Biologia Molecular

Prof. Edilson D. Arajo:

O download dessa apostila disponibilizado pelos autores no site:

http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Produzido por: UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE
RIBEIRO PRETO

Alexandra A. C. Nascimento
Enilza Maria Espreafico
Maria Luisa Pa Larson
Ndia Monesi
Nilce Maria Martinez Rossi
Vanderlei Rodrigues

Reviso: Eliana Valria Patussi

Mrcia A. S. Graminha
I. CONCEITOS BSICOS

1. INTRODUO

At a dcada de 70, o DNA era o componente celular mais difcil de ser

analisado. Sua sequncia de nucleotdeos de enorme tamanho e monotonia qumica era
geralmente analisada por meios indiretos como a sequncia de protenas e anlise
gentica. A partir da dcada de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o
isolamento e a purificao de genes especficos num processo chamado de clonagem
gnica. Na verdade, muitas destas tcnicas so provenientes da Microbiologia,
Bioqumica, Imunologia e Gentica Microbiana e permitiram que a anlise do DNA
ganhasse um novo enfoque. O DNA tornou-se ento, a molcula mais fcil de ser
analisada, sendo possvel isolar regies especficas, obt-las em grande quantidade e
determinar a sua seqncia numa velocidade de milhares de nucleotdeos por dia.
A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este
conjunto de tcnicas, tem uma ampla aplicao. Ela pode ser usada para estudar
mecanismos de replicao e expresso gnica, na determinao da seqncia de um
gene e conseqentemente da protena que ele codifica, ou no desenvolvimento de
culturas microbianas capazes de produzir substncias teis tais como a insulina humana,
hormnio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua
aplicao comercial ou biotecnolgica parece ter um potencial inesgotvel.
Como conseqncia do desenvolvimento desta tecnologia atualmente possvel
realizar investigao de paternidade e o diagnstico de doenas genticas e infecciosas
atravs da anlise de DNA.

2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR

A origem do termo clonagem vem da Gentica Bacteriana que considera uma

colnia de bactrias como um clone porque todos os indivduos so geneticamente
idnticos bactria inicial.
A tcnica central da metodologia do DNA recombinante a clonagem molecular,
a qual consiste no isolamento e propagao de molculas de DNA idnticas. A
clonagem molecular compreende pelo menos dois estgios importantes: primeiro o
1
fragmento do DNA de interesse chamado de inserto ligado a uma outra molcula de
DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a
molcula do DNA recombinante introduzida numa clula hospedeira compatvel, num
processo chamado de transformao. A clula hospedeira que adquiriu a molcula do
DNA recombinante agora chamada de transformante ou clula transformada.
Um nico transformante, em condies ideais, sofre muitos ciclos de diviso
celular, produzindo uma colnia que contm milhares de cpias do DNA recombinante.

3. ENZIMAS DE RESTRIO

Em 1953 foi descrito um estranho fenmeno no qual a eficincia da replicao

de um bacterifago (vrus de bactrias) dependia da clula hospedeira na qual ele estava
inserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem
em determinadas linhagens bacterianas era devido a presena de nucleases altamente
especficas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de
defesa bacteriano que degrada DNA que lhe estranho (restrio). A bactria protege
seu prprio DNA desta degradao camuflando-o atravs da metilao de algumas
bases especficas (modificao). Como conseqncia, este sistema frequentemente
descrito como fenmeno da restrio/modificao e existe em um grande nmero de
bactrias.
As enzimas de restrio ou endonucleases de restrio so divididas em vrias
classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos stios de reconhecimento e
clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes na Tecnologia do DNA
Recombinante, so proteinas monomricas ou dimricas e clivam o DNA no mesmo
stio do seu reconhecimento. O stio de reconhecimento deste tipo de enzima
normalmente uma seqncia palindrmica, isto , ela tem um eixo de simetria e a
seqncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na direo
oposta (Figura 1).

2
a) C livage m no eixo de sim etria b) C livage m sim tricam e nte situada ao
redor do eixo de sim etria

...TC GA... ...GAA TTC...

...AG CT... ...CTT AAG...

3 5

+
5 3
3 5

+
5 3

M olculas com extrem ida des a bruptas M olculas com extrem ida des coe sivas

Figura 1. Dois tipos de clivagem feitas por enzimas de restrio. As setas indicam os stios de
clivagem. As linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequncia.

Estas enzimas reconhecem seqncias especficas de 4 a 8 pares de base (pb) na

molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. H 2 tipos distintos de
clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqncia especfica,
gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes so feitos simetricamente, porm, fora
do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas
conseqncias esto mostrados na Figura 1.
Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrio j foram identificadas. A
nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviao do nome do microrganismo do
qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gnero e as outras duas a
espcie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da
descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio
denominada de EcoRI purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de
transferncia de resistncia RI, enquanto que a Hind III isolada da Haemophilus
influenzae, linhagem d III.

A Tabela 1 mostra a seqncia palindrmica e o local de clivagem de algumas

enzimas de restrio. Note que algumas enzimas deixam terminaes coesivas enquanto
que outras fazem cortes abruptos ou no coesivos.

3
 M icrorganism o Enzim a Sequncia A lvo
G A A T T C
E sch erich ia co li E coR I C T T A A G

G G A T C C
B a cillu s a m ylo liq u efa cien s H B amH I C C T A G G

A G A T C T
B a cillu s g lo b ig ii B g lII T C T A G A

Pu G C G C Pi
H a em o p h ilu s a e g yp tiu s H a eII P iy C G C G Pu

A A G C T T
H a em o p h ilu s a e g yp tiu s H in dIII T T C G A A

C T G C A G
P ro vid e n cia stu a rtii P stI G A C G T C

G T C G A C
S trep to co ccu s a lb u s G S a lI C A G C T G

T C G A
T h erm u s a q u a tic u s Ta q I A G C T

T G G C C A
B rev ib a cteriu m a lb id iu m B a lI A C C G G T

A G G C C T
H a em o p h ilu s a e g yp tiu s H a eIII T C C G G A

C C C G G G
S erra tia m a rce sce n s Sm aI G G G C C C

Tabela 1. Algumas endonuclease de restrio: origem e stios de clivagem. A seta indica

o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.

O interesse por estas enzimas de restrio aumentou em 1973 quando se

percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades
de fitas simples de DNA que permitiam a ligao dos fragmentos. Isto significava que a
recombinao poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Alm disto, DNA bacteriano
poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espcie, abrindo a
possibilidade de clonar genes humanos ou isolar protenas de culturas bacterianas.
Uma importante conseqncia da especificidade destas enzimas de restrio
que o nmero de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo
definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de
4
restrio gera uma famlia nica de fragmentos quando cliva uma molcula de DNA
especfica. Enzimas que reconhecem stios de restrio compostos por 4 pares de bases
clivam o DNA em mdia a cada 256 nucleotdeos (44=256). Aquelas que reconhecem
stios com 6 e 8 pb clivam o DNA em mdia a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente.
No entanto, esta mdia pode sofrer variaes significativas, dependendo principalmente
da composio de bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um
stio de restrio contendo 8pb, incluindo nucleotdeos CpG, que raramente ocorre no
DNA de mamferos.
A famlia de fragmentos gerados por digesto com enzima de restrio
geralmente detectada pela separao destes fragmentos por eletroforese em gel de
agarose. Os fragmentos migram em funo de seus pesos moleculares sendo que os
menores migram mais rapidamente (Figura 2).

Sentido da migrao

P ares d e
base

Figura 2. Molculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese.
Molculas menores movem-se mais rapidamente que molculas maiores, tornando-se portanto
separadas em bandas. O DNA corado com brometo de etdeo uma molcula que fluoresce
quando iluminada com luz Ultra Violeta.

4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE

Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia nica de

bases. DNAs de origem diferente sob a ao da mesma enzima de restrio produzem
5
fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos
de dois diferentes organismos (por exemplo, bactria e homem) podem ser ligados por
renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a ligao for "selada" com a
enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos sero ligados
permanentemente.
A tcnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de
DNA clivado for um plasmdeo.

TGC A
ACG T
P lasm d eo DN A hum ano
de TGCA TGCA
E .coli
ACGT ACGT

E nzim a E nzim a

GCA T
T ACG
DN A liga se

TG
CA T AC
TG

CA T

G
G
AC

P lasm d eo hb rido

Figura 3. Construo de uma molcula de DNA hbrida a partir de fragmentos de

diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrio.

A figura 3 mostra uma molcula de DNA de plasmdeo que tem somente um stio
de clivagem para uma determinada enzima de restrio. A mesma enzima usada para
clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano so misturados com o DNA
plasmidial linearizado, permitindo a ligao entre eles, uma molcula de DNA
plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmdeo hbrido pode ser
inserido numa bactria por transformao e ento o inserto ser replicado como parte do
plasmdeo. Geralmente antibiticos so acrescentados ao meio da cultura para selecionar
somente as linhagens que portam os plasmdeos (o plasmdeo usado para esta finalidade porta
resistncia a pelo menos um antibitico).

6
5. DNA LIGASE

Conforme mencionado anteriormente esta enzima promove a ligao dos fragmentos de

DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrio. A DNA ligase requer
um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato
na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA
ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli
e de outras bactrias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacterifago T4 requer
ATP como cofator.

O
-

DNA 3 OH + O P O 5 DNA
-

O
DNA-Ligase
ATP ou N AD

DNA 3 O P O 5 DNA
-

Figura 4. DNA ligase cataliza a juno de duas fitas de DNA que so partes da molcula da
dupla-hlice.

Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA ligase

a) Fragmentos com extremidades coesivas

As extremidades coesivas produzidas por vrias enzimas de restrio permitem

dois fragmentos de DNA ligarem-se facilmente, atravs da formao de pontes de
hidrognio pela complementariedade das bases. Finalmente a ligao covalente dos
fragmentos realizada pela DNA ligase (ver figura 4).

b) Fragmentos com extremidade no coesivas

DNAs portando extremidades no coesivas so ligados com muito menos

eficincia que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma concentrao muito maior

7
de DNA ligase e mesmo dos DNAs envolvidos necessria para que as molculas com
extremidades no coesivas sofram reao de ligao.
No entanto, a ligao deste tipo de fragmento facilitada pela transformao
prvia das extremidades no coesivas em coesivas. Este procedimento pode ser feito
atravs de dois processos:
a) Adio de polidesoxi (A) na extremidade 3' de um fragmento de DNA e
polidesoxi (T) na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, atravs da enzima
desoxinucleotidil transferase terminal ou simplesmente transferase. Esta enzima, uma
DNA polimerase incomum, adiciona nucleotdeos extremidade 3-OH de fragmentos
fita simples proeminente de uma cadeia de DNA. Para gerar este tipo de extremidade
proeminente a molcula tratada previamente com uma exonuclease 5-especfica para
remover alguns nucleotdeos terminais. Aps a mistura dos dois tipos de fragmentos
complementares e anelamento dos mesmos, as molculas so unidas preenchendo-se os
espaos existentes com o auxlio da DNA pol I e selando-os com DNA ligase (Figura 5)
b) Adio de adaptadores s extremidades no coesivas
Os adaptadores so oligonucleotdeos sintticos e complementares que contm
stios de clivagem para uma ou mais enzimas de restrio. Eles so unidos ao DNA
com o auxlio da DNA ligase (Figura 6).
c) O terceiro mtodo utiliza T4 ligase em concentraes que pode ligar
molculas de DNA sem proeminncias.

8
 5 3 5 3
3 5 3 5

5 - E xonuclea se espe cfica

3 3

3 3

D eoxinucleotdio tran sferase te rm in al

+dATP +dTTP

AAAA TTTT

AAAA TTTT

E spaos p re enchido s com D N A P ol I. D N A ligase

para com pletar a ligao

Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformadas em coesivas pela
adio de poli (A) e poli (T).

DNA a ser inserido

GAATTC
CTTAAG
Vetor +
GAATTC Adaptador
CTTAAG Sinttico

T4 DNA ligase

EcoRI GAATTC GAATTC

CTTAAG CTTAAG

EcoRI

G AATTC AATTC G
CTTAA G G CTTAA

Figura 6. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformados em coesivas pela adio de
adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrio que reconhece o adaptador.

9
6. TRANSFORMAO BACTERIANA
6.1.Conceito de transformao induzida

O processo de transformao constitui um evento de alta importncia na tcnica

de manipulao gnica. A transformao natural descrita por Griffith, em 1928, e por
Avery e colaboradores, em 1944, um evento raro. No entanto em 1970, Mandel e
Higa encontraram que a E.coli tornou-se marcadamente competente para transformao
com DNA exgeno, quando a bactria foi suspensa em cloreto de clcio gelado e
submetida a um curto choque trmico 42oC.
Estes mesmos autores tambm verificaram que as bactrias crescidas at a fase
log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estgios do crescimento.
O procedimento do cloreto de clcio que usado at hoje produz uma eficincia
de transformao de 105 a 107 transformantes por micrograma de DNA (a eficincia de
transformao geralmente expressa como o nmero de clulas transformadas, obtido a
partir de um micrograma de DNA plasmidial intacto).
O tamanho e a conformao da molcula do DNA, afeta o processo de
transformao. Plasmdeos pequenos so mais facilmente incorporados pela clula
bacteriana competente, DNA linear pobremente incorporado, talvez pelo fato de
sofrer degradao pelas enxonucleases presentes no espao periplasmtico.

6.2. Mecanismos de captao do DNA

O mecanismo de captao da molcula do DNA pela bactria competente ainda

desconhecido. Uma hiptese que as molculas do DNA passam atravs de canais
situados nas chamadas zonas de adeso, que so locais onde a membrana interna e
externa da clula bacteriana se unem formando poros. Estes poros s esto presentes
durante o crescimento bacteriano (fase de crescimento exponencial).
Em condies naturais, a captao do DNA torna-se difcil, devido a repulso
eletrosttica existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipdeos da
membrana bacteriana com a carga negativa do grupo fosfato da molcula do DNA.
O papel do clcio explicado pela hiptese de que a 0oC a fluidez da membrana
+2
celular cristalizada, estabilizando a distribuio dos fosfatos carregados. Os ons Ca
formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas, facilitando
10
agora a atrao eletrosttica com as molculas do DNA na zona de adeso. O choque
trmico, complementa este processo de captao, provavelmente criando um desbalano
trmico entre o interior e o exterior da clula bacteriana, auxiliando o bombeamento do
DNA atravs da zona de adeso. A figura 7 ilustra este processo.

D N A ge n m ico C lula
B acte rian a

- - - Zo na d e a de so
- - - -
- - Bicam ada lipdica
- (interna)

- C a m a da p e p tido

- -
g lu ca n

- B icam ad a lip dica

- - --
(e xte rn a)
- - - - - Fo sfo lip de os
- - on d e c lcio

- - -
-
- -
- - - -
- -
- -
P lasm d eo - -
- -
-
- -
--
- -
-
- - -
-

Figura 7. Mecanismo molecular proposto para explicar a transformao de E. coli com uma
molcula de DNA exgeno.

II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

Aps o isolamento de uma informao gentica, por exemplo um fragmento de
DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrio, este fragmento dever ser inserido
numa outra molcula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informao
gentica em centenas de cpias. Este processo de amplificao obtido atravs do uso
de molculas de DNA que so os chamados vetores de clonagem molecular.

11
 Atualmente, os tipos bsicos de vetores usados na metodologia do DNA
recombinante apresentam caractersticas especiais que os tornam excelentes veculos de
clonagem em diferentes situaes.
A seguir, vamos apresentar os principais tipos de vetores atualmente em uso na
biologia molecular.

1. PLASMDEO
So pequenas molculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessrios
para a sua replicao e pelo menos um gene que confere resistncia a antibitico. Estes
elementos genticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente
esto presentes em duas ou mais cpias por clula. Os plasmdeos presentes num grande
nmero de cpias so usados como veculos de clonagem desde que capacitem a
amplificao do segmento do DNA neles clonado.
Um plasmdeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes
propriedades:
a) possuir uma origem de replicao (O), ou seja, uma seqncia de DNA que permita
que o vetor seja replicado na clula hospedeira,
b) apresentar dois ou mais stios nicos de clivagem para endonucleases de restrio. O
conjunto destes stios denominado de Mltiplo Stios de Clonagem (MSC) o local
onde o inserto incorporado ao vetor de clonagem,
c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a clula transformada da
clula no transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene
que confere resistncia ampicilina (AmpR). As clulas transformadas com tais vetores
so capazes de crescer num meio contendo o antibitico, enquanto que as clulas no
tranformadas acabam morrendo.
A figura a seguir ilustra as principais caractersticas estruturais de um
plasmdeo.

12
 O

Am pR M SC

Figura 8. Estrutura molecular de um plasmdeo tipico usado em clonagem molecular

Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular o uso de

enzima de restrio que produz extremidades compatveis durante a clivagem do DNA a
ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor).
Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molcula hbrida dever ser
introduzida numa clula hospedeira geralmente bactrias, por um processo chamado de
transformao, para que o vetor possa sofrer replicaes e consequentemente amplificar
o nmero de cpias do inserto. A bactria transformada ser facilmente reconhecida
pela aquisio de um novo fentipo dado pelo plasmdeo, ou seja, capacidade de crescer
em meios contendo antibitico.

2. FAGOS
Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular o
denominado bacterifago , o qual comporta-se como um vrus da E.coli. Antes de
analisarmos o uso deste elemento como veculo de clonagem molecular, vamos mostrar
resumidamente as suas propriedades biolgicas e estruturais.

2.1 Biologia do fago

O fago um parasita obrigatrio da E.coli, o qual necessariamente deve
injetar o seu DNA na bactria hospedeira para a sua multiplicao. Aps a infeco da
E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias:

13
a) No primeiro caso denominado estado ltico, o DNA do fago permanece na bactria
como uma molcula independente, havendo a ativao de alguns genes do fago e a
concomitante inativao de outros, dentro de um programa estritamente definido.
Como resultado o cromossomo do fago replicado ativamente, ocorre a sntese
das protenas da capa e da cauda, formam-se novas partculas virais. Em
aproximadamente 45 minutos aps a infeco a clula hospedeira lisada havendo a
liberao de cerca de 100 novos fagos.
b) A outra via que o cromossomo do fago pode seguir o denominado estado
lisognico. Neste caso, o DNA do fago integrado no cromossomo da bactria
passando a ser chamado profago. No estado lisognico, todos os genes do profago esto
inativos com excesso do gene que produz a protena repressora. A bactria hospedeira
carregando o profago multiplica-se e este replicado passivamente e distribudo para as
bactrias descendentes.
Em condies naturais a opo entre seguir o estado ltico ou lisognico depende
das condies do meio. Assim, via de regra em meio rico em nutrientes o estado ltico
preferencial, por exemplo o fago na bactria E.coli intestinal. Por outro lado, em meio
pobre de nutrientes como o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisognico.
Em condies experimentais, o estado a ser seguido depende de um balano entre os
fatores do meio intra e extra celular e de fatores genticos da bactria hospedeira e do
bacterifago.

2.2 Genoma do fago

O bacterifago uma partcula viral constituda de aproximadamente 50% de
protenas e 50% de DNA. O DNA do fago , na forma como ele isolado da partcula
viral, uma molcula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases.
As extremidades da molcula contm uma frao de DNA fita simples com cerca de 12
nucleotdeos, os quais so complementares na sequncia de bases e atravs delas que
o DNA assume a forma circular quando ele injetado na clula hospedeira. Estas
extremidades so denominadas de stio cos. O genoma do fago codifica para
aproximadamente 50 protenas, cujos genes tem um cronograma de expresso bem
definido, o que determina a instalao do estado ltico ou lisognico.

14
 As figuras 9 e 10 ilustram o ciclo biolgico do fago em uma clula
hospedeira e o genoma do fago com alguns dos seus principais genes,
respectivamente.

5 1
2

4 3

Figura 9. Replicao do fago no interior da clula hospedeira. Aps adsoro (1) e injeo
(2) do genoma do fago na bactria, a via ltica indicada pelos nmeros 3, 4 e 5 leva a
formao de novas partculas virais. Alternativamente, a via lisognica (6) pode ser ativada
levando integrao do material gentico viral ao genoma da bactria hospedeira.

Em pacotame nto R ecombinao R egulao R eplicao Lise

cos A J int .cIII cI cII O P S R

N C ro
pL pr

Figura 10. Genoma do fago

2.3 Controle de expresso dos genes do fago

Seja qual for a via a ser seguida pelo fago , ou seja via ltica ou lisognica, a
expresso dos genes envolvidos nestes circuitos comea pelos produtos dos genes N e

15
Cro, regulados pelos promotores pL e pR respectivamente situados esquerda (pL) e
direita (pR) do gene cI.
Durante o transcurso da via ltica, o produto do gene cro est diretamente
relacionado com a replicao do genoma do fago , atravs da induo da expresso
dos genes OP. Por outro lado, o produto do gene N est diretamente relacionado com a
expresso dos genes da regio de empacotamento ou seja genes A e J, responsveis pela
sntese das protenas da cabea e da cauda do fago como tambm da expresso dos
genes S e R, diretamente envolvidos com a lise da clula hospedeira.
Durante a via lisognica, a transcrio tambm se inicia pelos promotores pL e
pR coordenando a expresso dos genes cII e cIII. O produto destes dois genes
coordena a expresso do gene cI que produz uma protena repressora inibindo a
expresso dos genes responsveis pelo empacotamento e a lise. Por outro lado, um
outro gene importante o int cujo produto relaciona-se com a integrao do fago no
genoma bacteriano estabelecendo o estado lisognico.

2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecular.

Durante o ciclo ltico, os genes envolvidos no processo de lisognia so
dispensveis e consequentemente a chamada regio de integrao do genoma do fago
pode ser totalmente substituda por um outro fragmento de DNA, sem que haja qualquer
alterao nos processos envolvidos na via ltica.
Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de clonagem que o
DNA inserido no fago empacotado in vitro. Embora a eficincia de empacotamento
seja cerca de 10%, uma vez que os fagos so empacotados teremos 100% de eficincia
na infeco da E.coli hospedeira.
Este processo altamente eficiente quando comparado com o da transformao
bacteriana com plasmdeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao redor de
108 transformantes por g de DNA o que significa que menos de 1 em 1000 plasmdeos
so transformados na E.coli hospedeira.

16
 Atualmente, existem vrios derivados do fago onde um ou mais stios de
restrio flanqueiam a regio de recombinao, facilitando a sua substituio por um
outro DNA. Estes so os chamados vetores de substituio. Um exemplo tpico destes
vetores o EMBL3, neste a regio de recombinao flanqueada pelas enzimas de
restrio EcoRI, BamHI e SalI, as quais quando clivadas podem receber fragmentos de
DNA variando de 10,4 a 20kb, como mostra a figura abaixo.

b
D N A bacterifa go a
b
b c

E coR I
ligase c
b
a

inform a es em pa cotam e nto

desne cess rias in vitro
E coR I
replicao

bacterifago
contendo
genes do
cam undo ngo

D N A cam undong o

Figura 11. Representao esquemtica da clonagem de um fragmento de DNA genmico no

fago . As regies indicadas por a contm todas as informaes necessrias para replicao em
E. coli e empacotamento in vitro. Os diferentes fragmentos obtidos da digesto do DNA de
interesse com enzima apropriada esto indicados pelas letras b e c, onde somente c possui
tamanho adequado para o empacotamento.

17
 Outros derivados do fago so os chamados vetores de insero, neste tipo de
vetor, os fragmentos de DNA que podem ser inseridos devem ter no mximo at 7kb de
tamanho para no alterar os processos de empacotamento do genoma do fago.
Os vetores de insero derivados do fago mais bem utilizados especialmente
na clonagem de cDNA, so os vetores gt10 e o gt11. Vamos a seguir fazer algumas
consideraes sobre estes dois tipos de vetores.
No fago gt10, o inserto geralmente cDNA inserido no stio da EcoRI situado
no gene repressor cI. O fago recombinante ter agora o gene cI obstrudo e
consequentemente produzir durante a cultura, placas de lise com o centro claro
morfologicamente fcil de ser distinguida da placa no recombinante que possue o gene
cI ntegro e por conseguinte uma placa de lise turva.
Por outro lado, o fago gt11 contm um stio de restrio EcoRI localizado no
gene LacZ, 53 pares de bases anterior ao cdigo de trmino de expresso da enzima
galactosidase. Quando o cDNA inserido no stio da EcoRI contm sequncias
codificadoras em fase de leitura com as sequncias codificadoras do LacZ, o cDNA
inserido expresso como uma protena fundida com a -galactosidase. Esta expresso
obtida na presena do IPTG (isopropil--D-galactosdeo) que o indutor do promotor
Lac que juntamente com o substrato cromognico X-gal iro produzir placas incolores
no caso do inserto estar presente e obstruir a expresso da enzima -galactosidase, ou
placas azuis quando no h inserto e a enzima expressa completamente ativa.

3. COSMDEO
A clonagem de fragmentos de DNA no fago apresenta uma limitao na qual
o fragmento a ser clonado no ultrapasse cerca de 15kb (Figura 12). Na maioria das
vezes, esta dimenso suficiente para conter um gene completo, incluindo as
sequncias flanqueadoras. Entretanto, muitos genes apresentam dimenses da ordem de
35 a 40 kb e nestes casos, a tcnica usada para a clonagem deste tipo de fragmento a
chamada clonagem em cosmdeos.
Os cosmdeos, so plasmdeos que contm um fragmento de DNA do fago
que inclue o stio cos. Estes cosmdeos podem ser usados como veculos de clonagem

18
molecular empregando o sistema de empacotamento in vitro. Este sistema, reconstitue a
estrutura do fago (cabea e cauda) e assim usado para infectar a clula hospedeira.
As enzimas do sistema de empacotamento do fago reconhecem dois stios cos
situados 35 a 49Kb de distncia e neste caso, somente fragmentos desta ordem de
tamanho sero convenientemente empacotados.
O DNA genmico clivado com uma enzima de restrio que produz grandes
fragmentos de DNA, os quais sero ligados ao cosmdeo, tambm clivado com uma
enzima semelhante.
A situao ideal que cada fragmento do DNA genmico apresente um stio
cos nas suas extremidades. Durante o empacotamento, as enzimas do sistema
reconhecem os stios cos situados a uma distncia dentro de 49Kb, clivam estes stios e
empacotam estas molculas.
O DNA do cosmdeo injetado no interior da clula hospedeira, circulariza
igual ao DNA do fago e replica como um plasmdeo normal, sem expresso de qualquer
funo do fago. As clulas infectadas sero selecionadas com base na resistncia
adquirida a um determinado antibitico. A figura ilustra um tpico processo de
clonagem em cosmdeo.

19
 R S tio alvo de restrio
Am p

frag m e n to s d e re s tri o
de 35 a 40 kb

cos

sele o d e
clo n e s re siste ntes
a am p icilina
D N A circu la riza
a ps infe c o

Figura 12. Esquema de clonagem em cosmdio

4. VRUS
A biologia molecular dos vrus de DNA e RNA foi extensivamente estudada
antes do advento da metodologia do DNA recombinante. O virus SV40 isolado de
clulas tumorais de macacos, foi um dos primeiros sistemas virais utilizados para
introduzir genes em clulas de mamferos. O DNA do SV40 apresenta 5.200 pares de
bases e pode ser dividido em duas regies quanto a expresso gnica viral. Estas regies
so chamadas de regio precoce e regio tardia.

20
 A regio precoce expressa atravs do cclo ltico, enquanto que a expresso dos
genes da regio tardia, ocorre somente aps o incio da replicao do DNA viral. Entre
estas duas regies, situa-se a origem de replicao do DNA do vrus.
Um produto de expresso da regio precoce o antgeno T o qual responsvel
pela transformao maligna de clulas no permissveis (clulas nas quais o vrus no
completa a sua replicao), como tambm pelo incio da replicao viral em clulas
permissveis. Os produtos de expresso codificados pela regio tardia correspondem s
protenas que forma o capsdeo da partcula viral. A figura 13 ilustra o genoma do virus
SV40.

E xp re ss o E xp re ss o
p re co ce ta rd ia

SV40

G e n om a d o S V 4 0

Figura 13. O DNA do virus SV40

4.1. Clonagem no vrus SV40

A produo de DNA recombinante no vrus SV40, pode ser realizada atravs da
substituio do segmento de expresso precoce ou do segmento de expresso tardia.
No primeiro caso, o vrus recombinante no produz o antgeno T, ao passo que
na segunda opo, no haver produo das protenas do capsdeo. Entretanto, estas
funes deletadas podem ser suprimidas como veremos a seguir.

4.2.Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia

Quando a regio tardia do SV40 substituda com outro DNA, a perda das
funes tardias, neste caso as protenas do capsdeo suprimida pelo uso simultneo de
um outro vrus SV40 que tem uma deleo nos genes da regio precoce. As clulas
21
permissveis so simultaneamente transfectadas com o SV40 recombinante e o SV40
deletado. O primeiro produz as protenas da regio precoce e o segundo as protenas da
regio tardia. Como resultado, teremos a produo de uma populao de partculas
virais mistas, ou seja, vrus deletado e vrus recombinante. A figura 14 ilustra este
procedimento.

R egio
funcional R egio funciona l
precoce S V 40
ta rdia

ge ne da
glo bina

S V 40 S V 40-g lobina

cotransfeco

em pacotam ento e lise

pa rtcula s Virais

Figura 14. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia

22
4.3. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce
Quando a clonagem no SV40 feita na regio precoce, a produo de partculas
virais depende do suprimento das protenas codificadas pela regio precoce (antgeno
T). Para evitar uma infeco mista com um vrus SV40 deletado, usa-se uma linhagem
celular, as clulas COS as quais apresentam uma poro do genoma do SV40 integrado
ao seu prprio cromossomo. Esta linhagem celular, produz a protena viral denominada
antgeno T, a qual se liga na origem de replicao do vrus e induz a sua replicao. A
figura 15 ilustra este tipo de clonagem.
Apesar deste sistema viral ter sido usado como vetor de expresso em muitas
estratgias de clonagem, existem algumas desvantagens de seu uso. Uma delas que o
gene a ser clonado no pode ser grande, a outra que a clula hospedeira s pode ser
clulas de macacos e finalmente, os genomas so muitas vezes rearranjados ou
deletados.
Atualmente, dois outros sistemas virais mais versteis esto em uso, so eles o
virus da vacina e o Baculovirus, os quais podem aceitar genes bem maiores do que
aqueles aceitos pelo SV40. Um inconveniente para estes dois sistemas virais que
ambos apresentam um grande genoma e o gene a ser clonado s pode ser inserido por
processos de recombinao dentro das clulas, o qual bastante lento em relao aos
processos tradicionais em uso na metodologia do DNA recombinante.
Finalmente, um sistema viral bastante promissor so os retrovirus que so
vrus cujo material gentico o RNA e apresentam um ciclo bastante diferente dos
mencionados anteriormente que so ciclos lticos. Os retrovirus infectam uma grande
variedade de clulas de mamferos e o seu RNA transcrito para DNA o qual
incorporado ao genoma da clula hospedeira. Neste estado ele produz continuamente
novas partculas virais, juntamente com o produto do gene nele clonado. Devido a sua
versatilidade, os retrovirus so atualmente os vetores eleitos para uso em terapia gnica.

23
 O

R e g i o
fu n cion a l R e g i o fu n cio n al
SV40 ta rd ia
p re co ce

g e ne d a
h e m a g lu tin in a (H a )

SV40
m uta n te S V 4 0-H a

co -tra n sfec o

S V 4 0 m uta nte
in te gra do a o
g en om a da clula C OS
a ntge no T re plicao

e m p a co ta m e n to
e lise

P a rtcula V ira l

Figura 15. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce

5. BACTERIFAGO M13
O bacterifago M13, um fago filamentoso da E. coli e contm uma nica fita
de DNA envolvida por protenas virais. Durante o seu ciclo, a clula hospedeira
infectada pela fita (+) a qual servir como molde para a sntese da outra fita (-). A dupla
fita denominada de forma replicativa, permanece no interior da clula hospedeira e
24
amplificada at 200 cpias por clula, quando ento a fita negativa no mais se replica e
a fita positiva continua a ser sintetizada, adquire as protenas da cpsula viral e sai da
clula hospedeira atravs de processo no ltico (Figura 16).

E .co li

-
+ + + +
M 13

Figura 16. Replicao do bacteriofago M13

5.1. Clonagem no bacterifago M13

A grande utilidade deste sistema de clonagem a sua facilidade na produo de
DNA fita simples, facilmente recupervel do sobrenadante de uma cultura lquida da
E.coli infectada com este vetor. Como veremos futuramente, este DNA fita simples
bastante til no processo de sequenciamento do DNA pelo mtodo desenvolvido por
Sanger e colaboradores (1977).
Para facilitar o seu uso especialmente em estratgias de seqenciamento, foram
desenvolvidos vetores da srie M13mp, os quais contm o MSC inserido no gene que
expressa a -galactosidase.
Mutaes foram realizadas de tal modo que a enzima s ativa quando o vetor
est na clula hospedeira, convenientemente preparada. Este processo denomina-se de
alfacomplementao. A incluso do mltiplo stio de clonagem no gene da
galactosidade visa a identificao dos possveis recombinantes quando na presena de
um substrato cromognico o X-gal ou Bluegal (5-bromo-4-cloro-indolil--D-
galactosdeo) e o indutor IPTG. Quando o vetor est intacto (no recombinante), a
enzima funcional e frente ao substrato cromognico este clivado produzindo placas
de cor azul. Por outro lado, quando um fragmento de DNA inserido no mltiplo sitio
25
de clonagem, a expresso da enzima suprimida, portanto, incapaz de metabolizar o
substrato cromognico formando como consequncia placas incolores.

5.2. Estratgia de clonagem em vetores da srie M13mp.

A utilizao de vetores com diferentes orientaes do mltiplo stio de clonagem,
tais como M13mp8 e o M13mp9, facilita a insero de um fragmento de DNA em
ambas as orientaes. Como veremos adiante, esta estratgia apresenta grande aplicao
no programa de sequenciamento de um DNA pelo mtodo de Sanger.
A figura 17 ilustra a insero de um fragmento de DNA clivado com as enzimas
Pst1 (P) e EcoRI (E), nos vetores M13mp8 e M13mp9, ambos clivados com as mesmas
enzimas. Esta clonagem orientada, permite a insero do fragmento de DNA na
orientao 5'3' no vetor M13mp8 e na orientao 3'5' no vetor M13mp9.

P E
5 3

P E E P

M 13 m p 9 M 13 m p 8

P E E P

Figura 17. Clonagem de um fragmento de DNA nos vetores M13mp8 e M13mp9, clivados
com as enzimas EcoRI (E) e PstI (P).

6. FAGEMDEOS
Apesar do bacterifago M13 apresentar grande aplicabilidade especialmente
nos processos de seqenciamento de DNA, foram desenvolvidos outras geraes de
fagos, os quais apresentam as vantagens do fago M13 e a do plasmdeo. Os primeiros
foram os vetores da srie pEMBL e mais tarde os plasmdeos pTZ, pBluescript e pGEM

26
(+/-). Estes vetores so chamados de fasmdeos ou fagemdeos e apresentam as
seguintes caractersticas principais:
fagemdeo apresenta um verstil MSC, permitindo a clonagem de grandes
insertos sem maiores dificuldades, alm de que, as enzimas situadas neste
stio foram ordenadas de tal modo a permitir uma alternativa interessante
durante o processo de sequenciamento.
utilizando uma combinao estratgica de duas enzimas de restrio,
possvel criar terminaes 5'e 3' proeminentes, tornando agora uma
extremidade (a do inserto) susceptvel ao da Exonuclease III. Esta
estratgia, permite a obteno progressiva e controlada de vrios fragmentos
deletados do inserto, os quais aps a recircularizao tornam-se apropriados
para o sequenciamento. Este procedimento, facilita o seqenciamento de um
grande inserto de DNA, sem a necessidade de mltiplas subclonagens como
usual no sistema M13 ou a sntese de vrios oligonucleotdeos internos,
usados como iniciadores no processo de seqenciamento.

6.1. Clonagem no fagemdeo.

Vamos utilizar como exemplo, o fagemdeo ZAP o qual particularmente til
para clonagem de cDNA. Este vetor, incorpora a biologia do fago M13 de tal modo que
um cDNA clonado neste vetor pode ser automaticamente excisado do fago para um
plasmdeo denominado pBluescript.
Basicamente, qualquer DNA clonado no MSC inativa o gene LacZ, produzindo
uma protena de fuso quando na orientao correta, podendo assim tambm ser
rastreada com anticorpos.
Quando uma cepa da E.coli (F') infectada com o fago recombinante e
superinfectada com o fago auxiliar, este forma as protenas do sistema M13 que
reconhecem duas sequncias de DNA a do sinal de iniciao e trmino da sntese do
DNA, os quais foram incorporados no fago ZAP. A clivagem destas duas sequncias,
liberar o inserto, o qual automaticamente circularizado na bactria para originar a
forma recombinante do Bluescript SK(M13).
O inserto clonado no Bluescript flanqueado por promotores para as RNA
polimerases dos fagos T3 e T7. Neste sentido, aps o vetor ser convenientemente
27
linearizado, cpias do RNA relativo ao inserto, podem ser obtidas em ambas as direes
atravs do uso da T3 e T7 RNA polimerase.

7. VETORES PARA TRANSFORMAO DE LEVEDURAS

O grande interesse existente no estudo das leveduras Saccharomyces cerevisiae
e Schizosacharomyces pombe deve-se ao fato de que tratam-se de organismos
eucariotos inferiores e como tais possuem organizao celular similar de eucariotos
superiores. Alm disso, muitas protenas de leveduras so similares estruturalmente e
funcionalmente s suas homlogas em mamferos. A utilizao de leveduras como um
modelo de estudo traz as seguintes vantagens:
tempo de crescimento reduzido que permite a obteno de grandes
quantidades de leveduras em pouco tempo.
genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 vezes menor que o genoma de
mamferos, o que simplifica anlises moleculares e genticas.
possibilidade de manter as leveduras como clulas haplides ou diplides, o
que permite a obteno de mutaes recessivas em clulas haplides, bem
como a realizao de experimentos de complementao gentica. As
clulas de mamferos so diplides o que torna impossvel a deteco de
mutaes recessivas.
Existem diferentes marcadores de seleo que so utilizados em leveduras. A
maior parte dos genes marcadores utilizados em leveduras so genes envolvidos na
biossntese de aminocidos e nucleotdeos. Um dos marcadores frequentemente
utilizados o gene de levedura LEU2, que codifica para uma das enzimas da via de
sntese da leucina, a enzima -isopropilmalato dehidrogenase. A linhagem mutante de
levedura, leu2, no cresce em meio de cultura que no contm leucina. Assim quando o
gene LEU2 utilizado na transformao da linhagem leu 2 as clulas desta linhagem
que adquiriram o gene LEU2 sero capazes de crescer em meio de cultura deficiente no
aminocido leucina. Esta estratgia semelhante a resistncia ampicilina adquirida
por bactrias que foram transformadas com plasmdeos que contm o gene que promove
a resistncia ampicilina.

A tabela a seguir lista alguns dos marcadores de seleo comumente utilizados

em levedura.

28
GENE ENZIMA SELEO

HIS3 Imidazol glicerolfosfato desidratase histidina

LEU2 -Isopropilmalato desidrogenase leucina
LYS2 -Aminoadipato redutase lisina
TRP1 N-(5-fosforibosil)- antranilato isomerase triptofano
URA3 Orotidina-5fosfato decarboxilase uracil

Tabela 2. Genes marcadores de seleo em levedura. Os meios de cultura utilizados em geral

contm todos os aminocidos necessrios manuteno da levedura com exceo de um.
Assim, por exemplo, clulas transformadas com o gene HIS 3 so selecionadas em meio de
cultura deficiente em histidina.

Os vetores utilizados na transformao de leveduras so capazes de

propagarem-se em E. coli e levedura. A manipulao destes vetores (clonagem,
mutagnese, seqenciamento, etc) realizada em bactria como para qualquer
plasmdeo convencional e ento o mesmo transferido para levedura, organismo onde
os ensaios de interesse so realizados. Tais vetores so denominados vetores do tipo
ponte (shuttle vectors) e contm entre outros elementos origens de replicao de
bactria e levedura bem como genes marcadores que funcionam para a seleo em
bactria e em levedura.
Diferentes tipos de vetores so utilizados na transformao de leveduras:
Vetores de integrao: tais vetores contm origem de replicao de bactrias e genes
marcadores para seleo em bactria e levedura. Neste caso o plasmdeo no capaz de
replicar de modo autnomo na levedura. O modo pelo qual este tipo de vetor
propagado e capaz de expressar o marcador de seleo atravs da integrao em um
dos cromossomos de levedura.
Vetores que replicam em levedura: tais vetores tambm contm origem de replicao
de bactria e genes marcadores para seleo em bactria e levedura. Dois tipos de
origens de replicao de levedura so empregadas nestes plasmdeos. O primeiro tipo
consiste na origem de replicao do plasmdeo de 2 m, que de ocorrncia natural em
levedura. O segundo consiste de origens de replicao isoladas de DNA cromossomal
denominadas ARS ( Autonomously Replicating Sequence, sequncias de replicao
autnoma). Plasmdeos contendo a origem de replicao do plasmdeo de 2m ou
sequncias tipo ARS replicam em mltiplas cpias em levedura (Figura 18). Uma

29
variante deste tipo de vetor inclui, alm da sequncia ARS, uma sequncia tipo
centromrica, denominada CEN, que garante que a replicao destes plasmdeos seja
estvel, ocorrendo uma nica vez por ciclo celular e que eles sejam segregados de modo
preciso durante a mitose e meiose. Vetores contendo sequncias tipo CEN so
mantidos em cpia nica na levedura (Figura 18).
YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura) so uma
variao de um vetor de cpia nica, que contm sequncias centromricas (CEN) e
sequncias telomricas, que so sequncias das extremidades dos cromossomos. A
presena de sequncias telomricas nestes vetores permite que sejam replicados como
molculas lineares, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. YACs
no so utilizados de rotina em experimentos de clonagem, entretanto, tm se mostrado
uma ferramenta valiosa na caracterizao de grandes segmentos genmicos na medida
em que possvel clonar em um YAC fragmentos que vo de 100 a 2000 kb (Figura
19).

LE U 2 LE U 2

ARS ARS

M ulticpias P uc118 C p ia nica

P uc118
CEN

D N A Le vedu ra
D N A Le vedu ra

Figura 18. Vetores de levedura. Contm sequncias de plasmdeo (aqui de pUC118) que
permitem a propagao e do resistncia a ampicilina em E.coli, o gene de seleo em levedura
(neste caso LEU 2) e stios nicos de restrio. Vetores multicpias:. Estes plasmdeos
existem na forma circular na levedura. Alguns destes vetores empregam a origem de replicao
do plasmdeo de 2 m. Outros utilizam origens de replicao isoladas de cromossomos que so
denominadas ARS. 2m e ARS permitem a replicao do plasmdio em mltiplas cpias.
Vetores cpia nica: Vetores que contm origens de replicao tipo ARS podem ser mantidos
estavelmente atravs da adio de sequncias centromricas, CEN. A existncia de sequncias
tipo CEN assegura que o plasmdeo seja mantido em 1 ou 2 cpias na levedura e segregado de
modo preciso durante a diviso celular.

30
 E co R I
CEN 4
ARS1
URA3
TRP1 YA C

Am p

+E L +E L
Bam HI

Figura 19. YACs: Contm um centrmero, dois telmeros, gene(s) marcadores para seleo
em levedura e uma seqncia tipo ARS. Devido presena destas seqncias os YACs so
replicados como pequenos cromossomos lineares na levedura.

GLOSSRIO
- ARS: (autonomous replication sequence, sequncia de replicao autnoma).
Sequncia que funciona como uma origem de replicao em cromossomos de
levedura.
- BAC: (bacterial artificial chromosome, cromossomo artificial de bactria). Vetor
utilizado na clonagem de DNA genmico, baseado no fator F de plasmdeo que
assegura que o plasmdeo seja mantido em pequeno nmero de cpias na bactria.
- Centrmero: regio do cromossomo que apresenta uma constrico e qual liga-se
o fuso mittico durante a meiose ou mitose. necessria para a manutno da
estabilidade e segregao correta dos cromossomos durante a mitose e meiose.
- Origem de replicao: regio onde iniciada a sntese de DNA em um dado
fragmento de DNA.
- Telmero: extremidade do cromossomo que contm sequncias repetitivas de DNA
sintetizadas pela enzima telomerase e importantes na manutno da integridade
cromossomal.
- YAC: (yeast artificial chromosome, cromossomo artificial de levedura). Sistema de
clonagem em levedura que consiste de um vetor linear que tem capacidade de
replicao autnoma e que contm um centromro de levedura e duas sequncias
telomricas em suas extremidades.

31
 III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA
RECOMBINANTE

A obteno de uma molcula de DNA recombinante, atravs da ligao de um

fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor, um processo direto e
relativamente simples. Entretanto, problemas especiais surgem quando o fragmento de
interesse constitui uma frao pequena do DNA total. Este o caso encontrado
comumente quando o objetivo o isolamento de genes presentes em uma nica cpia
num genoma complexo, ou quando o objetivo o isolamento de clones portadores do
DNA complementar RNA mensageiro raro. Deste modo, claro que quando
queremos clonar um determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou
mensagens por ele codificada(s) necessrio a obteno de colees de clones
recombinantes, portadores de molculas representantes de todo o genoma, ou de
colees de clones de cDNAs derivados de toda a populao de mensageiros da clula
ou tecido de interesse. Essas colees de clones de DNA recombinante so chamadas
de bibliotecas: Biblioteca Genmica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do
DNA genmico ou Biblioteca de cDNA, no caso dos clones terem sido construdos a
partir de DNA complementar.
O DNA de organismos superiores bastante complexo: por exemplo, o genoma
haplide de mamfero composto de aproximadamente 3x109 pares de bases (pb).
Portanto, se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreender somente 1 parte
em 106 de uma preparao do DNA total. De modo similar, uma espcie de RNAm
particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 105 ou 106 da frao de
RNA mensageiros de uma clula. Deste modo, para que seja garantida a presena na
biblioteca de pelo menos uma verso de todas as seqncias da populao alvo, um dos
pontos principais na construo de bibliotecas teis a obteno de grandes
quantidades de clones. Embora a soluo deste problema envolva estratgias
especficas no preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem, em linhas
gerais a construo de bibliotecas genmicas e de cDNAs segue um procedimento
bsico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA genmico ou os cDNAs so
preparados para a insero no vetor escolhido. O vetor e o DNA alvo so ligados e
introduzidos em E.coli atravs de infeco ou em alguns casos, por transformao direta
(Fig. 20).
32
 E sco lha do
Tecido
Ve tor

mRNA DNA

D ig erir o D N A ,
P arcial ou com pletam ente

cD N A Fra cionar por tam anho

D N A clonvel

Lig ar D N A a um vetor

Introd uzir o produ to

da lig ao em E .coli

Titulao e caracte rizao

da B ibliote ca

Figura 20. Passos envolvidos na construo de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas genmicas.

1. BIBLIOTECA DE cDNA

A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente

de RNA encontrada predominantemente em vrus de RNA de tumor, tornou possvel a
sntese in vitro de DNA usando-se como molde RNAm. O DNA produto dessa reao
o DNA complementar ou cpia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A
sntese e possvel clonagem de cDNAs contribuiram para grandes avanos na anlise da
estrutura e expresso de genes de eucariotos e propiciaram uma revoluo tecnolgica
nas indstrias farmacutica e de alimentos. Esses clones so comumente isolados de
bibliotecas de cDNA, construdas a partir da populao de RNAm isolada da clula ou
do tecido de interesse. Portanto, em comparao com bibliotecas do genoma total essas
bibliotecas so enriquecidas com seqncias gnicas. Uma vez que o cDNA cpia da
mensagem, ele no contm introns e apresenta significativamente poucas seqncias
33
que no codificam para protenas (Fig.21). A ausncia de introns permite que cDNAs
relativos a clulas de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos
em bactrias e em outros microorganismos, permitindo assim a produo em grande
escala de polipeptdeos importantes tanto na rea de pesquisa como na rea aplicada. A
ausncia de introns tambm facilita a determinao direta da seqncia da mensagem e
subsequente deduo da seqncia de aminocidos da protena por ela codificada. Isso
tem resultado na identificao da seqncia de uma enorme quantidade de protenas,
algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas gentica ou bioquimicamente.
De modo resumido, o procedimento para a sntese, clonagem e isolamento de
cDNAs especficos envolve 4 etapas:

1) Sntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do

tecido de interesse.

2) Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor escolhido

3) Introduo dos cDNA recombinantes nas clulas hospedeiras, onde sero replicados.
Isto resultar na amplificao dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na
expresso das protenas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs.

4) Identificao dos clones de interesse atravs de um processo de triagem dos clones

recombinantes

5
  
D N A G enm ico 3

5
 3
R N A m en sa geiro

3
5


cD N A

A e E = S eq u ncias Flan qu ea d ora s B e D = e xon s C = in tro n

Figura 21. Diagrama representando de forma simplificada as diferenas entre um fragmento de

DNA genmico e do cDNA relativo a ele.

34
1.1. Sntese de cDNAs de fita dupla

A construo de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o isolamento do RNA

total do tecido e subsequente seleo da frao de RNA poli (A)+, que compreende a
maioria das mensagens presentes na clula. O isolamento de um RNA poli (A)+ de boa
qualidade essencial, uma vez que qualquer degradao do RNAm afetar a
representatividade das seqncias na biblioteca.
Uma vez obtida a frao de RNA poli (A)+, procede-se a sntese dos cDNAs
atravs de uma srie de reaes enzimticas (Figura 22). Nos ltimos dez anos foram
descritos vrios mtodos para sntese de cDNA, cada um apresentando vantagens e
desvantagens particulares. Como exemplo, apresentamos a seguir um procedimento
amplamento usado para esse fim:
a) Sntese da fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA) atravs da enzima
transcriptase reversa. Essa enzima capaz de catalizar in vitro a polimerizao de
DNA a partir RNA e requer um "primer" com a extremidade 3'OH livre para iniciar a
sntese. Na maioria das vezes, a molcula utilizada como "primer" um oligo (dT), que
se anela na cauda poli (A)+ do RNA.

b) Aps a sntese dessa fita de cDNA, o RNAm parcialmente removido, pelo uso da
RNase A para cortar pedaos do RNA da molcula hibrida RNA-DNA.

c) Utilizando como "primer" os fragmentos de RNA no digeridos pela RNaseA, a

DNA polimerase de E.coli substitui eficientemente o RNA por DNA, resultando em
uma molcula de cDNA de fita dupla.

d) O cDNA fita dupla tratado com T4 polimerase. A atividade 3'-5' exonuclease dessa
enzima usada para remover possveis nucleotdeos extras nas extremidades 3' do
cDNA.

e) O produto final desse conjunto de reaes uma molcula de DNA de fita dupla,
cpia exata da mensagem.

1.2. Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor

Uma vez obtido o cDNA, o prximo passo prepar-lo para a insero em um
vetor de clonagem (Figura. 22). Para isso tambm existem vrios mtodos disponveis,
que diferem entre si dependendo do tipo de vetor escolhido: plasmdeo ou fago. O fago
35
 tem sido o vetor de escolha para a construo de bibliotecas de cDNA. A razo bsica
desta preferncia a eficincia. Em comparao com plasmdeos, o fago requer cerca
de 16 vezes menos cDNA por g do vetor para produzir nmero equivalente de clones
recombinantes. Alm disso, bibliotecas em fago so mais fceis de serem
manipuladas do que bibliotecas em plasmdeos. Entretanto, uma desvantagem dos
vetores que no so favorveis para procedimentos de sequenciamento do DNA e de
mutagnese dirigida. Mais recentemente, outro tipo de vetor foi idealizado para suprir
essas deficincias. Essa classe de vetores compreende os fagemdeos que, como o
prprio nome sugere, so plasmdeos contendo pores do genoma de fago e que
reunem vantagens desses dois vetores.
Para dar uma noo dos passos implicados na clonagem do cDNA relatamos a
seguir um procedimento adotado para a clonagem de cDNA em fago .

a) metilao dos stios de EcoRI atravs do tratamento do cDNA com EcoRI, na

presena de S-adenosil metionina. Esse passo essencial para proteger os stios
EcoRI que possam existir no cDNA contra a ao da EcoRI em digesto a ser
realizada subseqentemente no processo de clonagem.
b) adio de adaptadores, com o stio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Essa
reao resulta em molculas de cDNA com adaptadores mltiplos ligados nas duas
pontas (ver figura. 23 )

c) um nico stio de EcoRI produzido em cada ponta do cDNA pela digesto com
EcoRI, liberando o excesso de adaptadores ligados na molcula. A metilao prvia
do cDNA garante que no haja digesto interna do cDNA.

d) antes de ser inserido no vetor, o cDNA separado do excesso de molculas de

adaptadores. Isso feito atravs de filtrao em colunas de Sephadex.

e) as molculas de cDNA so ligadas ao vetor, atravs de reao com T4 ligase

f) o produto da ligao empacotado com as protenas formadora do capsdeo do fago.

g) os fagos obtidos so utilizados para infectar bactria de linhagem que favorece o

crescimento dos recombinantes.

h) aps a infeco da bactria com os cDNA recombinantes temos como produto uma
biblioteca de cDNA, que deve conter cpias de toda as seqncias de RNAm da

36
 populao original. Essa biblioteca pode ser estocada na geladeira, ou submetida a
uma triagem em busca do clone de interesse.
Cauda poli A
5 AUG 3
mRNA AAAAAAAA
Transcriptase
reversa TTTT

{
+dNTPs Oligo dT iniciador
AUG
AAAAAAAA
cDNA TTTT
E.coli Rnase H

AAAAAAAA
cDNA TTTT
DNA Polimerase I
+dNTPs

CDNA
T4 DNA Polimerase

CDNA fita dupla

Figura 22. Sntese de cDNA fita dupla.

37
 1 2 3





M e tila o do cD N A para p ro teger Liga o d os a daptadores E c o R I D iges to c om E c o R I pa ra

os s tios internos de E c o R I c om o cD N A gerar s tios c oe sivos E c o R I

4 5 6

S e para o do cD N A do ex ces s o de c D N A p urificad o Liga o d o cD N A do s b ra os

ada ptado re s do fago lam b da

7 8 9

E m pac otam ento dos re co m binante s Infe c o d a bac tria hos ped eira P laqu eam e nto d os rec om bina ntes
c om as prote nas form a doras da o fa go rec om b inan te
partc ula v iral

Figura 23. Clonagem de cDNA em fago

.
2. BIBLIOTECA GENMICA

Para se obter informaes sobre a estrutura molecular de um gene de eucariotos

necessrio o isolamento da poro do DNA genmico que contenha toda a unidade de
transcrio, mais as regies flanqueadoras onde se localizam os elementos
controladores da expresso desse gene. O modo mais eficiente para se conseguir isolar

38
essa poro do DNA atravs do uso de uma biblioteca genmica, que deve conter
clones portando fragmentos de DNA representantes de todo o genoma do organismo em
questo. Deste modo, o aspecto principal considerado na construo de uma biblioteca
genmica atem-se obteno de um nmero grande de clones portando fragmentos do
genoma, obtidos aleatoriamente. O tamanho necessrio de uma biblioteca genmica,
para que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados,
determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. Deste
modo, a estratgia bsica na construo de bibliotecas genmicas busca minimizar o
nmero de clones necessrios atravs da clonagem de fragmentos de DNA de maior
tamanho possvel, e maximizar a eficincia da clonagem, atravs da utilizao de
vetores baseados no fago . Basicamemte, a construo da biblioteca genmica
envolve os seguintes passos:

a) isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente quebrado de

modo a produzir fragmentos de tamanho compatvel com o vetor de clonagem

b) ligao desses fragmentos no vetor e introduo dos recombinantes obtidos

nas clulas hospedeiras.

Dentre esses passos, o modo de preparo dos fragmentos a serem clonados

(insertos) merece ser discutido criticamente dada sua importncia na representatividade
da biblioteca.

2.1. Preparo do DNA inserto

A representatividade de uma biblioteca genmica depende grandemente da

aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados so gerados, para que no haja
excluso sistemtica de nenhuma seqncia. O fracionamente mecnico do DNA o
meio de se obter completa aleatoriedade na fragmentao do DNA. Entretanto, esse
mtodo no comumente adotado devido a trabalhosa manipulao necessria para que
os fragmentos assim obtidos possam ser inseridos no vetor. Com bom senso e cuidado
possvel conseguir fragmentao sufientemente aleatria atravs de digestes parciais
do DNA com enzimas de restrio. Uma vantagem em se utilizar a disgesto parcial do
DNA a produo de fragmentos com pontas coesivas e que, portanto, podem ser
diretamente ligados ao vetor. Para garantir que a digesto atinja todo o genoma so

39
utilizadas enzimas de restrio que cortam frequentemente o DNA e que no
apresentam desvios de preferncia de stios. A enzima Sau3A I, que reconhece o stio
de 4 bases GATC, e que gera fragmentos compatveis com stios de clonagem de vrios
fagos e cosmdeos, tem provado ser bastante til na produo de bibliotecas de DNA
genmico digerido parcialmente. Aps a digesto parcial, os fragmentos gerados
precisam ser fracionados antes de serem ligados ao vetor. Sem esse fracionamento,
fragmentos pequenos podero ligar-se entre si produzindo falsos recombinantes.
Fragmentos muito grandes que no permitem o crescimento do fago podero ligar-se
aos braos do fago, alterando a relao entre as quantidades de DNA de inserto e vetor.
Um mtodo de fracionamento frequentemente adotado o de centrifugao em
gradiente de sacarose. Aps a digesto parcial, a soluo de DNA aquecida para que
possveis fragmentos agregados se dissociem, e ento, aplicada sobre um gradiente de
sacarose de alta salinidade. Aps a centrifugao, so coletadas fraes desse gradiente.
Essas fraes so analisadas por eletroforese em um gel de agarose. As fraes
contendo os fragmentos de DNA de tamanho apropriado so utilizadas para a ligao
com o vetor. A figura abaixo ilustra esse procedimento.

40
 Tubo de pl stico
Tubo capilar

B om ba

G rad iente de Tubos de coleta

sacarose 1 2 3 4 5

Figura 24. Mtodo para fracionamento do DNA por centrifugao em gradiente de sacarose. O
gradiente aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristltica. A poro mais
densa do gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, aspirada primeiro. O gradiente
coletado em alquotas de 750ul.

Uma vez garantida a aleatoriedade dos fragmentos clonados, bastante razovel

se pensar que a probabilidade de uma dada seqncia de interesse estar presente em uma
biblioteca genmica possa ser estimada estatisticamente, com base na distribuio de
Poisson. Especificamente, o nmero de clone independentes (N) que precisam ser
triados para uma propabilidade (P) de se isolar uma seqncia especfica dada por:

N = ln(1-P)/ ln[1-(I/G)]

onde I o tamanho mdio dos fragmentos clonados, em pares de base, e G o tamanho

do genoma, em pares de base.
Deste modo, precisamos triar cerca de 690.000 clones de uma biblioteca que usa
como vetor um fago , para termos 99% de chance de isolar qualquer dada seqncia
presente em uma nica cpia em um genoma tpico de mamfero.

N = ln(1-0,99)/ln[1- (2x104/3x109)]= 690.000

41
2.2. Vetores utilizados na construo de biblioteca genmica

Fagos e cosmdeos so os dois tipos de vetores comumente usados na

construo de bibliotecas genmicas. Nos dois casos, fragmentos grandes de DNA
gerados por fragmentao aleatria so ligados com o DNA do vetor para formar
concatmeros que podem ento ser empacotados em partculas de fago . As bibliotecas
construdas em vetores so armazenadas e propagadas na forma de fagos
recombinantes. No caso de clonagem em cosmdeos, entretanto, essas partculas virais
servem meramente como veculos para introduzir o DNA recombinante dentro da
bactria. Uma vez dentro da bactria o cosmdeo se comporta como um plasmdeo
grande. Os cosmdeos podem aceitar insertos de aproximadamente 45kb, quase duas
vezes o tamanho dos insertos clonveis em fago . Deste modo, usando-se cosmdeo
como vetor, necessrio gerar somente 350.000 recombinantes para atingir 99% de
probabilidade de uma seqncia de cpia nica estar representada em uma biblioteca
genmica de mamfero. Entretanto, bibliotecas em cosmdeos so mais difceis de se
construir e manter do que as bibliotecas de fagos Cosmdeos so ento usados quando
o gene de interesse muito grande ou quando uma regio extensa do DNA
cromossomal desejada. No caso de isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em
circunstncias onde a biblioteca ser usada muitas vezes, o uso de vetores mais
recomendado.
Na figura abaixo apresentamos um diagrama da estrutura de um vetor tipo ,
bastante utilizado na construo de bibliotecas genmicas.
 
 
5 
 3
cos
cos Fra gm e nto central
3 5


  
b ra o e sq u erd o b ra o d ireito

Figura 25. Estrutura do vetor EMBL3. LA=brao esquerdo; RA=brao direito;

stuffer= fragmento central; S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI.

Conforme indicado no diagrana este vetor apresenta um fragmento central

flanqueado por dois fragmentos essencias (direito e esquerdo). O fragmento esquerda,

42
chamado de brao esquerdo, codifica para as protenas do capsdeo e o fragmento
direita, chamado de brao direito, contm a origem de replicao do fago e promotores
de outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braos encontram-se os
stios de restrio utilizados na clonagem - SalI, BamHI, EcoRI - em orientao inversa.
Como todo fago , a extremidade de cada brao apresenta um segmento de fita
simples (cos). Esses segmentos so complementares ente si e permitem a
recircularizao da molcula, e consequente replicao do DNA do fago dentro da
clula hospedeira.
Esse tipo de vetor chamado de vetor de substituio por que no processo de
clonagem a parte central do DNA do fago substituida pelo fragmento de DNA a ser
clonado, originando a molcula recombinante.

IV. DETECO E ANLISE DO CLONE RECOMBINANTE

Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante encontrar o clone

correto na mistura de clones que foi criada durante os procedimentos da confeco da
biblioteca genmica ou de cDNA. Embora seja relativamente fcil selecionar as
colnias que abrigam os vetores de clonagem usando os marcadores de resistncia a
antibiticos que esto presentes nos vetores (Figura 26), muito mais difcil selecionar
o clone que contenha o gene de interesse. Note que no caso do vetor ser um plasmdeo
devero ser examinadas milhes de colnias de bactrias crescidas em placas de petri
contendo agar, para a deteco daquela(s) colnia(s) que produza(m) pequenas
quantidades da proteina expressa pelo gene de interesse ou ento que possua(m) o gene
de interesse sem qualquer expresso proteica que o caracterize. Ser discutido
inicialmente a situao na qual a proteina expressa no hospedeiro. Em seguida ser
discutida a situao mais comum onde a proteina no expressa e a anlise ser feita
atravs da prpria presena do DNA de interesse no fago ou na bactria.

43
A E c oR I C la I H in d III
BamHI

S a lI
P s tl

R e sistn cia a
a m p ic ilin a pBR322
R e sistn cia
a te tra ciclin a

O rig e m da re plic a o
d o p la s m de o

B S tio
BamHI

R
Am p TcR
p B R 32 2

S tio B am H I

Bam HI

D N A E x g en o

Bam HI

D N A lig a se

TcR

A m pR A m pR
TcR
P las m de o hibrido c on te nd o
D N A E x g en o

p B R 32 2
re circ ula c iz ad o
Tra ns fo rm a o d e E .co li

Tra ns fo rm an te s res is te ntes Tra ns fo rm an te s res is te ntes

a am p ic ilin a e te tra c ic lin a a am p ic ilin a m a s s en sve l
a te tra cic lin a

Figura 26. Estrutura do plasmdeo pBR322, um tpico vetor de clonagem. A seta indica a
direo da replicao do DNA a partir da sua origem (A). Mtodo da inativao insercional
para isolar plasmdeos contendo DNA exgeno. A inserso do DNA exgeno no plasmdeo
pBR322 causa inativao da resistncia tetraciclina, permitindo o isolamento de
transformantes contendo o fragmento de DNA clonado (B).

44
4.1. Quando o gene de interesse expresso no hospedeiro

Se o gene de interesse capaz de se expressar na clula hospedeira pode-se

identificar o clone que carrega este gene pela presena desta proteina entre as colnias
recombinantes. Para isto, o hospedeiro no deve produzir esta proteina, a menos que ele
carregue o clone que a produza. Se esta proteina fr produzida normalmente pela clula
hospedeira, ser ento necessrio o uso de uma clula hospedeira defectiva ou mutante
para o gene de interesse. Quando este gene fr incorporado ele pode ser detectado por
complementao daquela funo. Se a proteina a ser detectada fr especfica de
mamfero, por exemplo, a clula hospedeira j ser naturalmente defectiva. Se a
proteina fr uma enzima que cataliza uma reao mensurvel pode ser possvel triar as
colnias por sua atividade enzimtica.
Se a proteina de interesse no fr uma enzima com funo detectvel, uma outra
estratgia ser necessria para a identificao do clone correto, como por exemplo, o
uso de um anticorpo especfico para a proteina de interesse. Anticorpo uma proteina
do soro produzida pelos mamferos que se combina com alta especificidade com outra
proteina, o antgeno. Neste caso, a proteina de interesse o antgeno. Como o anticorpo
se combina especificamente com o antgeno, se o antgeno estiver presente em uma ou
mais colnias de uma placa de petri, a identificao destas colnias poder ser feita
observando-se a reao antgeno-anticorpo.
Para que o antgeno seja produzido na clula hospedeira a biblioteca de cDNA
ter de ser construda num vetor de expresso. Neste caso os cDNAs so inseridos
nestes vetores em regies que promovam sua expresso em E.coli, normalmente em
promotores que possam ser regulados. Esta protena antignica ser expressa como uma
protena de fuso ou seja, ser sintetizada subsequente a alguns aminocidos
pertencentes proteina do vetor bacteriano. Estas protenas de fuso so geralmente
mais estveis que a correspodente protena de eucarioto produzida em bactria e
portanto podem ser obtidas em grande quantidade. Para visualizar a produo destas
protenas, uma parte dos fagos de cada placa de lise (ou bactrias) recombinantes
desenvolvidos numa placa de Petri so transferidos (como um carimbo) para uma
membrana de nitrocelulose, tratados para expor suas protenas e ento submetidos a
uma soluo contendo um anticorpo especfico para a protena desejada. Depois que os

45
anticorpos livres so removidos, um segundo anticorpo adicionado para localizar a
posio do primeiro. O segundo anticorpo normalmente radioativo e pode ser
identificado por autoradiografia utilizando-se um filme de raio X. Se uma colnia
radioativa estiver presente, uma mancha no filme de raio X ser observada depois que o
filme fr revelado (Fig. 27). A localizao desta mancha no filme corresponde a
localizao da colnia que produziu aquela proteina, na placa de petri original. Esta
colnia ser ento recuperada da placa original e cultivada. Uma limitao deste
procedimento que o anticorpo utilizado nesta triagem precisa ser especfico para a
proteina de interesse. A produo de anticorpos pode ser obtida pela injeo da proteina
(antgeno) em um animal. No entanto, esta proteina injetada deve ser pura, caso
contrrio mais que um anticorpo ser formado.

4.2 O uso de sondas moleculares de cidos nucleicos para identificar o gene de interesse
Como pode ser detectado um gene de interesse entre as colnias da biblioteca
genmica ou de cDNA, se este gene no expresso?
Quando o DNA em soluo aquosa aquecido 100C, ou exposto pH alto, as
bases complementares que normalmente seguram as duplas hlices juntas so
dissociadas em duas fitas simples. Este processo chamado de denaturao. Estas
mesmas fitas simples podero se reassociar se forem conservadas 65C, por longos
perodos, num processo chamado de renaturao (ou hibridao, quando a associao
ocorre entre cidos nucleicos de diferentes origens). Reaes de hibridao ocorrem
entre qualquer duas cadeias de cidos nucleicos de fita simples (DNA:DNA,
RNA:DNA ou RNA:RNA) desde que tenham sequncias de nucleotdeos
complementares.

46
 P ro m oto r

E co R I la c

g fll -G a la ctosid ase

E co R I

E coR I cD N A
linke r

E coR I E co R I

P ro te in a d e Fu s o

E m p acotam en to d os fa go s
in vitro e p la qu ea m en to em
cam a da ba cterian a
M em b ran a de
n itro celu lo se

N itroce lu lose
sob re as p la ca s
d e lise
P lacas d e lise

R e m o o da
m em b ran a

P ro te na s se lig am
a nitro ce lu lo se

In cu b a m e m b ra na com
Film e de ra io -X a ntico rp o p rim rio
a ntico rp o se cu nd rio
L ava m e m bra na

In cu b a m e m b ra na com
a ntico rp o se cu nd rio

a ntico rp o p rim rio

Figura 27. Triagem de bibliotecas de expresso com anticorpos. Se o inserto estiver na orientao correta e na apropriada sequncia aberta de
leitura traduzido em proteina de fuso (antgeno). Os anticorpos identificam as placas de lise especficas destes antgenos.

47
 Este princpio da hibridao molecular fundamental para caracterizar DNAs
recombinantes quando o gene de interesse no expresso. Sondas de cidos nucleicos
32
(fragmentos de cido nucleico marcados radioativamente, geralmente com P) so
utilizadas para localizar clones, numa biblioteca genmica ou de cDNA, que carreguem
uma sequncia de DNA de interesse. Aps a confeco da biblioteca genmica (ou de
cDNA) os fagos carregando DNA recombinante so espalhados juntamente com uma
suspenso de bactrias numa placa de petri contendo meio de cultura slido. Uma vez
visualisadas as placas de lise (ou as colnias, no caso do vetor ser um plasmdeo)
preparada uma rplica de cada placa de petri com uma membrana de nilon ou de
nitrocelulose. Este processo permite a transferncia de uma poro de fagos de cada
placa de lise (ou de bactrias de cada colnia) para a membrana, de tal maneira que o
padro das placas de lise da placa de petri original seja mantido na membrana. Para
identificar qual das placas de lise porta o gene de interesse esta membrana tratada para
expr e denaturar o DNA das colnias al presentes e incubado com uma soluo de
DNA ou RNA fita simples, marcado radioativamente e complementar ao gene de
interesse para permitir a hibridao. Dois polinucleotdeos simples fitas somente iro se
hibridar se forem complementares. A localizao da placa de lise que se hibridou
sonda determinada aps a exposio da membrana um filme de Raio-X
(autoradiografia) e a comparao deste filme com a disposio da colonias na placa de
petri original (Fig 28).
Esta sonda molecular radioativa pode ser parte de um gene j clonado para o
qual se procura o gene total, pode ser o DNA de um gene vizinho ao gene de interesse,
pode ser o RNA de genes que so expressos em tecidos especficos ou em estgios
especficos do ciclo celular, ou mesmo o gene de uma outra espcie que codifica para a
mesma protena. Neste ltimo caso, a reao de hibridao pode ser realizada em baixa
temperatura (420C ao invs de 650C) e em baixa concentrao de sal (baixa
estringncia) para permitir a hibridao mesmo entre DNAs que tenham algumas bases
no complementares.

48
 M em brana de
nitrocelu lose

P lacas de lise Fa gos a bsorvem a P laca m estra

nitrocelu lose

M em brana rplica

S onda de cid o
nucle ico m arcad a
com 3 2p

S onda H ibridiza
D N A liga do a o filtro

Lavag em das sonda s

no in co rporadas

S onda hibridiza ao D N A do fag o

que contem a sequ ncia com plem entar Film e de ra io-X

D N A lam bda
isolado da placa de
lise
P laca m estra
D N A clonado

C lo ne lam bda purificado

Figura 28. Triagem de uma biblioteca genmica ou de cDNA, construdas no fago , com uma sonda
molecular para encontrar um clone de interesse. Esta triagem feita espalhando-se os fagos previamente
incubados numa cultura de bactrias, em vrias placas de agar. Depois que as placas de lise tornam-se
visveis, so feitas as rplicas em membrana de nitrocelulose, seu DNA exposto e hibridizado com a
sonda molecular. A posio do clone recombinante de interesse identificada atravs de autoradiografia.
O DNA isolado dos fagos presentes na placa de lise positiva, identificada na placa de petri original e
submetido anlises posteriores.
49
 Genes que respondem a um mesmo mecanismo de regulao podem ser
identificados numa biblioteca de cDNA por hibridao diferencial. Isto , genes
expressos em tecidos especficos, em estgios especficos do desenvolvimento ou do
ciclo celular e genes regulados por fatores de crescimento so adequados para serem
analisados por este tipo de abordagem. Para esta identificao necessrio produzir
duas populaes celulares (ou extrair mRNA de dois diferentes tecidos) uma na qual
eles no se expressam e outra na qual eles se expressam. Suponha por exemplo, que
uma biblioteca de cDNA seja preparada usando o mRNA isolado de clulas tratadas
com fatres de crescimento. Esta biblioteca plaqueada e transferida para dois
conjuntos de membranas de nitrocelulose. Um conjunto ensaiado com DNA marcado
radioativamente preparado por transcrio reversa do RNA das clulas tratadas com os
fatores de crescimento. O outro conjunto de filtros hibridado com cDNA preparado de
clulas no tratadas. Clones positivos identificados por hibridizar mais fortemente com
a primeira sonda codificam mRNAs induzveis pelos fatores de crescimento (Figura
29).
Quando o DNA a ser clonado expressa uma proteina cuja sequncia
conhecida pode-se inferir a sequncia de um trecho de DNA que lhe deu origem e
sintetizar oligonucleotdeos que lhe sejam complementares para serem utilizados como
sondas moleculares. Estes nucleotdeos devem ter pelo menos 17 a 20 nucleotdeos de
comprimento para ser especfico para a sequncia procurada. Um problema enfrentado
para sintetizar estes oligonucleotdicos a degenerecncia do cdigo gentico. Alguns
aminocidos so codificados por quatro ou mesmo seis diferentes cdons e portanto
mesmo um pequeno polipeptdeo pode ter sido codificado por vrias sequncias de
DNA. Para contornar este problema as sondas oligonucleotdicas so algumas vezes
sintetizadas como uma mistura de todas as possveis combinaes dos cdons que so
traduzidas naquela sequncia proteica (Figura. 30). Uma destas sequncias correta e
ir hibridar com o clone de interesse, mas a possvel hibridao dos outros
oligonucleotdeos com sequncias sem interesse pode levar a obteno de clones falsos
positivos.

50
 C lu la s co m fa tore s C lu la s Q u ie sce ntes
d e cre scim e nto

C re sce em 3 h s Isola o m R N A
Isola o m R N A p oli(A ) p oli(A )

AAAAA AAAAA
AAAAA AAAAA
AAAAA m R N A ind u zido pe lo s
fa to res d e cre scim e n to
AAAAA AAAAA
AAAAA AAAAA

O ligo (d t) O ligo (d t)
Tra nscrita se P re pa ra biblio t ca Tra nscrita se
R e ve rsa d e cD N A co m fa go R e ve rsa
3 2p -dN T PA la m bd a e infecta E coli 3 2p -dN T PA
h ib rid ao h ib rid ao

P laca m e stra

R plica e m m em b ran a de n itro celulose

H ib rida o
A u to rad io gr fia n eg lig e ncia ve l A u to rad io gr fia
cD N A
C lo n e d e cD N A
com u m
in d usvel po r
fa to res d e
crescim en to Isola o clon e
d o fag o

Film e
d e ra io -X
Film e
d e ra io -X

P laca m e stra

Figura 29. Clonagem de genes regulados por fatores de crescimento atravs de hibridao
diferencial. Esta estratgia utilizada para clonar uma famlia de genes que so induzidas
quando clulas quiescentes so estimuladas a crescer pela adio dos fatores de crescimento.

51
 Cys-M et-Asp-G lu-M et-Lys-Arg-Asn-Ile S e q u ncia P a rcia l
d e A m in o cid o s

A
T C A A A C S e q u ncias P o ssve is
TG -ATG-GA -GA -ATG-AA -AG -AA -ATT
C T G G G T do DNA
C
P a rte d a se q u n cia co m
p o uca a m b ig id a d e A
CG C
G
T

S o n d a s con te n d o S o n d a te n ta tiva
to d as a s p o ssveis co m b in a e s
d e con d o n s d e p a rte
d a seq u n cia
TGTATGGATGAAATGAA 5TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC 3

TGCATGGATGAAATGAA
TGTATGGACGAAATGAA
TGCATGGACGAAATGAA
TGTATGGATGAGATGAA
TGCATGGACGAGATGAA
TGCATGGATGAGATGAA
TGTATGGATGAGATGAA

H ib rid a o co m cD na

5 TGCATGGACGA
GATGAAGCGCAAC ATC 3
---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTT TAG---
A

5 TGCATGGACGAAATGAA 3

---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG---

Figura 30. Desenho de sondas oligonucleotdicas baseadas na sequncia proteica. Como a

maioria dos aminocidos so especificados por dois ou mais codons estes oligonucleotdeos so
sintetizados usando-se uma mistura dos nucleotdeos das posies ambguas. A sequncia
correta estar representada entre os oligos. Uma outra possibilidade usar uma sonda tentativa
cuja escolha baseada na frequncia de uso do codon na espcie em estudo. Neste caso
pareamentos incompletos podem ocorrer.

52
 Uma variao deste mtodo utilizar o menor nmero possvel de
oligonucleotdeos como sonda, escolhendo a regio da proteina que contm o menor
nmero possvel de cdons degenerados (por exemplo, metionina somente codificada
pelo cdon AUG). Deve-se levar em conta tambm qual o cdon de uso mais
frequente para cada aminocido, na espcie que est sendo analisada.

4.3 Anlise do DNA e RNA por eletroforese em gel e blotting.

Vrias tcnicas foram desenvolvidas baseadas nas propriedades de hibridao
dos cidos nucleicos visando a triagem e isolamento de sequncias especficas destas
molculas. A maioria destas tcnicas, conforme j mencionado, trabalha com uma
rplica do DNA de interesse imobilizado num suporte slido tal como uma membrana
de nailon ou de nitrocelulose. Um destes mtodos, desenvolvido na dcada de 70 por
E.M.Southern, tornou-se conhecido por Southern blotting. Nesta tcnica o DNA
digerido com uma ou mais enzimas de restrio e os fragmentos resultantes separados
por eletroforese num gel de agarose. Os fragmentos de DNA dupla fita so visualizados
por colorao com brometo de etdio, denaturados in situ com hidrxido de sdio e
transferidos para uma membrana por capilaridade, com o auxlio de uma soluo de alta
concentrao salina. Tais condies permitem que o DNA seja retido na membrana no
ponto de contacto entre o gel e a membrana, criando portanto uma rplica do gel. O
DNA covalentemente ligado membrana usando-se calor ou luz ultravioleta. Sondas
de cidos nucleicos (DNA ou RNA marcados radioativamente) podem ser utilizadas
para hibridar com o DNA fixado na membrana e a posio na qual a ligao especfica
ocorrer pode ser detectada por autoradiografia da membrana (Figura. 31). O padro de
hidridao pode ser comparado diretamente com a regio no gel original que contm a
sequncia de DNA de interesse. Southern blotting uma tcnica to poderosa que
permite que as informaes obtidas sejam utilizadas para a construo de um mapa de
restrio de uma determinada parte do DNA clonado, por exemplo, para identificar a
regio que contm o gene de interesse. Esta tcnica possibilita tambm que as sondas de
cidos nucleicos sejam utilizadas para diagnsticos de distrbios genticos, ensaiando-
se o DNA genmico dos indivduos afetados e de seus familiares.

53
 S o nda d e D N A
m a rc ada com
3 2

tra nsfe r ncia

ele troforese d o D N A p or a uto ra diog rafia
b lo tting .

pap el
gel de de autoradiogram a
aga ro se nitrocelu lose

Figura 31. Southern blotting. Um fragmento de DNA especfico pode ser identificado
separando-se a mistura de fragmentos por eletroforese, transferindo-se para nitrocelulose e
hibridizando-se com uma sonda molecular complementar sequncia e marcada com 32P.

De modo anlogo, molculas de RNA tambm podem ser identificadas aps

serem separadas por eletroforese, transferidas para nitrocelulose, sofrerem hibridao
com sondas de DNA ou RNA. Esta tcnica de analisar RNA, por analogia ao Southern
blotting, recebeu o nome de Northern blotting. Esta tcnica til como auxiliar na
anlise de clones de cDNA porque, o tamanho do mRNA especfico pode ser
comparado com o tamanho dos cDNAs clonados, revelando a integridade dos clones.
Alm disto, esta tcnica permite indicar em qual tecido ou tipo celular um determinado
gene expresso ou quais so os fatres que regulam a sua expresso.

4.4 Como os genes clonados so utilizados?

O clone de interesse pode ser explorado sob vrios aspectos. Ele pode ser
sequenciado e comparado com outras sequncias j descritas, ser utilizado no estudo da
expresso gnica do(s) gene(s) contido(s) no clone, ser alterado especificamente por
mutagnese stio dirigida ou ser usado para gerar um produto de intersse comercial.
Para isto quase sempre ser necessrio transferir o clone, ou parte deste para um vetor
mais apropriado para atingir os objetivos desejados. Transferncia de parte do DNA
clonado para um novo vetor conhecido como sub clonagem. Algumas destas
aplicaes sero abordadas nos captulos seguintes.

54
4.5. Mapa de restrio

O mapa de restrio do DNA clonado ou de pequenas molculas de DNAs de

fagos, plasmdeos ou mitocondrias pode ser bastante til na caracterizao da molcula.
Esta tcnica envolve a separao por eletroforese dos fragmentos de DNA obtidos aps
digesto do DNA total com determinada enzima de restrio. A ordem dos fragmentos
na molcula pode ser descoberta com o uso de outras enzimas de restrio, em duplas
digestes e/ou por digestes sequenciais usando 2 enzimas. Assim cada fragmento
obtido aps digesto com a enzima x removido do gel e submetido a digesto com a
enzima y e vice-versa (Figura 32).
Informaes sobre o mapa de restrio de um fragmento de DNA so utilizadas,
por exemplo, para subclonar partes destes fragmento para o sequenciamento. O mapa de
restrio do DNA mitocondrial vem sendo til na caracterizao de linhagens e/ou
espcies de vrios organismos, auxiliando em estudos taxonmicos e evolutivos.

Figura 32. Mapa de restrio do DNA do fago para vrias endonucleases. As barras
verticais indicam os locais de clivagem de cada enzima e os nmeros no alto indicam o tamanho
da molcula em unidades de 5000 pares de bases. Esta molcula possui no total 48502 pares de
bases.

55
 V. SEQENCIAMENTO DE DNA

5.1 Sequenciamento manual

O mtodo de sequenciamento do DNA mais utilizado no momento foi
desenvolvido por Sanger e colaboradores (1979), conhecido tambm como mtodo do
trmino do crescimento da cadeia.
O sequenciamento do DNA atravs deste mtodo, exige a clonagem do
fragmento de DNA e de seus subfragmentos a serem sequenciados em vetores
apropriados como os da srie M13mp os quais tem sido largamente utilizados para esta
finalidade.
O prncipio do mtodo baseia-se na capacidade da DNA polimerase copiar uma
fita de DNA a partir do molde na presena de um iniciador. A reao de
sequenciamento consiste na hibridizao de um oligonucleotdeo sinttico (iniciador),
com uma regio conhecida do vetor (M13), imediatamente adjacente ao inserto a ser
sequenciado.
A seguir, promove-se a sntese da fita complementar empregando o fragmento
Klenow da DNA polimerase I e uma mistura de deoxinucleotdeos (dNTP), sendo um
deles marcado com 32P ou 35S.
No processo so realizadas quatro reaes independentes, sendo que em cada
uma delas adicionado um tipo de dideoxinucleotdeo (ddNTP). Em cada reao, um
nmero muito grande de molculas de fita complementar esto sendo copiadas
simultaneamente. No entanto, em um dado momento da extenso, uma pequena
porcentagem de molculas ir incorporar um ddNTP e neste caso a reao de
alongamento da cadeia ser automaticamente interrompida naquele stio, devido
ausncia do grupamento 3'OH do ddNTP. Por outro lado, em outras molculas a reao
de extenso continua a ocorrer at que um ddNTP seja incorporado.
Sendo assim, em cada uma das quatro reaes, haver fragmentos de todos os
tamanhos sendo que todos eles tem incio comum ou seja adjacente ao iniciador.
Uma vez terminadas as reaes de extenso, cada fragmento recm sintetizado
separado em gel desnaturante de poliacrilamida-uria e a seguir autoradiografado.
Como este tipo de gel tem alto poder de resoluo, possvel ento visualizar na
autoradiografia cada um dos fragmentos sintetizados como uma banda especfica. Desta
forma, possvel analizar de 200 a 300 nucleotdeos por gel (figura 33.).
56
 DNA
P rim e r

d d AT p d d C Tp d d G Tp d d TT p

A C G T

L e itura
C G A C TG A C TA G TG

S e q u n cia o b tid a

Figura 33. Sequenciamento de nucleotdeos pelo mtodo do trmino do crescimento da cadeia.

5.2 Sequenciamento automtico

A utilizao de sequenciadores automticos essencial quando deseja-se
realizar sequenciamneto em larga escala, como por exemplo em projetos genoma. O
desenvolvimento e utilizao de sequenciadores automticos torna mais efeciente e
rpido o sequenciamento de DNA na medida em que as etapas de leitura do gel e o
processamento de sequncias so realizadas atravs de computadores. A reao de
sequenciamento realizada atravs do mtodo de Sanger (1979), do mesmo modo que
no sequenciamento manual. Entretanto, no sequenciamento automtico os nucleotdeos
esto marcados com fluorocromos ao invs de istopos radioativos. Quatro diferentes
fluorocromos so empregados e uma vez excitados por um feixe de laser emitem luz em
57
diferentes comprimentos de onda. possvel marcar com estes fluorocromos o
primer universal M13 ou ento cada um dos dideoxinucleotdeos (terminadores).
Assim, uma vez que em cada uma das reaes (A, T, C, G) foi empregado um
fluorocromo diferente possvel juntar estes produtos e realizar a corrida em uma nica
raia do gel de sequenciamento. Os produtos da reao de sequenciamento, marcados
com os fluorocromos, ao serem submetidos a eletroforese passam pelo feixe de laser,
que promove a excitao dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluorocromos
detectada por um fotomultiplicador e a informao processada atravs de um
computador (Figura 34).

VI. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

A reao em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction), foi

idealizada em meados de 1980 e totalmente descrita em 1987.
A maior aplicao desta metodologia a possibilidade de se amplificar uma
determinada sequncia do DNA sem a necessidade do uso das tradicionais tcnicas de
clonagem molecular. Uma simples cpia de um gene especfico dentro de um genoma
pode ser amplificado para alguns microgramas, partindo-se de quantidades mnimas
como sub picogramas de DNA total. A condio bsica para a aplicao da tcnica,
depende da construo de oligonucleotdeos (iniciadores) os quais so complementares
as duas fitas opostas do DNA e que estejam flanqueando a sequncia a ser amplificada.
O processo inicia-se com a desnaturao da dupla fita do DNA que contm a
sequncia a ser amplificada. Geralmente, a desnaturao realizada a uma temperatura
de 94C durante 5 minutos, onde nesta temperatura as duas fitas do DNA separam-se.
O passo seguinte, consiste em abaixar a temperatura para nveis ao redor de 35
C, permitindo que os oligonucleotdeos iniciadores anelem-se especificamente nas
extremidades flanqueadas da sequncia alvo e nas fitas opostas. Finalmente, a
temperatura elevada para aproximadamente 72C e com isto a polimerase copia a
sequncia alvo a partir dos oligonucleotdeos iniciadores a fase de extenso.
Inicialmente, usou-se a DNA polimerase da Escherichia coli, cuja temperatura
tima de 37C. Ela era adicionada manualmente a cada ciclo porque o passo de
desnaturao a 94C inativava a enzima.

58
 DNA
P rim e r

d d AT p d d C Tp d d G Tp d d TT p

D e te ctor L a ser

S e q u ncia
co m p u ta d or

Figura 34. Sequenciamento automtico de DNA. As reaes com os diferentes

dideoxinucleotdeos so realizadas em um plasmdeo M13, no qual encontra-se clonado o
fragmento de DNA a ser sequenciado. Cada uma das misturas de reao contm o primer
universal M13 marcado com um fluorocromo diferente. Os produtos de reao so agrupados
e submetidos a eletroforese em uma nica raia de gel de sequenciamento, no sequenciador
automtico. A medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos so
excitados e a luz emitida detectada por um fotomultiplicador. Esta informao traduzida na
forma de sequncia atravs de um computador.

Como podemos ver, o processo basicamente ocorre em 3 fases: desnaturao,

anelamento e extenso, os quais, constituem um ciclo da reao de amplificao (Figura
35). Inicialmente, usou-se a DNA polimerase da Escherichia coli, cuja temperatura
tima de 37C. Ela era adicionada manualmente a cada ciclo porque o passo de
desnaturao a 94C inativava a enzima.

59
 A n e la m en to
D N A co m P R IM E R S
(34 C )

D e sn a tu ra o E xte n s o
do DNA co m P o lim e ra se
(94 C ) (72 C )

Figura 35. O ciclo do PCR

Um importante avano tcnico no processo surgiu com a descoberta da Taq

polimerase (Sarki et al, 1988) oriunda da bactria Thermus aquaticus a qual vive em
fontes de gua temperatura de 75C. A enzima tem uma temperatura tima de ao a
72C, mas permanece razoavelmente estvel mesmo a 94C e com isto, a enzima
adicionada uma nica vez. Devido a este fato, foi possvel a automatizao do processo
nos chamados termocicladores.
Alm da molcula do DNA, tambm o RNA pode ser amplificado desde que ele
seja primeiro convertido para cDNA atravs da transcrio reversa. Alm do principal
uso do PCR que o processo de amplificao de sequncias especficas, rapidamente
surgiram novas aplicaes para esta poderosa metodologia, tais como: sequenciamento
de nucleotdeos, anlise do polimorfismo, diagnstico de doenas genticas e
infecciosas e vrias outras aplicaes mais especficas durante o uso da metodologia do
DNA recombinante.

60
VII. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS

1. INTRODUO
A descoberta de promotores e repressores especficos do genoma de E. coli, de
uma variedade de vrus de E. coli e de clulas eucariticas permitiu a manipulao da
expresso de protenas e a clonagem de genes sob o controle de um dado promotor, cuja
expresso pode ser indutvel ou contnua. O primeiro, e mais comumente usado,
sistema de expresso de protenas heterlogas em E. coli baseado no operon lac
(Figura 36). Neste sistema, o DNA de interesse clonado em fago (no caso de
biblioteca de cDNA de expresso) ou plasmdeo contendo o lacI (repressor), lacP
(promotor) e lacZ (gene estrutural transcrito para mRNA da -galactosidase). A
induo da transcrio obtida pela adio de um anlogo de lactose sinttico e no
degradvel (isopropiltio--D-galactosdeo, IPTG), o qual se associa ao repressor e
inibe-o, deixando o promotor livre para a interao com a RNA polimerase e
consequente transcrio do gene.
O sistema mais comumente utilizado para expresso de protenas heterlogas o
que utiliza E. coli como clula hospedeira. Este sistema amplamente difundido
devido facilidade e baixo custo de se cultivar E. coli, e pela reprodutibilidade e
abundncia de protena que produz. Alm disso, modificaes nos vetores e linhagens
de E. coli so frequentemente feitas no sentido de aumentar a eficincia e versatilidade
do sistema original. Com isto, e com o advento de novos sistemas de expresso em
clulas de eucariotos (levedura, insetos, mamfero), a expresso de protenas clonadas
tornou-se uma abordagem poderosssima que vem revolucionando os estudos de
estrutura, funo, purificao e identificao de novas protenas. Nestes outros
sistemas, o recombinante a ser introduzido no hospedeiro alvo pode ser facilmente
construdo e amplificado em E. coli. Por isso os plasmdeos de levedura, mamfero, etc.
so construdos por fuso de uma poro de um plasmdeo de E. coli (origem de
replicao e resistncia a um antibitico) com seqncias especficas para se obter
expresso em clula eucaritica, conforme veremos adiante.

61
 G e ne estrutural

tra nscri o
G e ne estrutural

Figura 36. Esquema ilustrando o funcionamento do operon lac. (a) Na ausncia de indutor. (b) Na
presena de indutor.

2. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS EM E.COLI

O uso de E. coli para a obteno de protena em quantidade suficiente para o
estudo da estrutura e funo da mesma ou para aplicaes clnicas ou industriais hoje
disseminado e constitui-se em um marco na histria do nosso conhecimento de estrutura
de protenas.
Este tpico pretende sobretudo descrever os passos bsicos envolvidos na
construo de recombinantes e expresso, em bactria, de uma protena clonada.

2.1 Subclonagem em plasmdeos de expresso

O procedimento de clonagem de um fragmento de DNA para expresso
exatamente igual a qualquer clonagem, no entanto, deve se ter em mente que o

62
propsito ser obter a protena correta. Para tanto, necessrio respeitar o sinal de
traduo de genes procariticos (sinal de Shine-Dalgarno), em outras palavras, o DNA
deve ser clonado de maneira que sua fase de leitura correta fique em fase com o ATG
iniciador (Figura 37).
Alm disso, um vetor para expresso em E. coli deve apresentar as seguintes
caractersticas:
- origem de replicao
- marcador para seleo: gene que confere resistncia a antibiticos como ampicilina,
tetraciclina, cloranfenicol, neomicina. Ex. o gene da -lactamase que confere
resistncia a ampicilina.
- um promotor para transcrio: como os vetores de expresso so normalmente
projetados no sentido de produzir protena em abundncia, o DNA codificante para
uma dada protena deve ser colocado sob o comando de um promotor forte
(exemplos: lacZ, tac (trp+lacZ), -pR, -pL, p10 do bacterifago T7) e regulvel,
isto , contendo um repressor para manter os nves basais de expresso do gene
insignificantes at a induo, o que se faz geralmente por adio de IPTG, no caso
por ex. do repressor lacI, ou choque trmico, no caso do repressor cIts857.
- sinal de terminao da transcrio
- sequncias para controle da traduo, como por ex., um stio de ligao ao
ribossomo para a iniciao da traduo (Shine-Dalgarno) e um ATG iniciador. Um
sinal de terminao da traduo (cdon de terminao) tambm deve estar presente
no vetor ou no inserto a ser clonado, ou deve ser adicionado.
- um MSC para facilitar a insero do gene de interesse na orientao correta.
Uma vez construdo, o vetor de expresso contendo a sequncia codificadora da
protena de interesse introduzido em E.coli por transformao.
Ao planejar uma subclonagem para a expresso de protena, alm de se respeitar
a fase de leitura correta, deve-se tambm tentar a medida do possvel fazer a clonagem
unidirecional do inserto. Na clonagem unidirecional utilizam-se duas enzimas de
restrio para digerir o vetor e o DNA inserto. Na bidirecional utiliza-se uma nica
enzima, de modo que as pontas so iguais, permitindo a insero do fragmento em
ambas as orientaes. Assim, em uma clonagem bidirecional h 50% de probabilidade

63
de se obter os recombinantes na orientao correta (senso) e 50% na orientao
invertida (anti-senso).

2.2 Anlise dos plasmdeos e seleo dos subclones corretos

A anlise de DNA plasmidial para a seleo dos subclones corretos feita por
digesto com enzimas de restrio e confirmada por sequenciamento se julgar
necessrio. A anlise de restrio um procedimento bastante simples; entretanto deve
ser feito com cautela e ateno. Seu objetivo selecionar o clone recombinante correto
quanto ao tamanho do inserto e sua orientao.
Como regra a primeira digesto deve ser feita com a(s) enzima(s) utilizada(s)
para a clonagem; isto produzir dois fragmentos: plasmdeo linear + inserto, e permitir
avaliar se os stios de clonagem foram recuperados intactos. Se a ligao for realizada
entre extremidades cegas, preenchidas pela ao da Klenow polimerase, verifica-se em
um catlogo de enzimas de restrio se haver a formao de um novo stio, o qual
poder ser clivado para anlise. Outra alternativa consiste em clivar em stios prximos
ao da clonagem em ambas as extremidades.
A segunda digesto, no caso da clonagem bidirecional, deve ser planejada para
determinar a orientao do inserto. Deve-se escolher um stio nico e no centralizado
no inserto e um stio no MSC que seja ausente no inserto, produzindo de preferncia
dois fragmentos de tamanhos facilmente distingveis no gel. Calcular previamente o
tamanho dos fragmentos esperados para ambas as orientaes. A digesto completa
fundamental para a correta interpretao dos resultados. A Figura 38 esquematiza um
projeto de subclonagem de um gene e a anlise de restrio dos subclones obtidos com
o objetivo de: a) selecionar os recombinantes, b) selecionar o recombinante correto.

64
Figura 37. Procedimentos para clonagem de um fragmento de DNA em fase de leitura correta
em um plasmdeo de expresso.

65
 1 kb H in dIII
BamHI Bam HI
H in dIII
In se rto sen so

Bam HI BamHI
P P R e co m bina nte
In ve rtido H in dIII
R e co m bina nte H in d III (a nti-sen so )
E spe ra do
(sen so)

3 kb

M SC

Nota : Os clones 1 e 2 foram digeridos com BamHI e Hind III, separadamente.

Responda: Qual dos dois clones tem o inserto na orientao correta (senso) para a
expresso da protena?

Figura 38- Subclonagem de um fragmento de DNA em plasmdeo de expresso e anlise

de restrio de dois recombinantes obtidos.

66
3. PRODUO DE PROTENAS HETERLOGAS EM E. COLI

3.1. Produo de protenas hbridas

De maneira ideal, quando se pensa em expresso heterloga, espera-se que a
protena de interesse seja estvel, no txica para a bactria, solvel, produzida em
grande quantidade e possa ser facilmente purificada. Um procedimento muito utilizado
o de expressar a protena de interesse em fuso com um tag especfico que permita a
fcil purificao da mesma atravs de cromatografia por afinidade em resinas s quais
se encontram acopladas ligantes, aos quais o tag possa se ligar especificamente. Uma
outra vantagem bvia de se produzir uma protena hbrida, ou de fuso, no caso da
expresso de polipeptdeos pequenos ou mesmo peptdeos, os quais, sem fuso, seriam
instveis e rapidamente degradados na clula.
Em geral projeta-se ainda um stio sensvel a uma determinada protease (ex: fator
Xa, trombina), inserido imediatamente acima do stio de clonagem, de maneira que a
protena hbrida possa ser clivada liberando a protena clonada que pode ento ser
facilmente purificada utilizando-se a mesma coluna de afinidade. A coluna reter a
protena de fuso e eliminar no "void" a protena de interesse. Um exemplo de
protena hbrida obtida por clonagem no vetor pMAL dado na Figura 39.
O procedimento de protelise relativamente trabalhoso e nem sempre eficiente,
por isso quando a protena de fuso no interfere se utiliza a prpria protena hbrida,
por exemplo, para experimentos funcionais, produo de anticorpos, etc. Note que
neste caso pode ser estratgico ter o mesmo DNA clonado em dois sistemas de fuso
diferentes. Isto permitir que anticorpos produzidos contra uma protena hbrida sejam
purificados por afinidade contra a outra, purificando-se assim apenas anticorpos cujos
epitopos localizam-se na protena clonada.
Dentre os vetores utilizados com sucesso para a produo de protenas hbridas
podemos citar:
- pGEX: apresenta a glutationa-S-transferase de Schistosoma japonicum (26 kDa)
como protena de fuso, permitindo a purificao da protena de fuso em coluna de
agarose-glutationa
- pMAL: apresenta a protena ligante de maltose (PLM) de bactria (42 kDa) como
fuso, permitindo a purificao da protena de fuso em coluna com amilose
acoplada

67
- pQE: apresenta um tag de 6 resduos de histidina como fuso e permite a
purificao das protenas de fuso em colunas quelantes de Ni2+
- pUR: cuja fuso um fragmento da -galactosidase

(b)
(a)

C LON A G EM

pM ALc

E XP R E SS O
(IN D U O ) PLM

P ro te in a d e
inte re ss e

P U R IF IC A O
POR
A F IN ID A D E
Figura 39- a) Esquema ilustrando os
passos para a expresso, purificao e
L a va g e m E lu o
clivagem de uma protena de fuso. b)
Gel de poliacrilamida-SDS de fraes da
purificao da protena de fuso PLM-
F a to r X a
C L IVA G E M
(p rote lis e ) paramiosina. Em A so mostrados os
extratos de clulas no induzidas (1) e de
clulas induzidas (2). Em B, protena de
fuso PLM-paramiosina aps eluio da
coluna de amilose por adio de maltose
R e tid a
S e p ara o (1), aps clivagem por fator Xa (2) e
frao coletada no "void"aps passagem
E lim in a d a
na coluna para a reteno da PLM (3).

A produo de protenas hbridas geralmente muito simples, eficiente e de

baixo custo financeiro, podendo suprir de imediato necessidades da pesquisa bsica,
tais como, produo de anticorpos e purificao destes por afinidade, sondas em
experimentos variados e para estudos funcionais/estruturais da protena expressa.
Permite, tambm, a expresso em grande escala, para fins industriais ou clnicos de
enzimas, hormnios, anticorpos, etc., quando a atividade da protena preservada.
Alm disto, possvel se obter, por mutagnese, protena com a atividade de interesse
potenciada e livre de efeitos adversos ou atividades indesejadas.
68
 importante estar alerta de que a situao ideal exposta acima nem sempre
atingida. Na realidade, na grande maioria das vezes, protenas de eucarioto produzidas
em bactria no so solveis; s vezes podem ser txicas para a clula; algumas so
expressas em baixos nveis; algumas interferem com a sua fuso inibindo-a de se ligar
resina de afinidade e tornando a purificao menos eficiente; outras formam agregados
extremamente insolveis mesmo na presena de SDS/-mercaptoetanol; algumas tm a
sua atividade biolgica plenamente recuperada, porm outras so inativas.
Assim, dentre os problemas mais comuns que ocorrem com a produo de
protenas heterlogas em E. coli, podemos citar:
- Protenas txicas: algumas protenas so txicas para a clula hospedeira. Neste
caso, pode-se proceder a secreo. Uma alternativa produo de protena
citoplasmtica, a produo de protenas que so secretadas. Para tanto basta
clonar o DNA codificante em fuso com uma seqncia codificante para um
peptdeo sinal de procarioto. Este peptdeo clivado pela peptidase sinal quando a
protena secretada para o periplasma. Embora este mtodo freqentemente traga
problemas com o rendimento ou a clivagem do peptdeo sinal, h vantagens em
alguns casos: no caso de protenas txicas para a bactria; algumas protenas
degradadas por protease no citoplasma so estveis no periplasma; algumas que so
inativas quando produzidas intracelularmente so ativas quando secretadas; a
protena produzida j tem a sua metionina N-terminal processada. Um exemplo de
sucesso a expresso do hormnio fator de crescimento epidermal humano (hEGF)
sob o comando do promotor da fosfatase alcalina (phoA) e com a seqncia sinal
desta. A induo obtida sob privao de fosfato do meio.
- Protenas instveis: isto pode ser resolvido reduzindo-se a temperatura de
crescimento ou mudando-se para uma linhagem de bactria deficiente em uma ou
mais proteases. Mesmo assim comum se obter algum nvel de fragmentao da
protena expressa (ver Fig. 39 b, raia 1).
- Baixos nveis de expresso: pode ocorrer pelas razes acima dentre outras, como,
por exemplo, instabilidade do mRNA, trmino prematuro da mensagem, traduo
ineficiente.
- Protenas insolveis: protenas de eucariotos produzidas em bactria so geralmente
precipitadas na forma de corpos de incluso e requerem procedimentos adicionais de

69
 desnaturao para solubiliz-las e de renaturao para mant-las solveis e
funcionais. Isto nem sempre um problema, pois a formao de corpos de incluso
pode proteger a protena contra a degradao por proteases bacterianas e tambm
facilitar a purificao, uma vez que so corpos densos, precipitados baixa
velocidade de centrifugao, enquanto a maior parte das protenas bacterianas
permanecem no sobrenadante. Mas algumas vezes no se consegue renaturao
adequada da protena purificada. Neste caso deve-se tentar atenuar a formao de
corpos de incluso alterando as condies de expresso, por exemplo, crescendo-se
a cultura a temperatura mais baixa aps a induo ou utilizando um promotor mais
fraco.

3.2. Produo de protenas intactas

A vantagem de se produzir protena intacta sem fuso que ela poder ser
utilizada sem a preocupao de que o segmento de fuso esteja interferindo em sua
estrutura e atividade. A principal desvantagem que nem sempre se encontra um
mtodo eficaz para a purificao da mesma. Contudo h exemplos demonstrando que
para estudos funcionais e de estrutura prefervel investir na produo de protena
intacta.
Vrios vetores encontram-se disponveis no mercado para a expresso de
protenas sem fuso em E.coli. Os mais referidos so da srie pET (plasmid for
expression by T7 RNA polimerase), cuja expresso est sob o controle do promotor de
transcrio 10 e dos sinais de iniciao de traduo s10 da protena do gene 10 (a
principal protena do capsdeo) do bacterifago T7. A grande vantagem deste vetor
que ele transcrito pela T7 RNA polimerase, a qual muito seletiva e ativa, sendo
capaz de elongar cadeias de RNA aproximadamente 5 vezes mais rpido que a RNA
polimerase de E. coli. Alguns vetores da srie pET apresentam o promotor T7-lac,
colocando a expresso da protena sob o controle lac e reduzindo portanto o background
de expresso da protena alvo na ausncia de IPTG.

4. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS EM ORGANISMOS

EUCARIOTOS

Ao se escolher um sistema de expresso, deve-se sempre considerar a aplicao

final da protena a ser expressa. Embora o sistema de expresso de protenas

70
heterlogas em E. coli seja bastante difundido, no caso de protenas eucariticas
complexas torna-se, as vezes, necessrio lanar-se mo de sistemas de expresso em
clulas eucariticas para se produzir protenas na sua forma nativa, pois estes sistemas
permitem modificaes ps-traducionais essenciais para a funo de determinadas
protenas, como, por exemplo, glicosilao. Consideraremos alguns destes sistemas a
seguir.

4.1. Expresso em clulas de mamferos

Os vetores para expresso em mamferos contm sequncias para facilitar a
propagao em bactria (origem de replicao e um marcador para seleo), bem como
seqncias especficas para se obter expresso em clulas eucariticas.
Assim, um vetor para expresso em clulas de mamferos deve apresentar as
seguintes caractersticas:
- origem de replicao para clulas eucariticas: por exemplo a do vrus SV40
- promotor: como, por exemplo, do SV40 ou do citomegalovrus (CMV). Existem
tambm vetores com promotores induzveis como, por exemplo, o da tetraciclina e o
responsivo ecdisona.
- sinais para o trmino da transcrio e para a poliadenilao do transcrito
- marcador para seleo: como por exemplo o gene que codifica a aminoglicosdeo
fosfotransferase, conferindo resistncia geneticina (um anlogo de neomicina).
- sequncia para ligao ao ribossomo (sequncia de Kozak)
Os sistemas de expresso em clulas de mamferos podem ser divididos em dois
tipos: a) aqueles envolvendo expresso transitria da protena em questo (1-4 dias aps
a introduo do DNA); b) aqueles envolvendo a expresso estvel e que requerem,
portanto, a integrao do gene no DNA cromossmico.

4.2 Expresso em fungos

Fungos so eucariotos unicelulares potencialmente capazes de realizar todas as
modificaes ps-traducionais observadas em clulas de mamferos. A facilidade de
cultivo em larga escala e o fato de S. cerevisiae ser um microrganismo seguro,
legalmente usado na indstria de alimentos e farmacutica, so caractersticas
adicionais que tornam a expresso heterloga de protenas neste sistema
particularmente atrativa e com perpectivas para uso, por exemplo, no desenvolvimento

71
de vacinas orais atravs da imobilizao de antgenos na superfcie deste
microrganismo. Exemplos da expresso de protenas heterlogas em fungos encontram-
se descritos nos tens 7.1.2 e 7.2.

5. SISTEMA DE EXPRESSO EM CLULAS DE INSETO UTILIZANDO

BACULOVRUS COMO VETOR
um dos sistemas de expresso em clulas eucariticas mais poderosos e
versteis.
O genoma do Baculovrus muito grande para permitir a insero direta de
genes heterlogos; por isso, estes so clonados em vetores de transferncia, os quais
contm sequncias flanqueadoras que so homlogas (5 e 3 ao inserto desejado) ao
genoma do Baculovrus. Procede-se, ento, co-transfeco do vetor de transferncia
contendo o gene de interesse clonado e do DNA linearizado do vrus Autographa
californica (AcNPV) em clulas do inseto Spodoptera frugiperda (Sf). Nestas clulas
ocorre recombinao homloga, com transferncia do gene heterlogo do vetor para o
DNA do AcNPV. A infeco das clulas Sf com o DNA do vrus resulta na parada
total da expresso das protenas do hospedeiro, permitindo alta produo do mRNA e
da protena recombinantes.
Uma variedade de vetores de transferncia foram construdos para utilizao
neste sistema. Cada vetor contem :
- uma origem de replicao de E.coli
- um marcador de resistncia ampicilina
- o promotor da polihedrina ou da p10 (protenas do baculovrus): promotores fortes.
- um MSC para permitir insero do gene de interesse
- sequncias flanqueadoras pertencentes ao genoma do vrus para facilitar a
recombinao homloga
Vantagens deste sistema de expresso:
- Modificaes ps-traducionais
- Obteno de protenas solveis e funcionalmente ativas
- Altssimos nveis de expresso
- Capacidade para grandes insertos

72
- Expresso simultnea de vrios genes: vrios plasmdeos com promotores mltiplos
encontram-se disponveis comercialmente, permitindo a expresso de duas ou mais
protenas numa nica clula infectada.
- Facilidade de purificao: vetores apresentando tags de 6xHis e GST permitem a
purificao por afinidade das protenas recombinantes.
- Facilidade de monitoramento da expresso: vetores Biocolors permitem a obteno
da protena de interesse em fuso com GFP (green), BFP (blue) ou YFP (yellow),
permitindo o monitoramento da expresso sem a necessidade da utilizao de
anticorpos.

6. EXPRESSO EM CLULAS DE Drosophila

Combina algumas das melhores caractersticas dos sistemas de expresso em
clulas de mamfero com aqueles em clulas de insetos utilizando baculovrus. um
sistema mais barato e eficiente que expresso em clulas de mamferos e mais rpido
que expresso utilizando baculovrus.
Este sistema utiliza vetores plasmidiais para expresso transitria ou estvel da
protena de interesse. Encontram-se disponveis comercialmente vetores para
expresso: a) constitutiva (promotor da actina), b)induzvel (promotor da
metalotionena, expresso induzida pela adio de cobre ou cdmio) e c) indzivel e
com secreo da protena para o meio. Todos os vetores apresentam tags de 6xHis no
C-terminal, facilitando a purificao por afinidade da protena de interesse.

7. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS - APLICAES E

PERSPECTIVAS

7.1- Bibliotecas de expresso e identificao de novas protenas atravs de anticorpos ou

outros ligantes especficos

7.1.1- Sistema convencional - expresso de biblioteca de cDNA em E. coli

Vocs j viram em captulos anteriores que uma biblioteca de cDNA pode ser
construda em vetor de expresso (fago ou plasmdeo). Para essa finalidade, um dos
vetores mais utilizados atualmente, pela sua versatilidade, o ZAP e o hospedeiro

73
mais usado E. coli. Quando se clona um dado fragmento de DNA pode-se planejar
previamente se deseja-se uma clonagem uni ou bidirecional. Quando se sintetiza uma
biblioteca de expresso usual que se opte pela clonagem unidirecional. Para isso
basta digerir o vetor com duas enzimas que geram pontas incompatveis e preparar o
inserto com adaptadores que geram pontas compatveis com as do vetor, de tal maneira
que a orientao seja a correta (fita sense, sentido 5'3', a partir do promotor) para a
expresso de protena. A biblioteca amplificada como qualquer outra e a expresso de
protena induzida pela adio de IPTG; uma rplica da placa de gar contendo as
placas de lise obtida em um filtro de nitrocelulose colocado sobre a mesma por um
certo tempo para que as protenas sejam aderidas. Este filtro em seguida tratado como
em um Western blot para a deteco de protena, com anticorpo ou um outro ligante
especfico para a protena de interesse. O sistema ZAP interessante porque aps o
isolamento do clone o fagomdeo pode ser facilmente obtido por exciso in vivo por co-
infeco com fago filamentoso auxiliar (Figura 40).

A protena clonada pode ento ser expressa e suas propriedades estudadas,

inclusive pode ser prontamente purificada para a injeo em coelhos a fim de gerar
anticorpos. Estes podem ser usados como contra-prova da clonagem e como sondas
importantssimas para diagnstico, imunocitoqumica, etc. H tambm a possibilidade
de se construir a biblioteca em um ZAP modificado que contm o promotor de
citomegalovrus (CMV) e outros elementos necessrios para a expresso do gene
clonado em clulas eucariticas.

7.1.2- Novos sistemas para a deteco de receptores ou protenas ligantes

A identificao de molculas que interagem com uma dada protena, isto

peptdeos ligantes, protenas ligantes ou receptores, fundamental para o mapeamento
da via de ao de uma dada protena na clula. O sistema convencional de "screening"
(seleo) descrito acima pode ser utilizado. Mas, novos sistemas comeam a aparecer
com o objetivo de selecionar ligantes ou anticorpos. Um destes a clonagem do DNA
(biblioteca de cDNA comum ou bibliotecas combinatoriais de peptdeos sintticos) em
fuso com uma protena que forma a capa do fago lambda (Felici et al., 1991).

74
Figura 40 Esquema do fago ZAP, isolamento do clone e exciso do fagemdeo pBluescript
por coinfeco com fago filamentoso auxiliar.

Isto tem permitido isolar ligantes de uma biblioteca complexa por passagem das
partculas de fago sobre determinado ligante especfico imobilizado em uma matriz.
Uma evoluo deste sistema que parece ser promissora a clonagem da biblioteca de
cDNA de interesse em fuso com uma protena da parede bacteriana, de tal maneira que
as protenas expressas ficaro expostas recobrindo a superfcie da bactria, a qual
poder ento ser incubada com um ligante marcado por fluorescncia que marcar
aquela clula que expressar o receptor ou ligante especfico. A clula marcada poder,
ento, ser selecionada (isolada) por um aparelho de seleo de clulas, "Fluorescent
75
Assisted Cell Sorters", comumente referido como FACS. Para a anlise de milhes de
bactrias, entretanto, ser necessrio o desenvonvimento de FACS mais sofisticados. A
Figura 41 exemplifica esquematicamente uma protena (anticorpo, neste caso) expressa
na superfcie de uma bactria (Little et al., 1993). Este sistema tem sido considerado
promissor para a produo de vacinas orais e kits para diagnstico.

cadeia Poro
pesada varivel
conector do
cadeia anticorpo
leve

m em brana
externa
PAL
PAREDE
CELULAR

m em brana
externa
gene que
codifica para citoplasm a
o anticorpo

Figura 41- Esquema ilustrando a apresentao na superfcie bacteriana de uma protena

heterloga expressa em fuso com uma protena da parede bacteriana. Este caso demonstra a
expresso dos domnios variveis de um anticorpo unidos por um peptdeo "conector" em
fuso com a lipoprotena associada a peptdeoglicano (PAL). Foi projetado para preservar a
conformao nativa da regio varivel do anticorpo de maneira a manter suas propriedades
ligantes intactas.

Alm dos exemplos citados acima, o "sistema de dois hbridos" (Fields & Song,
1989), para expresso em levedura, tem sido bastante utilizado para a deteco e
identificao de protenas capazes de interagir com uma determinada protena (Figura
42). Neste sistema dois plasmdeos so construdos para posterior co-transfeco e
expresso dos hbridos. O primeiro hbrido (isca) a protena conhecida (x) em fuso
com o domnio ligante de DNA do fator de transcrio GAL4; o segundo so genes
desconhecidos de uma biblioteca de um determinado tecido ou espcie (protena y) em
fuso com o domnio da GAL4 ativador da transcrio. um processo engenhoso, cuja
lgica baseia-se no fato de que a GAL4, como a maioria dos fatores de transcrio,
uma protena com dois domnios bem definidos (um ligante de DNA e o outro ativador

76
da maquinaria de transcrio), ambos indispensveis para o efeito final de ativao da
transcrio de genes situados sob seu controle (controle do promotor GAL). Quando se
expressa estes domnios separadamente, a protena ser inativa, exceto se os dois
polipeptdeos se associarem de tal maneira que encontrar-se-o juntos na regio
promotora para exercerem seu papel de ativao da transcrio. Quando se expressam
estes hbridos em uma linhagem de levedura, cujo determinado gene marcador de
seleco est sob o comando de GAL4 e, cultivam-se as clulas na ausncia de um
nutriente essencial sintetizado pelo gene marcador, a ativao deste gene torna-se
essencial para a sobrevivncia das clulas. Um gene comumente utilizado como
marcador de seleo neste sistema o HIS3, cujo produto uma enzima da via de
biossntese de histidina; neste caso, as clulas so capazes de crescer em meio com
histidina, mas so incapazes na sua ausncia, a menos que a transcrio do gene HIS3
seja ativada pelo fator GAL4 reconstitudo (ativo). Isto significa que no interior das
clulas que sobreviveram encontram-se dois hbridos que formam um complexo; isto ,
a protena conhecida x interage com uma protena desconhecida y, a qual pode ser ento
identificada por sequenciamento de seu cDNA e caracterizada. Merece destaque o
fato de que a interao entre as protenas x e y, por este processo, ocorre no interior
de uma clula eucaritica viva, sendo, por isso, provavelmente mais confivel que
outros mtodos utilizados para o estudo de interaes entre protenas.

7.2. A utilizao da tecnologia do DNA recombinante no conhecimento de

receptores de membrana

Para informaes especficas em clonagem de receptores de superfcie celular,

incluindo abordagens que visam descobrir ou projetar novas drogas efetivas
direcionadas a esses receptores, consulte a reviso de Luyten & Leysen (1993). Estes
autores enfatizam que a expresso heterloga de receptores clonados proporciona uma
fonte rica, reprodutvel, inexaurvel e barata de subtipos de receptores humanos. Esses
receptores expressos podem ser utilizados no screening de drogas e tambm para o
design de novas drogas atravs de um melhor entendimento da relao estrutura-
funo, visto que a clonagem molecular desses receptores revelou uma abundncia de
subtipos, bem como modelos estruturais dos mesmos (Figura 43)

77
 (a)
G A L4 nativa

Transcrio

(b) G ene H IS 3
H brido com dom nio ligante de D N A da G A L4

(c) G ene H IS 3
H brido com dom nio da G AL4 ativador da transcrio

(d) Interao entre hbridos reconstituindo a atividade da G AL4 G ene H IS 3

X Y
transcrio

G ene H IS 3
Figura 42 Estratgia para detectar protenas ligantes utilizando o sistema de dois hbridos.

Agora, uma nova era pode ter lugar, em que as drogas comeam a ser projetadas
e construdas com base na estrutura de seu alvo no organismo (Bugg et al., 1994).
Exemplos da utilizao da tecnologia do DNA recombinante neste caso incluem
a expresso heterloga de receptores acoplados a protena G nos fungos Saccharomyces
cerevisae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris, visando estudos estruturais e
funcionais. Clulas de S. cerevisiae expressando o receptor de somatostatina de rato
foram usadas com sucesso no screening de anlogos de somatostatina e bibliotecas
combinatoriais para identificar agonistas e antagonistas seletivos para subtipos com
potentes efeitos in vivo (M. H. Pausch, 1997).

78
Figura 43- Modelos estruturais de famlias de receptores de superfcie celular. Os domnios
trans-membrana e alguns domnios funcionais so representados. O enrolamento da cadeia
proteica hipottico, pois o nico que teve sua estrutura determinada por cristalografia at o
momento foi o domnio extracelular do receptor de hormnio de crescimento.

7.3. Expresso de protenas para interveno teraputica

Podemos dizer que h duas maneiras gerais de se fazer teraputica por expresso
de protenas:
a) a expresso heterloga de uma protena humana em bactria ou clula
eucaritica para a produo em grande escala, purificao e utilizao desta para
injeo em pacientes: o exemplo mais conhecido provavelmente o da insulina
(Bristow, 1993), a qual foi o primeiro produto comercial obtido pela tecnologia do
DNA recombinante e aprovado para uso em humanos em 1982 pela U. S. FDA (Food
and Drug Administration). A Figura 44 mostra as estratgias empregadas para a

79
produo de insulina para fins teraputicos; a bovina e a suna sem modificaes
qumicas so menos eficientes. A insulina produzida pela tecnologia do DNA
recombinante apresenta a vantagem de eliminar a possibilidade de contaminantes ou
agentes infecciosos que podem estar presentes nas protenas purificadas de animais.
Uma das maiores expectativas neste campo a possibilidade de se obter mutantes com
atividade muito superior ao da protena nativa e sem certos efeitos adversos. Outros
exemplos de produtos obtidos pela tecnologia do DNA recombinante e utilizados com
finalidade teraputica so o anticoagulante TPA (ativador de plasminognio tipo
tecidual), o fator VIII de coagulao e a eritropoietina (hormnio que estimula a
produo de eritrcitos).
A determinao e caracterizao refinada da estrutura de protenas comea a
ganhar maior impacto pela possibilidade de expresso/purificao de protena em larga
escala e mutagenisadas. Alm de nos proporcionar a satisfao de se conhecer uma
nova estrutura, esse conhecimento nos permite projetar drogas e pensar em outras
estratgias teraputicas, tais como, expressar apenas um domnio ativo da protena.

E.coli E.coli E.coli levedura

cadeia A cadeia B Pr-insu lina Precurssor

Hum ana de insulina

Insulina suna
s s s s s s
A s s
A A s s s s
A
pncreas pncreas s s s s s s
bovino suno B Ala B B B

s s s s s s s s s s s s
A s s
A s s
A s s
A s s
A s s
A s s
s s s s s s s s s s s s
B B B Thr B B B

Insulina bovina Insulina suina Insulina humana Insulina humana Insulina humana Insulina humana
(e mp) (crb) (prb) (pry )

Figura 44- Representao esquemtica de estratgias usadas para produzir insulina para fins
teraputicos.

80
 Por exemplo, os domnios variveis de anticorpos podem ser expressos como
uma nica cadeia polipeptdica ativa. Pode-se pensar tambm na expresso de
receptores solveis (ou domnios ativos destes) para um dado vrus, no sentido de inibir
a sua interao com o receptor da clula; um exemplo seria a expresso do receptor
CD4 para o vrus da AIDS. Uma idia espetacular que comea a emergir a partir do
nosso conhecimento da estrutura atmica e funo de fatores de transcrio, a
possibilidade da sntese de drogas que inibiriam ou ativariam especificamente um dado
fator de transcrio (Figura 45).

D om nio de ativ a o D roga in ibe

dom nio de

ativa o

D om nio
de
dim eriza o
D om nio de
liga o ao
D NA

DNA

D roga in ibe
dom nio de D roga in ibe
liga o ao
D NA dom nio de

dim eriza o

Figura 45 Modelos hipotticos da ao de drogas que poderiam ser efetivas em teraputica

atuando sobre um fator de transcrio

Um outro exemplo da potencial aplicao da expresso de protenas heterlogas

em interveno teraputica seria a produo de grandes quantidades de anticorpos em
plantas, visando seu uso em imunoterapia. As plantas so capazes de sintetizar e

81
montar virtualmente qualquer tipo de molcula de anticorpo, desde fragmentos at
cadeias completas e mesmo anticorpos multimricos. Ma & Ben (1995) descreveram a
expresso e montagem em plantas da molcula de IgA, que a forma predominante de
imunoglobulina em secrees de superfcies mucosas como o trato grastrointestinal.
At ento a produo de IgA em sistemas heterlogos tinha sido frustante devido a
complexidade desta molcula. Anticorpos produzidos em plantas podem vir a ser
particularmente teis para imunoterapia tpica. No caso, por exemplo, de cries, Ma et
al. (1990) mostraram que a aplicao tpica de anticorpos monoclonais contra uma
protena da superfcie (de adeso) do Streptococcus mutans em dentes humanos
conferiu proteo a longo prazo contra esse microrganismo em adultos.

b) a terapia gnica por transfeco de clulas retiradas do prprio paciente com

retrovrus, ou outros tipos de vrus, com o intuito de repor um gene mutante ou para o
tratamento de doenas multi-fatoriais como cncer e doenas cardacas. A primeira
terapia gnica realizada para substituir um gene mutante nico, iniciada em 1990, foi a
terapia para a deficincia da adenosina desaminase (ADA), a qual consiste em implantar
linfcitos T transfectados com retrovrus expressando a protena ausente nos portadores
desta doena. Esta tem sido considerada o prottipo das terapias gnicas e tem sido
bem sucedida (ver o artigo de F. Watson, 1993).

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Bristow, A.F. Recombinant-DNA-derived insulin analogues as potentially useful therapeutic

agents. Trends in Biotechnology 11: 301-305, 1993.

Bugg, C.E., Carson, W.M., and Montgomery, J.A. Drugs by Design. Scientific American
269: 60-66, 1994.

Felici, F., Castagnoli, L., Musacchio, A., Jappelli, R. and Cesareni, G. J. Mol. Biol. 222:
301-310, 1991.

Fields, S., and Song, O. Novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature
340: 245-246, 1989.

Little, M., Fuchs, P., Breitling, F., and Dbel, S. Bacterial surface presentation of proteins
and peptides: an alternative to phage technology? Trends in Biotechnology 11: 3-5, 1993.

82
Luyten, W.H.M.L., and Leysen, J.E. Receptor cloning and heterologous expression--
towards a new tool for drug discovery. Trends in Biotechnology, 11:247-254, 1993.

Ma, J. K-C., and Hein, M. B. Immunotherapeutic potential of antibodies produced in plants.

Trends in Biotechnology 13: 522-527, 1995.

Ma, J. K-C., Hunjan, M., Smith, R., Kelly, C., and Lehner, T. An investigation into the
mechanism of protection by local passive immunization with monoclonal antibodies against
Streptococcus mutans. Infection and Immunity 58: 3407-3414, 1990.

Monaco, A.P. AND Larin, Z. YACS, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as
research tools. Trends in Biotechnology 12: 280-86, 1994

Pausch, M. H. G-protein-coupled receptors in S. cerevisae: high-throughput screening assays

for drug discovery. Trends in Biotechnology 15: 487-494, 1997.

Sambrook, J.; E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Watson, F. Human gene therapy-progress on all fronts. Trends in Biotechnology 11: 114-117,
1993.

83
 NDICE
I. CONCEITOS BSICOS............................................................................................................................... 1
1. INTRODUO ............................................................................................................................................... 1
2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR ......................................................................................................... 1
3. ENZIMAS DE RESTRIO............................................................................................................................... 2
4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE ....................................................................................................... 5
5. DNA LIGASE ............................................................................................................................................... 7
Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA ligase ................................................................... 7
a) Fragmentos com extremidades coesivas ............................................................................................................... 7
b) Fragmentos com extremidade no coesivas .......................................................................................................... 7
6. TRANSFORMAO BACTERIANA .................................................................................................................. 10
6.1.Conceito de transformao induzida ................................................................................................... 10
6.2. Mecanismos de captao do DNA ...................................................................................................... 10
II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR ......................................................................................... 11
1. PLASMDEO ........................................................................................................................................... 12
2. FAGOS .................................................................................................................................................... 13
2.1 Biologia do fago .............................................................................................................................. 13
2.2 Genoma do fago ............................................................................................................................... 14
2.3 Controle de expresso dos genes do fago ......................................................................................... 15
2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecular. .......................................................................... 16
3. COSMDEO ............................................................................................................................................. 18
4. VRUS...................................................................................................................................................... 20
4.1. Clonagem no vrus SV40 .................................................................................................................... 21
4.2.Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia ........................................................................ 21
4.3. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce .................................................................... 23
5. BACTERIFAGO M13 ........................................................................................................................... 24
5.1. Clonagem no bacterifago M13 ......................................................................................................... 25
5.2. Estratgia de clonagem em vetores da srie M13mp. ......................................................................... 26
6. FAGEMDEOS ........................................................................................................................................ 26
6.1. Clonagem no fagemdeo..................................................................................................................... 27
7. VETORES PARA TRANSFORMAO DE LEVEDURAS..................................................................... 28
III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE......................................... 32
1. BIBLIOTECA DE CDNA............................................................................................................................... 33
1.1. Sntese de cDNAs de fita dupla .......................................................................................................... 35
1.2. Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor................................................................................. 35
2. BIBLIOTECA GENMICA.............................................................................................................................. 38
2.1. Preparo do DNA inserto .................................................................................................................... 39
2.2. Vetores utilizados na construo de biblioteca genmica................................................................... 42
IV. DETECO E ANLISE DO CLONE RECOMBINANTE ................................................................ 43
4.1. Quando o gene de interesse expresso no hospedeiro........................................................................ 45
4.2 O uso de sondas moleculares de cidos nucleicos para identificar o gene de interesse ....................... 46
4.3 Anlise do DNA e RNA por eletroforese em gel e blotting. ............................................................. 53
4.4 Como os genes clonados so utilizados? ............................................................................................. 54
4.5. Mapa de restrio.............................................................................................................................. 55
V. SEQENCIAMENTO DE DNA ............................................................................................................... 56
5.1 Sequenciamento manual..................................................................................................................... 56
5.2 Sequenciamento automtico............................................................................................................... 57
VI. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)............................................................................... 58

VII. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS .......................................................................... 61

1. INTRODUO ............................................................................................................................................ 61
2. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS EM E.COLI .................................................................................. 62
2.1 Subclonagem em plasmdeos de expresso .......................................................................................... 62

84
 2.2 Anlise dos plasmdeos e seleo dos subclones corretos.................................................................... 64
3. PRODUO DE PROTENAS HETERLOGAS EM E. COLI .................................................................................. 67
3.1. Produo de protenas hbridas ......................................................................................................... 67
3.2. Produo de protenas intactas........................................................................................................ 70
4. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS EM ORGANISMOS EUCARIOTOS...................................................... 70
4.1. Expresso em clulas de mamferos ................................................................................................. 71
4.2 Expresso em fungos......................................................................................................................... 71
5. SISTEMA DE EXPRESSO EM CLULAS DE INSETO UTILIZANDO BACULOVRUS COMO VETOR ............................ 72
6. EXPRESSO EM CLULAS DE DROSOPHILA .................................................................................................... 73
7. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS - APLICAES E PERSPECTIVAS......................... 73
7.1- bibliotecas de expresso e identificao de novas protenas atravs de anticorpos ou outros ligantes
especficos ................................................................................................................................................ 73
7.1.1- Sistema convencional - expresso de biblioteca de cDNA em E. coli .............................................. 73
7.1.2- Novos sistemas para a deteco de receptores ou protenas ligantes .............................................. 74
7.2. A UTILIZAO DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE NO CONHECIMENTO DE RECEPTORES DE MEMBRANA
..................................................................................................................................................................... 77
7.3. Expresso de protenas para interveno teraputica ....................................................................... 79
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................................................... 82

85