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Apostila de Aulas Prticas de Bioqumica para o BCT

Guia de Normas e Experimentos


3 quadrimestre/2015

Coordenao: Profa. Dra. Iseli Loureno Nantes

Autores: Ncleo Docente da UFABC

2015
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Sumrio

AULA CONTEDO

Introduo Apresentao e Disposies Gerais do Curso Experimental

Experimento 1 gua

Experimento 2 Espectrofotometria: Conceitos e Aplicaes

Experimento 3 Propriedades cido-base das protenas e seus efeitos sobre a


solubilidade das mesmas: Aplicao na purificao de
protenas.

Experimento 4 Propriedades de surfactantes e lipdios

Experimento 5 Carboidratos

Experimento 6 Enzimas
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Apresentao e Disposies Gerais do Curso Experimental

APRESENTAO

A disciplina Transformaes Bioqumicas composta por aulas expositivas em sala de aula e por
aulas prticas nos laboratrios didticos. Este guia traz ao estudante o contedo das aulas prticas, com
introduo, objetivos, procedimentos e normas que regem a execuo destas atividades.

OBJETIVOS E COMPETNCIAS

Os mdulos prticos desta disciplina tm como objetivo apresentar uma seqncia de experimentos
que permitir ao aluno identificar aspectos estruturais, funcionais e de reatividade da gua, aminocidos,
carboidratos, lipdeos e enzimas.
Espera-se que, aps a realizao das aulas prticas, o aluno seja capaz de compreender os conceitos
fundamentais da Bioqumica, fazendo a conexo entre o macroscpico, acessvel aos nossos sentidos, e os
eventos que ocorrem em escala molecular.

AULAS PRTICAS

Existem normas de segurana para o trabalho em laboratrio que devem ser seguidas e respeitadas.
Um conjunto destas normas ser entregue ao aluno no incio das aulas de laboratrio juntamente com um
termo de compromisso (caso no o tenha recebido em disciplina anterior) no qual o aluno se compromete a
ler e seguir as mesmas. Todos os trabalhos em laboratrio sero realizados por equipes de no mximo 5
alunos. Espera-se que os resultados obtidos sejam obra de um esforo conjunto e que todos os componentes
estejam presentes na hora marcada para o incio das aulas. Haver uma tolerncia de 10 minutos e aps esse
tempo os alunos retardatrios no podero realizar as atividades do dia. A aula ser encerrada no horrio pr-
estabelecido, no havendo prorrogao para os alunos que no tenham concludo os experimentos dentro do
prazo previsto por motivos alheios prtica.
IMPORTANTE: No haver reposio de experimentos no caso de falta, ficando o aluno prejudicado com
o aprendizado daquele contedo.

AVALIAO
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Para a avaliao das atividades prticas, ser utilizado o contedo do caderno de laboratrio
elaborado individualmente pelo aluno sobre cada experimento. O aluno dever fazer um pr-relatrio no
caderno anteriormente a aula em questo e utiliz-lo para as anotaes durante a aula, bem como as anotaes
referentes discusso dos resultados obtidos. Esse caderno deve ser apenas manuscrito e no poder conter
cpia xerogrfica do caderno dos colegas ou de qualquer outro material. O aluno no poder participar, em
hiptese alguma, da aula prtica sem o caderno de laboratrio contendo o pr-relatrio. O aprendizado
na disciplina de Transformaes Bioqumicas ser avaliado continuamente ao longo da disciplina pelo
acompanhamento direto do docente e tambm ao final por meio de provas tericas e prticas. O componente
da teoria da nota final ter peso 7 e o prtico, peso 3. A prova prtica envolver a execuo de experimentos
no laboratrio e resposta a questes propostas durante a execuo.
Alunos com rendimento igual ou superior a 86% obtero conceito A; com rendimento entre 70 e 85%,
conceito B; com rendimento entre 56 e 70%, conceito C; de 50 a 55%, conceito D e rendimento inferior a 50%
com conceito F. O aluno reprovado (conceito F) poder fazer EXAME com o contedo todo do
quadrimestre, cuja nota constituir uma nova mdia aritmtica com a mdia quadrimestral obtida
previamente para chegar em seu conceito final.

RECOMENDAES PARA AS AULAS EXPERIMENTAIS

1. obrigatrio o uso de avental (jaleco) no laboratrio; o mesmo deve ser comprido, de mangas compridas
e ser usado fechado (com os botes fechados);

2. No ser permitido fazer a aula de laboratrio usando sandlias, bermudas, shorts ou saia;

3. No permitida a execuo da aula de Transformaes Bioqumicas de bon, culos escuros nos olhos ou
na cabea e fones de ouvido;

4. proibido comer ou beber no laboratrio;

5. Proibido o uso de telefone celular durante as aulas de Transformaes Bioqumicas;

5. Cabelos compridos devem estar devidamente presos;

5. No dia da aula experimental todos devem apresentar um fluxograma individual (PR-RELATRIO) e


feito mo no caderno de laboratrio para dar incio aula, sendo que o mesmo poder ser utilizado durante
a execuo do experimento;

5. Evitar ao mximo faltar ou chegar atrasado s aulas prticas para no ser prejudicado;

6. O aluno que faltou em aula prtica ter prejuzo no componente da parte prtica da nota e nos seus
conhecimentos daquele tpico, uma vez que no h possibilidade de reposio da aula;

Modelo de Fluxograma
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O fluxograma pode ser feito de maneira esquemtica ou na forma descritiva.

O objetivo fazer com que todos leiam os contedos do experimento e resumam as atividades
experimentais, ou seja, cheguem sabendo exatamente o que ser feito.

Sem o fluxograma no ser permitido realizar a aula experimental.

Modelo de Fluxograma 1: Esquemtico

Experimento 1 Parte 1:

Modelo de Fluxograma 2: Descritivo

ORIENTAES PARA O USO DE MICROPIPETAS


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A transferncia de volume exato de lquidos fundamental para vasta maioria dos experimentos nas reas de
bioqumica, biologia molecular, qumica, etc. A medio de volume um passo importante em qualquer
laboratrio porque um pequeno erro de pipetagem pode causar um erro significativo no resultado obtido.
Micropipetas so aparelhos designados para a transferncia de pequenos volumes (entre 0,2 a 5000 l) com
mxima preciso. A construo das micropipetas consiste em um corpo anatmico de polipropileno
(autoclavvel) equipado com um boto dispensador e um ejetor de ponteiras no topo, um indicador de volume
na lateral e uma haste para encaixe de ponteiras descartveis na parte inferior. Existem vrios tipos de
micropipetas:

pipetas monocanal ou multicanal


pipetas com volume fixo ou com volume varivel
pipetas com deslocamento de ar ou com deslocamento positivo

Fig. 1: A - Pipeta de Deslocamento Positivo; B - Pipeta Deslocamento de Ar (monocanal) e C -


Pipeta Deslocamento de Ar (multicanal).

Funcionamento de micropipetas com deslocamento de ar


Este tipo de pipetas o mais utilizado, por ser muito verstil. O boto dispensador ligado a um pisto
dentro da pipeta. Ao pressionar o boto, o pisto se move deslocando o ar que por sua vez desloca um lquido
para dentro ou para fora da ponteira. A trajetria de boto dispensador tem dois estgios que podem ser
percebidos por diferena da resistncia de molas que retornam o boto dispensador para posio de repouso
aps ele ser liberado. Os dois estgios permitem fazer a pipetagem usando duas tcnicas diferentes: a
pipetagem direta (esgotamento total) ou a pipetagem reversa (esgotamento parcial). A escolha da tcnica
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depende das caractersticas do lquido a ser pipetado (viscosidade, volatilidade, hidrofilicidade) e do processo
da pipetagem (pipetagem nica, titulante ou repetida).

A preciso da pipetagem influenciada por vrios fatores:


- encaixe da ponteira na haste: antes de pipetar, a compatibilidade do tipo de ponteira (fabricante) com o tipo
de haste deve ser verificada para evitar passagem de ar no encaixe. A ponteira deve ser encaixada por
movimento circular que assegura boa vedao entre a ponteira e a haste, alm de maior durabilidade pelo uso
correto da haste. Por estas razes, o encaixe da ponteira por batimentos repetidos de haste na ponteira deve
ser evitado.
- ajuste de volume (pipetas com volume varivel): cada indicador de volume tem uma pequena folga. Assim,
para a maior preciso, o volume deve ser ajustado sempre e somente de um lado (de preferncia, no sentido
horrio). Quando o ajuste ultrapassa o volume desejado, recomenda-se voltar <1/3 da rotao e ajustar o
volume de novo. Para ajustar corretamente o volume, deve ser considerado o erro paraltico; o eixo da viso
tem que ser perpendicular escala do indicador do volume.
- a poro imersa no lquido: por causa da compressibilidade do ar, existe uma medida ideal da imerso da
ponta da ponteira que minimiza tais imprecises (Tabela 1).

Tabela 1: Imerso ideal da ponta da ponteira em relao do tipo de ponteira - volume


pipetado

- tenso lateral do lquido: os lquidos podem molhar a parede da ponteira, o que pode resultar em perdas de
volume ejetado (parte dele fica nas paredes). A minimizao dessa impreciso consiste em aspirao e ejeo
de lquido sem efetuar a transferncia (no mesmo recipiente). Assim, as paredes j estaro molhadas e o
volume da 2a aspirao ser transferido por completo.
- volatilidade do lquido: para diminuir gotejamento do lquido durante a transferncia e quando a natureza
do lquido permite (no corrosivo, no infectante ou no radioativo), o lquido pode ser asp irado/ejetado no
mesmo recipiente vrias vezes at o ar em cima do lquido ser trocado completamente por vapor do lquido.
Pipetagem direta (esgotamento total)
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a tcnica de pipetagem mais conhecida. Utiliza-se para transferir volumes nicos de lquidos aquosos
ou de lquidos no volteis, no viscosos e no espumantes. O princpio de transferncia de lquido mostrado
na Figura 2:

Fig. 2: Esquema de procedimento usado por a tcnica de pipetagem direta. Linhas


pontilhadas representam as posies de boto de esgotamento: Repouso (linha superior), 1o
estgio (linha no meio) e 2o estgio (linha inferior).

Pipetagem reversa (esgotamento parcial)


uma tcnica de pipetagem pouco conhecida. Recomenda-se fortemente o uso desta tcnica em casos
de pipetagem de lquidos viscosos, volteis e espumantes. Uso da pipetagem reversa em casos de pipetagem
repetida de um volume do mesmo lquido (por exemplo, em dosagens de protena amostra e curva padro)
pode melhorar a confiabilidade do mtodo at 10 vezes.
A transferncia de lquidos por esta tcnica resulta em um volume que sobra na ponteira aps da
transferncia que pode ser uma desvantagem no caso de lquidos caros ou de volume limitado. Porm, a grande
vantagem consiste em ejeo de lquido viscoso ou espumante, onde praticamente impossvel realizar o
esgotamento total (da tcnica direta). Caso de lquidos volteis, a transferncia do lquido pode ser
acompanhada por gotejamento do lquido fora da ponteira (vapor do lquido voltil expande o ar dentro da
pipeta). A tcnica da pipetagem reversa garante um volume de reserva na ponteira que permite a
transferncia de volume correto at de lquido bastante voltil.

O princpio de transferncia de lquido mostrado na Figura 3:


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Cada micropipeta calibrada para o valor indicado (valor terico) corresponder ao valor efetivamente
medido (valor real) na faixa da preciso de micropipeta (erro 2% para pipetas P10, P20, P100, P200, P1000
e 5% para pipetas P2 e P5000). Porm, com tempo e uso prolongado, os componentes mecnicos so sujeitos
ao desgaste ou disfuno resultante de uso inadequado. Assim, essencial a verificao da calibrao das
micropipetas nas mesmas condies em que so utilizadas no laboratrio. Esta verificao consiste
essencialmente em um conjunto de medies usadas para restabelecer/atualizar a relao entre o valor indicado
e o valor efetivamente medido.
Normalmente, a verificao deve ser realizada nas seguintes situaes:
- aps uma manuteno e/ou troca de peas;
- aps de um perodo de uso (~ 1 ano);
- quando a pipeta sofre um dano: queda, contaminao da haste, etc;
- de acordo com orientaes do fabricante;

Empregam-se geralmente trs mtodos de calibrao de pipetas automticas:

1. Mtodo gravimtrico: uma srie de medies do peso de lquido pipetado (considerando a


temperatura, umidade, presso atmosfrica e coeficiente de expanso) posteriormente convertida em volume.
Este mtodo realizado por laboratrios de calibrao especializados.

2. Mtodo titrimtrico: uma srie de medies de quantidades de NaOH com concentrao conhecida em
volumes pipetados (sem interferncia da temperatura, umidade ou presso atmosfrica). Exige uma
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padronizao das solues envolvidas.

3. Mtodo fotomtrico: uma srie de medies fotomtricas de diferentes diluies de um cromforo com
concentrao conhecida. Este mtodo pode ser facilmente implantado no laboratrio.

Para a anlise dos resultados da calibrao, as sries de medies so convertidas para volume (valor
efetivamente medido) e comparados com volumes ajustados no indicador da micropipeta (valores indicados).
Calcula-se uma mdia (para mesmos volumes) ou regresso linear (para volumes diferentes) desvio padro.
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Experimento 1 gua: propriedades fsico-qumicas relacionadas sua estrutura e polaridade

Resumo

A estrutura peculiar da molcula de gua responsvel pelas propriedades desse solvente que so
cruciais para a existncia de vida na Terra tanto em termos de modular a estrutura e funo das biomolculas
quanto ao controle do clima do planeta. As propriedades da gua que determinam o comportamento das
biomolculas tambm so utilizadas para aplicaes tecnolgicas e por essa razo, o estudo dessas
propriedades relevante para diversas reas do conhecimento. Nessa aula, estudaremos a formao de micelas
aquosas de SDS e CTAB, surfactantes aninico e catinico, respectivamente, influenciadas pela fora inica
do meio com diferentes concentraes de NaCl. Em sequncia, veremos a capacidade que as micelas possuem
de sequestrar o corante azul de metileno e modular o estado de agregao e as propriedades ticas do mesmo.

Abstract

The peculiar structure of water molecule is responsible for the properties of this solvent which are
crucial to the existence of life on earth in terms of modulating the structure and function of biomolecules as
to control the climate. The properties of the water which determine the behavior of biomolecules are also used
for technological applications and for this reason, the study of these properties is relevant to many areas of
knowledge. In this lesson, we will study the formation of aqueous SDS and CTAB micelles, anionic
surfactants and cationic respectively, influenced by the ionic strength of the medium with different
concentrations of NaCl. In sequence, we will see the ability of the micelles have to kidnap the methylene blue
dye and modulate the state of aggregation and optical properties thereof.

Introduo

As propriedades da gua so de fundamental importncia para a vida na Terra porque determinam a


estrutura e funo das biomolculas, a associao dessas em agregados supramoleculares funcionais tais como
as membranas biolgicas, os complexos proteicos, os ribossomos e os cromossomos. A gua tambm
importante para a vida na Terra, pois regula o clima do planeta. Alm disso, o crescente desenvolvimento e
novas aplicaes da nanotecnologia e nanobiotecnologia dependem do domnio do conhecimento sobre as
propriedades da gua como agente fundamental para a construo e modulao das propriedades dos
agregados supramoleculares naturais bem como os desenhados e construdos pelo homem.

A molcula de gua possui a densidade eletrnica distribuda de forma desigual na estrutura molecular.
Dentro de uma estrutura tetradrica (Fig. 1), dois cantos do tetraedro so ocupados pelos orbitais moleculares
no ligantes (par de eltrons no compartilhados) do tomo de oxignio e os outros dois so ocupados pelos
tomos de hidrognio.
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Fig. 1: Estrutura molecular da gua inserida em uma estrutura tetradrica e frmula estrutural da gua com o valor do
ngulo entre os hidrognios que se desvia do valor esperado de 109,5 do carbono tetradrico com hibridizao sp 3.

Os tomos de hidrognio na estrutura da gua formam um ngulo de 104,5 que difere do valor
esperado de 109,5 do carbono tetradrico com hibridizao sp 3. Esse valor de ngulo entre os hidrognios
explicado pela regra de Bent (Bent, 1961) segundo a qual em uma molcula AX2 e AX3, o tomo central
ligado a multiplos grupos hibridizar de modo que orbitais com maior carter s estaro direcionados para
substituintes eletropositivos e orbitais com maior carter p estaro direcionados para os substituintes mais
eletronegativos. Um exemplo bem conhecido o da molcula de gua em comparao com o dimetil ter,
metanol e difluoreto de oxignio.

Tabela 11

ngulo de ligao entre os


Molcula
substituintes

111
Dimetil ter

107-109
Metanol

104.5
gua

Difluoreto de 103.8
oxignio

Em adio, as ligaes O-H so polarizadas devido alta eletronegatividade do oxignio. Assim, um


lado da molcula de gua carrega uma carga parcial () de -0,6 unidades e o outro lado positivamente

1 Tabela
extrada de HENRY A . BENT AN APPRAISAL OF VALENCE-BOND STRUCTURES AND HYBRIDIZATION IN
COMPOUNDS OF THE FIRST-ROW ELEMENTS. Chemical Reviews, 1961, Vol. 61(3), pp.275-311.
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carregado de forma correspondente (Fig. 1). Essa separao espacial entre as cargas d molcula de gua as
caractersticas de um dipolo eltrico, de tal modo que, essas molculas se atraem como magnetos e
estabelecem ligaes de hidrognio (Fig. 2). Sendo assim, ao contrrio do que acontece com metano (Fig. 3)
que no dipolar (momento de dipolo 0 C.m), para vaporizar a gua (momento de dipolo 6,2.10 -30 C.m)
necessrio colocar grande quantidade de energia para romper as pontes de hidrognio. Disso decorre a enorme
discrepncia entre os pontos de ebulio da gua ao nvel do mar (100C) e do metano (-162C).

Fig. 2: Representao de duas molculas de gua ligadas por ligaes de hidrognio.

Fig. 3: Estrutura molecular do metano.

A polaridade da gua a torna um excelente solvente para ons e um indutor da formao de agregados
supramoleculares de molculas surfactantes. Surfactantes com uma cauda apolar, como o SDS (surfactante
aninico, Fig. 4) e o CTAB (surfactante catinico, Fig. 4) quando presentes em gua em concentrao acima
da CMC (concentrao micelar crtica) organizam-se como micelas aquosas (Fig. 5). Quando misturados
com gua e solventes orgnicos em propores de cerca de 1/10 podem formar as chamadas micelas
reversas (Fig. 5).

Fig. 4: Estruturas do SDS (esquerda) e CTAB (direita).


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Fig. 5 : Micela aquosa e micela reversa, mostradas esquerda e direita repectivamente, sendo a gua representada em
azul e o solvente orgnico em amarelo.

Surfactantes com duas caudas apolares tais como os fosfolipdios organizam-se em meio aquoso como
bicamadas e formam vesculas uni ou multilamelares. O tipo de estrutura formada determinado pela
geometria da molcula do lipdio anfiptico (Figura 6). Lipdios com uma nica cadeia carbnica, como sabes
de detergentes, devido a forma cnica e afilada de suas molculas, formam, preferencialmente, micelas. Nesta
estrutura esfrica, as cadeias carbnicas organizam-se no interior, isolando-se da gua, e os grupos polares
posicionam-se na superfcie externa, interagindo com o solvente.

Cavidade Aquosa

(A) Micela (B) Bicamada Lipdica (C) Lipossomo

Fig. 6: Estruturas formadas por lipdios anfipticos em meio aquoso. (A) Micelas so formadas por molculas de lipdios
com uma nica cadeia carbnica, cadeias estas que se localizam no interior dessas estruturas. (B) Bicamada lipdica
uma estrutura bidimensional na qual as cadeias carbnicas formam um domnio central hidrofbico, isolando-se da gua,
exceto nas extremidades da bicamada; a estrutura comumente formada por lipdios anfipticos com duas cadeias de
hidrocarbonetos. (C) Liposssomo uma vescula oca, resultante do fechamento de uma bicamada lipdica, dotada de
uma cavidade central preenchida por solvente.

As micelas e os lipossomos possuem a capacidade de sequestrar molculas hidrofbicas como o


corante azul de metileno e modular o estado de agregao e as propriedades ticas do mesmo. O corante possui
uma estrutura molecular de baixa polaridade e se associa a micelas e no ao monmero de um detergente, ou
seja, micelas formadas pelos surfactantes (aninicos ou catinicos) aprisionam molculas de MB. As
micelas de SDS, um detergente aninico, formam uma interface carregada negativamente e tem maior
afinidade pelo MB (catinico) que o CTAB (catinico). Assim, para modular esse processo necessrio
considerar a razo micela/corante.
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Estrutura molecular do MB
Estruturas do SDS (esquerda) e Micela aquosa
CTAB (direita).

Representao de uma micela de SDS com um monmero de MB (esquerda) e de uma micela com um dmero
de MB (direita).

Fig. 6: Estrutura de surfactantes, do azul de metileno, de micelas e da associao do corante com as micelas na forma
de monmero e dmero.

Objetivo Geral

Este experimento didtico tem como proposta fazer com que os estudantes entendam as propriedades fsico-
qumicas da gua relacionadas sua estrutura e polaridade e sua influncia na formao de agregados
supramoleculares de surfactantes que so capazes de sequestrar molculas hidrofbicas e interferir no estado
de agregao e propriedades das mesmas. Ao manipular as solues e fazer transferncias de volumes devem
adquirir conhecimento e desenvolver a habilidade no uso correto de micropipetas e modos de pipetagem dos
lquidos.

Objetivos Especficos

Mais especificamente abordaremos o efeito dos estados de agregao nas propriedades ticas de um corante,
o azul de metileno (Fig. 6), promovidas por altas concentraes do mesmo e associao a micelas.
Adicionalmente veremos que a carga do surfactante pode influir na afinidade por determinadas molculas.
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Materiais

11 tubos de ensaio por grupo, sendo 10 tubos para a Parte 1 (identificar como 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 1B,
2B,3B, 4B e 5B , conforme a Tabela 1) + 1 tubo para a Parte 2 ( identificar segundo o * para cada
grupo de acordo com a Tabela 2)
4 microtubos Eppendorfs de 2 mL por grupo (Parte 2)
Suporte para tubos e para microtubos
1 unidade de micropipeta automtica de volume varivel por grupo ( P10, P20, P100, P200, P1000)
Ponteiras
1 bquer de 50 mL
Papel absorvente
Fita crepe para identificao dos tubos e Eppendorfs ( a equipe tcnica pode fazer a identificao
prvia)
Soluo de NaCl (Cloreto de sdio M.M. 58,5 g/mol) a 1,14 mol/L. Para 10 mL de soluo estoque
utilizar uma massa de 0,6669 g.
Soluo de SDS ( Sodium dodecyl sulfate / C12H25 NaO4 S , M.M. 288 g/mol ) a 40 mmol/L. Para 10 mL
de soluo estoque utilizar uma massa de 0,1152 g
Soluo de CTAB (N-Cetyl-N,N,N-trimethyl-ammioniumbromid / C19 H42BrN ,M.M. 364,46 g/mol) a 40
mmol/L. Para 10 mL de soluo estoque utilizar uma massa de 0,1458 g
Soluo de Azul de Metileno (Methylene Blue / CHClNS, M.M. 319,85 g/mol ) a 500 mol/L.
gua deionizada
Agitador Vrtex
Papel de alumnio

Procedimento

Para as pipetagens utilize a micropipeta de volume varivel disponvel para o seu grupo ( P10, P20, P100,
P200, P1000) que seja adequada para a transferncia de volume exato do lquido.

Parte 1

Posicione os tubos no suporte e numere-os na seguinte ordem: 1A, 2A, 3A, 4A e 5A e outra fileira 1B, 2B,
3B, 4B e 5B.

Nos tubos de 1A a 5A e de 1B a 5B, coloque os respectivos volumes de gua deionizada recomendados para
cada tubo, conforme Tabela 1.
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Em seguida adicione os volumes de soluo estoque de NaCl, 0, 35, 175 e 350 L respectivamente nos tubos
2B a 5B.

Por fim adicione os respectivos volumes indicados da soluo estoque de SDS nos tubos 2A a 5A e 2B a 5B
para as concentraes finais de 16, 8, 4 e 1.5 mmol/L. Aps a adio do detergente em todos os tubos, agitar
individualmente, manualmente e depois no agitador Vrtex, e observar a formao de espuma (vide Fig. 7).
Anotar (Tabela 1) e fotografar por grupo (A e B).

Tabela 1 Volumes de adio referentes Parte I do experimento 1 gua.

Amostra A (Sem sal) B (Com sal)

1A 1B
2A 3A 4A 5A 2B 3B 4B 5B
(controle) (controle)
Reagente

gua 2 mL 1200 L 1600 L 1800 L 1925 L 2 mL 1200 L 1565 L 1625 L 1575 L

Soluo NaCl 35 L 175 L 350 L


- - - - - - 0
(concentrao) (20 mM) (100 mM) (200 mM)

Surfactante SDS 0 800 L 400 L 200 L 75 L 0 800 L 400 L 200 L 75 L

(concentrao) (0) (16 mM) (8 mM) (4 mM) (1,5 mM) (0) (16 mM) (8 mM) (4 mM) (1,5 mM)

Formao de espuma

SDS 8 mM SDS 8 mM
NaCl zero NaCl 200mM
(2mL) (2mL)

Fig. 7: Exemplo de resultado esperado. Efeito da fora inica sobre a CMC de um detergente. O tubo da esquerda
contm 8 mmol/L de SDS em gua deionizada o que equivale ao valor da CMC do detergente e o tubo da direita possui
a mesma concentrao de SDS em soluo de NaCl 200 mmol/L. Nessa concentrao a CMC do detergente cai para 1
mmol/L.
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Parte 2
(A turma dever ser dividida em 6 grupos e cada grupo dever preparar somente as solues relacionadas ao
seu ndice em negrito conforme Tabela 2: Aa,Ab,Ba,Bb,Ca,Cb)

Nos microtubos Eppendorf, prepare solues com concentraes finais de SDS de zero, 1,5 e 16 mmol/L e
de CTAB com zero, 0,75 e 8 mM, nos volumes indicados na Tabela 2 referente ao seu grupo, identificando-
os respectivamente como 1a, 2a e 3a, e 1b, 2b e 3b e o nome do grupo (Exemplo: B1a). Observe que a
amostra identificada com * dever ser preparada em tubo de ensaio pois corresponde a um volume
maior que as demais.
Em seguida, adicione a soluo de azul de metileno (MB) nos Eppendorfs, de acordo com o indicado para
seu grupo: Aa Ab q.s.p. 5 M, Ba Bb q.s.p. 50 M e Ca Cb q.s.p. 150 M. (Ateno para os
volumes indicados para o seu grupo!)
Em relao amostra preparada no tubo de ensaio, dividi-la em 2 Eppendorfs , colocando 2 mL de
soluo em cada. Identificar os microtubos com o grupo e amostra e tambm com ndice P (protegido da luz)
e E (exposto a luz), por exemplo, A3aP e A3aE. As amostras com ndice P devem ser cobertas com papel
alumnio.
Observe a colorao das solues e fotografe na ordem 1, 2 e 3.

Todas as amostras da Parte II desse experimento devem ser guardadas, no laboratrio, para utilizao
no Experimento 2.

Tabela 2 Volumes de adio referentes Parte II do experimento 1 gua.

Grupo A q.s.p. 5 M de MB
Amostra SDS (Aa) CTAB (Ab)

3a*
2a 2b 3b
1a (16 mM) 1b
(1.5 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente 4 mL

gua 1980 L 1905 L 2360 L 1980 L 1942,5 L 1580 L

Surfactante 0 L 75 L 1600 L 0 L 37,5 L 400 L

Azul de Meliteno 20 L 20 L 40 L 20 L 20 L 20 L
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Grupo B q.s.p. 50 M de MB

Amostra SDS (Ba) CTAB (Bb)

2a*
3a 2b 3b
1a (1.5 mM) 1b
(16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente 4 mL

gua 1800 L 3450 L 1000 L 1800 L 1762,5 L 1400 L

Surfactante 0 L 150 L 800 L 0 L 37,5 L 400 L

Azul de Meliteno 200 L 400 L 200 L 200 L 200 L 200 L

Grupo C q.s.p. 150 M de MB

SDS (Ca) CTAB (Cb)


Amostra

1a* 2a 3a 2b 3b
1b
4 mL (1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente

gua 2800 L 1325 L 600 L 1400 L 1362,5 L 1000 L

Surfactante 0 L 75 L 800 L 0 L 37,5 L 400 L

Azul de Meliteno 1200 L 600 L 600 L 600 L 600 L 600 L

*amostra preparada em tubo de ensaio.

cyan cyan

royal

Fig. 8: Exemplo de resultado a ser obtido. Em cada foto, os tubos Eppendorfs da esquerda contm 0, 1,5 e 16 mM de
SDS e os da direita contm 0, 0,75 e 8 mmol/L de CTAB. Nas foto da esquerda, centro e direita, as concentraes de
azul de metileno so respectivamente, 5, 50 e 150 mmol/L. Observar as diferenas de tonalidade de azul. A tonalidade
royal indica predominncia de dmeros do corante e a tonalidade cyan indica predominncia de monmero do corante.
20

Anlise dos dados

As anotaes e fotos de cada grupo devem ser compartilhadas.


1- Descreva as caractersticas da espuma formada nos tubos 1A a 5A e 1B a 5B e explique.
2- Qual a C.M.C. do SDS e do CTAB em gua sem adio de sal ?
3- Aps pesquisar a estrutura do MB e compartilhar as fotos e as observaes dos grupos A, B e C, indique e
explique qual (quais) ficaram com a colorao cyan ou royal em todas as condies (presena ou no de
surfactante e tipo de surfactante). Fundamente sua discusso com base na hidrofobicidade.

REFERENCIAS:

KOOLMAN, Jan. Color Atlas of Biochemistry. 2nd edition. 2005. Thieme.


JUNQUEIRA, Helena C., SEVERINO, D., DIAS, L. G., GUGLIOTTI, M. S. and.BAPTISTA,M. S.
Modulation of methylene blue photochemical properties based on adsorption at aqueous micelle interfaces.
Phys. Chem. Chem. Phys.(4) 23202328, 2002.

VOET, Donald. Bioqumica. 4 edio. 2013. Artmed


LEHNINGER, David. Princpios da Bioqumica. Terceira edio, Agosto de 2002. RR Donnelley.
H. A. Bent. Chem Rev. 61, 275-311 (1961).
21

Experimento 2 Espectrofotometria: Conceitos e Aplicao

Abstract

The light absorption phenomenon directly by macromolecules or by chromophores formed by


secondary reactions is used for the spectral characterization and/or quantification of these substances through
spectrophotometry. The purpose of this experiment is to present the technique of spectroscopy at the UV-vis
range applied to Biochemistry using the Lambert-Beers law and qualitative measurements by the analysis of
a dye monomer and dimer composite spectra. To this class, it will be used direct absorbance at 280 nm and
the colorimetric Biuret method for albumin quantification. The extinction coefficient () of albumin at 280
nm and of the Biuret chromophore will be calculated by fitting a curve of absorbance intensity versus protein
concentration. The calculation of the absorbance intensity at wavelength of maximum absorbance of dye
monomer and dimer will provide to the students the identification of the experimental conditions that change
the equilibrium between these species.

Resumo

O fenmeno de absoro de luz diretamente por macromolculas ou cromforos formados por reaes
secundrias usado para a caracterizao espectral e/ou quantificao dessas substncias por
espectrofotometria. Este experimento didtico tem como proposta apresentar a tcnica de espectrometria de
absoro eletrnica na faixa de espectro eletromagntico UV-vis aplicada Bioqumica para realizar medidas
quantitativas de acordo com a Lei de Lambert-Beer e medidas qualitativas por meio da observao da relao
monmero/dmero em agregados supramoleculares de um corante. Para esta aula, sero obtidos espectros de
absoro de uma soluo de concentrao desconhecida da protena albumina para dosagem dessa diretamente
a 280 nm e pelo mtodo do Biureto. O coeficiente de extino () da albumina a 280 nm e o do cromforo do
Biureto sero calculados por meio do ajuste de uma curva padro de intensidade de absorbncia em funo da
concentrao do cromforo. Tambm sero obtidos espectros de absoro de solues de trs diferentes
concentraes do corante azul de metileno combinadas com trs diferentes concentraes dos surfactantes
SDS e CTAB. Por meio do clculo da razo entre picos de absorbncia do monmero e do dmero do corante,
os estudantes observaro as mudanas na razo monmero/dmero em diferentes condies experimentais.

Introduo
22

O termo medida fotomtrica foi definido originalmente como o ato de medir a intensidade da luz,
independente do comprimento de onda (energia). A maioria dos instrumentos tem, contudo, mecanismos para
isolar uma faixa estreita de comprimentos de onda do espectro. Os instrumentos que usam filtros para esse
propsito so referidos como fotmetros de filtro ou colormetros e os que utilizam prismas ou grades de
difrao so chamados de espectrofotmetros.

Comprimento de onda refere-se a distncia entre dois picos da propagao da luz que ocorre na forma
de onda, e essa distncia normente dada em nanmetros (nm). A radiao eletromagntica inclui desde a
energia radiante dos comprimentos de onda curtos dos raios aos comprimentos de onda longos das ondas de
rdio. O termo luz usado para descrever a energia dos comprimentos de onda visveis ao olho humano e
queles limtrofes. O olho humano capaz de detectar comprimentos de onda entre 380 e 750 nm, entretanto
espectrofotmetros so capazes de medir tambm comprimentos de onda mais curtos (ultra-violeta, UV) ou
mais longos (infra-vermelho, IV) (Fig. 1).

Fig. 1. Espectro eletromagntico evidenciando a faixa dos comprimentos de onda visveis.


(fonte: http://www.arq.ufsc.br/labcon/arq5656/Curso_Iluminacao/07_cores/luz_01.htm e
http://www.wordpress.com/2009/03/teoriadacor_01.jpg).

A espectrofotometria um dos mtodos pticos de anlises mais usados nas investigaes bioqumicas
(Fig. 2). O espectrofotmetro um instrumento que permite comparar a intensidade de luz absorvida ou
transmitida por uma soluo que contm uma quantidade desconhecida de soluto, em relao a quantidade
conhecida da mesma substncia. Todas as substncias podem absorver energia radiante, como por exemplo, a
gua que absorve fortemente na regio do IV. A absoro das radiaes ultravioletas, visveis e infravermelhas
dependem da estrutura molecular e caracterstica para cada substncia qumica. Quando a luz atravessa uma
soluo de determinada substncia, parte da energia absorvida (absorbncia). A cor das substncias se deve
a no absoro (transmitncia) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando
transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas no absorvidos. Esse fenmeno pode ser
23

usado para quantificao de substncias por meio da intensidade de absorbncia em um comprimento de onda
especfico, com base em uma curva-padro, utilizando-se da Lei de Lambert-Beer (PUNGOR, 1995).

Fig. 2. Esquema ptico simplificado de um espectrofotmetro. (fonte: http://www.ufpa.br/ccen/quimica/espect2.jpg)

Fundamentao Terica

Considere um feixe de luz incidente com intensidade I o passando por uma cubeta contendo uma
soluo de uma determinada substncia que absorve luz de certo comprimento de onda (Fig. 3). A intensidade
do feixe de luz transmitido (I) ser sempre menor que I o, sendo que a transmitncia (T) definida como uma
relao entre a intensidade da luz transmitida e a intensidade da luz incidente (Lei de Beer).
T = I/Io

Fig. 3. Esquema demonstrando a incidncia de um feixe de luz em uma cubeta e sua


transmitncia.

(fonte:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/04/Beer_lambert.png/300px-Beer_lambert.png)

medida que aumentamos a concentrao da substncia em soluo, a transmitncia varia em relao


inversa ao logaritmo da concentrao. Em conseqncia disso, pode-se definir um novo termo, absorbncia
(A), que ser diretamente proporcional concentrao. Portanto,

A = log I/Io = log T


A = log 1/T
24

Dessa forma, a absorbncia direta e linearmente proporcional concentrao. Esta varia tambm de
forma direta com o caminho ptico (dimetro interno) da cubeta, ou seja, se dobrarmos o caminho ptico
mantendo a concentrao constante, teremos um valor de absorbncia duas vezes maior. Essa relao
frequentemente referida como Lei de Lambert-Beer:

A = a.b.c

Onde A = abosrbncia, a = constante de proporcionalidade (absortividade ou coeficiente de extino),


b = caminho ptico (em centmetros) e c = concentrao. Como os valores de A so adimensionais, a unidade
de so as recprocas daquelas para b e c. Quando b = 1 cm (geralmente ) e c expresso em mol/L ou molL-
1, a constante pode ser chamada de absortividade ou coeficiente de extino molar (, epsilon) e constante
para dado comprimento de onda, temperatura, pH, solvente, etc.

Assim, a proporcionalidade direta entre absorbncia e concentrao pode ser usada para a
determinao da absortividade de uma determinada substncia em determinada condio experimental por
meio de realizao de uma curva-padro. Para a construo dessa curva, solues de concentraes conhecidas
da substncia devem ser preparadas e as absorbncias determinadas em determinado comprimento de onda.
Posteriormente, essa absortividade pode ser utilizada para quantificao dessa substncia em uma soluo,
cuja concentrao desconhecida (VOET & VOET, 2006).

Objetivo Geral

Introduzir os conceitos de espectrofotometria ao aluno utilizando como exemplo a dosagem de


protenas em uma amostra por mtodo direto, ou seja pela intensidade de absorbncia a 280 nm e pelo mtodo
indireto do Biureto; em ambos os casos com aplicao da Lei de Lambert-Beer. Observar mudanas espectrais
que acompanham alteraes no estado de agregao do corante azul de metileno e assim, entender que a
espectroscopia de absorbncia tambm fornece informaes qualitativas a respeito das molculas.

Objetivos especficos
25

1. Obter o espectro de absoro UV da albumina decorrente da presena de aminocidos aromticos e de


cistina, assim como o referido espectro visvel do complexo formado entre os ons Cu2+ presentes no reagente
de Biureto e as protenas.

2. Utilizar valores de absorbncia no comprimento de onda de absorbncia mxima de concentraes


conhecidas de uma soluo para a elaborao de uma curva-padro e determinao do coeficiente de extino
dos cromforos para aplicao da Lei de Lambert-Beer na quantificao das substncias.

3. Calcular a concentrao de uma soluo de albumina e dessa soluo acrescida de biureto.

4. Observar o espectro de absoro de solues do corante azul de metileno (MB) em trs diferentes
concentraes que interferem com seu estado de agregao e em trs concentraes dos surfactantes SDS e
CTAB relacionadas com a CMC dos detergentes. O uso de surfactantes catinicos e aninicos tambm
fornecer informaes sobre a influncia da carga da interface das micelas na associao com outras
molculas.

Materiais

Soluo-problema com concentrao desconhecida.


Reagente de Biureto
H2O destilada
1 unidade de micropipeta automtica de volume varivel por grupo ( P10, P100, P200, P1000)
Ponteiras
Estante com 2 tubos de ensaio
Bquer de 50 mL
Espectrofotmetros (de Varredura)
Cubetas de quartzo caminho ptico 1 cm.
Papel absorvente macio para limpeza das cubetas
Amostras preparadas pelos alunos na Aula 2 Experimento 1 gua.

O reagente de Biureto composto por CuSO4 0,15 % (m/v), tartarato de sdio e potssio 0,6 % (m/v)
e NaOH 0,75 mol/L. Este reagente no deve ser guardado por mais de 30 dias, devido a possibilidade de
precipitao do cobre na forma de xidos ou sais insolveis. Porcentagem m/v refere-se massa do soluto,
em grama, usada para preparar 100 mL de soluo, isto , 0,15 g de CuSO4 para 100 mL de soluo.
26

Parte 1 : Medidas quantitativas obtidas pela Espectroscopia UV-Vis


Albumina e Albumina+Biureto

Nesses experimentos determinaremos a concentrao de uma soluo de albumina por dois mtodos de
forma comparativa: diretamente pela absorbncia de seus aminocidos aromticos e cistinas a 280 nm (mtodo
direto) e pela formao de complexos com Cu 2+ presentes no reagente de biureto e que absorvem luz com
mximo em 550 nm (mtodo do Biureto).

1. Mtodo direto. Nesse mtodo, a quantificao da concentrao de albumina feita pela contribuio de
absorbncia dos seus resduos de aminocidos aromticos (tirosina, fenilalanina e triptofano) e tambm dos
resduos de cistina.

Procedimento

Aquisio do espectro da soluo-problema de BSA: coloque 2 mL da soluo de BSA de concentrao


desconhecida na cubeta de caminho ptico 1 cm e faa a aquisio do espectro em ESPECTROFOTMETRO
DE VARREDURA, na regio espectral de 240 a 320 nm, com 1 nm de intervalo de . NO ESQUECER de
fazer o branco, isto , a aquisio de um espectro com gua no lugar da amostra, antes do incio da leitura
da soluo-problema de BSA. Analise se o espectro no ultrapassa a intensidade de 1 e apresenta uma banda
bem definida com pico em 280 nm. Caso contrrio, dilua a amostra 10 vezes e refaa a leitura. Compare os
dois espectros e discuta qual deles confivel. Qual seria a outra alternativa para no no saturar a
fotomultiplicadora caso no fosse possvel diluir a amostra?

Observao: Esse procedimento dever ser realizado pelo professor ou por um colaborador da disciplina e
acompanhado pelos estudantes. Dividir a turma em dois ou trs grupos, dependendo do nmero de alunos. O
arquivo dever ser identificado como BSA e ser disponibilizado posteriormente para os alunos.

Anlise dos dados


27

Para dosar albumina pelo mtodo do biureto voc utilizar a constante de absortividade molar de

15.100 M-1cm-1obtida a partir de uma curva padro de albumina que reagiu com o biureto (Figura 2). Para

dosagem direta da albumina voc ir utilizar os dados da Tabela 1 e ir plotar um grfico de absorbncia em

280 nm em funo da concentrao de albumina para determinar o valor de 280 (contribuio conjunta dos

aminocidos aromticos).

1.0
0.9 Concentraoes
Albumina-Biureto
(cubeta 1cm)
20 M

0.8 0.5
40 M
60 M
80 M
100 M
Absorbncia

0.7 120 M
140 M
160 M
180 M
200 M
0.6
0.5
A550

0.0
0.4 400 450 500 550 600
Comprimento de onda (nm)
650 700

0.3
0.2
0.1 Albumina_Biureto (cubeta 1cm)
= 15.100 M-1.cm-1
0.0 550nm

0 1 2 3

C .l . 106 M-1cm-1

Figura 4. Curva padro de albumina determinada pelo mtodo do biureto. O inserto mostra os espectros do cromforo Biureto-

Albumina, os quais forneceram os valores de absorbncia em 550 nm usados na construo da curva padro.
28

Concentrao albumina (M) Absorbncia em 280 nm

0 0
20 0,07872
40 0,15472
60 0,24432
80 0,34145
100 0,38875
120 0,47505
140 0,54262
160 0,62176
180 0,70163
200 0,76322

Com uso do valor de 280nm obtido, calcule a concentrao de albumina nessa soluo problema,

utilizando a equao de Lambert-Beer = . . .

Conforme pode ser verificado, de acordo com a equao de Lambert-Beer (equao de reta), a
intensidade de absorbncia em 280 nm deve aumentar linearmente com a concentrao de albumina. O ajuste
linear do grfico de intensidade de absorbncia (A) em 280 nm versus concentraes conhecidas de albumina
em concentrao molar (C) X caminho tico de leitura em cm (l) fornece o valor da constante de absortividade
molar () do cromforo, no caso, a contribuio simultnea dos resduos aromticos e de cistina. Deve-se
ressaltar que o aumento linear da absorbncia da albumina em funo da concentrao se restringe a condies
de concentraes relativamente baixas nas quais no h agregao significativa das molculas de protenas. A
formao de agregados a partir de determinadas concentraes levam a perda da linearidade do grfico a partir
dessa dada concentrao, visto que o agregado se comporta como outro cromforo, com propriedades distintas
do monmero.

2. Mtodo do Biureto. Esse mtodo utilizar igualmente a lei de Lambert-Beer. A nica diferena que nesse
mtodo, cria-se um novo cromforo na molcula de albumina capaz de absorver na regio visvel do espectro
eletromagntico, no caso com mximo em 550 nm. Esse cromforo resulta da complexao do cobre presente
no reagente com as ligaes peptdicas e assim, independe do tipo de protena.

Procedimento.
29

Coloque 0,5 mL de soluo de albumina no tubo e acrescente 1 mL de gua destilada. Aps agitao
manual delicada, adicionar 1,5 mL do reagente de Biureto e tornar a agitar. Aps 5 minutos, fazer a leitura da
soluo no espectrofotmetro de varredura. ATENO, obter o branco com uma soluo de
gua+biureto ( 1,5 mL de gua destilada + 1,5 mL de Biureto ) e fazer a leitura da absorbncia dessa soluo
no incio da leitura da amostra.
Anote atentamente o valor de absorbncia da soluo.

Anlise dos dados

1) Determinar a concentrao da soluo-problema albumina+biureto, utilizando os dados obtidos no item 3.

2) Demonstrar os clculos para a preparao da soluo de Biureto, admitindo a preparao de 100 mL da


soluo.

3) Em que se baseia o Mtodo do Biureto para a dosagem de protena e porque utilizada uma banda de
absoro diferente em ambos os mtodos?

4) Relacione as vantagens e desvantagens do mtodo do biureto em relao a outros mtodos para dosagem
de protenas.

Parte 2 : Medidas qualitativas obtidas pela espectroscopia UV-Vis


Solues de Azul de Metileno com surfactante

Nessa parte da aula sero usadas as amostras preparadas no Experimento 1. Somente as amostras com
ndice A (maisculo) devem ser lidas no espectrofotmetro de varredura. Entretanto todas as amostras devero
ser analisadas visualmente em relao as diferenas de tonalidade de azul, relacionando-as a predominncia
de dmero e monmero. A tonalidade royal indica predominncia de dmeros do corante e a tonalidade cyan
indica predominncia de monmero do corante. Uma amostra dos espectros obtidos em cada condio est
fornecida no apndice a seguir.
Observe a colorao das solues referentes ao seu grupo e fotografe na ordem 1a, 2a e 3a ou 1b, 2b e 3b.
Para os grupos com ndice a, compare as solues E e P correspondentes. Fotografe.
30

Procedimento para obteno dos espectros de varredura. Essa parte do experimento ser executada por
um colaborador da disciplina, com acompanhamento pelos alunos. Os espectros obtidos sero disponibilizados
para os alunos da maneira mais adequada a cada turma (pendrive, dropbox, facebook ).
Configurao do equipamento:
Regio espectral de 350 a 750 nm,
de leitura de 1 em 1 nm
Escala e unidades : auto
Branco no incio da srie de leituras com cada cubeta : gua destilada
As solues devem ser lidas na sequncia especificada na Tabela 2, em cubeta de caminho ptico 1 cm, aps
realizar o branco. Aps a leitura, voltar com a soluo para o respectivo Eppendorfs.

Tutorial para realizao das leituras dos espectros de absoro UV-Vis no equipamento do laboratrio didtico
601-B. Importante: fazer a IDENTIFICAO DE CADA AMOSTRA. Para isso seguir as instrues:
pressione Opes, em seguida Mais, depois Configuraes do sistema, selecione ID da amostra,
pressione Novo e nomeie a amostra pressionando sobre as letras e nmeros e digitando, assim, a nova
identificao. Nesse experimento, atente para o nome marcado em cada Eppendorf e na Tabela 2, que devem
ser o mesmo. Aps a identificao correta da amostra, pressione OK e depois Regressar > Colocar amostra
na cubeta e essa em posio > Na janela Procurar comprimento de onda, pressione Ler. Ao trmino da
leitura aparecer na tela o espectro da amostra. Se desejar obter o valor de absorbncia no mximo ou no
mnimo, utilizar as setas ou na lateral direita da tela, sendo que esse aparecer na lateral superior
esquerda. Nesse experimento a obteno desses valores no ser necessria. Terminada a leitura da amostra,
pressione Opes > Pressione a figura de uma pasta > Selecione na listagem do equipamento a entrada ou
Procedimento que estiver livre (1, 2, 3...) ou aquele onde ser gravada a leitura daquela amostra > Pressione
Armazenar. Para esse experimento, anotar na Tabela 2 o nmero do arquivo ou do procedimento para a
respectiva amostra para garantia da correta identificao.
Se desejar enviar os dados para o pen drive imediatamente aps a leitura e armazenamento, instale-o na parte
posterior do equipamento, pressione Opes, depois Mais e em seguida Enviar dados. Aguarde o envio
e pressione Regressar. Reiniciar a sequncia com a identificao da prxima amostra. Ateno: os arquivos
podem ser enviados um a um, ao final de cada leitura ou aps a leitura das 6 amostras. Atente para o fato de
que o equipamento possui uma memria interna de 20 entradas somente, aps esse limite os dados devem ser
apagados ou sero sobrepostos. Caso queira apagar algum arquivo duvidoso, sobreponha nele a prxima
leitura. Para enviar os dados para um pen drive aps a leitura das 6 amostras, insira o pen drive na parte
posterior do aparelho, no Menu principal pressionar Recuperar dados, pressionar Procurar comprimento
de onda, pressionar Opes, pressionar a figura do computador e esperar a transferncia de dados ser
31

concluda. Remova o pen drive e confira se os arquivos foram transferidos corretamente. S desligue o
equipamento aps conferir se os arquivos foram enviados corretamente para o pen drive.

Combinar com o professor responsvel pela turma como os dados obtidos nessa aula sero disponibilizados
aos alunos (espectro de BSA de concentrao desconhecida e das solues de azul de metileno com
surfactante). Preferencialmente os dados devem ser convertidos em uma planilha do Microsoft Excel (.xls),
pelos colaboradores da disciplina, antes de enviados aos alunos, conforme Tutorial para converso de dados
do Espectrofotmetro de varredura (.csv) para processamento dos dados disponvel a seguir.

Tabela 2 - Dados para orientao da identificao e ordem de leitura dos espectros de varredura das amostras da parte
2 do Experimento 2 de TBq 2015.3.

Cubeta Identificao da amostra Nmero do arquivo Check list


Branco : gua destilada

1 A1b
A1a
A2b

cm A2a
A3b
A3a

Tutorial para converso de dados do Espectrofotmetro de varredura (.csv) em uma planilha do


Microsoft Excel (.xls) para processamento dos dados ( Lab. Didticos midos Bloco B)

Aps o envio de todos os dados com extenso .csv do espectrofotmetro de varredura, com o auxlio de um
pendrive, transferir os arquivos para o computador.

Clicar sobre o arquivo desejado com o boto direito do mouse e selecionar abrir com;
Selecionar o programa Bloco de Notas;
Na aba Editar selecionar a opo Substituir ou apertar as teclas de atalho Crt+H;
Abrir-se- uma janela em segundo plano, nela existem duas caixas de textos, uma localizar e outra
substituir;
Primeiramente, no campo localizar insira: , (vrgula) e no campo substituir inserir ; (ponto-
e-vrgula);
Pressionar o boto Substituir tudo;
Em seguida, ser feito o mesmo processo, porm com as informaes nos campos diferentes. No
campo localizar insira . (ponto) e no campo substituir insira ,
Pressionar o boto Substituir tudo;
Salvar o arquivo com o nome desejado.
32

Com esta etapa terminada todas as informaes referentes a tabulao ideal do arquivo estaro completas e a
manipulao no Microsoft Excel ser facilitada.

Abrir o Microsoft Excel;


Na aba arquivo, selecionar a opo abrir ou pressionar as teclas de atalho Crtl+A;
Selecionar o arquivo j modificado no bloco de notas;
Note que dependendo da verso do Microsoft Excel, o arquivo pode no aparecer, para isso
coloque nas opes embaixo ou ao lado de Nome do arquivo a opo Todos os arquivos;
Uma aba de auxilio de converso de dados de extenso .csv em uma planilha de Excel ser aberta;
Na primeira parte estar selecionado a opo delimitado, apenas clique em avanar;
Em seguida, na aba de delimitadores, selecione o combobox com a informao ponto e virgula;
Logo abaixo, aparecer uma prvia de como a planilha dever ficar. Verifique se surgiram
bordas que separam as informaes da forma desejada;
Pressionar em avanar;
Pressionar concluir na aba seguinte;
Salvar o documento no formato .xls

Anlise dos dados

1 . Plotar os grficos absorbncia X comprimento de onda e analisar a razo entre os picos de absoro
das formas monmero e dmero em cada condio, conforme modelos no apndice.
2. Discutir as diferenas entre as amostras armazenadas com e sem proteo da luz.

Apndice

Grficos do Experimento 2 Parte 2 : Medidas qualitativas obtidas pela Espectroscopia UV-


Vis para a soluo de Azul de Metileno com surfactante.

Espectros padro de cada condio experimental mostrados de forma comparativa.

Ao analisar os espectros seguintes atente para o fato de que cada espectro sobreposto ao outro
foi plotado em uma escala diferente na ordenada (y), portanto as intensidades no so comparativas.
O eixo y correspondente a cada grfico est na mesma cor da linha do grfico.
Observem a forma e localizao dos picos das bandas de absoro de acordo com a
concentrao de MB, na ausncia de surfactante, conforme mostrado na Figura 1 e na Figura 7 a seguir,
relacionando-os a presena de MB na forma de monmero ou de dmero. Em seguida observem a
33

forma e localizao dos picos das bandas de absoro de acordo com a concentrao de MB, na
presena das diferentes concentraes de surfactante SDS ou CTAB. Atentem para o fato de que o
corante se associa a micelas e no ao monmero do detergente, ou seja, micelas formadas pelos
surfactantes (aninicos ou catinicos) aprisionam molculas de MB. As micelas de SDS, um
detergente aninico, formam uma interface carregada negativamente e tem maior afinidade pelo MB
(catinico) que o CTAB (catinico). Assim, para modular esse processo necessrio considerar a razo
micela/corante.

Estrutura molecular do MB
Estruturas do SDS (esquerda) e Micela aquosa
CTAB (direita).

Representao de uma micela de SDS com um monmero de MB (esquerda) e de uma


micela com um dmero de MB (direita).
34

0,30
0_SDS_5uM_MB_A1a 0,7
0,20 0_SDS_50uM_MB_B1a (cubeta 0.1)
0,25 Monmero
0_SDS_150uM_MB_C1a (cubeta 0.1) 0,6

Dmero
0,15 0,20 0,5
Absorbncia

0,4
0,15
0,10
0,3
0,10
0,2
0,05
0,05
0,1

0,00 0,00 0,0


450 500 550 600 650 700 750

Comprimento de onda (nm)

Figura 1 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5uM , 50uM e
150uM, sem surfactante (0_SDS).

0,35
0,2
0,10 Monmero
0,30
Dmero
0,08 0,25
Absorbncia

0,20
0,06
0,1
0,15
0,04
0,10

0,02 1.5_SDS_5uM_MB_A2a
1.5_SDS_50uM_MB_B2a (cubeta 0.1) 0,05
1.5_SDS_150uM_MB_C2a (cubeta 0.1)
0,0 0,00 0,00
450 500 550 600 650 700 750
Comprimento de onda (nm)

Figura 2 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50 M e 150
M e concentrao de 1,5 mM do surfactante SDS.
35

16_SDS_5uM_MB_A3a
16_SDS_50uM_MB_B3a (cubeta 0.1)
1,2
0,4 16_SDS_150uM_MB_C3a (cubeta 0.1)

0,3
1,0

0,3
0,8
Absorbncia

0,2
0,6
0,2

0,4
0,1
0,1
0,2

0,0 0,0 0,0


450 500 550 600 650 700 750 800 850
Comprimento de onda (nm)

Figura 1 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50 M e 150
M e concentrao de 16 mM do surfactante SDS.

5uM_MB_0 SDS_A1a
0,20 5uM_MB_1,5mM_SDS_A2a
0,2
5uM_MB_16mM_SDS_A3a 0,3

0,15
Absorbncia

0,2

0,10 0,1

0,1
0,05

0,00 0,0 0,0


600 800
Comprimento de onda (nm)

Figura 2 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 5 M e concentra-
es de 0 mM, 1,5 mM e 16 mM do surfactante SDS. O grfico obtido dos espectros adquiridos durante a aula a
partir das amostras preparadas pelos alunos deve ser semelhante a esse, considerando as amostras A1a, A2a e A3a.
36

50uM_MB_0 SDS_B1a
50uM_MB_1,5mM_SDS_B2a
0,30
0,12 50uM_MB_16mM_SDS_B3a
0,4

0,25 0,10

0,3
0,20 0,08
Absorbncia

0,15 0,06 0,2

0,10 0,04

0,1
0,05 0,02

0,00 0,00 0,0


500 600 700 800
Comprimento de onda (nm)

Figura 3 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 50 M, e
concentraes de 0 mM, 1,5 mM e 16 mM do surfactante SDS.

150uM_MB_0 SDS_C1a
150uM_MB_1,5mM_SDS_C2a
0,7 150uM_MB_16mM_SDS_C3a
0,35

0,6 1,0
0,30

0,5 0,8
0,25
Absorbncia

0,4
0,20 0,6

0,3 0,15
0,4
0,2 0,10

0,2
0,1 0,05

0,0 0,00 0,0


500 600 700 800
Comprimento de onda (nm)

Figura 4 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 150 M, e
concentraes de 0 mM, 1,5 mM e 16 mM do surfactante SDS.
37

0_CTAB_5uM_MB_A1b
0,20 0_CTAB_50uM_MB_B1b (Cubeta 0.1)
0,7
0_CTAB_150uM_MB_C1b (Cubeta 0.1)
0,25
0,6
0,15
0,20
0,5
Absorbncia

0,15 0,4
0,10
0,3
0,10
0,2
0,05
0,05
0,1

0,00 0,00 0,0


450 500 550 600 650 700 750 800
Comprimento de onda (nm)

Figura 5 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 5 M, 50 M e
150 M e concentrao de 0 mM do surfactante CTAB.

0.75_CTAB_5uM_MB_A2b
0.75_CTAB_50uM_MB_B2b (Cubeta 0.1)
0,3
0.75_CTAB_150uM_MB_C2b (Cubeta 0.1) 0,7
0,25
0,6

0,20
0,2 0,5
Absorbncia

0,15 0,4

0,3
0,10
0,1
0,2

0,05
0,1

0,00 0,0 0,0


450 500 550 600 650 700 750 800
Comprimento de onda (nm)

Figura 6 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50 M e
150 M e concentrao de 0,75 mM do surfactante CTAB.
38

8mM_CTAB_5uM_ MB_A3b
8mM_CTAB_50uM_MB_B3b (cubeta 0.1)
0,30
8mM_CTAB_150uM_MB_C3b (cubeta 0.1) 0,7
0,25
0,25 0,6

0,20 0,5
0,20
Absorbncia

0,15 0,4
0,15
0,3
0,10
0,10
0,2

0,05 0,05
0,1

0,00 0,00 0,0


450 500 550 600 650 700 750 800
Comprimento de onda (nm)

Figura 7 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50 M e
150 M e concentrao de 8 mM do surfactante CTAB.

5uM_MB_0_CTAB _A1b
0,20 5uM_MB_0.75mM_CTAB_A2b 0,30
5uM_MB_8mM_CTAB_A3b
0,25
0,25
0,15
0,20
0,20
Absorbncia

0,15
0,10 0,15

0,10
0,10
0,05
0,05 0,05

0,00 0,00 0,00


500 600 700 800
Comprimento de onda (nm)

Figura 8 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 5 M, e
concentraes de 0 mM, 0,75 mM e 8 mM do surfactante CTAB. O grfico obtido dos espectros adquiridos durante
a aula a partir das amostras preparadas pelos alunos deve ser semelhante a esse, considerando as amostras A1b, A2b e
A3b.
39

50uM_MB_0_CTAB (cubeta 0.1)_B1b


50uM_MB_0.75mM_CTAB (cubeta 0.1)_B2b
50uM_MB_8mM_CTAB )cubeta 0.1)_B3b
0,3

0,25 0,25

0,20 0,20
0,2
Absorbncia

0,15 0,15

0,10 0,10
0,1

0,05 0,05

0,00 0,0 0,00


500 600 700 800
A

Figura 9 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 50 M e
concentraes de 0 mM, 0,75 mM e 8 mM do surfactante CTAB.

150uM_MB_0_CTAB (cubeta 0.1)_C1b


150uM_MB_0.75mM_CTAB (cubeta 0.1)_C2b
0,7 150uM_MB_8mM_CTAB (cubeta 0.1)_C3b 0,7
0,7
0,6 0,6
0,6
0,5 0,5
0,5
Absorbncia

0,4 0,4
0,4

0,3 0,3
0,3

0,2 0,2 0,2

0,1 0,1 0,1

0,0 0,0 0,0


500 600 700 800
Comprimento de onda (nm)

Figura 10 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 150 M e
concentraes de 0 mM, 0,75 mM e 8 mM do surfactante CTAB.
40

MB_5uM_SDS_0_A1a
1,0 MB_50uM_SDS_0_B1a (cubeta 0.1)
MB_150uM_SDS_0_C1a (cubeta 0.1)
1.5mM_SDS_5uM_MB_A2a
1.5mM_SDS_50uM_MB_B2a (cubeta 0.1)
1.5mM_SDS_150uM_MB_C2a (cubeta 0.1)
16mM_SDS_5uM_MB_A3a
16mM_SDS_50uM_MB_B3a (cubeta 0.1)
16mm_SDS_150uM_MB_C3a (cubeta 0.1)
Absorbncia

0,5

0,0
500 550 600 650 700 750 800 850
Comprimento de onda (nm)

Figura 11 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) e do surfactante SDS nas diversas
concentraes.

0_CTAB_5uM_MB_A1b

0,6 0_CTAB_50uM_MB_B1b (Cubeta 0.1)


0_CTAB_150uM_MB_C1b (Cubeta 0.1)
0.75mM_CTAB_5uM_MB_A2b
0.75mM_CTAB_50uM_MB_B2b (Cubeta 0.1)
0.75mM_CTAB_150uM_MB_C2b (Cubeta 0.1)
Absorbncia

8mM_CTAB_5uM_ MB_A3b

0,4 8mM_CTAB_50uM_MB_B3b (cubeta 0.1)


8mM_CTAB_150uM_MB_C3b (cubeta 0.1)

0,2

0,0
550 600 650 700 750 800 850
Comprimento de onda (nm)

Figura 12 - Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) e do surfactante CTAB nas diversas
concentraes.
41

Tabela 3 - Volumes de adio referentes s amostras apresentadas nos grficos.

Grupo A q.s.p. 5 M de MB
Amostra SDS (Aa ) CTAB (Ab)

3a*
2a 2b 3b
1a (16 mM) 1b
(1.5 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente 4 mL

gua 1980 L 1905 L 2360 L 1980 L 1942,5 L 1580 L

Surfactante 0 L 75 L 1600 L 0 L 37,5 L 400 L

Azul de Meliteno 20 L 20 L 40 L 20 L 20 L 20 L

Grupo B q.s.p. 50 M de MB

Amostra SDS (Ba) CTAB (Bb)

2a*
3a 2b 3b
1a (1.5 mM) 1b
(16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente 4 mL

gua 1800 L 3450 L 1000 L 1800 L 1762,5 L 1400 L

Surfactante 0 L 150 L 800 L 0 L 37,5 L 400 L

Azul de Meliteno 200 L 400 L 200 L 200 L 200 L 200 L


42

Grupo C q.s.p. 50 M de MB

Amostra SDS (Ca) CTAB (Cb)

2a*
3a 2b 3b
1a (1.5 mM) 1b
(16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente 4 mL

gua 1800 L 3450 L 1000 L 1800 L 1762,5 L 1400 L

Surfactante 0 L 150 L 800 L 0 L 37,5 L 400 L

Azul de Meliteno 200 L 400 L 200 L 200 L 200 L 200 L

Cyan Cyan Cyan Cyan Cyan


Cyan

Royal Royal
Royal

Figura 13 - Fotos das solues referentes Tabela 1 e aos grficos apresentados. Em cada foto, os tubos Eppendorfs
da esquerda contm 0; 1,5 e 16 mmol/L de SDS e os da direita contm 0; 0,75 e 8 mmol/L de CTAB. Nas fotos da
esquerda, centro e direita, as concentraes de azul de metileno so respectivamente, 5, 50 e 150 mmol/L. Observar
as diferenas de tonalidade de azul. A tonalidade royal indica predominncia de dmeros do corante e a tonalidade
cyan indica predominncia de monmero do corante.

Exerccio

De acordo com os grficos apresentados para o surfactante SDS, os quais esto todos representados na
Figura 13, com a Tabela 1 e as imagens da Figura 15, indique (nos retngulos) a forma do corante azul de
metileno representada pelos espectros no grfico abaixo e a tonalidade da soluo correspondente.
Considerando as possveis combinaes em relao concentrao de MB (baixa ou alta) e de micelas
(excesso ou no) e a razo micela/corante (alta ou baixa razo), atribua para os espectros representados pelas
linhas azul, vermelha e preta quais outras condies experimentais resultariam em espectros semelhantes,
considerando as solues com 5 microM de MB em gua, 50 microM de MB em SDS 16 mM , 150
microM de MB em gua, 50 microM de MB em gua. Obs: Desconsidere a intensidade de absorbncia.
Indique as solues nas respectivas colunas .
43

0,35
0,2
0,10
0,30

0,08 0,25
Absorbncia

0,20
0,06
0,1
0,15
0,04
0,10

0,02 1.5_SDS_5uM_MB_A2a
1.5_SDS_50uM_MB_B2a (cubeta 0.1) 0,05
1.5_SDS_150uM_MB_C2a (cubeta 0.1)
0,0 0,00 0,00
450 500 550 600 650 700 750
Comprimento de onda (nm)

Vermelha___________________ Azul________________________ Preta_______________________


___________________________ ___________________________ ___________________________
___________________________ ___________________________ ___________________________
___________________________ ___________________________ ___________________________
___________________________ ___________________________ ___________________________
________________________ ___________________________ ___________________________

Desafio: Explique o que levou a amostra de azul de metileno 150 microM em 1.5 mM SDS apresentar mais
monmeros do que a amostra de menor concentrao do corante, ou seja, 50 microM em 1.5 mM SDS.

Referncias Bibliogrficas

1. PUNGOR, E. A practical guide to instrumental analysis. Boca Raton: CRC Press, c1995.384.
2. VOET, D; VOET, J.G. Bioqumica, 3 ed., Porto Alegre: Artmed, 2006.
3. ZAIA, D.A.M.; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, J. Determinao de protenas totais via
espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes. Qum. Nova 21(6):787-
793, 1998.
4 . JUNQUEIRA, Helena C., SEVERINO, D., DIAS, L. G., GUGLIOTTI, M. S.
and.BAPTISTA,M. S. Modulation of methylene blue photochemical properties based on
adsorption at aqueous micelle interfaces. Phys. Chem. Chem. Phys.(4) 23202328, 2002.
44

Experimento 3 Propriedades cido-base das protenas e seus efeitos sobre a solubilidade das mesmas: Aplicao
na purificao de protenas.

Abstract

This educational experiment has the purpose of making the students of Biochemical
Transformations understand that the side chains of the amino acid residues contribute to the
properties of a protein. The basic properties of proteins depend on their amino acid composition
and may be useful for separation and purification thereof using techniques that exploit the net
charge of a protein as a function of pH. A strategy for the purification of a protein is the
precipitation at the pH in which the net charge of the protein is zero (pI). One can use different
strategies to precipitate proteins at the pI such as the use of organic solvents or the polymer
polyethylene glycol. At the pI, the solubility of a protein can be increased by adding salt
constituting the salting-in phenomenon. At pH higher than pI, a protein can be precipitated by
the addition of salt at high concentrations (salting out). The specific pI values of each protein can
also be used to separate a mixture of proteins by electrophoresis and electrofocusing.

Resumo

Este experimento didtico tem como proposta fazer com que os estudantes de
Transformaes Bioqumicas entendam que os aminocidos constituintes de uma protena
contribuem para as propriedades das mesmas por meio de suas cadeias laterais. As propriedades
cido-base das protenas dependem de sua composio de aminocidos e podem ser usadas para
separao e purificao das mesmas por meio de tcnicas que exploram a variao de carga de
uma protena em funo do pH do meio. Uma tcnica de purificao de protenas a precipitao
no pH no qual a carga lquida da protena igual a zero (pI). Pode-se utilizar diferentes estratgias
para precipitar protenas no pI como por exemplo o uso de solventes orgnicos ou o polmero
polietilenoglicol. No pI, a solubilidade de uma protena pode ser aumentada pela adio de sal
constituindo o fenmeno de salting-in. Em pH maior do que o pI, uma protena pode tambm ser
precipitada pela adio de sal em altas concentraes (salting out). Os valores de pI especficos
de cada protena tambm permite separar uma mistura de protenas por meio de eletroforese e
eletrofocalizao.
45

Introduo

Aminocidos

Em qumica, um aminocido qualquer molcula que contm simultaneamente grupos


funcionais amina e cido carboxlico. Em bioqumica, este termo usado como termo curto e
geral para referir os -aminocidos, ou seja, cidos carboxlicos em que as funes amino esto
ligadas s posies (ou posio 2 em relao carboxila).

Na natureza existem cerca de 200-300 aminocidos, entretanto, somente 21 so utilizados


para a sntese de protenas (aminocidos proteinognicos) e outros aparecem como intermedirios
de vias metablicas. Dentre estes, 8 so chamados aminocidos essenciais, isto , no podem ser
sintetizados pelo organismo humano, e precisam ser obtidos a partir dos alimentos de origem
animal ou vegetal. Os demais so chamados de no essenciais. H um aminocido, a taurina, que
est presente nos organismos superiores, mas no na constituio das protenas.

Aminocidos essenciais (no sintetizados pelo organismo humano): isoleucina, leucina,


lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina.

Aminocidos no-essenciais (sintetizados pelo organismo humano): arginina, alanina,


asparagina, cistena, glicina, glutamina, histidina, prolina, cido asprtico, cido
glutmico, serina e tirosina.

Contudo, esta classificao no pode ser tomada como algo geral para todos os organismos
superiores e em todas as etapas de seus ciclos de vida. Em crianas, por exemplo, os aminocidos
cistena, tirosina, histidina e arginina so considerados semi-essenciais uma vez que as etapas
metablicas para sintetizar estes aminocidos no esto completamente desenvolvidas. Portanto,
esta classificao de essencial e no-essencial no reflete a importncia destes -aminocidos,
uma vez que, todos os 21 -aminocidos so necessrios na constituio de protenas e peptdeos,
conseqentemente, de toda a matria viva.
O aminocido mais simples a glicina (Figura 1), e possui apenas um tomo de hidrognio
em sua cadeia lateral. A alanina vem a seguir, com um grupamento metila. Cadeias laterais
hidrocarbnicas maiores so encontradas na valina, leucina e isoleucina. A prolina tambm tem
uma cadeia lateral aliftica, mas difere dos outros membros do conjunto dos vinte por sua
46

cadeia lateral ser ligada tanto ao nitrognio quanto ao tomo de carbono . Esta resultante
estrutura cclica influencia fortemente a arquitetura das protenas. Trs aminocidos com cadeias
laterais aromticas fazem parte do conjunto dos vinte. A fenilalanina contm um substituinte
fenila ligado a um grupamento metileno. O anel aromtico da tirosina contm uma hidroxila, o
que torna a tirosina menos hidrofbica do que a fenilalanina. O triptofano tem um anel indlico
ligado a um grupamento metileno. Dois aminocidos, serina e treonina , contm hidroxilas
alifticas, o que as tornam muito mais hidroflicas e reativas. Vamos agora aos aminocidos com
cadeias laterais muito polares, sendo altamente hidroflicos. A lisina e a arginina tm cargas
positivas em pH neutro. A histidina pode no ter carga ou t-la positiva, dependendo de seu
ambiente local. As cadeias laterais da arginina e da lisina so as mais longas no conjunto dos
vinte.

O O O O O
H 2N S
OH OH OH OH OH
NH2 NH 2 NH 2 NH2 NH2

L-isoleucina L-leucina L-lisina L-metionina L-fenilalanina

O O O O
OH O
H 2N
OH OH OH OH
OH
NH2 HN NH 2 NH 2 O NH2
NH 2

L-treonina L-valina L-triptof ano L-alanina L-aspargina

O O O O O O O
HO
OH HS OH HO OH H 2N OH OH
O NH2 NH 2 NH2 NH 2 NH 2

cido L-asprtico L-cistena cido L-glutmico L-glutamina glicina

O O O NH O O
H
N OH N
HO OH OH H 2N N OH OH
NH2 H
NH 2 NH 2 HN NH2
HO

L-serina L-prolina L-tirosina L-arginina L-histidina

Figura 1. Estrutura dos 20 L-aminocidos encontrados em protenas. O vigsimo primeiro


aminocido, no representado aqui a selenocistena. Nesse aminocido, o tomo de enxofre da cistena
substitudo por um tomo de selnio.

Existem dois aminocidos com cadeias laterais cidas, o cido asprtico e o cido glutmico.
Esses aminocidos so geralmente chamados de aspartato e glutamato para salientar que suas
47

cadeias laterais tm, quase sempre, cargas negativas no pH fisiolgico. A glutamina e a


asparagina so derivados no carregados de glutamato e aspartato que contm uma amida
terminal em vez de um carboxilato. Sete dos vinte e um aminocidos tm cadeias laterais
facilmente ionizveis. Um tomo de enxofre est presente nas cadeias laterais de dois
aminocidos. A cistena contm uma sulfidrila (-SH) e a metionina possui um tomo de enxofre
em uma ligao tioter (-S-CH3). Ambas as cadeias laterais que contm enxofre so hidrofbicas.
Deve-se destacar que a maioria destes aminocidos presentes em protenas possui pelo menos um
centro quiral definido com estereoqumica (S) com exceo da cistena que (R) (notaes de
Cahn-Ingold-Prelog) e da glicina que no possui centro quiral (Figura 1); ainda, todos os
aminocidos comuns em protenas so freqentemente denominados L-aminocidos, baseados
na nomenclatura do gliceraldedo (configuraes de Fisher). Estas caractersticas conferem a
estes compostos uma grande diversidade qumica e estrutural, permitindo que estes possam
constituir uma gama enorme de diferentes protenas com diferentes arranjos espaciais e as mais
diversas funes (Figura 2).
Alguns autores relatam que para formar uma protena necessria uma cadeia com mais de
70 aminocidos. J os peptdeos (fragmentos de protenas) podem ser formados por dois ou
mais aminocidos.

Figura 2. Esquema representativo dos diferentes nveis de estrutura protica da hemoglobina


(LEHNINGER, NELSON & COX, 2006).
48

FUNDAMENTAO TERICA

Propriedades cido-base dos aminocidos e protenas


Os aminocidos na forma livre possuem, no mnimo, dois grupos ionizveis, que so os
grupos -carboxlico e -amino. Alguns aminocidos possuem um terceiro grupo ionizvel na
cadeia lateral. Os aminocidos com cadeias laterais com grupos ionizveis tais como lisina,
arginina, glutamato, aspartato, histidina, cistena e tirosina so os responsveis pelas propriedades
cido-base das protenas. Ao se fazer a titulao de um aminocido com um cido forte na escala
de pH de zero a 14, o aminocido atuar como um tampo e apresentar alteraes de carga
lquida de sua estrutura conforme ilustrado abaixo.
O O O O
O O
O O OH- OH- OH-
- - - -
- O O
HO O O O
HO OH
+ +
NH3 NH2
+ NH3
NH3

Zwitterion -1 -2
+1
O O
O O
H+ OH- H+ OH- OH- N -
N -
O
N N - O
OH O
+
+ + NH3 NH2
NH3 NH3 N N
N N H
H
H H
+2 +1 -1
Zwitterion
O O
O OH- + OH- O
OH-
+ H3N
H3N - H2N H2N -
O -
OH O O
+ +
+ NH3 +
NH3 NH3 NH3

+2 +1 Zwitterion -1

Assim, os aminocidos atuam como tampes duplos ou triplos. Abaixo temos o exemplo
da curva de titulao da histidina na qual se observa a mxima capacidade tamponante exibida
por esse aminocido em 3 faixas de pH: de 0,8 a 2,8, de 5 a 7 e de 8,2 a 10,2.

Figura 3. Curva de titulao da


histidina.

Quando os aminocidos estabelecem as ligaes peptdicas, suas cadeias laterais no


perdem as propriedades de ionizao, porm, podem ter seus valores de pKa bastante alterados
devido vizinhana de outros grupos carregados. Assim, em um peptdeo ou em uma protena,
os grupos ionizveis sero o N-terminal, o C-terminal e as cadeias laterais ionizveis dos
49

aminocidos. Abaixo vemos o efeito da titulao, com uma base forte, de um peptdeo formado
pelos mesmos 3 aminocidos mostrados acima. Nesse caso, verificamos que a carga lquida
tambm varia com o pH do meio e em um determinado pH o peptdeo tambm ficar na forma
zwiterionica.
O H O H - O H -
OH O O
+ H O + H O + H O
H3N N H3N N H3N N
N O N O N O

+
OH- +
OH- +
HN HN HN
NH NH NH
O O -
OH OH O O

+ + +
+3 NH3 +2 NH3 +1 NH3

OH-

O H - O H - O H -
O O O
H O + H O + H O
H2N N H3N N H3N N
N O N O N O

N
OH- OH- N
N
NH NH NH
- - -
O O O O O
O

+
NH2 NH2 NH3
-2 -1 Zero

Figura 4. Formas inicas formadas durante a titulao de glutamilhistidinillisina com base forte.
No ponto isoeltrico, uma protena apresenta carga lquida igual a zero e essa propriedade
pode ser utilizada para separar e purificar protenas. Uma estratgia bastante usada em protemica
a eletrofocalizao na qual uma mistura de protenas colocada em uma matriz (fita) que
apresenta diferentes valores de pH ao longo de sua extenso. Ao submeter a amostra, nesse meio,
a uma diferena de potencial, as protenas migraro para o polo oposto ao de sua carga lquida no
pH da regio de partida e estacionaro na regio da fita no qual o pH igual ao seu pI. Em
seguida, efetua-se a separao das protenas de mesmo pI e massas moleculares diferentes
submetendo a amostra a uma eletroforese em sentido perpendicular (Fig.5). Essa tcnica
chamada de eletroforese bidimensional.

Figura 5. Eletroforese
bidimensional .
50

No pI, uma protena apresenta a mais baixa solubilidade em meio aquoso e pode ser
facilmente precipitada pelo uso de solventes ou do polmero polietilenoglicol. Os fatores que
governam a precipitao da albumina pelo polmero sinttico polietilenoglicol (PEG) foi
previamente investigado por Ingham (1978) para determinar as bases moleculares da precipitao
de protenas por polmeros sintticos. A concentrao de PEG 4000 requerida para precipitao
da albumina foi mnima no ponto isoeltrico da protena. Porm, o aumento da concentrao de
sal desviou para valores mais altos a quantidade de PEG necessria para precipitao no pI. Efeito
oposto do sal foi observado em pH abaixo do pI. Assim, essa propriedade pode ser explorada no
processo de separao e purificao de protenas. Se tivermos, por exemplo, uma mistura de duas
protenas sendo uma com pI = 4 e outra com pI = 7, podemos nos valer do uso de PEG para
separ-las. Se ajustarmos o pH para um valor igual ao pI de uma delas e adicionarmos PEG, a
protena que esteja no pI ir precipitar em grande quantidade e a outra protena permanecer em
soluo. O uso de polietilenoglicol para precipitao de albumina no pI e o efeito de sal na
solubilidade da albumina ser o tema da presente aula.

Objetivo

Verificar o efeito da adio de polietilenoglicol sobre a solubilidade da albumina


modulada pelo pH do meio (abaixo, igual e acima de seu pI), em condies de baixa e alta fora
inica.

Materiais

12 mL de soluo de albumina 270 mg/mL.


Tampo acetato de potssio 2M, pH 3, 4,7 e 7.
Soluo aquosa de polietilenoglicol 4000 40%.
3 tubos eppendorf contendo cada um 7,4 g de cloreto de potssio.
Pipetas automticas de 1000 a 5000 L, de 10 a 100 L e ponteiras.
6 tubos de ensaio etiquetados como pH 3, pH 4,7, pH 7 e pH 3 + KCl, pH 4,7+ KCl, pH
7+ KCl.
Estante para tubos
51

Tubos eppendorf.

Procedimento
Transfira 1,5 mL da soluo de albumina para cada um dos seis tubos de ensaio
disponibilizados. Analise o aspecto da soluo e fotografe. Em seguida, adicione 0,5 mL da
soluo de PEG 4000 40% em cada um dos tubos. Agite e observe o aspecto de cada soluo.
Fotografe os tubos novamente e anote as mudanas ocorridas. Em seguida adicione todo o
contedo de sal contido em cada um dos 3 eppendorfs em cada um dos tubos assinalados com o
valor de pH + KCl. Agite, anote as mudanas ocorridas e fotografe novamente os tubos de ensaio.
Observao: Nesse quadrimestre cada grupo far os procedimentos de um dos seis tubos e
a turma analisar o conjunto dos resultados. Assim um grupo far o tubo de pH 3 sem
adio de sal, outro grupo far o tubo de pH de 4,7 sem adio de sal e assim sucessivamente.

Resultado esperado

Anlise dos dados


Em casa, monte um texto com as fotos inseridas no qual se discute os fenmenos ocorridos
durante as etapas do procedimento. Proponha uma explicao para o sal (KCl) ter promovido a
precipitao da albumina com PEG em pH menor do que o pI.
52

EXERCCIO

Atribua o nome de cada aminocido (como exemplificado para a L-alanina) comparando


as estruturas qumicas (Figura 1) com as projees moleculares 3D abaixo. Nas estruturas,
considere os tomos de carbono em cinza, oxignio em vermelho, nitrognio em azul, enxofre
em amarelo e hidrognio em branco. No se esquea de considerar as mltiplas ligaes que esto
implcitas nestes modelos (por exemplo, uma nica ligao entre um dos carbonos e um dos
oxignios da L-alanina, significando que h uma dupla ligao pois o oxignio bivalente veja
a posio circulada).

L-alanina

/ 3,9 / 4,3
53
54
55

Referncias Bibliogrficas

1. LEHNINGER, A.L; NELSON, D.L; COX, M.M. Princpios de bioqumica. 4 ed. So Paulo:
Sarvier, 2006. 1202 p.

2. BERG, M.J.; TYMOCZKO, J.L., STRYER, L. Biochemistry 5th. Edition. W. H. Freeman and
Company. New York, 2002.
3. BETTELHEIM, F.A.; LANDESBERG, J.M. Laboratory Experiments for General, Organic &
Biochemistry, Harcourt College Pub, New York, 2000.
4. VOET, D.; VOET, J.G. Bioqumica, 3 ed., Porto Alegre: Artmed, 2006.
5. INGHAM. K. C. Precipitation of Proteins with Polyethylene Glycol: Characterization of
Albumin. Arch. Biochem. Biophys. (1978) 186, 106-113.
56

Experimento 4 - Propriedades de surfactantes e lipdios

Abstract

The aim of this experiment is to introduce the students of the Federal University of ABC
to the procedures related to the characterization of lipids employing soybean as a source of
triacylglycerol, one type of biologic lipids. Furthermore the students will learn the saponification
concept through the alcaline hydrolysis of soybean triacylglycerol and the physical and chemical
properties of the soap obtained will be exploited.

Resumo

O presente experimento visa apresentar aos alunos de Bacharelado em Cincias e


Tecnologia, da Universidade Federal do ABC, caractersticas fsico-qumicas de lipdios. Sero
utilizados o sabo de coco para explorar as caracterstias fsico-qumicas dos surfactantes e
diferentes tipos de gorduras para explorar o efeito do grau de insaturao de seus cidos graxos
constituintes no ponto de fuso das mesmas.

Introduo

Os lipdios so representados por um grupo de biomolculas de baixa massa molecular


que apresentam estruturas qumicas bastante variadas, baixa solubilidade em gua de tal forma
que so extraidos dos tecidos biolgicos com uso de solventes de baixa polaridade tais como ter
e clorofrmio . A diversidade de estruturas apresentadas pelos lipdios faz com que esses
compostos tenham a capacidade de exercer diversas funes biolgicas atuando desde
componentes de membranas celulares, isolantes trmicos, sinalizadores celulares, pigmentos e
reservas de energia (leos e gorduras). Adicionalmente, os prprios lipdios ou seus derivados,
podem tambm exercer funes de vitaminas e hormnios. As principais classes de compostos
pertencentes ao grupo dos lipdios so os triacilgliceris, glicerofosfolipdeos, esfingolipdios,
glicolipdios e esterides (Figura 1).
57

(A)

(B)

Figura 1. As principais classes de lipdios biolgicos. Em (A) todos os lipdios mostrados apresentam
glicerol ou esfingosina, estrutura central, ligados a cidos graxos. (B) Estrutura de trs hormnios
esterides.

Tipicamente, os lipdios apresentam em suas estruturas longas cadeias carbnicas, como


os cidos graxos e isoprenos, ou mltiplos anis interligados, como no caso dos esterides.
Vrias classes de lipdios apresentam cidos graxos como componentes estruturais. cidos
graxos so cidos monocarboxlicos, molculas anfipticas que apresentam uma regio polar,
representada pelo grupo carboxila (ionizado em pH neutro), e uma regio apolar, representada
por uma cadeia carbnica com comprimento variando entre 4 a 36 tomos de carbono (Figura 2).
Estruturalmente, a cadeia carbnica dos cidos graxos caracterizada pela presena de nmero
par de carbonos formando uma estrutura no ramificada que pode ser saturada ou conter uma,
duas ou mais insaturaes.
58

Grupo
carboxila

Insaturao

Cadeia
carbnica

(A) (B)

Figura 2. Estrutura de cidos graxos. Os cidos graxos so compostos anfipticos formados por uma longa
cadeia carbnica apolar e um grupo carboxila polar. As cadeias carbnicas dos cidos graxos no possuem
ramificaes e podem ser saturadas, como no caso do cido esterico, (A) ou insaturadas, como no caso
do cido oleico (B).

Lipdios como triacilgliceris, fosfolipdios, glicolipdios e esfingolipdios apresentam


cidos graxos esterificados em suas estruturas. Uma das funes mais importantes dos cidos
graxos nas clulas a participao na construo das membranas celulares, finas camadas
lipdicas que circundam todas as clulas e suas organelas internas. As membranas celulares so
compostas em grande parte por fosfolipdios, pequenas molculas constitudas principalmente
por cidos graxos e glicerol. Outra importante funo desempenhada pelos cidos graxos est
associada manuteno de uma reserva energtica celular. De fato, os cidos graxos podem ser
estocados no citoplasma celular na forma de gotculas lipdicas constitudas por molculas de
triacilgliceris. Os triacilgliceris, tambm conhecidos como triglicerdeos, triglicrides ou
gorduras neutras, representam os lipdios mais abundantes na natureza sendo formados pela
esterificao de trs cidos graxos a uma molcula de glicerol. este estabelecimento de ligaes
ster entre os precursores polares dos triacilgliceris (hidroxilas do glicerol e carboxilas dos
cidos graxos) que confere ao composto carter essencialmente apolar, permitindo com que seja
armazenado nas clulas de forma praticamente anidra (Figura 3).
59

Glicerol

Triacilglicerol

Figura 3. Triacilglicerois so compostos apolares resultantes da formao de ligaes ster entre as


hidroxilas livres de uma molcula de glicerol e os grupos carboxila dos cidos graxos.

As gorduras animais e leos vegetais so misturas de triacilgliceris, que diferem na sua


composio em cidos graxos e, conseqentemente, no seu ponto de fuso. Os triacilgliceris das
gorduras animais so ricos em cidos graxos saturados, o que atribui a esses lipdeos uma
consistncia slida temperatura ambiente. J os triacilgliceris origem vegetal so ricos em
cidos graxos poliinsaturados sendo, portanto, lquidos temperatura ambiente. Os leos vegetais
so utilizados para a fabricao de margarinas atravs de um processo de hidrogenao que reduz
parte de suas duplas ligaes e os torna slidos temperatura ambiente.

cidos graxos saturados Cadeia carbnica no apresentam ligaes duplas entre os


tomos de carbono e, assim, contem o nmero mximo possvel de hidrognios.

cidos graxos insaturados Cadeia carbnica possui uma ou mais ligaes duplas
entre tomos de carbono contendo o nmero mximo possvel de hidrognios.

Os lipdios anfipticos, tais como os cidos graxos, quando so adicionados a um meio


aquoso, tendem a agregar-se, organizando-se espontaneamente em estruturas plurimoleculares.
Essas estruturas permitem maximizar as interaes hidrofbicas entre as cadeias carbnicas,
isolando-as da gua, e deixar os grupos polares em contato com o solvente, com o qual podem
60

interagir. Tais arranjos moleculares constituem o estado de menor energia livre para esses lipdios
em gua e resultam da presena de duas regies com solubilidades diferentes na mesma molcula.

O tipo de estrutura formada determinado pela geometria da molcula do lipdio


anfiptico (Figura 4). Lipdios com uma nica cadeia carbnica, como sabes de detergentes,
devido a forma cnica e afilada de suas molculas, formam, preferencialmente, micelas. Nesta
estrutura esfrica, as cadeias carbnicas organizam-se no interior, isolando-se da gua, e os
grupos polares posicionam-se na superfcie externa, interagindo com o solvente. A formao de
micelas uma etapa importante na digesto dos lipdios da dieta. A maioria dos fosfolipdios e
glicolipdios associam-se em uma camada dupla de molculas, chamada bicamada lipdica. Esta
estrutura permite uma agregao mais estvel das molculas desses lipdios, que tm forma
cilndrica pela presena de duas cadeias apolares.

As molculas de lipdios alinham-se lado a lado, compondo duas monocamadas e as


cadeias carbnicas das monocamadas agrupam-se frente a frente de modo a criar um domnio
hidrofbico no meio da bicamada; os grupos hidroflicos dispem-se na superfcie das duas faces
da bicamada, interagindo com a gua. Bicamadas lipdicas tendem a se converter em estruturas
fechadas, chamadas lipossomos, que so mais estveis porque no apresentam caudas
hidrofbicas expostas ao solvente, como acontece na periferia das bicamadas planas. Lipossomos
so, portanto, vesculas sintticas esfricas formadas por uma bicamada lipdica contnua, que
delimita uma cavidade interna preenchida por solvente.

Cavidade Aquosa

(A) Micela (B) Bicamada Lipdica (C) Lipossomo

Figura 4. Estruturas formadas por lipdios anfipticos em meio aquoso. (A) Micelas so formadas por
molculas de lipdios com uma nica cadeia carbnica, cadeias estas que se localizam no interior dessas
estruturas. (B) Bicamada lipdica uma estrutura bidimensional na qual as cadeias carbnicas formam um
domnio central hidrofbico, isolando-se da gua, exceto nas extremidades da bicamada; a estrutura
comumente formada por lipdios anfipticos com duas cadeias de hidrocarbonetos. (C) Liposssomo uma
61

vescula oca, resultante do fechamento de uma bicamada lipdica, dotada de uma cavidade central
preenchida por solvente.

1. Fundamentao Terica

Os lipdios representam um grupo de compostos com estrutura bastante variada. Vrias


classes de lipdios apresentam cidos graxos como componentes estruturais entre eles, os
fosfolipdeos, glicolipdeos e os triacilgliceris. Os lipdios podem ser caracterizados por suas
propriedades fsico-qumicas. Em geral, possuem baixa solubilidade em gua enquanto
apresentam alta solubilidade em solventes orgnicos como clorofrmio, ter, benzeno, mistura
de Folch (clorofrmio:metanol), entre outros.

Os triacilgliceris, que constituem o principal grupo de lipdios, podem ser hidrolisados


liberando cidos graxos e glicerol. Se esta hidrlise feita mediante aquecimento em meio
alcalino (hidrlise alcalina), formam-se sais de cidos graxos (sabes) e o processo chamado
saponificao (Figura 5). Este o princpio da fabricao dos sabes a partir de gordura animal
fervida em presena de NaOH ou KOH.

Triestearina Glicerol Estearato de Sdio

Figura 5. Hidrlise alcalina de triacilgliceris. Triacilgliceris, mediante aquecimento em presena de


bases fortes, como hidrxido de sdio (NaOH) ou hidrxido de potssio (KOH), sofrem hidrlise
produzindo sais de cidos graxos (sabes). No esquema acima mostrada a hidrlise do triestearina na
presena de NaOH dando origem a glicerol e sal sdico (estereato de sdio).

Como so cidos graxos, os sabes obtidos da hidrlise de gorduras so molculas


anfipticas apresentando em sua estrutura uma longa cadeia carbnica (cauda apolar, lipoflica)
62

e um grupo carboxilato (cabea polar, hidroflica). Dessa maneira, os sabes, quando em soluo
aquosa, associam-se por interaes hidrofbicas entre as caudas apolares formando um uma
pelcula lipdica na superfcie do liquido ou dando origem a estruturas como as micelas (Figura
6).

Pelcula lipdica

Grupo carboxilato
Cadeia carbnica

Micela
Sabo

Figura 6. Formao de micelas a partir das interaes entre sabes dispersos em soluo aquosa.

Propriedades dos sabes:

Sob condies especficas, os cidos graxos dos sabes podem ser precipitados. A adio
de cidos fracos, como cido actico, leva a formao de cidos graxos insolveis por causa do
baixo grau de dissociao (Figura 7).

OLEATO DE POTSSIO CIDO ACTICO CIDO OLICO ACETATO DE


(precipita) POTSSIO

Figura 7. Precipitao de cidos graxos devido ao protonamento do grupo carboxilico promovido pelo
cido actico . Em presena de cido actico (cido fraco), cido olico (cido graxo) precipitado a partir
da hidrlise cida do oleato de potssio (sabo).

Os sabes precipitam quando so usados em guas ricas em sais de clcio ou magnsio


(guas duras). Os ons clcio e magnsio da gua reagem com cidos graxos formando sais
insolveis. Os sabes tambm podem precipitar pela adio de excesso de eletrlitos, os quais
reprimem a dissociao dos sabes, fazendo com que as micelas percam a carga e precipitem.
63

OLEATO DE POTSSIO CLORETO DE OLEATO DE CLCIO CLORETO DE


CLCIO (precipita) POTSSIO

Figura 8. Reao de precipitao de sabo atravs de salificao. A exposio de sabes, como o oleato
de potssio, ambientes ricos em sais de clcio ou magnsio induz a formao de sabes insolveis.

Os sabes possuem propriedades emulsificantes. Emulso a mistura entre dois lquidos


imiscveis em que um deles (fase dispersa) encontra-se na forma de pequenos glbulos dispersos
em meio ao outro (fase contnua). Minsculas partculas de leo ou solventes orgnicos so
mantidas em suspenso numa soluo aquosa. Porm, quando as duas fases so misturadas ou
agitadas vigorosamente, essas partculas formam uma emulso onde os leos ou os solventes
orgnicos tendem a dispersar-se pela soluo. Com o tempo, as emulses tendem a retornar para
o estado estvel podendo se observar duas ou mais fases distintas (Figura 9A). Os sabes so
agentes emulsificantes, pois quando adicionados s emulses, tendem a torn-las mais estveis e
homogneas (Figura 9B).

(A)

AGITAO TEMPO

MISTURA EMULSO MISTURA

SABO

(B)

AGITAO

MICELA

MISTURA EMULSO
64

Figura 9. Propriedade emulsificante dos sabes. Uma mistura de dois lquidos imiscveis pode
formar uma emulso atravs de agitao (fornecimento de energia). Contudo, as emulses so
instveis e tendem a tornar-se misturas com o passar do tempo (A). Os sabes agem como
surfactantes estabilizando a emulso formada atravs da formao de micelas com leos ou
solventes orgnicos. As cadeias hidrocarbnicas no-polares dos sabes dissolvem-se no leo ou
solvente orgnico enquanto os grupos inicos polares na fase aquosa. As gotculas carregadas
negativamente repelem-se mutuamente (B).

Curiosidade: Um subproduto da manufatura de sabes a glicerina (glicerol), da qual se pode


obter a nitroglicerina, um poderoso explosivo. Durante a I e II Guerras Mundiais, as donas de
casa guardavam o excesso de leo e gorduras de cozinha e o devolviam para a recuperao da
glicerina.

2. Objetivos da aula

A aula apresenta como objetivos verificar o efeito de pH na formao de agregados


supramoleculares de surfactantes, no caso, sabo de coco fabricado a partir da hidrlise da gordura de
coco (saponificao). Adicionalmente a aula ter por objetivo verificar o efeito do grau de insaturao
dos cidos graxos no ponto de fuso dos mesmos e das gorduras que integram.

Materiais

1. Reagentes
Soluo aquosa de sabo de coco obtida da diluio em gua deionizada fervente e sob
agitao de sabo de coco puro em barra na proporo de 1:9 (m/v)
Soluo de NaOH (10 M)
Soluo de HCl ( 1 M)
gua deionizada

2. Materiais e vidrarias
3 tubos de ensaio por grupo
Estante para tubos de ensaio
Pipetador automtico e ponteiras de 1000 e de 100 L
Bquer pequeno

3. Procedimento experimental

1. Identificar os tubos de ensaio: 1, 2 e 3. Em cada um deles colocar 1 mL da soluo de sabo


de coco fornecida e acrescentar 1 mL de gua deionizada.
2. No tubo 2 acrescente 100 mL de HCl, observe e anote a mudana ocorrida.
2

3. No tubo 3 acrescente 100 mL de HCl, em seguida 50 mL de NaOH e agite suavemente


misturando a soluo, observando a mudana ocorrida.
Fotografe os 3 tubos juntos.

1
2 3
(controle)

Soluo sabo de coco 1 mL 1 mL 1 mL

gua 1 mL 1 mL 1 mL

Soluo HCl (1 M) - 100 L 100 L

Soluo NaOH - - 50 L

Aspecto da soluo

(turvo,precipitado,lmpido)

Resultado esperado

Discuta:
Qual a natureza qumica do detergente do sabo de coco e como ele produzido.
Qual a organizao supramolecular que o surfactante do sabo de coco forma em gua?

Referncias Bibliogrficas
3

1. MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioqumica Bsica, 3 ed., Rio de Janeiro: Guanabara


Koogan, 2007.
2. ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P.
Molecular Biology of the Cell, 5 ed., Garland Science, New York, 2008.
3. LEHNINGER, ALBERT L.; NELSON, DAVID L.; COX, MICHAEL M. Princpios de
bioqumica, 4 ed., So Paulo: Sarvier, 2006.
4. NEPOMUCENO, M. F.; RUGGIERO, A. C. Manual de Bioqumica: Roteiros de Anlises
Bioqumicas Qualitativas e Quantitativas, 1 ed., Ribeiro Preto: Tecmedd, 2004.
5. PETKOWICZ, I.; DE OLIVEIRA, C. L. Bioqumica: Aulas Prticas, 7 Ed., Editora UFPR,
Paran, 2007.

Experimento 5 - Carboidratos

Abstract

In this experiment the extraction and purification of the polysaccharide starch from
potatoes will be performed. After the microscopic characterization of the starch granules
morphology, biochemical reactions using iodide will be performed at several experimental
conditions. Besides, a qualitative analysis of reducing power of starch will be done in
comparison with glucose. The observed results will be discussed in terms of chemical structure
of the polymer. This practical application of the theoretical concepts learned inside the classes
about the spatial structure of starch is helpful for the improvement of biochemistry
understanding of UFABC students.

Resumo

Nesta aula prtica os alunos realizaro a extrao e purificao do amido da batata. Aps
a caracterizao microscpica dos grnulos de amido, observando a morfologia especfica,
sero feitas reaes bioqumicas de caracterizao utilizando iodo em diversas condies
experimentais. Alm disso, uma anlise qualitativa do poder redutor do amido ser feita em
comparao com a glicose e a sacarose. Os resultados obtidos sero discutidos em funo da
estrutura qumica espacial adquirida em meio aquoso por este polissacardeo. Este experimento
permite a aplicao dos conceitos tericos adquiridos durante as aulas sobre a conformao
4

espacial do amido extremamente importante para o aprendizado de bioqumica estrutural


pelos estudantes da UFABC.
5

Introduo

O amido um polissacardeo que tem como funo reserva energtica na forma de


carboidratos em plantas, que so consumidas por organismos heterotrficos como principal
fonte de glicose para gerao de ATP (LEHNINGER, NELSON, & COX, 2006). O amido
constitui de 50% a 65% do peso das sementes de cereais secos, e at 80% da substncia seca
dos tubrculos. Nos pases europeus e nos Estados Unidos, mais de 50% da produo de amido
destinada produo de hidrolisados, tais como glicose, maltose, dextrinas e maltodextrinas.
Esses hidrolisados, por suas propriedades especficas e seus diferentes usos no setor
alimentcio, constituem uma excelente valorizao da fcula (SUMERLY et al., 2002).

Embora a distribuio do amido seja ampla no reino vegetal, poucas plantas o produzem
em grandes quantidades. Milho e outros cereais, como o arroz, o sorgo e o trigo, contribuem
significativamente para o suprimento mundial de amido. Nos Estados Unidos mais de 95% do
amido comercializado proveniente do milho. Em muitos pases, como por exemplo, no Brasil,
o amido tambm extrado da batata, dos rizomas da araruta e das razes da mandioca.

Comercialmente, o amido usado na alimentao, fabricao de xaropes, preparo de


colas e gomas, com excipiente farmacutico, na fabricao de etanol, entre outros.

O amido ocorre em grnulos (ou gros) que tm estrias tpicas. Estas, aliadas ao tamanho
e forma dos grnulos, so especficas de cada espcie de planta e esta caracterstica
morfolgica pode servir de meio de identificao microscpica da origem botnica do amido
(Fig. 1).
6

Fig. 1 Microscopia eletrnica de varredura (MEV) esquerda e microscopia ptica direita de um


grnulo de amido. (fonte:
http://www.cheng.cam.ac.uk/research/groups/polymer/RMP/nitin/Granule.jpg).

Estruturalmente, o amido classificado como um homopolissacardeo, sendo que a


hidrlise de suas ligaes glicosdicas fornece unidades de glicose livres. Tal hidrlise pode ser
qumica ou enzimtica e a glicose formada que pode ter diversos destinos, variando desde uma
aplicao biolgica, sendo fundamental fonte de energia para as clulas vivas sendo convertida
em ATP por reaes catablicas oxidativas, at aplicaes biotecnolgicas, servindo como
fonte de carboidratos para reaes fermentativas para produo de etanol em indstrias
qumicas, de alimentos, de bebidas ou de combustveis.

Fundamentao Terica

O amido um polissacardeo sintetizado pelos vegetais e tem a funo de reserva


energtica, semelhante ao glicognio nas clulas animais. Estruturalmente, o amido formado
pela mistura de dois polmeros, a amilose e a amilopectina, que so homopolissacardeos
constitudos por resduos de -D-glicopiranose ligados entre si por ligaes glicosdicas. A
amilopectina constitui aproximadamente 80% do peso seco dos polissacardeos existentes no
gro de amido e menos hidrossolvel que a amilose. formada por resduos de -D-glicose
unidos entre si por ligaes glicosdicas (14) com ramificaes (16), enquanto que a
amilose no possui tais ramificaes, formando um polmero linear (Fig. 2).

CH2OH
O
H
H
H
AMILOPECTINA
OH H

ligao
AMILOSE O
16
H OH
CH2OH CH2OH
CH2 CH2OH
O O
H H H H O O
H H H H H H
H H
OH H OH H
O O OH H OH H
O O

H OH H OH n H OH H OH n
ligao ligao
14 14
7

Fig. 2 Estruturas qumicas da amilose e amilopectina, evidenciando as ligaes glicosdicas.

Os tipos de ligaes presentes na amilose e amilopectina foram esses polmeros a


adquirem uma conformao espacial helicoidal (Fig. 3). Estas estruturas compactas produzem
os grnulos densos de estocagem do amido, j mostrados na Fig. 1.

Fig. 3 Representao da estrutura helicoidal de uma cadeia de amilose, polmero que


compe a estrutura do amido (fonte: LEHNINGER, NELSON & COX, 2006).

O amido tem estrutura qumica muito parecida com o glicognio, porm possui menos
ramificaes. Sua sntese em plantas tambm bastante semelhante sntese do glicognio em
animais, com a substituio da forma ativada da glicose de UDP-glicose por ADP-glicose, com
catlise pela enzima amido sintase. No processo de digesto, a hidrlise do amido catalisada
enzimaticamente pelas -amilases salivar e pancretica, que clivam as ligaes glicosdicas
14 da amilose originando uma mistura de maltose, amilopectina e glicose, e tambm as
ligaes 14 da amilopectina, originando uma mistura de polissacardeos denominados
dextrinas.

Os monossacardeos so definidos como poli-hidroxialdedos ou poli-hidroxicetonas ou


compostos que os liberem por hidrlise. Apresentam a frmula geral [C(H2O)] n e apresentam
uma propriedade qumica muito importante em meio aquoso devido reatividade ca carbonila:
ciclizao em meio aquoso. Este processo de ciclizao leva a formao de um carbono
anomrico, sendo que a hidroxila formada ligada a esse carbono apresenta propriedades
redutoras.

Diversos reagentes so utilizados para a anlise de poder redutor em acares. Alguns


desses mtodos utilizam agentes oxidantes suaves, tais como ons frrico (Fe 3+) e cprico (Cu2+)
em meio alcalino, fazendo deteco qualitativa. Mtodos quantitativos utilizam tcnicas
8

espectrofotomtricas, titulomtricas ou gravimtricas (SILVA et al., 2003). Dissacardeos


ligados pelas suas hidroxilas redutores como o caso da sacarose no apresentam poder redutor,
porm quando hidrolisados passam a exibir esta caracterstica.

Tais propriedades so muito importantes e, por muitas vezes, utilizadas para


identificao de acares, verificao de adulterao e falsificao de alimentos, entre outros.

Objetivo

Permitir a compreenso de processos de extrao do amido da batata e, aps etapa de


purificao e secagem, realizar sua caracterizao bioqumica. Para isso, so propostos os
seguintes objetivos especficos:

- extrair e purificar o amido da batata;

- realizar observao morfolgica por microscopia ptica;

- fazer a reao de identificao com iodo, variando condies de temperatura, utilizando tubos
abertos e tampados;

- fazer a reao qualitativa de identificao de acares redutores no amido utilizando o


reagente de Benedict, em comparao com solues de glicose e sacarose.

MATERIAIS E MTODOS

1. Reagentes

- batatas in natura;
- gua destilada;
- lugol;
- reagente de Benedict;
- soluo de glicose 1,0 % (m/v);
- soluo de sacarose 1,0 % (m/v);
- suspenso de amido 1,0 % (m/v);
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2. Materiais e Vidrarias

- liquidificador;
- bquer 200 mL;
- gaze;
- estufa de secagem;
- papel de filtro;
- bomba de vcuo;
- funil de Bchner;
- balana analtica;
- papel de pesagem (ou vidro de relgio) e esptulas;
- proveta 50 mL;
- estante para tubos de ensaio;
- 5 tubos de ensaio, um deles com tampa;
- bico de Bunsen;
- banho de aquecimento fervente (~ 100C);
- pipetador automtico e ponteiras de 500 e 1000 L;
- conta-gotas ou pipeta de Pasteur;
- pina de madeira

3. Procedimento Experimental

3.1. Extrao do amido da batata (j realizado previamente pelo tcnico de laboratrio).


Homogeneizar 50g de batata descascada em liquidificador com 200 mL de gua destilada.
Filtrar em gaze dobrada, recolhendo a suspenso de amido em um bquer. Deixar o amido
depositar no fundo do bquer (~ 5 min). Desprezar cuidadosamente o sobrenadante. Adicionar
cerca de 100 mL de gua. Agitar, deixar decantar (~5 min), remover o sobrenadante. Repetir
esse procedimento de lavagem por 5 vezes. Juntar ao amido 200 mL de gua destilada, filtrar
em Bchner e deixar secar em estufa.

3.2. Preparo da suspenso de amido. Pesar 0,5 g do amido seco e ressuspender em 50 mL de


gua destilada (suspenso de amido 1,0 % (m/v)).

3.3. Exame microscpico dos grnulos de amido. Adicionar 2 mL desta soluo em 2 tubos
de ensaio numerados 1 e 2. Ferver um deles at que a soluo fique opalescente, agitando
sempre. Pingar uma gota das solues dos tubos 1 e 2 um uma lmina, cobrir com uma lamnula
e observar em microscpio ptico. Pingar uma gota de lugol e observar novamente em
microscpio ptico.
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3.4. Reao de caracterizao com iodo. Tomar 4 tubos de ensaio, sendo um deles com tampa,
e adicionar em dois deles (sendo um com tampa) 1 mL de amido 1 % (m/v) e nos demais 1 mL
de gua destilada e 1 mL de glicose 1 % (m/v). Em seguida, adicionar 1 gota da soluo de
lugol em cada um dos tubos de ensaio e observar o resultado. Aquecer cuidadosamente o tubo
tampado contendo amido (direto na chama) e observar o resultado. Deixar o tubo resfriar e
observar o resultado. Repetir o procedimento para o tubo sem tampa contendo amido e anotar
o resultado. ***CUIDADOS ESPECIAIS: 1. O tubo com tampa deve estar com a mesma pouco
(frouxa) e no muito apertada. 2. O aquecimento direto na chama deve ser feito com auxlio da
pina, com quantos ciclos forem necessrios (CADA CICLO: no mximo 2 segundos na chama
agitao fora da chama).
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3.5. Pesquisa de poder redutor. Tomar 4 tubos de ensaio e seguir procedimento abaixo:

Tubos Amostras (mL) H2O (mL) Benedict (mL)

B - 1,5 1,0

1* 1,0 0,5 1,0

2* 1,0 0,5 1,0

3* 1,0 0,5 1,0


*onde, 1, 2 e 3 so as amostras numeradas fornecidas para o experimento.

Em seguida, ferver os tubos em banho-maria por 5 minutos e observar as possveis


alteraes. Sabendo que entre as amostras 1, 2 e 3 tratam-se de glicose, amido e sacarose,
identifique as amostras em funo da colorao observada e discuta os resultados.

BIBLIOGRAFIA
1LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princpios de Bioqumica, 4. ed. New
York: Worth Publishers, 2006, p.685-686.

2 SUMERLY, R.; ALVAREZ, H.; CEREDA, M.P.; VILPOUX, O.F. Tecnologia, usos e
potencialidades de tuberosas amilceas latino-americanas. Em: Culturas de tuberosas amilceas
latino-americanas. v. 3, p. 377-448, 2002.
3SILVA, R.N.; MONTEIRO, V.N.; ALCANFOR, J.D.X.; ASSIS, E.M.; ASQUIERI, E.R.
Comparao de Mtodos para a Determinao de Acares Redutores e Totais em Mel. Cin.
Tecnol. Aliment., v. 23, n. 3, p. 337-341, 2003.
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Experimento 6 - Enzimas

Abstract

The first aim of this experiment is to demonstrate the enzyme activity present in
pineapple, these activities promote the degradation of collagen, additionally, the experiment
shows that the proteolytic activity can be destroyed boiling the pineapple juice, probably due
the protein denaturation process caused by the heating. The second aim of this experiment is to
demonstrate the protein precipitation by the addition of alcohol (coagulation) or ammonium
sulfate (salting out) in the collagen solution, showing the modification of protein solubility.

Resumo

O primeiro objetivo desse experimento demonstrar a atividade enzimtica presente no


abacaxi, essas atividades promovem a degradao do colgeno, adicionalmente o experimento
mostra que a atividade proteoltica pode ser destruda pela fervura do suco de abacaxi,
provavelmente devido ao processo de desnaturao protica causado pelo aquecimento. O
segundo objetivo do experimento mostrar a precipitao protica pela adio de lcool
(coagulao) ou sulfato de amnio (salting out) na soluo de colgeno, mostrando a alterao
da solubilidade protica.
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Introduo

Enzimas proteolticas ou proteases catalisam o rompimento das ligaes peptdicas em


protenas. So enzimas da classe 3, as hidrolases, e subclasse 3.4, as peptdeo-hidrolases ou
peptidases. Estas enzimas constituem uma grande famlia (EC 3.4), dividida em endopeptidases
ou proteinases (EC 3.4. 21-99) e exopetidases (EC 3.4.11-19), de acordo com a posio da
ligao peptdica a ser clivada na cadeia peptdica. Estas endopeptidases podem ser ainda
subdivididas de acordo com o grupo reativo no stio ativo envolvido com a catlise em serina-
(EC 3.4.21), cistena- (EC 3.4.22), asprtico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e
metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC 3.4.24). As enzimas cujo mecanismo de ao
no est completamente elucidado so classificadas no subgrupo EC. 3.4.99.

Exopeptidases

As exopeptidases atuam somente nos finais das cadeias polipeptdicas na regio N ou C


terminal. Aquelas que atuam na regio amino terminal livre liberam um nico resduo de
aminocido (aminopeptidases), um dipeptdeo (dipeptidil-peptidases) ou um tripeptdeo
(tripeptidil-peptidases). As exopeptidases que atuam na regio carboxi terminal livre liberam
um nico aminocido (carboxipeptidases) ou um dipeptdeo (peptidil-dipeptidases).

Endopeptidases

Endopeptidases atuam preferencialmente nas regies internas da cadeia polipeptdica,


entre as regies N e C terminal.

Tipos catalticos

Segundo Barret, 1994 as proteases so classificadas em carboxipeptidases e as


endopeptidases e so divididas em subclasses, tendo como base o seu mecanismo cataltico. As
carboxipeptidases foram subdivididas em serino-, metalo- e cisteno- carboxipeptidases e as
endopeptidases em serino-, cisteino-, asprtico- e metaloendopeptidases. Serino peptidases
possuem um resduo de serina em seu centro ativo, enquanto as asprtico-peptidases tm duas
unidades de cido asprtico no seu centro cataltico. Cisteno-proteases apresentam um
aminocido cistena e as metalo-proteases usam um on metal no seu mecanismo cataltico.
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Proteases: funo e aplicao

Proteases representam uma classe de enzimas com importantes papis em processos


fisiolgicos. Alm disto, elas possuem aplicao comercial, estando entre os trs maiores
grupos de enzimas industriais, sendo responsveis por 60% da venda internacional de enzimas.
Estas enzimas esto envolvidas em processos biolgicos essenciais, como a coagulao
sangunea, morte celular e diferenciao de tecidos. Vrias etapas proteolticas importantes
ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no ciclo de infeco de um grande
nmero de vrus e microrganismos patognicos. Estes fatos tornam as proteases um alvo
quimioterpico valioso para o desenvolvimento de novos compostos farmacuticos. As enzimas
proteolticas tambm participam no catabolismo de protenas, tanto nas vias degradativas como
nas biossintticas, e na liberao de hormnios peptdeos farmaceuticamente ativos a partir de
protenas precursoras. Certas modificaes especficas e seletivas de protenas durante a
ativao de enzimas ocorrem via protelise, que tambm colabora no transporte de protenas
secretrias na membrana. As proteases tm tambm uma variedade de aplicaes
principalmente na indstria de detergentes e de alimentos. Tendo em vista os recentes acordos
mundiais para uso de tecnologias no poluentes, as proteases comearam a ser usadas em larga
escala no tratamento do couro, em substituio aos compostos txicos e poluentes at ento
usados. Na indstria farmacutica, as proteases so usadas em pomadas cicatrizantes e tm um
uso potencial para outros medicamentos. Proteases hidrolisam as protenas em peptdeos e
aminocidos, facilitando a sua absoro pelas clulas; devido a seu papel despolimerizante, as
enzimas extracelulares tm um papel importante na nutrio.

Objetivo

Demonstrar a atividade proteoltica presente no suco de abacaxi, o efeito da


desnaturao protica por temperatura e o efeito da alterao de solubilidade protica, e
conseqente precipitao, provocados pela adio de lcool ou sal de amnio em soluo de
gelatina (colgeno).

Materiais

8 tubos de ensaio de 20 mL
1 tubo de ensaio de 30 mL
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Estante para tubos de ensaio


Bquer de vidro de 100 mL (para aquecer gua)
Bquer de 25 ou 50 mL (para gua destilada)
Funil de vidro pequeno e papel de filtro, tesoura para cortar o papel de filtro
Recipiente com gelo
Almofariz e pistilo
Pipetadores automticos de 1,0 mL e ponteiras, ou pipetas de vidro de 5,0 mL
Faca ou estilete
Luvas de ltex
Basto de vidro (para dissolver a gelatina)
Placa aquecida ou banho-maria 100C
Banho-maria 60C
Banho-maria 30C
Balana

Reagentes
Soluo de sulfato de amnio 3 mol/L
Etanol absoluto ou comercial 99,3 INPM
Abacaxi maduro (1 fatia mdia)
Gelatina incolor e sem sabor
gua destilada

Procedimento

Parte 1: Atividade enzimtica do suco de abacaxi e desnaturao protica por


aquecimento.

Extrao do suco de abacaxi


Uma fatia de abacaxi deve ser cortada em pequenos pedaos. A extrao do suco ser
feita macerando-se os pedaos utilizando almofariz e pistilo. O suco deve em seguida ser
filtrado utilizando funil de vidro e papel de filtro em um tubo de ensaio de 20 mL. O tubo dever
ser armazenado no gelo.

Preparo da gelatina
Pesar 2 g de gelatina incolor e sem sabor de qualquer marca comercialmente disponvel
e dissolver em 20 mL de gua destilada, em tudo de ensaio de 30 mL, aps solubilizao a
soluo de gelatina deve ser aquecida a 60C e mantida nessa temperatura at o uso.
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Ensaio
Primeiramente, deve-se preparar as amostras de abacaxi. Para isso, utilizando tubos de
ensaio de 20 mL, deve-se pipetar 2,0 mL de gua no tubo 1 e 2,0 mL do extrato de abacaxi nos
tubos 2, 3 e 4. O tubo 2 deve ser mantido temperatura ambiente, o tubo 3 aquecido 60C e
o tubo 4 fervido por 5 minutos. Aps este tempo de tratamento de cada uma das amostras,
resfriar no gelo imediatamente por 1 minuto. Aps o resfriamento das amostras fervidas
adicionar em todos os tubos a soluo de gelatina. Homogneizar. Incubar as amostras por 10
minutos a 37oC e em seguida resfriar todas as amostras no gelo por 7 minutos, observar e anotar
o resultado.

Tabela 1. Resumo do procedimento experimental.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4


gua 2,0 mL - - -
Amostra Abacaxi - 2,0 mL - -
Amostra Abacaxi 60C - - 2,0 mL -
Amostra Abacaxi Fervida - - - 2,0 mL
Gelatina 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL

Parte 2: Precipitao de protenas.


Pipetar nos tubos de ensaio de 20 mL os reagentes conforme a tabela 2, realizar o
experimento em temperatura ambiente (~ 25C). Observar e anotar o resultado para posterior
discusso.

Tabela 2. Resumo do procedimento experimental.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

gua 2,0 mL - -

Sulfato de amnio - 2,0 mL -

Etanol Absoluto - - 2,0 mL

Gelatina 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL


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Anlise dos dados:

1. Prepara uma tabela indicando os resultados observados de cada experimento.


2. Tirar uma fotografia dos resultados para anexar ao relatrio como figura.
3. Discutir o efeito do suco de abacaxi sobre o colgeno (gelatina).
4. Discutir o efeito da temperatura sobre as enzimas (proteases) presentes no suco do abacaxi.
5. Discutir o efeito do etanol e do sulfato de amnio sobre as protenas em soluo. Qual o
princpio de cada efeito.

Para discusso:

1. Pesquisar: qual(is) protease(s) est(o) presente(s) no suco de abacaxi.


2. Como poderia ser realizada a purificao dessa(s) protena(s)?
3. A atividade das proteases pode ser otimizada? Como?
4. Discuta o efeito da temperatura sobre a desnaturao de protenas no processo de cozimento
dos alimentos, qual a importncia disso?
5. Por que se pode utilizar abacaxi para amaciar carnes? Qual a relao entre o suco do abacaxi
e os amaciantes de carnes comerciais.

Referncias Bibliogrficas
URL: http://www.protease.ufrj.br/ProteaseApres.htm
Rawling, N.D., Barret, A. 1994. Families of serine peptidases. Meth. Enzymol. 244:18-61.
Rawling, N.D., Barret, A. 1994. Families of cysteine peptidases. Meth. Enzymol. 244:461-486.
Rawling, N.D., Barret, A. 1994. Families of aspartic peptidases, and those of unknown
mechanism. Meth. Enzymol. 248:105-120.
Rawling, N.D., Barret, A. 1994. Families of metallopeptidases. Meth. Enzymol. 248:183-228.
Francisco Jr, W.E. et Francisco W. Protenas: hidrlise, precipitao e um tema para o ensino
de qumica. Qumica Nova na Escola, 24, 2006.