Você está na página 1de 8

2017 Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research, 5 (2), 106-113, 2017

ISSN 0719-4250
http://jppres.com/jppres

Original Article | Artculo Original

Validacin de una tcnica por cromatografa lquida de alta resolucin para


la determinacin de isoflavonas totales
[Validation of a technique by high-performance liquid chromatography for the determination of total isoflavones]
Pilar A. Soledispa Caarte1, Migdalia Miranda Martnez1*, Viviana Garca Mir2
1Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad de Guayaquil. Ciudadela Universitaria Salvador Allende. Ave. Kennedy S/N y Av. Delta. Guayaquil. Ecuador.
2Universidad Tcnica de Machala. Av. Panamericana Km 5 1/2 Va a Pasaje. Machala. Ecuador.

*E-mail: migdalia.mirandam@ug.edu.ec

Abstract Resumen
Context: Isoflavones may act as selective regulators in the prevention of Contexto: Las isoflavonas funcionan como reguladores selectivos en la
various diseases. The most important source of isoflavones is the soy, prevencin de diversas enfermedades. La fuente ms importante es la soja
from which different phytotherapeutics are elaborated of use in de la que se elaboran diferentes fitoterpicos de uso en la poblacin
Ecuadorian population. However, its concentration varies depending on ecuatoriana. Sin embargo, su concentracin vara dependiendo de
several factors, therefore quality assessment need to be carried out diversos factores por ello es necesaria la evaluacin de la calidad a travs
through out several analytical methods. de diversos mtodos analticos.
Aims: To validate an analytical method by high precision liquid Objetivos: Validar un mtodo analtico por cromatografa lquida de alta
chromatography (HPLC) to quantify total isoflavones in herbal medicine. precisin (CLAR) para cuantificar isoflavonas totales en fitofrmacos.
Methods: To quantify isoflavones, it was used a brand liquid Mtodos: Para cuantificar se emple un cromatgrafo lquido con
chromatography with UV/VIS detector at 260 nm, C-18 column using detector UV/VIS a 260 nm, columna C-18 usando el mtodo isocrtico. La
isocratic method. The mobile phase was composed of 2% acetic acid: fase mvil fue cido actico 2%: acetonitrilo (75:25). La cuantificacin se
acetonitrile (75:25). The quantification was performed against reference realiz frente a estndar de referencia. Los parmetros para la validacin
standard. The parameters for the validation followed the established in siguieron lo establecido en la USP 33.
the USP 33. Resultados: El cromatograma present seis picos con elucin entre 1,557 y
Results: The chromatogram presented six peaks with elution between 18,913 min. La linealidad del sistema y el mtodo obtuvieron r2 igual a 0,98
1.557 and 18.913 min. The linearity of the system and the method got r2 y 0,99, respectivamente. Los coeficientes de variacin 1,5% en el estudio
equal to 0.98 and 0.99 respectively. The coefficients of variation 1.5% in de repetitividad y 2% en la precisin intermedia. La exactitud del modelo
the study of repetitiveness and 2% in intermediate precision. The lineal ajustado mostr r= 0,97 e intervalo de confianza del intercepto
accuracy of the adjusted lineal model exhibited r=0.95 and intercept (-0,921; 1,743).
reliable interval (-0.921; 1.743). Conclusiones: El mtodo validado result especfico, preciso, exacto y
Conclusions: The validated method was specific, accurate, precise and lineal. Puede ser utilizado para el control de la calidad y la estabilidad de
linear. It can be used for quality control and stability studies of las isoflavonas presentes en los fitofrmacos.
isoflavones present in herbal medicine.
Keywords: analysis of methods of validation; HPLC; isoflavones; quality Palabras Clave: CLAR; control de calidad; isoflavonas; validacin de
control. mtodos anlisis.

ARTICLE INFO
Received | Recibido: September 2, 2016.
Received in revised form | Recibido en forma corregida: November 26, 2016.
Accepted | Aceptado: November 27, 2016.
Available Online | Publicado en Lnea: December 17, 2016.
Declaration of interests | Declaracin de Intereses: The authors declare no conflict of interest.
Funding | Financiacin: The author confirms that the project has no funding or grants.
Academic Editor | Editor Acadmico: Gabino Garrido.

_____________________________________
Soledispa Caarte et al. Determinacin de isoflavonas en fitofrmacos que contienen soja

INTRODUCCIN Patrones y reactivos

El papel de las isoflavonas es profundamente va- Los patrones empleados para la identificacin y
lorado y actualmente es objeto de numerosas inves- cuantificacin de las isoflavonas fueron: genistena,
tigaciones debido a la doble actividad estrognica y genistina, y daidzina, obtenidos de 5YR Nanjing Ze-
antiestrognica que presentan. Estudios recientes lang Medical Technology Co., China (continental).
indican que las isoflavonas tienen beneficios poten- Todos los disolventes y reactivos utilizados (etanol,
ciales como los de reducir los sntomas de la meno- acetonitrilo, cido actico, cido clorhdrico e hi-
pausia, mejorar el nivel de colesterol, retardar el drxido de sodio), fueron de calidad Merck
agrandamiento de la glndula prosttica masculina Darmstadt, Alemania, para uso en HPLC y se sumi-
y mejorar la salud sea. La base molecular sobre la nistraron por Labomersa Ecuador; el perxido de
cual se sustenta su accin esteroidea radica inicial- hidrgeno fue de Sigma-Aldrich, Steinheim, Ale-
mente en su similitud estructural con los estrge- mania, y se suministr por la misma empresa.
nos (Sakamoto et al., 2010; Philibert et al., 2010; Ferraz Carbo-
nel et al., 2011; Garca Martn et al., 2012; Prez Rovira y Mach
Condiciones cromatogrficas
Casellas, 2012; Valladares et al., 2012; Gofur y Lestari, 2013; de Para validar el mtodo analtico se siguieron los
Piano et al., 2013; Correia et al, 2015). procedimientos establecidos por Micke et al. (2006)
En Ecuador, muchos laboratorios farmacuticos y Guidance for Industry (2015), empleando formula-
producen fitoteraputicos que contienen extractos ciones de fitofrmacos elaborados con isoflavonas
de soja, de los que se desconoce el contenido en de soja.
isoflavona y no se ha establecido un mtodo de con- La condiciones experimentales fueron isocrti-
trol de calidad por medio del cual el organismo re- cas, como detector se emple el UV a 260 nm, la
gulador pueda certificar la calidad de ellos. Esto temperatura del horno de la columna 25C, volu-
constituye, por tanto, un problema a resolver para men de inyeccin 10 L, flujo 1 mL/min, tiempo de
los organismos de salud pblica. corrida 30 min, fase mvil cido actico 2% y aceto-
Es por ello que el presente trabajo se plantea nitrilo.
como objetivo: desarrollar un mtodo de anlisis
por cromatografa lquida de alta resolucin Preparacin del estndar
(CLAR), para evaluar la concentracin de isoflavo-
nas en los diferentes fitofrmacos que se comercia- Para la preparacin de las muestras se tuvo en
lizan en Ecuador y asegurar la confiabilidad de los cuenta lo planteado por Rostagno (2005). En un ba-
resultados y as cumplir con lo establecido en las ln aforado de 50 mL se disolvi una cantidad de
normas internacionales (ISO/IEC: 17025, 2005). extracto estandarizado de isoflavona de soja 40%,
equivalente a 10,0 mg de isoflavonas totales, en 30
MATERIALES Y MTODOS mL de solucin etanlica 70% v/v. Se aplic ultra-
sonido a temperatura de 60C, por espacio de 20
min y luego se afor con el mismo disolvente (con-
Equipamiento analtico
centracin final: 0,2 mg/mL). Las muestras se pre-
Para el anlisis cromatogrfico se utiliz un pararon al momento del anlisis. Este procedimien-
cromatgrafo lquido de alta resolucin Chrom Eli- to se aplic de igual forma para los estndares
te, Merck-Hitachi, Japn. La columna para realizar daidzina, genistina y genistena.
la separacin fue una Symmetry C-18 (150 x 5 mm),
Waters, Ecuador. Las pesadas se realizaron en una Preparacin de la muestra
balanza Mettler-Toledo, Switzerland. Para la diso- Se tom una muestra de 20 cpsulas de concen-
lucin de las muestras se emple un bao ultras- trado de soja, las cuales fueron pesadas individual-
nico digital Branson, Labomersa, Ecuador. mente para determinar el contenido del producto
por unidad y el peso promedio. El contenido de la
muestra se homogeneiz y se pesaron 237,5 mg del

http://jppres.com/jppres J Pharm Pharmacogn Res (2017) 5(2): 107


Soledispa Caarte et al. Determinacin de isoflavonas en fitofrmacos que contienen soja

producto (equivalentes aproximadamente a 50 mg Para comprobar la linealidad del sistema croma-


de isoflavonas totales). Se transfiri a un baln de togrfico se prepararon a partir de una solucin
50 mL adicionando 20 mL de solucin etanlica al madre de isoflavonas totales (0,2 mg/mL), solucio-
70 % v/v sonicando por 20 min, posteriormente se nes de 0,04; 0,12; 0,20; 0,28; 0,36 mg/mL que abar-
afor con el mismo disolvente. caron el rango entre 20 y 180% de la cantidad de
La curva de calibracin a partir del estndar de isoflavonas totales presente en la muestra. La curva
referencia abarc un rango entre 0,04 a 0,36 mg/mL de regresin de mejor ajuste sobre los puntos indi-
a partir de la solucin madre de 0,2 mg/mL, elabo- viduales se determin por el mtodo de mnimos
rada inicialmente. cuadrados de seis rplicas.
La exactitud y linealidad del mtodo se realiz
Degradacin del estndar y la muestra por un anlisis repetido de muestras de diferentes
De las soluciones de estndar y muestra elabora- concentraciones 0,16; 0,20; 0,24 mg/mL de isoflavo-
das se transfiri una alcuota de 5 mL a un Erlen- nas totales presente en la muestra. Se consider en
meyer de 250 mL, adicionando 5 mL del producto cada punto el CV, el porcentaje de recobro y los re-
de degradacin respectivo (agua, hidrxido de sodio sultados de la prueba de t de Student, entre la recu-
0,1 N, cido clorhdrico 0,1 N y perxido de hidr- peracin media y 100%. Tambin, se determin la G
geno 1%). Las muestras, de forma independiente, se de Cochran para conocer si las varianzas de las con-
sometieron a reflujo a 60C por 30 min. Despus de centraciones eran equivalentes.
enfriar las soluciones se transfirieron a un baln de
Anlisis estadstico
25 mL y se complet el volumen con solucin eta-
nlica 70% v/v. Para la deteccin de fotlisis se to- Los resultados en los diferentes ensayos se pro-
maron 5 mL de la solucin inicial y se transfirieron cesaron estadsticamente con un nivel de significa-
a un baln de 25 mL, exponindolo a la luz ultravio- cin = 0.05 mediante el programa Statgraphics
leta durante 30 minutos. Centurion 16.1.11 plus para Windows.

Validacin del mtodo RESULTADOS


Para la validacin del mtodo se evalu, prime-
En la Fig. 1A, se muestra el cromatograma de la
ramente, la especificidad. En esta determinacin se
mezcla de los estndares, el cual, segn las condi-
emplearon muestras sometidas a la degradacin y el
ciones descritas present picos cuya elucin estuvo
arreglo de diodo como mtodo, para observar la
comprendida entre 1,557 y 18,913 min. Los picos
aparicin de picos secundarios a otras longitudes de
principales fueron: daidzina con TR 1,557 min, ge-
onda y la no interferencia de posibles picos con el
nistina con TR 3,17 min y genistena con TR 18,913
principal.
min.
La precisin se determin mediante la prueba de
En los cromatogramas (Figs. 1 B-E) se visualizan
repetibilidad y la precisin intermedia. Para ello se
los resultados de la aplicacin del mtodo analtico
emplearon soluciones de tres concentraciones: 50%
en diferentes condiciones degradativas (oxidacin y
(0,16 mg/mL), 100% (0,20 mg/mL) y 150% (0,24
fotlisis).
mg/mL) de la cantidad terica, por dos analistas, en
En la Tabla 1 se reportan los valores de las abun-
diferentes das, siguiendo el mtodo de anlisis
dancias relativas para las tres curvas de calibracin
propuesto. Se determin la media, la desviacin es-
realizadas con el estndar y la muestra y en la Tabla
tndar (D.E.) y el coeficiente de variacin (CV). Los
2 los parmetros estadsticos del mtodo corres-
resultados se compararon estadsticamente median-
pondientes a cada determinacin.
te las pruebas de F de Fisher y t de Student. El crite-
En el estudio de precisin resultaron los coefi-
rio de aceptacin incluy valores de coeficiente de
cientes de variacin CV 80% = 0,568; CV 100% =
variacin inferiores al 1,5% y al 2% para los estudios
0,743% y CV 120 % = 0,470% para la repetibilidad y
de repetibilidad y precisin intermedia, respectiva-
al 0,59% en la precisin intermedia. Los resultados
mente.

http://jppres.com/jppres J Pharm Pharmacogn Res (2017) 5(2): 108


Soledispa Caarte et al. Determinacin de isoflavonas en fitofrmacos que contienen soja

del procesamiento estadstico (Tabla 2) muestran la Los resultados obtenidos cumplieron con el lmi-
relacin entre los analistas (p=0,05; p=0,14). te establecido para el coeficiente de variacin de
En la linealidad del sistema se obtuvo una ecua- mtodos cromatogrficos, el cual debi ser menor o
cin de la curva ajustada rea = 2,87 + igual que 2%; esto seala que el mtodo es repeti-
1,95E8*Concentracin, con pendiente significativa ble. El valor de la C - experimental en el test de Co-
(0,00). La Fig. 2A muestra la curva de calibracin chran fue menor que el tabulado lo cual indica que
correspondiente. De igual manera se analiz la li- la concentracin no influye en la precisin. Al cum-
nealidad del mtodo analtico mostrando resultados plirse los criterios de aceptacin entre las disper-
similares (Fig. 2B) a la del sistema. siones y las medias de ambos analistas, puede asu-
La Tabla 2 reporta los porcentajes de isoflavonas mirse que existe homogeneidad en los datos y de
totales calculados utilizando como referencia el es- esta forma se demuestra que el mtodo es reprodu-
tndar. A partir de estos valores se construy una cible.
curva de calibrado de cantidades aadidas vs. can- En la demostracin de la exactitud del mtodo,
tidades recuperadas. se pudo comprobar que en todos los casos el coefi-
Como se observa, para el modelo lineal ajustado, ciente de variacin obtenido fue menor que 2%, los
se obtuvo un valor de r=0,97, el intervalo de con- porcentajes de recuperacin estuvieron entre 98 y
fianza del intercepto (-0,921; 1,743) incluyendo el 102%, lo que cumple lo establecido en la literatura
cero. A partir de los resultados en el clculo de las (Micke et al., 2006). No se encontraron diferencias sig-
isoflavonas totales, se determin el porcentaje de nificativas entre la recuperacin media y 100% de
recuperacin o recobrado (R) para cada concentra- recobro. Las varianzas de las concentraciones son
cin (Fig. 2C). equivalentes, con valores de G de Cochran experi-
mental menor que la tabulada; por lo tanto puede
DISCUSIN asumirse que la concentracin no influye en la va-
riabilidad de los resultados. Da Costa Csar et al.
En las muestras que fueron tratadas con hidrxi-
(2007), obtuvieron resultados similares para la de-
do de sodio 0,1 N se observ una marcada disminu-
terminacin por CLAR de las isoflavonas de soja.
cin de los picos cromatogrficos correspondientes
Estudios realizados por Rostagno (2005), para
a las isoflavonas, lo cual es indicativo de que en este
evaluar la estabilidad de las isoflavonas de soja, de-
medio se produce una degradacin de stas que
mostraron que los extractos de isoflavonas se pue-
puede ser debida al rompimiento del anillo con la
den conservar sin que se produzca degradacin sig-
consiguiente formacin de sales de cadena abierta.
nificativa a -20C durante 30 das en la oscuridad o
El tratamiento con el medio oxidante provoc, de
entre 5 y 10C durante 7 das, en la oscuridad o con
igual forma, una significativa disminucin de las
luz incidente. En este estudio, las muestras a anali-
isoflavonas. No obstante a estos cambios, no se ob-
zar se elaboraron en el momento en que se iban a
serv la aparicin de nuevos picos cromatogrficos
procesar, por lo que no deben haberse presentado
que pudieran interferir en la determinacin, lo que
degradaciones producto del almacenamiento.
garantiza la especificidad del mtodo ensayado.
Otro aspecto evaluado por este autor, fue la efi-
Para comprobar la linealidad del mtodo se apli-
cacia del empleo del ultrasonido como mtodo de
c el estadgrafo t de Student, a travs del cual se
extraccin. l seal que la eficacia de extraccin
demostr que los valores experimentales cumplie-
de las isoflavonas aumenta con el empleo del ultra-
ron con el criterio de aceptacin para el intercepto.
sonido, pero es fuertemente dependiente del disol-
El valor medio del coeficiente de respuesta fue cer-
vente empleado y sugiere como mejores disolventes
cano al valor de la pendiente de la recta y el coefi-
al etanol al 50% y al metanol al 50%, debido a que
ciente de variacin de los factores de respuesta me-
con la presencia del agua se trasmiten mejor las on-
nor que 5%. El r obtenido indic que existe una
das ultrasnicas, finalmente estableci en su proto-
fuerte correlacin lineal positiva entre las variables
colo que una temperatura de 60C y un tiempo de
x (concentracin del analito) y y (rea bajo la
20 min, seran los ms apropiados.
curva) lo que indica el cumplimiento del parmetro
de linealidad para el mtodo propuesto.
http://jppres.com/jppres J Pharm Pharmacogn Res (2017) 5(2): 109
Soledispa Caarte et al. Determinacin de isoflavonas en fitofrmacos que contienen soja

Figura 1. Estudio de degradacin del estndar de isoflavonas sometido a diferentes medios.


(A) Cromatograma del estndar: daidzina (1), genistina (2), genistena (3); (B) estndar tratado con cido clorhdrico; (C) estndar
tratado con hidrxido de sodio; (D) estndar tratado con perxido de hidrgeno; (E) estndar sometido a fotlisis.

http://jppres.com/jppres J Pharm Pharmacogn Res (2017) 5(2): 110


Soledispa Caarte et al. Determinacin de isoflavonas en fitofrmacos que contienen soja

Tabla 1. Abundancia relativa de los picos cromatogrficos de las disoluciones estndares y las muestras.

Concentracin de las diluciones/Abundancia relativa


Corridas del estndar
20% 60% 100% 140% 180%

1 9474076 26514672 44259219 59832516 73088487

2 9532894 26895331 43778360 64099571 73477952

3 9520910 27305973 45737273 63913433 73149698

Media D.E. 9509293,33 31082,14 26905325,33 395745,16 44591617,33 1020882,72 62615173,33 2411648,44 73238712,33 209435,93

Corridas de la muestra 20% 60% 100% 140% 180%

1 9583924 26163279 42194411 60852583 78982899

2 9450143 26670847 43693558 60719958 78624512

3 9350470 26675814 44467219 62798198 77722885

Media D.E. 9461512,33 117141,53 26503313,33 294488,84 43451729,33 1155540,94 61456913,00 1163478,16 78443432,00 649231,31

D.E: desviacin estndar.

Tabla 2. Validacin del mtodo analtico por cromatografa lquida de alta precisin (CLAR) para evaluar la concentracin de isoflavonas.

Parmetros Criterios Resultados


2
Linealidad del sistema r > 0,99; r > 0,98 r=0,99; r2=0,98
Intercepto no significativo rea = 2,87 + 1,95E8*Conc
exp < tab Cexp=0,37 < Ctab = 0,68
Pendiente significativa (p < 0,05) Fexperimental = 783,98; p = 0,00
Pendiente significativa (p = 0,00)
Intercepto no significativo (p=0,099)
Linealidad del mtodo r > 0,99; r2 > 0,98 rea = 657039,0 + 2,15E8*Conc
Intercepto no significativo r = 0,99; r2 = 0,99
exp < tab ANOVA p = 0,00
Pendiente significativa (p < 0,05) Pendiente significativa (0,00)
Intercepto no significativo (p = 0,12)
Exactitud R= 97 103% R= 100,85%
exp < tab % obtenido= 9,9327 + 0,9060*% terico
Gexp < Gtab t-experimental (0,90) y t-tabulada (2,92).
Gexperimental 0,42 y Gterico 0,71
Repetibilidad CV 1,5% CV 80% = 0,568%
CV 100% = 0,743%
CV 120% = 0,470%
Precisin intermedia CV 3% CV = 0,594%
Fexp < Ftab Fexp = 2,46; Ftab = 5,05
exp < tab exp = 0,13; tab = 2,23

http://jppres.com/jppres J Pharm Pharmacogn Res (2017) 5(2): 111


Soledispa Caarte et al. Determinacin de isoflavonas en fitofrmacos que contienen soja

A B C

Figura 2. Curvas de calibracin de linealidad y exactitud.


(A) Curva de calibracin de la linealidad del sistema; (B) Curva de calibracin de la linealidad del mtodo anal-
tico por cromatografa lquida de alta precisin (CLAR); (C) Curva de calibracin de la exactitud del mtodo
analtico por CLAR.

En este trabajo, con excepcin del disolvente em cpsulas de isoflavonas por cromatografia em camada
empleado, que fue etanol al 70%, se cumplieron con delgada (CCD) e cromatografia lquida de alta eficincia
(CLAE). Rev Bras Farmacogn 17(4): 616-625.
todos los aspectos establecidos en el trabajo de Ros- de Piano A, de Mello MT, Watson RR, Dmaso AR (2013) The
tagno (2005) y resulta importante sealar que se ob- effects of a fermented soy product and isoflavones in met-
tuvo una buena extraccin de las muestras estudia- abolic syndrome control. In: Bioactive Food as Dietary In-
das ya que no existe una gran diferencia de polari- terventions for Diabetes. Elsevier Inc., pp. 481494.
Ferraz Carbonel AA, Simes RS, Barros Rabelo Santos RH, Pin-
dad entre los disolventes sugeridos y el empleado, heiro Baracat MC, Simes MJ, Baracat ECH, Soares Jnior
por lo que se considera que las condiciones de ex- JM (2011) Effects of high-dose isoflavones on rat uterus.
traccin fueron adecuadas y no influyentes en la Rev Ass Med Bras 57(5): 524-529.
validacin del mtodo. Garca-Martn A, Quesada Charneco M, Alvrez Guisado A,
Jimnez Molen JJ, Fonoll Joya J, Muoz-Torres M (2012)
Efecto de un preparado lcteo con isoflavonas de la soja
CONCLUSIONES sobre la calidad de vida y el metabolismo seo en mujeres
posmenopusicas: estudio aleatorizado. Med Clin 138(2):
Los resultados obtenidos permiten concluir que 47-51.
el mtodo desarrollado es especfico, preciso, exacto Gofur A, Lestari SR (2016) Effect of black soybean natto extract
y lineal, por lo que puede ser empleado para la (Glycine soja) on reproduction system of hypercholesterol-
cuantificacin de isoflavonas totales en los fitome- emia male mice. Asian Pac J Reprod 5(5): 387-390.
dicamentos que se comercializan en Ecuador. Guidance for Industry (2015) Analytical Procedures and Meth-
ods Validation Chemistry, Manufacturing, and Controls
Documentation. U.S. Department of Health and Human
CONFLICTO DE INTERS Services Food and Drug Administration. Center for Drug
Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics
Los autores declaran que no existen conflictos de inters. Evaluation and Research (CBER).
ISO/IEC 17025 (2005) Requisitos generales para la competencia
AGRADECIMIENTOS de los laboratorios de ensayo y de calibracin.
Los autores confirman que este estudio no cuenta con fon- https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso-iec:17025:ed-
dos ni subvenciones. 2:v1:es. [Consultado 1 de septiembre, 2016].
Micke GA, Fujiya NM, Tonin FG, de Oliveira Costa AC, Maggi
REFERENCIAS Tavares MF (2006) Method development and validation
for isoflavones in soy germ pharmaceutical capsules using
Correia Silva ML, Leite Speridio PG, Marciano R, Amncio micellar electrokinetics chromatography. J Pharm Biomed
OMS, de Morais TB, de Morais MB (2015) Effects of soy Anal 41: 16251632.
beverage and soy-based formula on growth, weight, and Prez Rovira A, Mach Casellas N (2012) Efecto del consumo de
fecal moisture: experimental study in rats. J Pediatr 91(3): soja en relacin con los sntomas de la menopausia. Rev
306-312. Esp Nutr Hum Diet 16(2): 69-76.
da Costa Csar I, Castro Braga F, Duarte Vianna-Soares C, de Philibert Ch, El Messaoui S, Gignoux M, Pinzani V, Larrey D,
Aguiar Nunan E, Franco Barbosa TA, Moreira-Campos LM Hillaire-Buys D (2010) Liver injury from phytotherapy
(2007) Determinao de daidzena, genistena e glicitena

http://jppres.com/jppres J Pharm Pharmacogn Res (2017) 5(2): 112


Soledispa Caarte et al. Determinacin de isoflavonas en fitofrmacos que contienen soja

treatment containing soy isoflavones. Therapie 65(5): 501- Sakamoto T, Horiguchi H, Oguma E, Kayama F (2010) Effects of
503. diverse dietary phytoestrogens on cell growth cell cycle
Rostagno MA (2005) Nuevos Mtodos para la Determinacin and apoptosis in estrogen-receptor-positive breast cancer
de Isoflavonas en Soja y Alimentos Derivados. Tesis Docto- cells. J Neurosci Res 88: 877-886.
ral. Departamento de Qumica Analtica Universidad de Valladares L, Garrido A, Sierralta W (2012) Isoflavonas de soya y
Cdiz. http://docplayer.es/5891602-Nuevos-metodos-para- salud humana: cncer de mama y sincronizacin de la pu-
la-determinacion-de-isoflavonas-en-soja-y-alimentos- bertad. Rev Med Chile 140: 512-516.
derivados.html [Consultado 1 de septiembre, 2016].
_________________________________________________________________________________________________________________

Contribucin de los autores:

Contribucin Soledispa Caarte PA Miranda Martnez M Garca Mir V


Conceptos o Ideas x x x
Diseo x x x
Definicin del contenido intelectual x x x
Bsqueda bibliogrfica x - -
Estudios experimentales x - -
Adquisicin de datos x - .
Anlisis de datos x x x
Anlisis estadstico - - x
Preparacin del manuscrito x x
Edicin del manuscrito x x
Revisin del manuscrito x x

Formato de cita: Soledispa Caarte PA, Miranda Martnez M, Garca Mir V (2017) Validacin de una tcnica por cromatografa
lquida de alta resolucin para la determinacin de isoflavonas totales. [Validation of a technique by high-performance liquid
chromatography for the determination of total isoflavones]. J Pharm Pharmacogn Res 5(2): 106-113.

http://jppres.com/jppres J Pharm Pharmacogn Res (2017) 5(2): 113