas y nuevamente cuando se usaron las clulas del
cultivo A las zonas de mayor estabilidad fueron de salinidad 1 y 3%, concentracin de
clulas de 0.1 y relacin crudo agua de 0.5. Cuando se usaron las clulas del cultivo C,
slo se logr la mxima estabilidad con 0.1 de clulas, salinidad de 3% y relacin de
crudo/agua de 0.5.

A C

Figura 21. Estabilidad de emulsiones con los cultivos A y C y crudo PA. Los niveles de
estabilidad se indican con rombos para estabilidad 3, tringulos hacia arriba para
estabilidad 2, tringulo hacia abajo para estabilidad 1 y estrella para nivel de estabilidad 0.

Finalmente, cuando se probaron los mismos cultivos con el crudo CS823, el

comportamiento fue nuevamente dependiente del cultivo empleado. Sin embargo, en
ambos casos las clulas no fueron determinantes en la estabilidad de las emulsiones.
Cuando se usaron clulas del cultivo A, las emulsiones fueron ms estables cuando no se
adicionaron clulas. Mientras que con el cultivo C la estabilidad de las emulsiones se
present en una mayor rea, pero se consigui la mxima estabilidad cuando no se
usaron clulas y cuando se usaron clulas a bajas concentraciones.

53
 Resultados

A C

Figura 22. Estabilidad de emulsiones con el cultivo A y B con el aceite de la zona

Samaria.

El comportamiento de las emulsiones es determinante cuando se usan diferentes aceites,

esto se debe a la composicin de los mismos, ya sea por los emulsificantes naturales que
contienen (asfaltenos, parafinas, etc), la cantidad de sales o incluso si se trata de un
crudo pesado o ligero.

Al finalizar los estudios se realiz un anlisis de varianza del diseo factorial de 4 niveles,
de 3 factores, con 2 rplicas, para el cual una probabilidad P< 0.1 fue considerada como
indicador de un efecto sobre la estabilidad de emulsiones para los factores por separado:
salinidad, concentracin de clulas y relacin crudo/agua, as como la interaccin de los
factores salinidad * concentracin de clulas, salinidad * relacin crudo/agua y
concentracin de clulas *r elacin crudo/agua. En el Cuadro 10 se muestran los valores
de probabilidad para los diferentes factores, se sealan en rojo los valores que indicaron
un efecto en la estabilidad de emulsiones ya sea por un factor o la combinacin de
factores.

54
 Resultados

Cuadro 10. Anlisis de varianza para la estabilidad de emulsiones.

Cultivo Cultivo Cultivo Cultivo Cultivo Cultivo Cultivo Cultivo Cultivo Cultivo
A en B en C en D en A en C en A en C en A en C en
AF392 AF392 AF392 AF392 CC154 CC154 PA PA CS823 CS823

Salinidad 0.499 0.455 0.455 * 0.455 0.802 0.455 0.709 * 0.455

Concentracin 0.005 0.007 0.021 * 0.422 0.178 0.001 0.005 * 0.016

de clulas

Relacin 0 0 0.002 * 0 0 0 0.32 * 0

crudo/agua

Salinidad*conce 0.09 0.5 0.5 * 0.5 0.5 0.5 0.5 * 0.5

ntracin de
clulas

Salinidad*Relaci 0.142 0.455 0.455 * 0.455 0.802 0.455 0.709 * 0.455

n crudo/agua

Concentracin 0.011 0.002 0.579 * 0.422 0.178 0.125 0.008 * 0.002

de
clulas*Relaci
n crudo/agua

* El denominador de la prueba F fue 0, por lo tanto no pudo calcularse la probabilidad.

Se observa que los factores concentracin de clulas y relacin crudo/agua tienen efecto
significativo en la estabilidad de las emulsiones, en la mayora de las emulsiones. Esto
confirma que las clulas s tienen efecto en la estabilizacin de emulsiones. Por otra parte
el efecto combinado de la concentracin de clulas y la relacin crudo/agua se observ
que es significativo, pero slo para las emulsiones formadas con clulas del cultivo A y B
en crudo AF392 y el cultivo C en crudo CS823. Es importante mencionar que los valores
significativos no distinguen entre si este efecto de las clulas y la relacin crudo/agua es
positivo o negativo en la estabilidad de las emulsiones.

55
 Resultados

3.8 Propiedades reolgicas de las emulsiones de aceite y agua

Una vez que se demostr el efecto de las clulas sobre la estabilidad de las emulsiones
en sistemas de 3 ml, se formaron emulsiones en sistemas de 120 y 500 ml para evaluar
su estabilidad a travs de las propiedades reolgicas. Para formar las emulsiones se
seleccion al cultivo A debido a su rpido crecimiento y a que es capaz de estabilizar
emulsiones al igual que el cultivo C. Dada la disponibilidad de muestras se probaron los
crudos AF392 y CS823 cuyas propiedades generales se listan en el cuadro 7.

El resultado de las emulsiones preparadas con crudo CS823 fue una separacin
inmediata de fases en cuanto se suspendi la aplicacin de energa, independientemente
de la adicin de regulador con o sin clulas; adems se gener un precipitado de sales en
la fase acuosa.

Las emulsiones preparadas con el aceite AF392 de Chicontepec, se formaron

completamente y permanecieron estables tanto en los sistemas de 120 ml como en los de
500 ml. A partir de estas emulsiones se realiz la caracterizacin reolgica. Las
emulsiones se prepararon con una relacin de crudo/agua de 0.5, con la siguiente
composicin: emulsin 1, regulador PUM salinidad 1%; emulsin 2, regulador PUM
salinidad 1% con 0.1 DO de clulas; emulsin 3, regulador PUM salinidad 3%; emulsin 4,
regulador PUM salinidad 3% con 0.1 DO de clulas.

Comnmente para las emulsiones usadas en extraccin mejorada de petrleo existen dos
caractersticas que son continuamente reportadas, en primer lugar la reduccin de la
tensin superficial por agentes tensoactivos o por emulsionantes naturales del aceite; en
segundo lugar la viscosidad incrementada de la emulsin. Ambos parmetros se han
descrito que permiten desplazar el aceite del poro de la roca y aumentar la eficacia del
barrido de las soluciones de inyeccin (Nazar et al. 2011). Es por esto que se determin la
tensin superficial del regulador, de las suspensiones celulares, del aceite de prueba y de
las emulsiones formadas. En la figura 24 se muestran los resultados de tensin
superficial. El regulador PUM tuvo la misma tensin superficial del agua 72 mNm-1 y la
adicin de clulas no tuvo un efecto en la tensin superficial. En cuanto al aceite de la
zona Agua Fra, ste tuvo una tensin superficial de 31.63 mNm-1, mientras que las
emulsiones tuvieron tensiones superficiales que oscilaron entre 43.5 y 53.36 mNm-1. Es
decir, la emulsificacin tuvo un efecto sobre la tensin superficial, pero la tensin
increment, de modo contario a lo esperado. Aunque, la adicin de clulas disminuy la

56
 Resultados

tensin superficial con respecto a las emulsiones formadas slo con regulador PUM, la
emulsin 2 con clulas aadidas tuvo una tensin superficial de 43.5 mNm-1 con respecto
a la emulsin 1 (sin clulas) cuya tensin superficial fue de 53.3 mNm-1, casi diez
unidades ms. La emulsin 4 con clulas tuvo una tensin superficial de 45.6 mNm-1,
mientras que la emulsin 3 con el mismo regulador pero sin clulas tuvo una tensin
superficial de 50.4 mNm-1.

80

70

60

50
mN m-1

40

30

20

10

0
PUM 1% PUM 3% PUM 1% PUM 3% Aceite Agua Emulsin 1 Emulsin 2 Emulsin 3 Emulsin 4
NaCl NaCl NaCl, NaCl, Fra 392 (sin clulas, (0.1 clulas, (sin clulas, (0.1 clulas,
clulas clulas NaCl 1%) NaCl 1%) NaCl 3%) NaCl 3%)
Muestra

Figura 23. Tensin superficial de emulsiones, crudos y reguladores.

Posteriormente se determin la viscosidad y su relacin con la deformacin, adems se

determinaron los mdulos de almacenamiento G y prdida G, con los que se evalu la
estabilidad de las emulsiones con respecto a la frecuencia (Tadros, 2004).

Inicialmente se realiz un barrido de deformacin para determinar los lmites del

comportamiento viscoelstico lineal de la muestra, dado que en esta regin las
propiedades no son dependientes de la deformacin ni del esfuerzo. Dentro de la zona
lineal se realiz un barrido de viscosidad contra deformacin para las cuatro emulsiones
analizadas (Figura 24).

57
 Resultados

10000 10000

1000 1000

Viscosidad (Pa s)
Viscosidad (Pa s)

100 100

10 10

1 1

0.1 0.1
0.01 1 100 0.01 1 100
A Deformacin (s-1) B Deformacin (s-1)

10000 10000

1000 1000
Viscosidad (Pa s)

Viscosidad (Pa s)

100 100

10 10

1 1

0.1 0.1
0.01 0.1 1 10 100 1000 0.01 1 100
C Deformacin (s-1) D Deformacin (s-1)

Figura 24. Viscosidad de las emulsiones contra deformacin. A) emulsin 1 (NaCl 1%, sin
clulas); B) emulsin 2 (NaCl 1%, con clulas 0.1 OD a 620 nm); C) emulsin 3 (NaCl
3%, sin clulas), D) emulsin 4 (NaCl 3%, con clulas 0.1 OD a 620 nm); pruebas por
duplicado.

58
 Resultados

10000

y = 53.744x-0.548
R = 0.9966

1000 y = 31.132x-0.51
R = 0.9963

y = 72.344x-0.576
R = 0.9942
y = 97.242x-0.613
Viscosidad (Pa s)

100 R = 0.9957

10

0.1
0.01 0.1 1 10 100 1000
Deformacin (s-1)

Figura 25. Viscosidad contra deformacin para las emulsiones 1, 2, 3 y 4. Los rombos
negros corresponden a la emulsin 1, los cuadros grises a la emulsin 2, los tringulos
grises a la emulsin 3 y las cruces grises a la emulsin 4. Las ecuaciones se muestran de
arriba hacia abajo de la 1 a la 4.

A partir de la ecuacin de la recta en la grfica anterior se consider la Ley de la potencia

n-1
donde = , se aplic la ley de los logaritmos para obtener la forma de una ecuacin
lineal y los valores se obtuvieron a partir de la figura 25 con escalas logartmicas para y
para , de acuerdo a la siguiente ecuacin Log = log + log (n-1) . Entonces se
obtuvieron los datos que se muestran en el cuadro 11, donde k es el valor hipottico de la
ordenada al origen, R2 es el indicador de linealidad, que soporta la aplicacin de la ley de
la potencia y n es el ndice de comportamiento de flujo (Mndez-Montealvo et al. 2001).

59
 Resultados

Cuadro 11. Valores que se dedujeron a partir de la de la ley de la potencia.

Emulsin k n R2
1 53.744 0.452 0.9966
2 31.132 0.49 0.9963
3 72.344 0.424 0.9942
4 97.242 0.387 0.9957

Con los valores de n se puede deducir el comportamiento de las emulsiones de acuerdo

a los siguientes intervalos:

a) n < 1 cuando son sistemas reofluidizantes, es decir que disminuye su

viscosidad a medida que aumenta el esfuerzo aplicado. Tambin cuando son
sistemas dbilmente floculados o tienen espesantes aadidos.
b) n = 1 cuando se trata de fluidos Newtonianos
c) n > 1 sistemas de engrosamiento por corte, es decir, que aumentan su
viscosidad a medida que aumenta el esfuerzo aplicado.

Las emulsiones analizadas tuvieron un comportamiento reofluidizante tanto por el

comportamiento que se aprecia en las figuras 24 y 25 como por el valor obtenido de n.

Posteriormente se realiz un barrido de frecuencia, en el cual se observaron los cambios

del comportamiento elstico y viscoso de la muestra, a travs de los valores de los
mdulos de almacenamiento G y de prdida G respectivamente. Las figuras 26 a 29
muestran este comportamiento por duplicado para cada una de las cuatro emulsiones.

En la figura 26 se muestra el barrido de frecuencia para la emulsin 1. A bajas frecuencias

el mdulo de almacenamiento fue mayor, se produjo el cruce a una frecuencia de 0.158
Hz y a partir de este punto ambos mdulos crecieron exponencialmente siendo mayor el
mdulo de prdida. Para la emulsin 2 en la que se aadieron clulas se tiene el mismo
comportamiento en la grfica (figura 27), incluso se produjo el cruce de los valores de los
mdulos a la misma frecuencia.

60
 Resultados

1.00E+04

1.00E+03

1.00E+02

G', G'' (Pa)

1.00E+01

1.00E+00

1.00E-01
0.01 0.1 1 10 100 1000
Frecuencia (Hz)

Figura 26. Barrido de frecuencia para la emulsin 1. Las equis y los cuadros grises
corresponden a G (mdulo de prdida); y los rombos negros y los tringulos grises
corresponden a G (mdulo de almacenamiento).

1.00E+04

1.00E+03

1.00E+02
G', G'' (Pa)

1.00E+01

1.00E+00

1.00E-01
0.01 0.1 1 10 100 1000
Frecuencia (Hz)

Figura 27. Barrido de frecuencia para la emulsin 2. Las equis y los cuadros grises
corresponden a G y los rombos negros y los tringulos grises corresponden a G.

61
 Resultados

Las emulsiones 3 y 4 se prepararon con una salinidad de NaCl de 3% y se obsev un

ligero cambio en el comportamiento de los mdulos con respecto a las emulsiones 1 y 2,
como se aprecia en las figuras 28 y 29 se extendi la zona donde el mdulo de
almacenamiento fue mayor o igual que el de prdida, el punto de cruce se observ a una
frecuencia de 0.996 Hz para la emulsin 3 y a 0.628 Hz para la emulsin 4 y a partir de
este cruce nuevamente aumentaron los valores para ambos mdulos, siendo mayor el
mdulo de prdida G.

1.00E+04

1.00E+03

1.00E+02
G', G'' (Pa)

1.00E+01

1.00E+00

1.00E-01
0.01 0.1 1 10 100 1000
Frecuencia (Hz)

Figura 28. Barrido de frecuencia para la emulsin 3. Las equis y los cuadros grises
corresponden a G y los rombos negros y los tringulos grises corresponden a G.

62
 Resultados

1.00E+04

1.00E+03

1.00E+02
G', G'' (Pa)

1.00E+01

1.00E+00

1.00E-01
0.01 0.1 1 10 100 1000
Frecuencia (Hz)

Figura 29. Barrido de frecuencia para la emulsin 4. Las equis los cuadros grises
corresponden a G y los rombos negros y los tringulos grises corresponden a G.

En la figura 30 se muestran reunidos los valores para la emulsin 1 y la emulsin 2, se

aprecia que hay una ligera variacin, aunque el cruce de ambos mdulos se da en el
mismo punto y la respuesta al incremento en la frecuencia sigue la misma tendencia, por
lo que se puede determinar que no hubo un efecto de las clulas sobre el comportamiento
reolgico de las emulsiones.

En la figura 31 se reunieron los resultados para las emulsiones 3 y 4, con respecto al

grfico anterior se observan diferencias debidas al aumento en la salinidad. Se modific el
punto de cruce de ambos mdulos, para la emulsin 3 el punto de cruce fue en 0.996 Hz y
para la emulsin 4 fue en 0.628 Hz. Es decir, en la emulsin que no contena clulas se
extendi el rea en que el mdulo de almacenamiento fue mayor. Dado que se considera
a una emulsin estable cuando el mdulo de almacenamiento es mayor al mdulo de
prdida, para estas emulsiones la adicin de clulas result en una disminucin de la
estabilidad (Torres et al., 2007).

63
 Resultados

1.00E+04

1.00E+03

1.00E+02

G', G'' (Pa)

1.00E+01

1.00E+00

1.00E-01
0.01 0.1 1 10 100 1000
Frecuencia (Hz)

Figura 30. Barrido de frecuencia para las emulsiones 1 y 2. Los cuadros grises
corresponden a G de la emulsin 1, las equis a G de la emulsin 2 y el rombo negro y el
tringulo gris corresponden a G de las emulsiones 1 y 2 respectivamente.

1.00E+04

1.00E+03

1.00E+02
G' G'' (Pa)

1.00E+01

1.00E+00

1.00E-01
0.01 0.1 1 10 100 1000
Frecuencia (Hz)

Figura 3124. Barrido de frecuencia para las emulsiones 3 y 4. Los cuadros grises
corresponden a G de la emulsin 3, las equis a G de la emulsin 4 y el rombo negro y el
tringulo gris corresponden a G de las emulsiones 3 y 4 respectivamente.

64
 Resultados

Se considera que una emulsin es estable cuando G es mayor a G y ambas son

independientes de la frecuencia (Torres et al. 2007). En cada caso se puede apreciar que
G es mayor a G slo a frecuencias bajas y hay una relacin entre los valores de los
mdulos de prdida y almacenamiento con respecto a la frecuencia.

Sin embargo, existe otro parmetro con el cul se puede determinar la estabilidad de las
emulsiones, el valor angular y est relacionado con los valores de G y G de la
siguiente forma:

G = cos

G = sin

Por lo tanto, Tan = G / G

Se obtiene () = tan-1 (G/G)

Con los valores angulares se pueden definir los comportamientos de las emulsiones en
los siguientes intervalos: 0 a 45 para emulsiones fuertemente asociadas , 45 a 70 para
emulsiones dbilmente asociadas y 70 a 90 para emulsiones no asociadas.

Como se aprecia en la figura 32 las emulsiones obtenidas en este trabajo presentaron los
tres comportamientos dependiendo de la frecuencia empleada, es decir a bajas
frecuencias todas las emulsiones se encontraron fuertemente asociadas, a frecuencias
intermedias se tuvo una menor asociacin y finalmente a frecuencias altas las emulsiones
no estuvieron asociadas. Slo en el caso de la emulsin 3 incluso a la mxima frecuencia
todava se ubic en valores de asociacin dbil, pero sin llegar a disociarse.

65
 Resultados

Figura 32. Relacin del valor angular de delta con respecto a la frecuencia para las
diferentes emulsiones.Los rombos representan la emulsin 1, los cuadros la emulsin 2,
los tringulos la emulsin 3 y las cruces la emulsin 4.

3.9 Identificacin del cultivo seleccionado

El cultivo A demostr tener efecto en la estabilidad de emulsiones y dado su rpido
crecimiento, se propone como un cultivo til para aplicaciones MEOR. En la figura 33 se
observa el rbol filogentico en el cual se aprecia la asociacin del cultivo A con
Thermoanaerobacter mathranii con nmero de acceso NR_074681, adems se obtuvo
una similitud de 99%, entre ambas secuencias.

66
 Resultados

98 NR_074681 Thermoanaerobacter mathranii

Cultivo A

50 L09164 Thermoanaerobacter pseudethanolicus

NR_027577 Thermoanaerobacter brockii
89 EF554599 Thermoanaerobacter subterraneus
59
100 NR_025056 Thermoanaerobacter yonseiensis
EU262599 Thermoanaerobacter inferii
L09160 Thermoanaerobacter kivui

93 L09163 Thermoanaerobacter acetoethylicus

99 L09162 Thermoanaerobacter ethanolicus
AF321086 Gelria glutamica

0.005

Figura 3325. rbol filogentico del cultivo A. Se construy con mtodos de distancia con
un alineamiento de 422 posiciones, usando el mtodo de agrupamiento Neighbor-Joining
y Jukes-Cantor para calcular la distancia, se realiz un remuestreo bootstrap de 1000
rplicas, empleando el programa Mega 5.2.

Thermoanaerobacter mathranii es una bacteria anaerobia, termfila, con metabolismo

fermentativo, fue aislada de una fuente hidrotermal en Islandia y se encuentra bien
adaptada a las condiciones presentes en la zona Coyotes del yacimeinto Chicontepec,
pues crece en un intervalo de temperatura de 50 a 75C y en un intervalo de pH de 4.7
hasta 8.8 (Larsen et al. 1997). Este cultivo se obtuvo de la muestra de agua congnita
AC272, sin embargo no se encontr en la genoteca ribosomal, es probable que se trate
de un organismo poco abundante en el agua congnita y que fue enriquecido de entre
otros integrantes de la comunidad, a travs del cultivo con las condiciones de temperatura
y pH.

67
 Discusin

IV. DISCUSIN

4.1 Diversidad microbiana en agua congnita y crudo de Coyotes,

Chicontepec
En este trabajo se analiz la diversidad microbiana a partir de dos muestras
correspondientes a las fases de crudo y agua congnita de dos pozos de la zona Coyotes
en el yacimiento Chicontepec. Se observaron diferencias importantes en la composicin
de la comunidad microbiana asociada a agua y a crudo, la diversidad en la muestra de
agua congnita fue amplia y se encontraron microorganismos pertenecientes a 9
diferentes grupos bacterianos, mientras que la diversidad en la muestra de crudo se limit
a 2 grupos microbianos. Estas diferencias en la diversidad se deben a la afinidad de las
clulas por la fase orgnica o la fase acuosa, en general se sabe que las clulas se
encuentran principalmente en la fase acuosa del petrleo debido a la naturaleza de la
superficie celular y a la disponibilidad de nutrientes (Wolicka et al. 2010). Adems, el
yacimiento Chicontepec es altamente heterogneo y existe una importante variacin en
las propiedades qumicas y geolgicas en pozos cercanos an en la misma zona de
explotacin (CNH, 2010) y por ello se espera que existan comunidades microbianas
diferentes en cada pozo.

La mayora de las especies encontradas en este trabajo, han sido descritas previamente
en ambientes de yacimientos petroleros, en sedimentos marinos o fuentes hidrotermales,
o bien en sitios contaminados con petrleo. Por lo tanto la comunidad aqu descrita
evidentemente est asociada al yacimiento, nicamente el gnero Mesorhizobium que se
encontr en la genoteca de agua congnita, se puede considerar exgeno, por ser una
bacteria habitante de suelo superficial que participa en la nodulacin de plantas y fijacin
de nitrgeno, no hay reportes en los que se haya encontrado en ambientes de pozo
petrolero o en lodos de perforacin, pero s se report como integrante de un consorcio
microbiano degradador de hidrocarburos (da Cruz et al. 2011).
En la genoteca a partir de aceite se encontr un conjunto de 12 clonas que se asociaron
con algunas secuencias previamente reportadas, pero no clasificadas an. Entre estas
secuencias se encuentran algunas obtenidas a partir de pozos de alquitrn en California,
Estados Unidos; estas muestras se tomaron de zonas donde se han datado fsiles con
antigedades entre 10 000 y 38 000 aos, sugiriendo que los microorganismos ah
encontrados son relevantes metablicamente por su supervivencia a lo largo del tiempo

68
 Discusin

en un ambiente rico en compuestos recalcitrantes como fuente de carbono (Kim y

Crowley, 2007). Otra secuencia con la que tuvieron una gran similitud las clonas fue
encontrada en una muestra de petrleo obtenido en Malasia (Ying y Jong, 2008). Una
secuencia ms fue identificada en sedimentos de un tanque de alquitrn en Sidney,
Australia (Yeung et al. 2011). Tambin se encontr similitud con una secuencia reportada
en sedimento contaminado de la baha de Suez (Elsaied et al. 2011). Estos datos
suponen que este grupo microbiano est bien adaptado a ambientes petroleros y para
lograr su correcta identificacin o descripcin de las especies es necesario realizar ms
estudios, ya sea mediante el uso de herramientas genmicas o bien, enfocar los
esfuerzos de cultivo.

Un gnero encontrado en ambas genotecas fue Marinobacterium, gnero de bacterias

marinas que fue descrito inicialmente a partir de un enriquecimiento de microorganismos
lignocelulolticos, se trata de bacterias aerobias capaces de usar como fuente de carbono
una gran variedad de compuestos orgnicos y metanol, son bacterias termodricas que
crecen en temperaturas desde 4C hasta 41C; y en un intervalo de pH desde 5.5 hasta
9.5 (Gonzalez et al. 1997). Al tratarse de bacterias aerobias es difcil considerarlas como
habitantes del yacimiento, sin embargo otras caractersticas como la resistencia a
temperatura superior de 40C y crecimiento en un intervalo de pH amplio, sugieren que
puedan sobrevivir al interior de un pozo. Adems, integrantes de este mismo gnero ya se
han descrito en un consorcio utilizado en la extraccin mejorada de petrleo (Hendrickson
et al. 2013)

Dentro del orden Thermotogales se encontr a Geotoga petraea un organismo anaerobio

estricto, termfilo y fermentativo; as como a Mesotoga prima, termfilo moderado,
fermentativo que puede utilizar tanto carbohidratos como protenas como fuente de
carbono. Ambos son considerados organismos autctonos del subsuelo profundo y de
yacimientos petroleros (Magot et al. 2000).
Otro gnero bacteriano relacionado con las secuencias aqu reportadas es Thermovirga
lienii un microorganismo fermentativo que fue descrito en agua congnita de un
yacimiento petrolero de alta temperatura en la formacin Troll en el mar del norte en
Noruega (Dahle y Birkeland, 2006). De acuerdo a sus caractersticas de crecimiento, este
microorganismo puede sobrevivir en yacimientos, ya que se trata de una bacteria
anaerobia fermentativa que crece en intervalos de temperatura de 38 a 68C, y en un
intervalo de pH entre 6.2 y 8 y salinidad como NaCl entre 0.5 y 8%.

69
 Discusin

La clona 46 de la genoteca de agua congnita se asoci con una bacteria que fue
encontrada en la zona submareal de la costa que fue expuesta a hidrocarburos con el
derrame del buque Prestige (Acosta et al. 2013). Adems fue ubicada a nivel de gnero
con Rhodovulum, un gnero de bacterias prpuras, fotosintticas y comnmente aisladas
de sedimentos marinos, que son capaces de oxidar hierro ferroso y producir importantes
cantidades de hidrgeno, por lo que se ha estudiado recientemente con enfoque hacia
energas alternativas (Cai y Wang, 2013; Straub et al. 1999).

Otros grupos microbianos encontrados fueron Geoalkalibacter, Calditerrivibrio, Moorella y

Prolixibacter, todos ellos son termoflicos o termodricos capaces de resistir temperaturas
de al menos 50C con metabolismos fermentativos, reductores de hierro o reductores de
nitrato, son organismos capaces de sobrevivir en temperaturas cercanas a las del
yacimiento Chicontepec y cuyo metabolismo corresponde al de los organismos habitantes
de yacimientos (Greene et al. 2009; Holmes et al. 2007; Iino et al. 2008; Slobodkin et al.
1997).

La supervivencia de los microorganismos en el yacimiento es importante para el xito de

las aplicaciones MEOR y es por ello que comnmente se opta por favorecer el
crecimiento de microorganismos autctonos, con la finalidad de obtener resultados por
mayores periodos de tiempo (Magot et al. 2000).

Debido a que la mayora de los microorganismos identificados son termfilos se estima

que tienen un alto potencial para sobrevivir en el yacimiento. Sin embargo, tambin se
encontraron algunos organismos mesfilos en las libreras ribosomales como
Rhodovulum, Marinobacter, Owenweeksia y Sphaerochaeta (Straub et al. 1999; Li et al.
2013; Riedel et al. 2012; Ritalahti et al. 2012) . Aunque la supervivencia de mesfilos, en
un yacimiento con temperaturas mayores a 60C es poco probable, se ha propuesto que
al interior del subsuelo se pueden formar microambientes por filtraciones de agua en
donde puedan sobrevivir por largos periodos de tiempo (Dahle et al. 2008).
Adems de las limitaciones impuestas por la temperatura, el yacimiento tiene una
salinidad de 3% que puede ser tolerada por la mayora de las especies aqu identificadas,
ya sea porque son especies provenientes de ambientes marinos, o porque son descritas
como organismos haloflicos como Marinobacter, Rhodovulum y Thermovirga (Li et al.
2013; Straub et al. 1999; Dahle y Birkeland, 2006).

70
 Discusin

La contribucin de los grupos microbianos previamente descritos en los ciclos

biogeoqumicos es importante principalmente en el ciclo del carbono, pues mltiples
organismos son capaces de usar una amplia variedad de fuentes de carbono, por va
fermentativa y no fermentativa contribuyendo a su reciclaje en el ambiente. Tambin se
encontraron microorganismos que participan en la solubilizacin de hierro a travs de la
reduccin y tambin a un organismo oxidador de hierro. En el caso del ciclo del azufre es
sorprendente que no se encontraran organismos reductores de sulfato que son
frecuentemente encontrados en yacimientos petroleros, sin embargo, su posible ausencia
es prometedora para aplicaciones MEOR. Finalmente en el caso de los microorganismos
que participan en el ciclo del nitrgeno se encontraron diferentes grupos de reductores de
nitrato y un fijador de nitrgeno, al respecto del fijador de nitrgeno Mesorhizobium, se
trata de un organismo nodulador y su presencia en el yacimiento puede explicarse como
una introduccin por maniobras de operacin y no como un habitante de este ambiente.
Por otra parte la deteccin de organismos reductores de nitrato es un indicador de que se
puede promover el metabolismo de los mismos, adems, algunos de ellos son tambin
fermentadores cuyos subproductos como cidos, gases, o solventes pueden favorecer la
extraccin de aceite.

Entre los microorganismos que se encontraron en las muestras, las bacterias de origen
marino fueron abundantes y esto pudo deberse a que, fueron recientemente inyectados
con agua de mar, o se han encontrado sobreviviendo en microambientes de yacimiento
que se generaron a travs de filtraciones de grietas marinas o incluso en sistemas que
quedaron atrapados hace miles de aos y crearon un microambiente con condiciones
aptas para la supervivencia (DHont et al. 2002). Es importante aclarar que ambos pozos
fueron muestreados antes de iniciar la extraccin secundaria de petrleo, lo que significa
que no haban sido inyectados con agua (Muoz-Colunga comunicacin personal), sin
embargo, la inyeccin de agua en pozos cercanos tambin pudo conducir al
desplazamiento o colonizacin hacia zonas distantes, dentro del mismo yacimiento.

En este trabajo se realiz la primera descripcin de la comunidad bacteriana al interior de

un yacimiento petrolero mexicano. En trabajos previos se han descrito organismo
cultivables, llegando incluso a proponer nuevas especies como Garciella nitratireducens y
Petrotoga mexicana (Miranda-Tello et al. 2003; Miranda-Tello et al. 2004).
Tambin se han cultivado organismos a partir de muestras del yacimiento Chicontepec,
identificando a integrantes de los gneros Thermoanaerobacter (Castorena et al. 2012)

71
 Discusin

Caldanaerobacter y Thermotoga (Hernndez-Gama et al. 2013). Ambos trabajos

realizados con microorganismos del yacimiento Chicontepec se enfocaron en la
produccin de CO2 por metabolismo fermentativo, subproducto microbiano que favorece
la re-presurizacin del pozo y el adelgazamiento del aceite. Mediante pruebas de
desplazamiento en ncleo Castorena y colaboradores 2012 demostraron un incremento
en la recuperacin de aceite hasta en un 12%, con cultivos del gnero
Thermoanaerobacter (Castorena et al. 2012). Tambin con un cultivo mixto fermentativo
compuesto por Thermoanaerobacter pseudethanolicus y Thermotoga neapolitana
(Hernndez-Gama et al. 2013) se prob en desplazamiento en ncleo consiguiendo un
incremento en la recuperacin de aceite de 13% (Muoz-Colunga, datos no publicados) lo
que es prometedor en aplicaciones de recuperacin mejorada, ya que en todo momento
se espera un incremento en la produccin de aceite de al menos 3 a 4% (Lazar et al.
2007).
El conocimiento de la diversidad microbiana del yacimiento Chicontepec, genera nuevas
posibilidades para aplicaciones MEOR, aunque ya se han realizado tratamientos de este
tipo en Chicontepec con buenos resultados (PEMEX, 2013); ahora se tiene la certeza de
que se puede estimular el metabolismo fermentativo, se sabe que probablemente no
existe microorganismos reductores de sulfato o se encuentran en baja cantidad y se
podra estimular el metabolismo reductor de nitrato. Por otra parte la inyeccin de agua
podra reducir ligeramente la temperatura al interior del pozo promoviendo el crecimiento
de una mayor diversidad de microorganismos. Con los resultados obtenidos se pueden
disear aplicaciones MEOR, que consideren la estimulacin de organismos autctonos
del yacimiento o la bioaumentacin con alguno de los cultivos fermentativos obtenidos y
sobre los cuales se discutir a continuacin.

4.2 Cultivos fermentativos provenientes de yacimientos mexicanos

Para cada una de las muestras de aceite y agua congnita probadas en este trabajo se
logr cultivar organismos fermentativos, lo cual indica que es un grupo distribuido en los
yacimientos Chicontepec y Samaria. Este tipo de organismos son tiles para aplicaciones
MEOR, ya que generan una serie de subproductos que pueden contribuir a la
recuperacin de aceite, su crecimiento se puede estimular mediante la adicin de fuentes
de carbono de fcil asimilacin y algunos de ellos de bajo costo como las melazas. Este
trabajo se enfoc al estudio de las clulas como biomasa y no a los subproductos del

72
 Discusin

metabolismo fermentativo, sin embargo, tanto las clulas completas como los productos
metablicos pueden tener un efecto sinrgico que conduzca a la modificacin de las
propiedades del aceite y a modificaciones en la interaccin entre la roca, aceite y agua
congnita, favoreciendo la extraccin de petrleo (Wolicka et al. 2010).

Con respecto a la aplicacin de los microorganismos en MEOR, es importante destacar

que los organismos de este trabajo se encuentran adaptados a condicin de temperatura
de la zona Coyotes del Yacimiento Chicontepec, es decir crecen a 70 C, con salinidad
NaCl de 2% y pH 8.0. La aplicacin en yacimientos diferentes debe ser evaluada, tanto
por los parmetros fsicos como qumicos del yacimiento.

En cuanto a las cinticas de crecimiento se evalu solamente la produccin de biomasa

cuantificada en forma de protena total, se obtuvieron un cultivo de crecimiento rpido el
cultivo A y tres cultivos de crecimiento lento B, C y D. Algo relevante durante la evaluacin
de la cintica de crecimiento fue la extensa fase de adaptacin que tuvieron los cultivos,
especialmente los de crecimiento lento B, C y D, esto puede indicar que los cultivos no se
encuentran del todo adaptados a las condiciones de cultivo, ya sea por el tipo de
nutrientes empleado o por condiciones limitantes como la temperatura o pH.

La cintica de crecimiento mostr un crecimiento rpido para el cultivo A, caracterstica

que fue considerada importante al momento de realizar las pruebas de estabilizacin de
emulsiones, pero especialmente por la posibilidad de emplear este mismo cultivo en
escalas de produccin ms grandes, pues llegar a la produccin mxima de biomasa
tom diez veces ms tiempo para los cultivos B, C o D (320 h) con respecto al tiempo en
que se alcanz para el cultivo A (32 h); lo que encarece cualquier proceso, pero
especialmente en este caso porque la incubacin de estos organismos se realiza en
condiciones anaerobias y a temperaturas de 60 o 70C.

El cultivo A se identific como Thermoanaerobacter mathranii mediante la secuencia del

gel 16S ribosomal, se trata de una bacteria con forma de bacilo, mvil y que puede formar
esporas terminales. Es termfila y puede crecer entre 50 y 75C , aunque la temperatura
ptima de crecimiento se encuentra entre los 70 y 75C, lo cual explica su crecimiento
rpido y abundante a 70C que es la temperatura al interior de los pozos de la zona
Coyotes. Tambin crece en un intervalo amplio de pH desde 4.7 hasta 8.8, aunque el pH
neutro es al que alcanza su mximo crecimiento. No es un organismo halfilo, por lo que
su supervivencia en yacimientos con alta salinidad es poco probable, aunque s puede

73
 Discusin

crecer hasta una salinidad de 2% sin que se afecte la produccin de biomasa, como es el
caso de la concentracin en el medio de cultivo R1. Aunque microscpicamente se
observ como un bacilo Gram negativo (Figura 12) y es normal que tome esta coloracin,
la estructura de su pared celular pertenece a Gram positivo (Larsen et al. 1997).

Thermoanaerobacter mathranii es un organismo que fermenta una gran variedad de

fuentes de carbono (excepto celulosa), por lo tanto las posibilidades de estimular su
crecimiento en yacimiento son altas y se pueden probar fuentes de carbono de bajo costo.
Dentro de los subproductos de la fermentacin produce etanol, acetato, lactato CO2 e H2,
es sobresaliente su capacidad para acumular etanol e incluso puede sobrevivir a
concentraciones de 4% de este producto (Larsen et al. 1997).

4.3 Efecto de las clulas en la estabilidad de emulsiones de crudo y

agua
La propuesta de este trabajo es que las clulas contribuyen a la estabilizacin de
emulsiones al funcionar como partculas que se establecen en la interfase aceite-agua
evitando la coalescencia de las gotas de la fase dispersa. Adems las clulas tambin
podran inhibir la coalescencia por su efecto sobre las propiedades viscoelsticas de la
emulsin, dando como resultado una red de partculas establecidas en la interfase. Por
esta razn se evalu la estabilidad de emulsiones en primer lugar mediante la
observacin visual de sus niveles de estabilidad, pero posteriormente se realizaron
mediciones reolgicas de las emulsiones.
Antes de realizar las emulsiones se evalu la hidrofobicidad de las clulas, como se pudo
apreciar en las figuras 15 a 18 en la seccin de resultados, los cultivos A, B y D
presentaron una alta hidrofobicidad, mientras que el cultivo C tuvo una hidrofobicidad
intermedia para la mayora de los solventes probados. Aunque la hidrofobicidad se
considera una caracterstica importante para que las clulas se establezcan en la
interfase crudo-agua, los cultivos A, C y D fueron capaces de favorecer la formacin de
emulsiones estables de crudo AF392 y agua, esto se debe a que otras caractersticas de
las clulas pueden intervenir como lo es el tamao de partcula y la forma; adems de la
contribucin de los surfactantes naturales presentes en el petrleo.
Los componentes del petrleo demostraron tener un efecto determinante en la estabilidad
de emulsiones, el comportamiento de las emulsiones en sistemas de 3 ml fue diferente

74
 Discusin

para algunos de los crudos probados, en el caso del crudo CC154 y del crudo CS823 las
emulsiones fueron igualmente estables en ausencia y presencia de clulas, e incluso para
el crudo CS823 en combinacin con las clulas del cultivo A, se inhibi la formacin de
emulsiones.
A escalas mayores el efecto de la composicin del aceite fue determinante para la
formacin de emulsiones, con el petrleo CS823 no se formaron las emulsiones de 120 ml
ni 500 ml. El crudo CS823 en un aceite pesado de 11.4 API, que posee un alto contenido
de agua, que de acuerdo a los resultados de las emulsiones pequeas, afect la
formacin de emulsiones. Adems, este aceite tambin tuvo una alta concentracin de
asfaltenos que pudieron precipitar e inestabilizar las emulsiones. Comparativamente el
crudo AF392 permiti la formacin de emulsiones estables independientemente de la
escala 3 ml, 120 ml y 500 ml y las caractersticas que lo hacen diferente del crudo CS823
son su menor contenido de asfaltenos, bajo contenido de agua, adems de ser un
petrleo ligero de 29 API.
Los asfaltenos contenidos en el petrleo funcionan como surfactantes, pero dada su
naturaleza no tienen un efecto lineal, cuando hay un exceso de ellos precipitan apilndose
y formando grumos. Otros componentes del aceite pueden modificar el efecto de los
asfaltenos, como es el caso de las resinas, que pueden disolver a los asfaltenos que ya
han precipitado, aunque tambin pueden disolver a los asfaltenos cuando se encuentran
en bajas concentraciones teniendo un efecto negativo sobre la estabilidad de las
emulsiones (Sjblon et al. 2007).
Una compleja combinacin de compuestos del petrleo intervienen en la formacin de
emulsiones, en este caso la adicin de clulas es una variable que se incluye en el
sistema y que tambin pueden contribuir a la disolucin/precipitacin de asfaltenos y a la
interaccin entre las gotas de la fase dispersa con la fase dispersante en la emulsin
(Langevin et al. 2004).
Los resultados de las emulsiones en sistemas de 3 ml, demostraron que las clulas y la
relacin crudo/agua tuvieron un efecto significativo en la estabilidad de las emulsiones.
Esto se apreci en los diagramas triangulares y se confirm mediante el anlisis de
varianza de los datos. Mientras que en los diagramas triangulares tambin se observ el
efecto de la salinidad, ste no fue significativo de acuerdo al anlisis estadstico.
Posteriormente, cuando se evalu la estabilidad de emulsiones en sistemas de 500 ml por
mtodos reolgicos (Figura 30) se manifest nuevamente el efecto de la salinidad en la

75
 Discusin

estabilizacin de la emulsin, siendo ligeramente mayor cuando la concentracin de NaCl

fue de 3%.
La estabilidad de las emulsiones no se vio afecta por el tiempo, en los sistemas de 3 ml el
aceite permaneci emulsionado durante 21 das sin generarse cambios importantes,
mientras que en los sistemas de 500 ml las emulsiones no se han separado despus de
tres meses de almacenamiento a temperatura ambiente, tanto en los sistemas con clulas
aadidas, como los que no las tienen. Sin embargo, tambin se espera que las
emulsiones puedan posteriormente separarse de una forma sencilla, pues una vez fuera
del yacimiento las emulsiones pueden generar problemas para la industria petrolera, por
el aumento de viscosidad, aumento en costos de transporte, almacenamiento; daos por
corrosin; depsito de sales y el incremento en el envenenamiento de catalizadores en los
procesos de refinacin (Marfisi y Salager, 2004).

4.4 Propiedades reolgicas de las emulsiones

En aplicaciones EOR, se emplean emulsiones formadas con surfactantes y se considera
relevante que posean las caractersticas de baja tensin superficial y alta viscosidad.
Ccomo se observa en la figura 25, la tensin superficial de las emulsiones aument con
respecto a la tensin superficial del crudo, esto se debe en primer lugar a ala adicin de
agua, sin embargo la adicin de clulas disminuy la tensin superficial, con respecto a
las emulsiones formadas sin clulas. Esta disminucin en la tensin superficial se cree
que facilita la movilizacin del aceite desde el poro de la roca, aunque se ha reconocido
que la tensin superficial no juega un papel fundamental en la estabilidad de emulsiones,
ya que son de mayor relevancia la elasticidad y viscosidad incrementadas, pues algunas
emulsiones con bajas tensiones superficiales pueden ser rgidas y quebradizas ante la
aplicacin de energa (Langevin et al. 2004).
Para determinar la estabilidad de emulsiones se realizaron evaluaciones visuales en los
sistemas de 3 ml, pero posteriormente se evalu la estabilidad de emulsiones en sistemas
de 500 ml con mediciones reolgicas para determinar la estabilidad fsica de las
emulsiones. Se usan las determinaciones reolgicas porque la mayora de los materiales
presentan simultneamente propiedades viscosas y elsticas en una estructura que se
deforma con la aplicacin de esfuerzo y se recupera parcialmente cuando el esfuerzo es
removido, mientras ms resistente a la deformacin es una estructura ms pronunciada

76
 Discusin

es su elasticidad, y si se deforma con facilidad su comportamiento es principalmente

viscoso.
Las emulsiones evaluadas en este trabajo son viscoelsticas y dicha propiedad depende
del esfuerzo aplicado. En prmer lugar las emulsiones formadas con crudo y agua tuvieron
una viscosidad que disminuy con la aplicacin de esfuerzo, por lo que se definen como
emulsiones reofluidizantes, lo cual indica que la aplicacin de esfuerzo disminuye de
forma importante su viscosidad. A pesar de esta reduccin en la viscosidad, es necesario
sealar que la viscosidad de las emulsiones es significativamente mayor a la del agua
(Mndez-Montealvo et al. 2001).
Por otra parte, los parmetros reolgicos mdulo de almacenamiento G (componente
elstico) y mdulo de prdida G (componente viscoso) permitieron determinar la
viscoelasticidad de las emulsiones. Analizando las grficas 30 y 31 observamos que los
mdulos G y G son dependientes de la frecuencia aplicada a las emulsiones, ante la
aplicacin de bajas frecuencias la emulsin tiene un mayor componente elstico que
viscoso, lo cual es deseable para confirmar la estabilidad de la emulsin, sin embargo al
aumentar la frecuencia se genera un cruce en la grfica y a partir de ese punto las
emulsiones tienen un componente principalmente viscoso. El punto de cruce se gener en
0.158 Hz para las emulsiones 1 y 2 preparadas con salinidad 1% de NaCl y en 0.996 y
0.628 Hz para las emulsiones 3 y 4 con salinidad 3%, es decir, el incremento de la
salinidad extendi la zona de estabilidad de la emulsin, mientras que la adicin de
clulas no tuvo efecto evidente.
Por otra parte, los valores de tambin permitieron tener una aproximacin a la
estabilidad de la emulsin y en este caso nuevamente todas las emulsiones mostraron un
comportamiento dependiente de la frecuencia observndose valores bajos de a
frecuencias bajas indicando una alta estabilidad de las emulsiones, mismos que
aumentaron con respecto al aumento en la frecuencia y en las emulsiones 1, 2 y 4
alcanzaron valores de inestabilidad, mientras que para la emulsin 3 se mantuvieron en
valores por debajo de 70 indicando una estabilidad intermedia incluso en las mximas
frecuencias probadas.
La estabilidad de emulsiones se vio favorecida cuando se emplearon reguladores con
salinidad de 3%, ya que se acumul un mayor nmero de valores de en el intervalo de
estabilidad alta e intermedia, la adicin de NaCl favoreci la estabilidad de emulsiones al
reducir la repulsin entre las partculas que se establecen en la interfase crudo-agua
(Tadros, 2004).

77
 Discusin

El caracterstico aumento en la viscosidad de las emulsiones de petrleo/agua con

respecto al aceite, es lo que permite proponerlas como medio de arrastre selectivo a nivel
de yacimiento para mejorar la recuperacin de aceite. Adems, las emulsiones pueden
usarse comercialmente como combustibles para termoelctricas o vehculos, un caso
exitoso durante varios aos fue la ORIMULSIONR producida en Venezuela que constaba
de 30% agua y 70% de aceite extrapesado, aunque las complicaciones logsticas
derivadas de la adicin de agua y por lo tanto de peso y volumen llevaron a su desuso,
actualmente resurge el inters en las emulsiones como combustibles por su alto poder
energtico y su bajo requerimiento de procesamiento, como es el caso de la empresa
NANoil de Dinamarca (Nanoil emulsion fuel, 2014).
Recientemente en el yacimiento Chicontepec se ha aplicado con xito la tecnologa de
extraccin mejorada conocida como fractura hidrulica, por las compaas Shulenberger,
Halliburton y Weatherford; esta tecnologa consiste en generar fracturas en el yacimiento
y posteriormente hacer pasar materiales viscosos para el arrastre del aceite, en la
mayora de los casos se usan polmeros de altos costos y que tienen un alto impacto
ambiental (Ballinas, 2012; Garca, et al., 2004; Garca, 2012). Las emulsiones formadas
en este trabajo poseen una alta viscosidad, son estables mientras se apliquen bajas
frecuencias y no es necesario aadir componentes txicos. Emulsiones de este tipo
podran emplearse como soluciones de inyeccin complementando diferentes tecnologas
que ya han demostrado su eficacia.
Las aplicaciones de las emulsiones caracterizadas en este trabajo, as como los cultivos
fermentativos obtenidos, especialmente Thermoanaerobacter mathranii as como la
descripcin de la comunidad bacteriana presente en la zona Coyotes en Chicontepec son
tiles para el mejoramiento de la extraccin de petrleo mexicano. Es un conocimeinto
que se genera en un momento en que se incursiona en tecnologas mejoradas de
extraccin e incluso en la prospectiva de petrleo crudo 2012-2026 se propone el uso de
tecnologas de extraccin mejorada de petrleo en los prximos aos, como uno de los
pilares para frenar la cada en la produccin de aceite en Mxico (SENER, 2012).

78
 Conclusiones

V. CONCLUSIONES

o La especies encontradas en la genoteca ribosomal de la muestra de aceite

correspondieron a Marinobacterium sp. y a un grupo de bacterias relacionadas con
ambientes petroleros y que no ha sido clasificadas.
o Las clonas de la genoteca de agua congnita se ubicaron a nivel de especie:
Mesotoga prima, Geotoga petraea y Sphaerochaeta globosa, a nivel de gnero:
Marinobacterium sp., Rhodovulum sp., Mesorhizobium sp.; y se relacionaron
distantemente varias secuencias con los gneros: Marinobacter, Thermovirga,
Geoalkalibacter, Calditerrivibrio, Moorella, Prolixibacter, Owenweeksia y
Sphaerochaeta.
o Se obtuvieron cultivos microbianos fermentativos de las muestras AC272, CC332,
AF392 y CS823.
o Los cultivos microbianos A, B y D presentaron una hidrofobicidad alta. El cultivo C
mostr una hidrofobicidad de intermedia a alta.
o El cultivo A se identific como Thermoanaerobacter mathranii.
o Los parmetros concentracin de clulas y relacin crudo/agua tuvieron efecto en
la estabilidad de emulsiones de aceite y agua. Las condiciones que favorecieron la
emulsificacin fueron: una relacin crudo/agua de 0.5 y concentracin de clulas
0.1 de DO a 600nm.
o Las emulsiones tuvieron una tensin superficial mayor con respecto al crudo y la
adicin de clulas redujo la tensin superficial con respecto a las emulsiones sin
clulas.
o Las emulsiones tuvieron una alta viscosidad, que disminuy con la aplicacin de
esfuerzo.
o Las emulsiones formadas fueron estables cuando se aplicaron bajas frecuencias y
a medida que se aument la frecuencia aplicada disminuy su estabilidad.

79
 Bibliografa

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88
 Apndice

VII. APNDICE

7.1 Medios de cultivo

A continuacin se describe la composicin de los medios de cultivo, su

preparacin contempl las precauciones necesarias para proporcionar la condicin
de anaerobiosis en los casos que se requiri.

Cuadro A. Composicin del Medio de cultivo R1 modificado. Base para

organismos de pozos petroleros (Dahle et al. 2008).

Componentes Volumen final 1L

NaCl 20 g
MgCl2 x 6H2O 0.9 g
MgSO4 x 7H2O 1.4 g
KCl 0.33 g
NH4Cl 0.25 g
CaCl2 x 2H2O 0.14 g
KH2PO4 0.45 g
Resarzurina 0.02 % 1 ml
Extracto de levadura 1g
Peptona 2.5 g
Maltodextrina 2.5 g
L-cistena 0.5 g

Se ajust el pH a 7.0 con KOH o HCl. Se aadieron 10 ml de solucin de

vitaminas, 20 ml de sulfuro de sodio 0.5 M y 5 ml de bicarbonato de sodio al 10%.
Se intercambi atmsfera con nitrgeno.

89
 Apndice

Cuadro B. Medio de cultivo R1 metangenos. Carece de fuente de carbono, los

organismos deben emplear CO2 o acetato de sodio (Dahle et al. 2008).

Componentes Volumen final 1L

NaCl 20 g
MgCl2 x 6H2O 0.9 g
MgSO4 x 7H2O 1.4 g
KCl 0.33 g
NH4Cl 0.25 g
CaCl2 x 2H2O 0.14 g
KH2PO4 0.82 g
L-Cistena 0.5 g
Resarzurina 0.02 % 0.5 ml

Se ajust el pH a 8 con KOH o HCl, se aadieron 10 ml de solucin de vitaminas,

20 ml de sulfuro de sodio 0.5 M y 5 ml de acetato de sodio al 10%. Se intercambi
atmsfera con nitrgeno y dixido de carbono.

Cuadro C. Medio de cultivo Chicontepec. Propuesto para el crecimiento de

microorganismos degradadores de hidrocarburos.

Componentes Volumen final 1 L

Sales marinas o agua congnita 33.6 g
Extracto de suelo (polvo de ncleo) 25 ml
K2HPO4 0.3 g
NH4NO3 1.0 g
MgSO4 x 7H2O 1.4 g
NH4Cl 0.25 g
Na2S (0.5 M) 4 ml
Resarzurina 0.02%

Se ajust el pH entre 7.6-7.8, se aadieron 10 ml de solucin de vitaminas, 20 ml

de sulfuro de sodio 0.5 M y 5 ml de bicarbonato de sodio al 10%. Se intercambi
atmsfera con nitrgeno y dixido de carbono.

90
 Apndice

Cuadro D. Medio de cultivo Allen modificado para termfilos aerobios.

Macroelementos Volumen final 1 L Microelementos mg/L

(NH4)2SO4 0.13g Fe 4
KH2PO4 0.27g Mn 0.5
MgSO4 0.25g B 0.5
CaCl2 0.07g Zn 0.05
H2SO4 0.1ml Cu 0.02
Glucosa 10 g Mo 0.01
V 0.01

El pH se ajust a 8.0 (Allen,1959).

Cuadro E. Solucin de vitaminas.

Ingredientes mg/L
cido nicotnico 21
D-pantotenato de calcio 11
PiridoxinaHCl 5
Tiamina HCl 4
Riboflavina 4
cido flico 1.4
D-biotina 0.1
Vitamina B12 (0.1% triturated in manitol) 17
a-Tocoferol (250 U/g) 211
Vitamina A palmitato (250 U/g) 11
Vitamina D3 (400,000 U/g) 1.7
Acido p-aminobenzoico 5
Sacarosa 6758

Todos los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave a 15 psi y 121C durante

15 min. Posterior a eso se les aadieron las soluciones estriles de vitaminas,
sulfuro de sodio y bicarbonato de sodio y acetato de sodio segn la formulacin de
cada medio.

Preparacin de extracto de suelo, polvo de ncleo. A un volumen de suelo

tamizado se aadieron 2 volmenes de agua desionizada. Se mezcl y esteriliz
en autoclave a 15 psi durante 2 h, se dej enfriar, se decant y se esteriliz por
filtracin. El extracto de polvo de ncleo se aadi a los medios de cultivo previo a
la esterilizacin de los mismos.

91