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UNIVERSIDADNACIONALDETRESDEFEBRERO

BIOENSAYO:SEMILLASDELECHUGA(LactucasativaL)


ECOTOXICOLOGA

PROFESORA:
NINFARODRIGUEZMENDOZA

ALUMNOS:
BELOGIAGUSTINA
CASTILLOJUANPABLO
PREZZOMATAS
RANALLIDMARIS
ROTAMELISA












Ensayodetoxicidadagudaconsemillasdelechuga(LactucasativaL)

Principio
El bioensayo de toxicidadcon semillas de lechuga (Lactuca sativa L) esunapruebaesttica
de toxicidad aguda(120 h de exposicin) en la que sepuedenevaluarlosefectos fitotxicos
de compuestospurosodemezclascomplejasenelprocesodegerminacindelassemillasy
en el desarrollo de las plntulas durante los primeros das de crecimiento. Como puntos
finales para la evaluacin de los efectos fitotxicos se determina la inhibicin en la
germinacin y la inhibicin en la elongacin de la radcula y del hipocotilo. Es importante
destacar que durante el periodo de germinacin y los primeros das de desarrollo de la
plntula ocurren numerosos procesos fisiolgicos en los que la presencia de una sustancia
txica puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo
por lo tanto una etapa degransensibilidadfrenteafactoresexternosadversos(figura1).Por
otraparte,muchasdelasreaccionesyprocesosinvolucradossongeneralesparala
gran mayora de las semillas, porloquelarespuestadeestaespecieylosdatosobtenidos a
partir de la aplicacin de esta prueba son en gran medida representativos de los efectos en
semillas o plntulas en general. El xito o aptitud de una plntula para establecerse en un
ambiente determinado es relevante para garantizar la supervivencia de la especie. La
evaluacin del desarrollo de la radcula y del hipocotilo constituyen indicadores
representativosparadeterminarlacapacidaddeestablecimientoydesarrollodelaplanta.


Figura1:Morfologadelasemillaylaplntuladelechuga

A diferencia de la prueba tradicional de germinacin desemillas, laevaluacin delefectoen
la elongacin de laradcula y delhipocotilode lasplntulaspermiteponderarelefectotxico
de compuestos solubles presentes en niveles de concentracin tan bajos que no son
suficientes para inhibir la germinacin, pero que sin embargo pueden retardar o inhibir
completamente los procesosde elongacin de la radculao del hipocotilo, dependiendo ello
del modo y sitio de accin del compuesto. De esta manera, la inhibicin enlaelongacinde
laradculaehipocotilo
constituyen indicadoressubletales muy sensibles paralaevaluacindeefectosbiolgicosen
vegetales, aportando informacin complementaria a la proporcionada alestudiarelefectoen
lagerminacin.


A diferencia deotraspruebasenlasqueseconsideranalgasoplantasacuticassumergidas
como organismo diagnstico, el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad de
muestras coloreadas o conelevada turbiedad demaneradirectaysinnecesidaddefiltracin
previa,reducindoseaslasinterferenciasdebidasal pretratamiento,ademsdesimplificarel
procedimientodeprueba.
Si bien L. sativa no es una especie representativa de ecosistemas acuticos, la informacin
generada a partir deesta prueba detoxicidad proporcionadatosacercadelposibleefectode
los contaminantes en las comunidades vegetales cercanas a las mrgenes de cuerpos de
agua contaminados, siendo tambin una especie interesante de considerar por su
importancia desde elpuntodevistahortcola.Porotraparte,esdefcilyrpidagerminacin,
porloqueesposibledesarrollarlapruebaenpocosdas.

Reactivosymateriales

Materialbiolgico:semillasdelechuga(LactucasativaLvar.mantecosa).
Aguapotable(decanilla)
CpsulasdePetride100mmdedimetro.
Papelde filtro Whatman nm. 3 (o equivalente), 90 mm de dimetro. El papel de filtro que
seseleccionecomosustratodegerminacindebetenerlassiguientes
caractersticas:
Tramaampliayporosaqueasegureunabuenacapacidadderetencindelquido.
Resistencia de la fibra del papel para que las radculas crezcan por su superficie sin
atravesarlo,situacinquedificultaralaremocindelasplntulassindaarlas.
Ausenciaderesiduostxicos(ej.blanqueadores).
Quenopromuevaeldesarrollodehongos(noasociadosalassemillas).
Matracesaforadosde50mL.
Pipetasvolumtricasde1,2,5y10mL.
Reglauotroelementodemedicin.
Pinzas.
Toallasdepapel.
Bolsasplsticas.
Cmaraoscuratermostatizada(222C)
Obtencin,controlyconservacindelassemillas

Nota:Elensayoserealizenlaestufaatemperaturaambiente.

Tinicial:25C
Tfinal:31C

Preparacindelasdiluciones

Para realizar una curva dosisrespuesta se recomienda preparar un mnimo de cinco o seis
diluciones de la muestra o compuesto a estudiar, de manera que se obtengan valores de
toxicidad intermediosentreel100y0%.Paralasmuestras ambientalesserecomiendaeluso
de un factor dedilucin de 0,5 paralapreparacindelaseriedediferentesconcentraciones.
Eluso deunfactorde0,3permiteevaluarlatoxicidadconsiderandoelintervaloentreel100y
1% de la muestra realizando cinco diluciones (100, 30, 10, 3 y 1%).Al aplicar un factor de
dilucin de 0,5, es necesario utilizar mayor nmero de diluciones para abarcar el mismo
intervalo de concentraciones(100, 50, 25, 12, 6, 3 y 1,5%), pero se obtienemayorprecisin
en los resultados. Para lapreparacin de cada dilucin se utilizaaguadurareconstituida (es
posible el uso de agua mineral dura para consumo humano), realizando el control negativo
con el agua de dilucin empleada.Con el fin de controlar la sensibilidad de las semillas,
simultneamente a la evaluacin de la toxicidad de una muestra debe realizarse un control
positivo.Enestecasosehautilizadoclorurodesodio.

Se han realizado las siguientes cantidades de muestras para cada una de las siguientes
diluciones:

3muestrasblancosnegativosconaguapotable

Blancospositivos:sehanrealizado1muestracon7diluciones.

Dilucininicial:Sediluye18gdeNaClen100mldeagua.

1muestraconNaClal50%
1muestraconNaClal25%
1muestraconNaClal12,5%
1muestraconNaClal6,25%
1muestraconNaClal3,12%
1muestraconNaClal1,56%
1muestraconNaClal0,78%

Contaminanteestudiado:ShampoomarcacomercialSedalCeramidas.
Composition: aqua, sodium laureth sulfate/sodium c1213 pareth sulfate, cocamidopropyl
betaine, glycol distearate, sodium chloride, parfum, carbomer, disodium edta,hydroxypropyl
methylcellulose, guar hydroxypropyltrimonium chloride, mica, dmdm hydantoin, peg45m,
titanium dioxide, ethylhexyl methoxycinnamate, dimethiconol, ceramide 2,
methylchloroisothiazolinone, Cl 17200, benzyl salicylate, butylphenyl methilpropional,
citronellol,hexylcinnamal,citricacid,sodiumhydroxide.

Composicin: agua,sulfatodelaureth,sodio/sulfato desodioC1213pareth,cocamidopropil


betana, diestearato de glicol, cloruro de sodio, parfum, carbmero, EDTA disdico,
hidroxipropil metilcelulosa, clorurode hidroxipropiltrimonio de guar, mica, DMDM hidantona,
peg 45m, dixido de titanio, metoxicinamato de etilhexilo, dimeticonol , ceramida 2,
metilcloroisotiazolinona, Cl 17200, salicilato de bencilo, methilpropionol butilfenilo, citronelol,
cinnamalhexilo,cidoctrico,hidrxidodesodio.

Dilucininicial:Sediluye10mldeshampooen15mldeagua.

3muestrasal100%
3muestrasal50%
3muestrasal25%
3muestrasal12%
3muestrasal6%
3muestrasal3%
3muestrasal1,5%

Protocolodeensayo
ColocarencadacpsuladePetriundiscodepapeldefiltro.
Marcar correctamente cada cajacon la dilucin correspondiente, as como la fecha y
horadeinicioytrminodelbioensayo.
Saturarelpapeldefiltrocon4mldeladilucinevitandoqueseformenbolsasdeaire.
Con la ayuda de una pinza, colocarcuidadosamenteveintesemillas,dejandoespacio
suficienteentreellasparapermitirlaelongacindelasraces.
Tapar las cpsulas y colocarlas en bolsas plsticas para evitar la prdida de
humedad. Dado quealgunas variedades de semillas de lechuga requieren oscuridad
para que se produzca la germinacin (semillas fotoblsticas negativas), las cajas de
Petri debencubrirse dela luz inmediatamente despus decolocarlasenlascpsulas
y durante el periodo de ensayo. Incubardurante120h(cincodas)aunatemperatura
de222C.
Realizarrepeticionesparacadadilucinensayada.

Medidadelospuntosfinalesdeevaluacindelafitotoxicidad

Cada punto final seevalacomparandoelefectogeneradoenlosorganismosexpuestosala


muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control negativo sujetos a las
mismascondicionesdeensayo,exceptoporlaausenciademuestra.
Terminado el periodo de exposicin (120 h), se procede a cuantificar el efecto en la
germinacinyenlaelongacindelaradculaydelhipocotilo.

Efectoenlagerminacin

Registrarelnmerodesemillasquegerminaronnormalmente,considerandocomocriteriode
germinacinlaaparicinvisibledelaradcula.

Efectoenlaelongacindelaradculaehipocotilo

Utilizando una regla o papel milimetrado, medir cuidadosamentela longitud de la radcula y


del hipocotilo de cadauna de las plntulas correspondientesa cada concentracindetxico
o dilucin de muestra ya los controles. La medidadeelongacindelaradculaseconsidera
desde el nudo (reginms engrosada de transicin entre laradcula y el hipocotilo)hastael
pice radicular.La medida de elongacin del hipocotilo se considera desde el nudo hastael
sitiodeinsercindelosdoscotiledones(figura2).

Figura2

Antes de retirar las plntulas de las cpsulas de Petri para evaluar el efecto en los puntos
finales anteriormente mencionados, es importante realizar una observacin detallada del
estado general de las mismas y del crecimiento de la radcula sobre el papel de filtro.
Informar cualquier indicador de fitotoxicidad o de crecimiento anormal en las plntulas
tratadas y en los controles (pices radiculares con necrosis, pelos absorbentes poco
desarrollados, radculas con crecimiento ensortijado, necrosis en los cotiledones, etctera).
La necrosis (presencia de tejido muerto) se evidencia como manchas localizadas de
coloracin parda, blanca o marrn. Al evaluarelefectoenlagerminacin,consignaradems
aquellas semillas con germinacin anormal (emergencia de cotiledones o cotiledones e
hipocotilosolamente,perosinemergencia
delaradcula)ocondesarrollodehongos.

Elensayodeberrepetirseencasodequeloscontrolespresenten:

Enelcontrolnegativo:
Porcentajedegerminacininferioral90%.
Altavariabilidadenlaelongacindelaradcula(CV>30%).

Enelcontrolpositivo:
Porcentajedegerminacininferioral90%.

Posibles interferencias en elproceso normal degerminacin odesarrollo


delasplntulasenloscontroles

Toxicidaddelsustrato
Suciedaddelascpsulas
Excesodeaguaodemuestrautilizadaparaembeberelpapel.
Dficithdricoduranteelperiododeexposicin
Exposicinalaluzduranteelprocesodeimbibicin
Temperatura de ensayo: las semillas de L. sativa expuestas a una temperatura superior
(apenas unos grados)a laptimaparalagerminacin,nogerminarnaunqueselescoloque
posteriormente a temperaturas inferiores (termodormancia o dormancia inducida por la
temperatura). En el ensayo,la temperatura ha sido un factor no controlado, y muy elevado
respecto a la temperatura ptima requerida, por lo cual, estimamos queha impactado en el
resultadodelbioensayo.

Expresindelosresultados

Serealizanlossiguientesclculos:
Promedio y desviacin estndar de la elongacin de la radcula y del hipocotilo de las
plntulasdecadarepeticin.
Porcentaje de inhibicin del crecimiento dela radcula y del hipocotilo, con el promedio de
elongacinparacadadilucinrespectodelpromediodeelongacindelcontrolnegativo.
Porcentajedeinhibicinenlagerminacin.

En el siguiente cuadro se vuelcan todas las conclusiones cuantitativas y cualitativas del


ensayorealizado:

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