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PROGRAMA EDUCATIVO:
INGENIERA EN ALIMENTOS
P r e s e n t a:
Julio Cesar Rosas Durn
Asesor:
Dra. Nieves Del Socorro Martnez Cruz
Codirector:
i
Este trabajo se realiz en el laboratorio 34 de Proyectos- Investigacin de la Facultad
de Ciencias Qumicas de la Universidad Veracruzana campus Xalapa.
ii
Dedicatoria
Este trabajo se lo dedico a mis padres Jorge y Rosa.
iii
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por haberme permitido concluir este trabajo que representa un
importante logro y que sin l no habra sido posible.
Agradezco a mis padres por el apoyo y esfuerzo brindado y que sin ellos no hubiera
podido llegar a esta etapa de mi vida.
Agradezco a mi asesora la Dra. Nieves del Socorro Martnez cruz por la atencin y
apoyo brindado durante la realizacin de este trabajo.
A mis amigas Adriana y Angelina por su apoyo incondicional en todos los das, por
escucharme y hacerme rer.
A mis amigas Monse, Gaby, Elani, Karina, por estar siempre presentes ayudarme en
este proyecto.
iv
A los compaeros de laboratorio 34 Blanca, Tere, Ricardo, Heidi, Humberto.
v
NDICE
RESUMEN. ............................................................................................................ x
1. INTRODUCCIN. ........................................................................................ 1
4. HIPTESIS. .................................................................................................... 15
5. OBJETIVOS. ................................................................................................... 15
vi
7. RESULTADOS ................................................................................................ 20
7.1 AIslamiento una cepa de hongo silvestre con capacidad de producir lipasas. .............................. 20
7.2. Crecimiento en cultivo en suspensin y determinacin de la actividad de lipasa del hongo
aislado. .................................................................................................................................................... 25
8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................. 29
9. BIBLIOGRAFA ............................................................................................... 30
vii
ndice de figuras
Figura 2.Cultivo in vitro de tejido de zarzamora (Rubus adenotrichus) contaminado con hongos.
..................................................................................................................................................................... 20
Figura 3. Crecimiento del hongo aislado que presenta las caractersticas de crecimiento del
gnero Penicillium. ................................................................................................................................... 21
Figura 6.Formas microscpicas del hongo aislado, caractersticas del gnero Penicillium. ....... 23
Figura 8.Crecimiento de Penicillium sp. En un medio (YMP suplementado con aceite de oliva),
con una temperatura de 22-23 C.......................................................................................................... 26
viii
ndice de tablas
ix
RESUMEN.
Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica, que como catalizadores biolgicos
presentan una gran ventaja frente a los de tipo qumico.Por su alta especificidad,
selectividad y su increble velocidad de reaccin. Las lipasas son parte de la familia de
las hidrolasas las cuales catalizan la hidrlisis de triglicridos en la interface lpido-agua.
Las lipasas tienen caractersticas que las convierten en biocatalizadores de alta
versatilidad, pero su uso se encuentra limitado por los altos costos de produccin, entre
las lipasas microbianas, se prefieren las de origen fngico en comparacin con las
bacterianas por su capacidad de actuar en rangos ms amplios de proceso, y sobre
todo, debido a que su produccin generalmente se efecta en el medio extracelular. En
el presente trabajo se aisl y caracterizo de forma preliminar una cepa de un hongo
silvestre productor de lipasas. El aislamiento de efectu a partir de un cultivo in vitro de
clulas de zarzamora. El hongo fue resembrado en placas por el mtodo de estriado y
en tubo inclinado en agar Dextrosa Sabouraud e incubndolas a 22 C durante siete
das, realizando durante este tiempo la observacin y registro de las caractersticas
morfolgicas del hongo. Despus se desarroll en un medio selectivo cuya composicin
fue: extracto de levadura (0.5g), extracto de carne (0.5g), fosfato de potasio dibsico
(0.5g), agar bacteriolgico (1.8 g), suplementado con una fuente lipdica(0.3g) que en
este caso fue aceite de oliva. La produccin de lipasas se observ por la generacin de
un halo transparente en el medio. Por microcultivo se confirm la pertenencia al gnero
Penicillium. El crecimiento del hongo en suspensin alcanz la fase estacionaria a 72
horas al igual que el pico de mxima actividad lipoltica la cual fue determinada de
manera indirecta por la determinacin de acidez titulable.
x
1. INTRODUCCIN.
Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica, que como catalizadores biolgicos,
presentan una gran ventaja frente a los catalizadores qumicos por su alta especificidad,
selectividad y su increble velocidad de reaccin. Estas molculas se utilizan en la
industria en un gran nmero de procesos como: la fabricacin de detergentes, la
obtencin de productos con bajas concentraciones de grasas y para sintetizar
qumicamente ms productos (Vera, 2007).
Las lipasas son enzimas que han emergido como catalizadores clave en la
biotecnologa, debido a sus propiedades multifacticas (especificidad, estabilidad, pH y
temperatura)tienen una gran variedad de aplicaciones industriales. Su aplicacin se da
en industrias tales como: la de alimentos, cosmticos y perfumes, del papel, la textil y
en la de pesticidas (Carrillo, 2011).
1
como temperatura, pH, sales minerales, fuentes de carbono, nitrgeno y de oxigeno
(Scragg, 2010).
A pesar de las grandes ventajas que tiene la aplicacin de las lipasas en diferentes
tipos de industrias, sus altos costos de produccin limitan su uso. Es por ello, que el
presente trabajo se enfoc en la bsqueda de nuevos microorganismosproductores de
lipasas que permitan en un futuro obtener a escala industrial estas enzimas utilizando
condiciones de operacin que faciliten la reduccin de los costos de produccin y se
convierta en un proceso biotecnolgico econmicamente viable.
2
2. MARCO TERICO.
2.1. Enzimas.
Todos los procesos de la vida, ya sea vegetal, animal o microbiana, dependen para el
crecimiento y mantenimiento celular de una compleja red de reacciones qumicas
catalizadas por enzimas. Las enzimas, son sustancias de naturaleza proteica que
catalizan reacciones qumicas en los sistemas biolgicos siempre que sea
termodinmicamente posible, por lo cual, tambin son conocidas como
biocatalizadores. Estas disminuyen la energa de activacin de las reacciones que
catalizan, de forma que se acelera la tasa de reaccin (Vera, 2007).
3
g) Son eficaces en un amplio intervalo de concentraciones.
h) Son biodegradables.
2.2. Lipasas.
4
Este tipo de enzimas son de importancia en la industria por sus mltiples aplicaciones
debido a que llevan a cabo la degradacin de sustratos con alto contenido graso as
como en reacciones de esterificacin en la industria alimenticia, farmacutica y
cosmtica. Las lipasas han sido encontradas en muchas especies de animales, plantas
y microorganismos. Sin embargo, las lipasas microbianas son mucho ms verstiles y
presentan caractersticas interesantes como estabilidad en solventes orgnicos,
actividad bajo diversas condiciones y alta especificidad de sustrato.
5
lipasas son generalmente aadidas a los detergentes principalmente en asociacin con
proteasas y celulasas (Pandeyet al., 1999).
Las lipasas catalizan una amplia variedad de reacciones como la hidrlisis parcial o
total de triacilglicridos y reacciones de esterificacin, transesterificacin e
interesterificacin de los lpidos en medios no acuosos (Gonzlez et al.,2010).
Recientemente, gracias a su capacidad para llevar a cabo reacciones de
transesterificacin las lipasas han adquirido un papel muy importante en la produccin
de biocombustibles, como resultado de la creciente demanda mundial en el uso de
energa renovable (Rivera y Garca, 2007).
Las lipasas han pasado a ser una parte integral en la actual industria alimentaria. Se ha
potenciado el uso de enzimas para mejorar procesos qumicos tradicionales en la
manufactura alimentaria, las lipasas, se usan actualmente en la produccin de una
variedad de productos como quesos y alimentos preparados (Houdeet al., 2004).
Una reciente aplicacin, que est acaparando un gran inters, es la obtencin de cido
felrico a partir de subproductos de la industria alimentaria; para su posterior aplicacin
en otras industrias farmacutica o en alimentaria (Topakaset al., 2007). A su vez, el
cido felrico puede ser convertido a vainilla enzimticamente, para mejorar el aroma y
el sabor de algunos alimentos (Bornscheue, 2002).
Los carotenoides son pigmentos naturales sintetizados por bacterias, hongos, plantas y
en menor cantidad por animales. Los carotenoides son empleados, industrialmente,
como colorantes artificiales en alimentos. Los carotenoides pueden acumularse libres o
esterificados. Para la liberacin de los esteres de carotenoides se emplean lipasas
6
procedentes de Pseudomonasfluorescens, Pseudomonasalcalgenesy
Agrobacteriumtumefaciens(Ralfet al., 2007).
El uso de enzimas permite panaderas para extender la vida til de panes, mejorar y
controlar el pardeamiento no enzimtico, aumentar el volumen del pan y mejorar la
estructura durante la coccin, la masa aumenta el volumen de las piezas de pan y el
producto final de panificacin presenta una corteza lisa, crujiente y dorada, de miga con
alveolado uniforme y mostrando un buen comportamiento durante el proceso de
conservacin (Copa et al., 2006).
En la industria de los alimentos las lipasas tienen amplia aplicacin, sin embargo, el
inters en la bsqueda de nuevas fuentes de estas enzimas se debe a la necesidad de
disminuir costos para generar procesos biotecnolgico viables.
7
2.4. Microorganismos productores de lipasas.
Los microorganismos con un alto potencial para producir lipasas pueden ser
encontrados en diferentes hbitats, principalmente en desechos o residuos de aceites
vegetales empleados en la elaboracin de frituras, industrias de productos lcteos,
suelos contaminados con aceites y alimentos deteriorados. Esto indica que el mismo
ambiente natural ofrece una amplia fuente para aislar nuevos microorganismos
productores de lipasas con propiedades novedosas. A partir de stos ambientes se han
aislado bacterias, hongos filamentosos, levaduras y actinomycetos, entre los que
sobresalen los gneros Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Staphylococcus,
Rhizopus, Mucor, Candida, Aspergillus y Geotrichumsp por su capacidad para producir
lipasas extracelulares ( Aceves y Castaeda., 2012).
Dado que las lipasas se encuentran entre las enzimas ms ampliamente utilizadas en
procesos biotecnolgicos y en procesos qumicos, la investigacin se ha enfocado en la
bsqueda de nuevos microorganismos con diferentes propiedades lipolticas deseadas.
A pesar del gran nmero de microorganismos productores de lipasas, slo algunas
especies de bacterias se han evaluado para la produccin de lipasas. Entre las
levaduras, el gnero Cndida es el que presenta una mayor produccin de lipasas
siendo las producidas por C. rugosa las que se han convertido en unas de las ms
utilizadas por la industria, debido a su alta actividad en procesos tanto de hidrlisis
como de sntesis (Snchez, 1998).
Las lipasas de origen fngico se prefieren en comparacin con las bacterianas por su
capacidad de actuar en rangos ms amplios durante el proceso, y sobre todo, debido a
8
que su produccin generalmente se efecta en el medio extracelular. El uso industrial
ms grande de estas enzimas est sujeta a una reduccin en los costos de produccin
(Reinehret al., 2014). Es importante considerar la temperatura para la actividad
enzimtica en la cual algunas lipasas alcanzan su mayor estabilidad. As, para el caso
de las lipasas fngicas, la temperatura ptima de accin cataltica suele estar entre los
40-60 C, siendo capaces de conservar el 100% de actividad incluso despus de 4
horas, permitindoles su versatilidad en aplicaciones dentro de diferentes reas
industriales (Pea et al., 2011).
9
Candidaantartica es una levadura basidiomyceteous aislada del lago Vanda en
Antrtida, la cual, produce dos lipasas denominadas A y B. Estas lipasas se encuentran
entre las lipasas ms termoestables reportadas hasta el momento y se han encontrado
numerosas aplicaciones para stas. La lipasa A de Candidaantarctica (CalA) muestra
una especificidad ms amplia hacia alcoholes secundarios y terciarios estricamente
impedidos y un mejor reconocimiento de cidos grasos trans en la hidrlisis de
triacilglicridos. La CalA tambin se ha utilizado para la sntesis asimtrica de
aminocidos y compuestos relacionados, debido a su quimioselectividad hacia grupos
amino; sin embargo, la CalA es dependiente de calcio y posee baja actividad cataltica,
por lo cual, se requieren en grandes concentraciones para catalizar reacciones.
Yarrowialipolytica, por otra parte, es una levadura GRAS no convencional que produce
8 lipasas, de las cuales una de ellas (LIP2), es excretada extracelularmente en grandes
cantidades, desarrollndose mtodos de cultivo y herramientas moleculares, as como
tcnicas de inmovilizacin para optimizar la actividad, selectividad y estabilidad. La
lipasa 2 de Y. lipolytica (LIP2) es una lipasa verstil que acepta diversos sustratos no
naturales y el conocimiento adquirido sobre su estructura y propiedades es de gran
utilidad en el desarrollo de nuevas variantes a la medida como biocatalizador en las
10
reacciones sntesis de biodiesel, biopolmeros y steres bioactivos de cido cafico, as
como en la resolucin de steres del cido 2-bromo-arilactico (Sandoval et al., 2009).
2.6. Hongos.
Son organismos de vida libre con una distribucin amplia en el planeta, por lo tanto, se
encuentran representantes de estos en condiciones climticas extremas como las
temperaturas rticas de menos 30C y tan elevadas como 70C, sin embargo, cada
gnero, o incluso cada especie, presentan temperaturas en el cual su desarrollo es
ptimo.
11
2.6.1GneroPenicillium.
12
En el 2010 Mendoza aisl hongos a partir aceites de desecho vegetales provenientes
de frituras con potencial de producir lipasas. Los hongos aislados se sometieron a la
prueba de liplisis que consisti en sembrar cada cepa aislada en agar con 3% de
substrato de lpidos (pH 6,3). Las placas fueron envueltas con papel Kraft e incubadas a
temperatura ambiente registrndose promedios mxima de 31C y mnima 23 C .Las
placas fueron observadas cada dos das. Considerando la presencia de hongos
lipolticos en general al evidenciar halos transparentes alrededor de la colonia y/o un
desarrollo profuso del hongo sobre el agar. Del total de hongos lipolticosque aisl(10
cepas),8 de los cuales pertenecen al gnero Penicilliumsp., los gneros
GeotrichumyAspergillus presentaron mayor capacidad de liplisis. Tambin Mendoza et
al, (2012) report que el gnero Penicillium y el gnero Aspergillus sp. Presentaron un
buen crecimiento en medio de cultivo adicionado con aceite de higuerilla y actividad
lipoltica con triglicridos de cadena corta.
13
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
14
4. HIPTESIS.
Es posible aislar una cepa de hongo silvestre generadora de enzimas lipolticas para su
posible aplicacin en la industria de los alimentos.
5. OBJETIVOS.
Obtener y caracterizar de manera preliminar una cepa de hongo silvestre con capacidad
de producir lipasas.
15
6. METODOLOGA.
16
6.1 Aislamiento de la cepa e identificacin del hongo.
6.3Microcultivo.
17
6.4 Generacin de esporas
Las esporas son estructuras caractersticas de los mohos, debido a que intervienen en
sus procesos reproductores, a travs de la formacin de estas, se pueden realizar
estudios que nos permitan conocer acerca del crecimiento y desarrollo de estos
organismos. Para la generacin de esporas fueron empleados dos medios de cultivo
caldoextracto de malta y el caldo dextrosa Sabouraud, con la finalidad de promover un
desarrollo ptimo del hongo.
La cepa se sembr en tubos inclinados en medio Dextrosa Sabouraud y una vez que la
colonia se encontren condiciones de color caracterstico y desarrollo macroscpico
viable, se adicionaron 10 mL de solucin fisiolgica a un tubo de conservacin y se
agitaron durante 20 segundos.La solucin de esporas se deposit en un frasco estril.
18
6.7Obtencin del extracto crudo enzimtico.
6.8Titulacin.
. . . 100
% =
19
7. RESULTADOS
20
A lo largo de siete das se realiz un seguimiento de su crecimiento observndose la
presencia de dos cepas cuyas caractersticas macroscpicas sugeran que uno
perteneca probablemente al gnero Mucor y el otro a Penicillium. Se decidi
seleccionar y aislar por medio de, al menos cinco resiembras, al segundo el cual
mostr colonias de crecimiento rpido, textura algodonosa y blanca en un principio
cambiando a un verde azulado, filamentoso y de color plido al reverso lo que
permiti sugerir que el hongo pertenece al gnero Penillium(Figura 3 y Figura 4).
21
Figura 3.Colonia caracterstica del hongo aislado.
22
La observacin al microscopio (Figura 6) confirm que el hongo aislado pertenece al
gnero Penicilliumya que fue evidente la formacin de conidios mediante una
estructura que recuerda la forma de pincel, las ramificaciones terminan en unas
clulas que se conocen como fialides las cuales originan esporas.
23
Figura 6. Formacin de halo transparente en el medio productor de lipasas.
En este trabajo la variable que se evalu fue el agente inductor, probndose dos:
mantequilla y aceite de oliva en una cantidad de 0.3 gr., notando un mejor desarrollo
del hongo y un dimetro mayor del halo de inhibicin en este ltimo, sugiriendo que
la lipasa de este hongo responde favorablemente a los inductores de origen vegetal
coincidiendo con los estudios de Mendoza (2010) .
24
7.2.Crecimiento en cultivo en suspensin y determinacin de la actividad de
lipasa del hongo aislado.
Generacin de esporas
Das
caldo extracto de malta Caldo dextrosa Sabouraud
Nmero de esporas Nmero de esporas
7 16 46
20 66 337
El crecimiento del hongo aislado fue seguido a lo largo de 7 das. Puede observarse
un lento crecimiento durante las primeras 32 horas y el inicio de la fase estacionara
alrededor de las 72 horas (Figura 8). Resultados similares son reportados por Shafei
y Allam (2010) quienes encontraron que para Penicilliumchrysogenum la produccin
de biomasa se encuentra en su fase estacionaria a partir de las 72 h de fermentacin
prolongndose hastalas 172 h.
25
concentracion g. micelio/ml
0.02 2
yY=0.0017079
= 0.0017085 + 7.253e-05x
+ 7.2535 R = 0.76282
x 10-5 R=0.87341
0.01
concentracion g. micelio/ml
0.01
0.01
0.01
0.01
0
0
0
-50 0 50 100 150 200
tiempo horas
Los resultados obtenidos con respecto a la actividad lipoltica muestran que a las 72
horas se incrementa para decaer despus de 132. Shafei y Allam (2010) encontraron
pico mximo de actividad de lipasa a las 96 horas para Penicilliumchrysogenum.En
otro estudio realizado por Miranda y colaboradores (2009) en el que utilizaron un
reciduo solido agroindustrial reportandi que Penicilliumsimplicissimumencontrando
una mxima actividad de la lipasaque va de las 72 hasta las 92 horas de
fermentacin.
26
1.2
0.163299316
0.098319208
0.484424057
1
0.051639778
0.172240142
0.13662601
0.103279556
0.104880885
0.8
Acidez (%)
0.6
0.116904519
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tiempo (h)
Existen diferentes factores que pueden tanto inhibir como inducir la produccin de
lipasas, los cuales pueden variar segn el microorganismo, entre estos factores se
encuentra la fuente de nitrgeno, que generalmente es de tipo orgnico como
extracto de levadura, peptona y triptona, o de tipo inorgnico como el cloruro de
amonio. Entre los factores inhibitorios ms comunes se encuentran la presencia de
azcares, iones metlicos y sales, por su parte algunos sustratos lipdicos pueden
inducir dicha produccin (Sharmaet al., 2001).
27
En este trabajo no se evalu ninguna variable para optimizar la actividad lipoltica por
lo que ser necesaria la continuacin de la investigacin que lleve a un futuro
inmediato el optimizar las condiciones de produccin de la enzima o enzimas
presentes en Penicilliumsp., as como a su aislamiento y purificacin para su
aplicacin biotecnolgica.
28
8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
29
9. BIBLIOGRAFA
30
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lipolyticactivity of differentPenicilliumroquefortistrains. FoodChem 36:16980.
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